Orientador: Eunice Oba / Resumo: Este estudo teve como objetivo investigar os efeitos de diferentes concentrações de Bis-carboxietil sesquióxido germânio (Ge132), adicionado ao meio de congelamento de sêmen bovino, mantido ou não sob prévia incubação, sobre as características espermáticas avaliadas, pós-descongelamento. Nove ejaculados de três touros foram misturados e divididos em grupo D (sêmen diluído e incubado a 33 °C por 30 minutos antes da refrigeração) e R (sêmen refrigerado a 4 °C imediatamente após a diluição). Ambos o grupos foram suplementados com 0, 500 e 1000 μg/mL de Ge132, resultando nos subgrupos experimentais D0, R0,D500, D1000, R500 e R1000. Após congelamento, as amostras de sêmen foram descongeladas e avaliadas aos 5 e 60 minutos, quanto a motilidade, velocidade e alterações morfofuncionais espermáticas. Os dados foram analisados, considerando-se a diferença entre os grupos e entre os momentos de avaliação. Maior valor para motilidade total (P<0,05) foi obtido no R0 em comparação com o R1000, D500 e D0. As análises realizadas aos 5 e 60 minutos revelaram diminuição dos valores da motilidade total no R500 e no R1000 e no D0, D500 e R500 para a ALH. Além disso, os valores da LIN aumentaram (P<0,05) no D1000, da mesma forma que a diferença para a STR entre os momentos foi maior no R500, R1000 e D1000. Maior porcentagem (P<0,05) de células com integridade de membrana foi observada no R500 do que no D0, D1000 e R1000, assim como para células sem desestabilização de membrana, a qual R500 aprese... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: This study aimed to investigate the effects of different concentrations of Bis-carboxietil sesquioxide germanium (Ge132) added to a bovine freezing medium, maintained or not under previous incubation, on frozen/thawed sperm characters. Nine bull ejaculates were pooled and divided into group D (ejaculate was diluted and kept at 33 °C for 30 min before cooling) and R (ejaculate was diluted and immediately cooled at 4 °C). Both of groups were added with 0, 500, and 1000 μg/mL of Ge132, forming the experimental groups D0, R0, D500, D1000, R500, and R1000. After freezing, the sperm samples were thawed and assessed at 5 and 60 minutes for motility, velocity and morphological/functional characteristics. The data were expressed taking into account a difference between the groups and between the moments of analysis. Higher (P<0.05) mean values were obtained in R0 for total motility in comparison to R1000, D500, and D0. The analyzes at 5 and 60 minutes revealed a significant decreased for total motility in R500 and R1000, as well as, in D0, D500 and R500 for ALH. However, mean values for LIN increased (P<0.05) in D1000, similarly that the difference for STR between moments was higher in R500, R1000 and D1000. Greater proportions (P<0.05) for acrossomal and plasmatic membrane integrity were observed in R500 than in D0, D1000 and R1000, as well as for without membrane destabilization than in D1000. Lower production of O2-. occurred in R0, with no significant differences among groups for ... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

O desvio de segregação, processo biológico definido pela formação de progênie cujas proporções genotípicas diferem das predições mendelianas, pode apresentar diferentes causas: a segregação não aleatória dos cromossomos durante a meiose, a seleção gamética e a viabilidade pós-zigótica diferencial. A fim de investigar a distorção de segregação em humanos, estudamos uma família com transmissão preferencial paterna de uma alteração patogênica no gene CAPN3(CAPN3 c.759_761del), previamente associada à distrofia muscular de cinturas do tipo 2A (LGMD2A). Inicialmente, definimos uma região com 2,1 Mb de extensão, presente na maior parte dos indivíduos da família. O sequenciamento direto de 14 genes contidos nesse intervalo não revelou variantes raras que pudessem estar diretamente associadas à vantagem da subpopulação de gametas portadores da alteração em CAPN3. Entretanto, a presença de variantes comuns distribuídas em cinco genes da região pode indicar que a distorção de segregação observada é consequência da interação, em nível proteico, de pequenas alterações genômicas, resultando no desempenho diferencial de tais células gaméticas. Além disso, utilizamos outra abordagem: espermatozoides de indivíduos saudáveis foram selecionados segundo sua motilidade e as frequências alélicas de cada loco em heterozigose foram comparadas entre células lentas e rápidas, a fim de identificarmos regiões suscetíveis ao desvio de segregação. Alguns resultados estatisticamente significantes foram obtidos para regiões que contêm genes envolvidos na reação acrossômica e na motilidade espermática, como PDE1C e PDE4D. Isso nos sugere que tais processos constituem alvos da seleção, o que pode culminar em formação de progênie com proporções que fogem às predições mendelianas. Esses achados são importantes porque possibilitam a ampliação de nossos conhecimentos acerca do desvio de segregação e seu impacto na espécie humana, considerando ainda possíveis efeitos na fertilidade masculina / The transmission ratio distortion (TRD), a biological process defined as a deviation from Mendelian predictions, is caused by different mechanisms: nonrandom segregation of chromosomes during meiosis or gametic and postzygotic viability selection. In order to investigate TRD in humans, we have studied a family with an overtransmitted pathogenic deletion in the CAPN3 gene (CAPN3 c.759_761del), previously associated to limb-girdle muscular dystrophy type 2A (LGMD2A). Initially, it was possible to define a 2.1 Mb region which was present in most of the individuals. The direct sequencing of 14 genes contained in this interval did not reveal rare variants that could be responsible for the advantage of gametes carrying the CAPN3 mutation. Nevertheless, common variants identified in five genes could indicate that the observed transmission distortion is caused by the interaction among proteins with small dissimilarities, resulting in differential performance of these gametic cells. Subsequently we developed another approach: spermatozoa from healthy individuals were sorted according to their motility and allelic frequencies at each locus in heterozygous state were compared in order to identify genomic regions susceptible to TRD. Surprisingly, some statistically significant results were achieved for regions containing genes involved with acrosome reaction and sperm motility, as PDE1 and PDE4, suggesting these processes are targets of the selection that ends in offspring with proportions skewed away from the Mendelian predictions. These results are important for enlarge our knowledge about TRD and its impact in humans, considering possible effects in male fertility

A inseminação artificial (IA) é uma técnica cada vez mais utilizada na suinocultura moderna, pois propicia ao suinocultor vantagens quanto ao desempenho dos reprodutores, ao controle dos cruzamentos e à facilidade na introdução de material genético. Entretanto, a produção de doses inseminantes com qualidade é um dos principais fatores envolvidos no sucesso da técnica. Nesse contexto, a adequada mensuração da concentração espermática do ejaculado suíno é parte fundamental da rotina de trabalho de Centrais de Inseminação Artificial em Suínos. Foram realizados dois experimentos onde se objetivou: Experimento 1 - avaliar a acurácia, a precisão e a robustez do volume do ejaculado do Espermiodensímetro de Karras (ESPM) e do Espectrofotômetro (ESPT), em comparação à Câmara de Neubauer (CN), técnica padrão e também produzir uma tabela de correção de escala do ESPM; Experimento 2 - avaliar o tempo gasto e a repetibilidade de cada técnica, além de comparar a tabela ajustada do ESPM produzida no Experimento 1 com a tabela padrão do ESPM. Utilizaram-se 141 ejaculados, que revelaram concentrações espermáticas médias (milhões de sptz/mL) e número médio de doses que poderiam ser produzidas, respectivamente de 229,1 e 22,6; 185,0 e 18,5; 283,6 e 28,0 para a CN, o ESPT e o ESPM. O viés médio (acurácia) obtido através da média da diferença do resultado da técnica alternativa e da técnica padrão, e o desvio-padrão do viés médio (precisão) do ESPT, em comparação à CN, foram, respectivamente de - 44,1 e 52,6, enquanto que para o ESPM foram de 54,5 e 44,8 (milhões de sptz/mL). Observou-se que o ESPT tende a subestimar e o ESPM a superestimar a concentração espermática, em comparação à CN. O ESPT foi igualmente preciso e mais acurado que o ESPM. Houve pouca influência do volume do ejaculado sobre os resultados do ESPM e do ESPT através dos resultados de robustez para o volume do ejaculado. O ESPM apresentou maior repetibilidade e menor tempo gasto para a realização dos exames, seguido do ESPT e, por último, da CN (P<0,05). A tabela produzida com os dados do Experimento 1 apresentou resultados mais aproximados aos da CN, em comparação com a tabela padrão do ESPM (2,96 bilhões de espermatozóides vivos/dose vs 2,36 bilhões de espermatozóides vivos/dose, respectivamente). Maiores informações de outras Centrais de Inseminação Artificial em Suínos (CIAS) sobre o uso a campo da tabela ajustada produzida, denominada \"Tabela Ajustada para o Espermiodensímetro LPS-FMVZ-USP\", seriam úteis para comprovar a sua eficiência a campo. / Artificial Insemination (AI) in swine is a rising technique that has been used during the last years at the swine production systems, because it furnish several advantages to the producers just like boar high efficiency, better breeding control and easiness in introducing foreign genetic materials. Nevertheless, high quality insemination doses output is one of the most important factors involving the technique success. In this manner, a correct measurement of the spermatic concentration of boars is a basic work routine of the Swine Artificial Insemination Centers (CIAS). Two trials had been performed, whose objectives were: Experiment 1 - evaluate the accuracy, precision and robustness for ejaculation volume of Spermdensimeter (ESPM) and Spectrofotometer (ESPT) in relation to the Neubauer Count chamber (CN), designed as the standard technique. Moreover, produce a scale correction of the ESPM table; Experiment 2 - evaluate the spent time and repetitiousness of each technique, and compare the ESPM adjusted table produced in Experiment 1 with the ESPM standard table. A total of 141 boar ejaculation was used for spermatic concentration measurement by the techniques described above. The average spermatic concentrations (106 sptz/mL) and average doses number were, respectively: 229.1 and 22.6, 185.0 and 18.5, 283.6 and 28.0 for CN, ESPT and ESPM. ESPT mean bias (accuracy) and standard deviation bias (precision), in relation to the CN were, respectively -44.1 and 52.6, while ESPM were 54.4 and 44.8 (106 sptz/mL). Through these results its possible to conclude that ESPT has a tendency to subestimate and ESPM to superestimate the spermatic concentration in relation to the CN. ESPT was more accurate and equally precise than ESPM. Little effect of ejaculation volume on accuracy and precision in both techniques (ESPM and ESPT) was confirmed by the robustness results. ESPM presented a minor coefficient of variation and timeless, followed by ESPT, and finally by CN (P<0,05). The adjusted table produced with Experiment 1 data presented similar results to CN, in relation to the ESPM standard table (2.96 billion of lives sptz/dose vs 2.36 billion of lives sptz/dose, respectively). Complementary data from others CIAS about field use of the ESPM adjusted table produced, named \"Adjusted Table for Karras Spermdensimeter LPS-FMVZ-USP\", would be useful to prove it efficiency.

A inseminação artificial (IA) é uma técnica cada vez mais utilizada na suinocultura moderna, pois propicia ao suinocultor vantagens quanto ao desempenho dos reprodutores, ao controle dos cruzamentos e à facilidade na introdução de material genético. Entretanto, a produção de doses inseminantes com qualidade é um dos principais fatores envolvidos no sucesso da técnica. Nesse contexto, a adequada mensuração da concentração espermática do ejaculado suíno é parte fundamental da rotina de trabalho de Centrais de Inseminação Artificial em Suínos. Foram realizados dois experimentos onde se objetivou: Experimento 1 - avaliar a acurácia, a precisão e a robustez do volume do ejaculado do Espermiodensímetro de Karras (ESPM) e do Espectrofotômetro (ESPT), em comparação à Câmara de Neubauer (CN), técnica padrão e também produzir uma tabela de correção de escala do ESPM; Experimento 2 - avaliar o tempo gasto e a repetibilidade de cada técnica, além de comparar a tabela ajustada do ESPM produzida no Experimento 1 com a tabela padrão do ESPM. Utilizaram-se 141 ejaculados, que revelaram concentrações espermáticas médias (milhões de sptz/mL) e número médio de doses que poderiam ser produzidas, respectivamente de 229,1 e 22,6; 185,0 e 18,5; 283,6 e 28,0 para a CN, o ESPT e o ESPM. O viés médio (acurácia) obtido através da média da diferença do resultado da técnica alternativa e da técnica padrão, e o desvio-padrão do viés médio (precisão) do ESPT, em comparação à CN, foram, respectivamente de - 44,1 e 52,6, enquanto que para o ESPM foram de 54,5 e 44,8 (milhões de sptz/mL). Observou-se que o ESPT tende a subestimar e o ESPM a superestimar a concentração espermática, em comparação à CN. O ESPT foi igualmente preciso e mais acurado que o ESPM. Houve pouca influência do volume do ejaculado sobre os resultados do ESPM e do ESPT através dos resultados de robustez para o volume do ejaculado. O ESPM apresentou maior repetibilidade e menor tempo gasto para a realização dos exames, seguido do ESPT e, por último, da CN (P<0,05). A tabela produzida com os dados do Experimento 1 apresentou resultados mais aproximados aos da CN, em comparação com a tabela padrão do ESPM (2,96 bilhões de espermatozóides vivos/dose vs 2,36 bilhões de espermatozóides vivos/dose, respectivamente). Maiores informações de outras Centrais de Inseminação Artificial em Suínos (CIAS) sobre o uso a campo da tabela ajustada produzida, denominada \"Tabela Ajustada para o Espermiodensímetro LPS-FMVZ-USP\", seriam úteis para comprovar a sua eficiência a campo. / Artificial Insemination (AI) in swine is a rising technique that has been used during the last years at the swine production systems, because it furnish several advantages to the producers just like boar high efficiency, better breeding control and easiness in introducing foreign genetic materials. Nevertheless, high quality insemination doses output is one of the most important factors involving the technique success. In this manner, a correct measurement of the spermatic concentration of boars is a basic work routine of the Swine Artificial Insemination Centers (CIAS). Two trials had been performed, whose objectives were: Experiment 1 - evaluate the accuracy, precision and robustness for ejaculation volume of Spermdensimeter (ESPM) and Spectrofotometer (ESPT) in relation to the Neubauer Count chamber (CN), designed as the standard technique. Moreover, produce a scale correction of the ESPM table; Experiment 2 - evaluate the spent time and repetitiousness of each technique, and compare the ESPM adjusted table produced in Experiment 1 with the ESPM standard table. A total of 141 boar ejaculation was used for spermatic concentration measurement by the techniques described above. The average spermatic concentrations (106 sptz/mL) and average doses number were, respectively: 229.1 and 22.6, 185.0 and 18.5, 283.6 and 28.0 for CN, ESPT and ESPM. ESPT mean bias (accuracy) and standard deviation bias (precision), in relation to the CN were, respectively -44.1 and 52.6, while ESPM were 54.4 and 44.8 (106 sptz/mL). Through these results its possible to conclude that ESPT has a tendency to subestimate and ESPM to superestimate the spermatic concentration in relation to the CN. ESPT was more accurate and equally precise than ESPM. Little effect of ejaculation volume on accuracy and precision in both techniques (ESPM and ESPT) was confirmed by the robustness results. ESPM presented a minor coefficient of variation and timeless, followed by ESPT, and finally by CN (P<0,05). The adjusted table produced with Experiment 1 data presented similar results to CN, in relation to the ESPM standard table (2.96 billion of lives sptz/dose vs 2.36 billion of lives sptz/dose, respectively). Complementary data from others CIAS about field use of the ESPM adjusted table produced, named \"Adjusted Table for Karras Spermdensimeter LPS-FMVZ-USP\", would be useful to prove it efficiency.

O desvio de segregação, processo biológico definido pela formação de progênie cujas proporções genotípicas diferem das predições mendelianas, pode apresentar diferentes causas: a segregação não aleatória dos cromossomos durante a meiose, a seleção gamética e a viabilidade pós-zigótica diferencial. A fim de investigar a distorção de segregação em humanos, estudamos uma família com transmissão preferencial paterna de uma alteração patogênica no gene CAPN3(CAPN3 c.759_761del), previamente associada à distrofia muscular de cinturas do tipo 2A (LGMD2A). Inicialmente, definimos uma região com 2,1 Mb de extensão, presente na maior parte dos indivíduos da família. O sequenciamento direto de 14 genes contidos nesse intervalo não revelou variantes raras que pudessem estar diretamente associadas à vantagem da subpopulação de gametas portadores da alteração em CAPN3. Entretanto, a presença de variantes comuns distribuídas em cinco genes da região pode indicar que a distorção de segregação observada é consequência da interação, em nível proteico, de pequenas alterações genômicas, resultando no desempenho diferencial de tais células gaméticas. Além disso, utilizamos outra abordagem: espermatozoides de indivíduos saudáveis foram selecionados segundo sua motilidade e as frequências alélicas de cada loco em heterozigose foram comparadas entre células lentas e rápidas, a fim de identificarmos regiões suscetíveis ao desvio de segregação. Alguns resultados estatisticamente significantes foram obtidos para regiões que contêm genes envolvidos na reação acrossômica e na motilidade espermática, como PDE1C e PDE4D. Isso nos sugere que tais processos constituem alvos da seleção, o que pode culminar em formação de progênie com proporções que fogem às predições mendelianas. Esses achados são importantes porque possibilitam a ampliação de nossos conhecimentos acerca do desvio de segregação e seu impacto na espécie humana, considerando ainda possíveis efeitos na fertilidade masculina / The transmission ratio distortion (TRD), a biological process defined as a deviation from Mendelian predictions, is caused by different mechanisms: nonrandom segregation of chromosomes during meiosis or gametic and postzygotic viability selection. In order to investigate TRD in humans, we have studied a family with an overtransmitted pathogenic deletion in the CAPN3 gene (CAPN3 c.759_761del), previously associated to limb-girdle muscular dystrophy type 2A (LGMD2A). Initially, it was possible to define a 2.1 Mb region which was present in most of the individuals. The direct sequencing of 14 genes contained in this interval did not reveal rare variants that could be responsible for the advantage of gametes carrying the CAPN3 mutation. Nevertheless, common variants identified in five genes could indicate that the observed transmission distortion is caused by the interaction among proteins with small dissimilarities, resulting in differential performance of these gametic cells. Subsequently we developed another approach: spermatozoa from healthy individuals were sorted according to their motility and allelic frequencies at each locus in heterozygous state were compared in order to identify genomic regions susceptible to TRD. Surprisingly, some statistically significant results were achieved for regions containing genes involved with acrosome reaction and sperm motility, as PDE1 and PDE4, suggesting these processes are targets of the selection that ends in offspring with proportions skewed away from the Mendelian predictions. These results are important for enlarge our knowledge about TRD and its impact in humans, considering possible effects in male fertility

Cuando Darwin postuló la teoría de Selección Sexual pudo explicar elaboradas características presentes normalmente en los machos que no podía predecir con la teoría de Selección Natural. Bajo esta teoría predijo que en general las hembras tenderán a ser el sexo selectivo y recurso escaso por el cual compiten los machos. Los arácnidos ofrecen un interesante modelo sexual entre los artrópodos para analizar procesos de selección sexual post-cópula como elección femenina y competencia espermática. Las arañas migalomorfas poseen caracteres plesiomórficos, por lo que el estudio en este grupo constituye un punto inicial para formular hipótesis evolutivas de comportamiento. Como objetivo general de la presente tesis se propone interpretaciones evolutivas para los patrones observados en el comportamiento sexual y estructuras reproductivas, comparando los datos obtenidos en las tarántulas Grammostola vachoni Schiapelli & Gerschman, 1961, Plesiopelma longisternale (Schiapelli & Gerschman, 1942) y la neméside Acanthogonatus centralis Goloboff, 1995 con los registrados en otras especies para contribuir al conocimiento de la biología reproductiva de los arácnidos. A partir de los resultados obtenidos, se amplía el conocimiento sobre los ciclos de vida y patrones de cortejo y cópula de las tres especies modelo. Con respecto a los estudios de comunicación química se halló que entre machos y hembras de A. centralis y P. longisternale no intervienen señales químicas aéreas pero si señales quimio-táctiles en la tela de las hembras que disparan el cortejo de los machos. Además los machos de A. centralis han desarrollado la capacidad de diferenciar entre las hembras y que éstas pueden advertir sobre su estatus reproductivo y receptividad. En relación al estudio de la trasferencia de esperma en A. centralis, no se encontró relación entre la duración de la cópula con la cantidad de esperma almacenado por la hembra así como tampoco con el remanente en los bulbos de los machos. No obstante, existiría un mayor control interno del almacenado de esperma por parte de la hembra, así como también una amplia comunicación de la pareja previa a la cópula y posterior a ella. Por medio de este trabajo se pudo confirmar la existencia de dimorfismo sexual en el tamaño corporal de las tres especies, además las hembras de A. centralis poseen mayor porcentaje de grasas e índice corporal que los machos, aunque se encontraron iguales porcentajes de musculatura en patas. Pero las hembras de A. centralis y G. vachoni, no mostraron superior inmunidad que los machos frente a un agente extraño. Por último con respecto a las variaciones entre las poblaciones de las arañas estudiadas, en las tarántulas P. longisternale y G. vachoni no se observaron diferencias en su repertorio de cortejo. En cambio A. centralis mostró un inicio de aislamiento reproductivo, que estaría en diferentes fases según la población. Los estudios realizados en estas arañas muestran que, pese a las dificultades que el grupo posee, interesantes patrones y mecanismos están presentes y son posibles de estudiar, brindando características de un grupo basal que ayudaría a entender la evolución de un clado más grande. / When Darwin proposed the theory of Sexual Selection has been able to explain the elaborated traits present in males who cannot be explained with the Natural Selection theory. Under this theory, he predicted that in general females will tend to be the selective sex and a limited resource for which males compete. Arachnids are an interesting sexual model among arthropods to analyze post-copula process of sexual selection such as female choice and sperm competition. Mygalomorph spiders have plesiomorphic traits, so, the study of this group of spiders constitutes the starting point to formulate evolutionary hypothesis of behavior. As a general objective of the present thesis, evolutionary interpretations for the observed patterns in sexual behavior and reproductive structures were proposed, comparing the data obtained in the tarantulas Grammostola vachoni Schiapelli & Gerschman, 1961, Plesiopelma longisternale (Schiapelli & Gerschman, 1942) and the nemesid Acanthogonatus centralis Goloboff, 1995 with the registered in other species to contribute to the knowledge of the reproductive biology of arachnids. Based on the results obtained, the knowledge of the life cycles and courtship and copula patterns of the three model species were broadened. Regarding to chemical communication studies, the results showed that there were no aerial chemical signals between males and females, but there were chemotactic signals that triggered the courtship in males. In addition, males of A. centralis have developed the ability to differentiate between females and this ability could use to inform them about the reproductive status and receptivity of the females. In relation to the sperm transfer study in A. centralis, no relationship was found between copula duration and the amount of sperm stored, or with the remained in the male’s bulbs. However, there would be a higher internal control of the sperm storage by the female, as well as broad communication of the couple before and after the copula. Through this thesis it was possible to confirm the existence of sexual dimorphism in the body size of the three species. In addition, females of A. centralis have a higher percentage of fats and body index than males, although similar percentages of musculature in legs were found. Females of A. centralis and G. vachoni did not show higher immunity than males against a foreign agent. Finally, regarding the variations between populations of the spiders studied, in the tarantulas P. longisternale and G. vachoni no differences were observed in their courtship repertoire. Contrarily, A. centralis showed a beginning of reproductive isolation, which would be in different phases according to the population. The studies carried out in these spiders showed that, despite the difficulties that this particular group of spiders has, interesting patterns and mechanisms are present and are possible to study, providing characteristics of a basal group that would be help to understand the evolution of a large clade.

Theory predicts that in species with a greater risk of sperm competition, males will invest more in ejaculate traits. In species with alternative mating tactics (AMTs), males of different phenotypes will be under different sperm competition risk. Because minors sneak inside other males\' territories to mate they should always face sperm competition. Major males, on the other hand, defend territories and have more chance of mating exclusively with females. For majors, the risk of sperm competition is theoretically lower. The main prediction from game theory models for species with AMTs is that majors invest less in ejaculate traits than minors. However, when the proportion of minors in the population increases, majors should invest more in ejaculate traits, reaching a similar level of ejaculate expenditure to minors. In this study, we tested these predictions with a meta-regression analysis of 29 fish species with AMTs. As a proxy for the risk of sperm competition, we ranked each species according to a sperm competition rank with five levels, from 1 (low risk of sperm competition) to 5 (high risk of sperm competition). Overall, we found that minors invest more in ejaculate traits than majors. We also categorized the ejaculate expenditure of males, according to the original variables quantified in the studies that were included in our analysis and found that minors invest more energy in the production of gonads than majors. Additionally, minors and majors have a similar investment in sperm number and sperm quality, but majors allocate more sperm to females. Overall, the sperm competition rank did not influence the magnitude of the difference in investment of majors and minors. The differential investment in gonad mass between majors and minors should represent an increase in sperm numbers, but our data showed that majors and minors are not producing different amount of sperm. Therefore, the higher investment in gonad mass can be related to minors mating more frequently than majors. minors are not able to produce sperm in greater quantities than majors, but they probably can replenish sperm faster than majors. Against theoretical predictions, sperm quality does not respond to differences of sperm competition, probably because sperm quality is not under such strong selection as gonad mass. Our findings suggest that, in fishes with alternative mating tactics, both majors and minors are under strong selection from sperm competition, even when the risk of polyandry is low / A teoria prevê que em espécies sob maior risco de competição espermática, os machos irão investir mais em características do ejaculado. Em espécies com táticas alternativas de acasalamento (AMTs), machos de fenótipos diferentes estão sob diferentes riscos de competição espermática. Uma vez que machos minors (i.e., machos furtivos) se esgueiram para dentro do território de outros machos para acasalar, eles provavelmente sempre enfrentam competição espermática. Machos major, por outro lado, defendem territórios e possuem uma chance maior de acasalar exclusivamente com fêmeas. Para os majors, o risco de competição espermática é teoricamente menor. A principal previsão de modelos de teoria dos jogos para espécies com AMTs é que majors investem menos em características de ejaculado do que minors. Entretanto, quando a proporção de minors em uma população aumenta, os majors devem investir mais em características do ejaculado, alcançando um nível similar de investimento em ejaculado que os minors. Neste estudo, nós testamos essas previsões com uma meta-regressão de 29 espécies de peixes com AMTs. Como proxy para o risco de competição espermática, nós classificamos cada espécie de acordo com um ranking de competição espermática. Esse ranking utiliza características de história de vida e demografia de cada espécie, e possui cinco níveis, de 1 (baixo risco de competição espermática) até 5 (alto risco de competição espermática). De maneira geral, nós encontramos que minors investem mais em características de ejaculado do que majors. Nós também categorizamos o investimento em ejaculado dos machos de acordo com as variáveis originais quantificadas nos estudos que foram incluídos na nossa análise e encontramos o resultado de que minors investem mais na produção de gônadas para seu próprio tamanho do que majors. Além disso, minors e majors apresentam investimento similar em número de espermatozoides e qualidade espermática, mas majors alocam mais esperma para as fêmeas. Em geral, o ranking de competição espermática não influenciou a magnitude da diferença de investimento entre majors e minors. O investimento diferencial em massa gonadal entre majors e minors deveria representar um aumento no número de espermatozoides, porém nossos dados mostraram que majors e minors não estão produzindo quantidades diferentes de esperma. Assim, um investimento maior em massa gonadal pode estar relacionado aos minors acasalarem mais frequentemente que os majors. minors não conseguem produzir esperma em maiores quantidades que os majors, mas eles provavelmente conseguem repor seu estoque de esperma mais rápido que os majors. Contrário às previsões teóricas, a qualidade espermática não responde às variações de competição espermática, provavelmente porque a qualidade espermática não está sob forte seleção como a massa gonadal. Nossos resultados sugerem que, em peixes com táticas alternativas de acasalamento, tanto os majors como os minors estão sob forte seleção da competição espermática, mesmo quando o risco de poliandria é baixo

A hipótese desta pesquisa foi que a maturação epididimária dos espermatozoides caninos envolve modificações nas proteínas e ácidos graxos do fluido sintetizado pelos distintos segmentos epididimários, além de alterações no perfil de ácidos graxos da membrana plasmática, organização celular e morfológica dos espermatozoides. Para tanto, este projeto foi realizado com 20 cães em idade reprodutiva e negativos para Brucella canis. Após a orquiectomia bilateral, os testículos e epidídimos foram acondicionados a 5&#176;C por no máximo 24 horas, em seguida, as amostras foram colhidas por incisões na cauda, corpo e cabeça do epidídimo. As amostras foram imediatamente processadas por avaliação subjetiva e automática da motilidade e vigor espermático, concentração, morfologia espermática, integridade da membrana plasmática, acrossomal e atividade mitocondrial. Foi possível observar determinar maior número de espermatozoides dentro da normalidade na cauda do epidídimo, especialmente, referindo-se à motilidade, integridade de membrana e atividade mitocondrial. A avaliação das modificações ultraestruturais dos espermatozoides permitiu observar a migração da gota citoplasmática e alterações acrossomais. No perfil de ácidos graxos observaram-se variações na quantidade e presença dos ácidos durante o traje epididimário, destacando o acréscimo do DHA na região da cauda epididimária. Ainda, no perfil protéico do plasma epididimário canino, foi possível identificar um padrão regional de secreção de proteínas, maior nas regiões da cabeça e corpo em relação à cauda do epidídimo. Apesar das importantes informações geradas a partir do presente trabalho, mais estudos são necessários para a compreensão da fisiologia reprodutiva, especialmente da maturação espermática epididimária na espécie canina. / The hypothesis of this research is that the canine maturation of epididymal spermatozoa involves progressive changes in the protein and fatty acid content of the fluid synthesized by the different epididymal segments, as well as changes in the fatty acid profile of the sperm plasma membrane, cell organization and morphology of the canine sperm. Therefore, this experiment was conducted with 20 dogs in reproductive age and free of Brucella canis. After bilateral orchiectomy, testes and epididymis were stored at 5&#176;C for up to 24 hours and then the samples were harvested through incisions of the tail, corpus and caput of the epididymis. The samples were immediately processed for subjective and automatic motility and sperm vigor, sperm count, morphology, plasma membrane integrity, acrosomal and mitochondrial activity. It was possible to observe a greater number of mature sperm in the epididymal tail compared to the corpus and caput, especially referring to motility, membrane integrity and mitochondrial activity. The evaluation of ultrastructural changes of the spermatozoa allowed to observed the migration of the cytoplasmic droplets and acrosomal changes. In the fatty acid profile was observed variations in the amount and presence of acids during epididymal maturation, highlighting the addition of DHA in the epididymal tail region. Moreover, in the protein profile of the canine epididymal plasma, it was possible to identify a regional pattern of protein secretion, higher in the caput and corpus in relation to the tail epididymis. In spite of the important data generated from this study, further studies are needed for understand the reproductive physiology, especially the epididymal sperm maturation in dogs.

Estudos recentes avaliaram o papel do Magnetic Activated cell Sorting (MACS, separação celular por ativação magnética) para reduzir a percentagem de espermatozoides apoptóticos e melhorar a qualidade seminal. No entanto, a eficiência do uso do MACS isoladamente, antes ou depois do processamento seminal pelos métodos clássicos, como o centrifugação em gradiente de densidade (DGC), ainda não foi estabelecida, de modo que o protocolo de uso do método não foi adequadamente estabelecido. Desta forma, o objetivo do presente estudo foi avaliar se o MACS sozinho, antes (MACS-DGC) ou depois do processamento seminal pelo DGC (DGC-MACS) melhora a seleção espermática quando comparado ao processamento pelo DGC. Realizou-se um estudo prospectivo experimental avaliando amostras de sêmen de 15 homens saudáveis. A mesma amostra foi dividida em 4 alíquotas e processada por: DGC, DGC-MACS, MACS-DGC e MACS. Após o processamento, foram analisadas a integridade do DNA espermático pelo método TUNEL - TdT-mediated dUTP Nick End Labeling (marcação de quebras no DNA por dUTP e deoxinucleotidil terminal transferase) assim como a concentração de espermatozoides, a motilidade progressiva e a morfologia, segundo os últimos critérios adotados pela Organização Mundial da Saúde. A percentagem de dano ao DNA foi significativamente menor no grupo MACSDGC, quando comparado com DGC e MACS, e semelhante a do grupo DGC-MACS. A concentração de espermatozoides recuperados nos grupos de DGC e MACS foi similar e significativamente maior do que MACS-DGC e DGC-MACS, que foram semelhantes entre si. A motilidade progressiva dos espermatozoides recuperados foi semelhante nos grupos MACS-DGC e DGC e significativamente maior do que nos grupos DGC-MACS e MACS. O percentual de espermatozoides com morfologia normal foi significativamente maior no grupo MACS-DGC quando comparado ao DGC-MACS e MACS, e semelhante quando comparado com DGC. Desta forma, evidenciou-se que ambos os métodos combinados promovem a recuperação de espermatozoides com menor percentagem de dano ao DNA espermático. O MACS isoladamente ou aplicado após o DGC promove redução significativa dos espermatozoides progressivos recuperados, assim como da percentagem de espermatozoides com morfologia normal. Todavia, o MACS aplicado antes do DGC promove a recuperação de amostras com elevada percentagem de espermatozoides com motilidade progressiva e morfologia normal, aliada a baixa percentagem de DNA fragmentado, sugerindo ser o melhor protocolo de uso desta metodologia, cuja importância clínica precisa ser avaliada em estudos clínicos bem delineados. / Recent studies evaluated the role of Magnetic Activated Cell Sorting (MACS) in order to reduce the percentage of apoptotic sperm and improve seminal quality. However, the effectiveness of using MACS alone, before or after seminal processing by classical methods, such as the density gradient centrifugation (DGC), has not yet been established. Thus, the role of the present study was evaluate whether: MACS alone, before (MACS-DGC) or after seminal processing by DGC (DGC-MACS) improves sperm selection when compared to DGC. A prospective experimental study was conducted evaluating semen samples from 15 healthy men. The same sample was divided into 4 aliquots and processed by: DGC, DGC-MACS, MACS-DGC and MACS. After processing, the integrity of the sperm DNA was analyzed by TUNEL - TdT - mediated dUTP method Nick End Labeling (marking DNA breaks by dUTP and deoxynucleotidyl terminal transferase), sperm concentration, progressive motility and morphology according to the last criteria adopted by the World Health Organization. The percentage of DNA damage was significantly lower in the MACS-DGC group, when compared to DGC and MACS, and similar to the DGC-MACS group. The concentration of spermatozoa recovered in the DGC and MACS groups was similar and significantly higher than MACS-DGC and DGC-MACS, which were similar to each other. The progressive motility was similar in the MACS-DGC and DGC groups and significantly higher than in the DGC-MACS and MACS groups. The percentage of spermatozoa with normal morphology was significantly higher in the MACS-DGC group when compared to DGC-MACS and MACS, and similar when compared to DGC. Thus, it was evidenced that both methods combined promote the recovery of spermatozoa with a lower percentage of DNA damage. MACS alone or applied after the DGC promotes a significant reduction of the progressive sperm retrieved, as well as the percentage of spermatozoa with normal morphology. However, the MACS applied before the DGC promotes the recovery of samples with a higher percentage of spermatozoa with progressive motility and normal morphology, combined with low percentage of fragmented DNA, suggesting to be the best protocol, whose clinical importance needs to be evaluated in well-delineated clinical studies.

A inseminação artificial é utilizada como uma importante ferramenta para o melhoramento reprodutivo, tanto com sêmen resfriado ou congelado. O primeiro experimento teve como objetivo identificar um tampão de pH para resfriamento de sêmen de pôneis por 48 horas a 5°C e 15°C. O efeito de cinco tampões (TES (ácido N-tris (hidroximetil) metil-2-aminoetanosulfônico), PIPES (ácido piperaxín-N,N'-bis(2-etanosulfônico)), BES (ácido N,N-Bis(2-18hidroxietil)-2-aminoetanosulfônico), MES (ácido 4-morfolinoetanosulfônico) e HEPES (ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N’-2-etanosulfônico)) foi avaliado em um diluente composto de leite em pó desnatado e glicose. Os testes do diluente com os tampões BES, MES e TES foram conduzidos com o sêmen fresco de oito pôneis e no sêmen resfriado por 48 h a 15°C. Uma amostra de cada grupo foi utilizada para análise da motilidade, pH, osmolaridade, teste hiposmótico, atividade mitocondrial (MTT) e integridade de membrana através das sondas fluorescentes. O pH e a osmolaridade dos diluentes sem o sêmen também foram avaliados. Os dados foram analisados por análise de variância e pelo teste de Tukey, quando P < 0.05 foi significante. A osmolaridade do sêmen diluído não variou entre diluentes e foi para o BES 350.91 ± 11.24 mOsm, MES 350.41 ± 11.76 mOsm e TES 350 ± 12.96 mOsm. O pH do sêmen após diluição nos respectivos diluentes variou entre as horas avaliadas (P < 0.05) e não variou com o passar do tempo o que evidencia o efeito tamponante dos diluentes. A osmolaridade dos diluentes foi similar entre os tampões BES (366 ± 5.47 mOsm), MES (370 ± 6.12 mOsm) ou TES (371 ± 5.47 mOsm) a fresco e sem adição de sêmen. Já o pH variou (P < 0.05) de acordo com o tampão. No experimento a 5°C ocorreu decréscimo na porcentagem de motilidade total, progressiva e local do sêmen resfriado após 24 h e 48 h comparado a avaliação a fresco em todos os grupos. No entanto, a porcentagem de espermatozoides móveis a fresco, 24 h e 48 h a 5°C entre tratamentos foi similar. A porcentagem de espermatozoides reativos ao teste hiposmótico, e com atividade mitocondrial não diferiu entre tratamentos. No experimento a 15°C o vigor e motilidade total, progressiva e local foram similares entre os tampões BES, MES e TES em cada período avaliado. A osmolaridade do sêmen diluído não variou entre diluentes e foi para o BES 360.93 ± 10.52 mOsm, MES 361.47 ± 6.79 mOsm e TES 361.56 ± 7.68 mOsm. Devido as características individuais de cada tampão o pH do sêmen diluído variou entre os diluentes com os tampões utilizados. A porcentagem de espermatozoides reativos ao teste hiposmótico, com atividade mitocondrial e membrana intacta observada com CFDA e PI não diferiu entre tratamentos. Evidenciou-se que tanto BES, MES ou TES podem ser utilizados no armazenamento e transporte do sêmen de pôneis durante 48 h a 5°C ou 15°C. O segundo experimento teve como objetivo foi avaliar a influência da suplementação de ácidos graxos poli-insaturados sobre a qualidade de sêmen de pôneis da raça Brasileira a fresco e após congelamento. Oito pôneis receberam sua dieta convencional não suplementada (grupo controle) ou dieta convencional e 70 g de farinha de alga Schizochytrium sp rica em DHA (grupo PUFA). O efeito da Vitamina E (1 mM, DL-α-tocoferol), adicionada ao diluente de congelamento para sêmen também foi avaliado sobre a qualidade seminal, antes e após o congelamento do sêmen. O sêmen foi coletado a cada 15 dias durante 60 dias. Os garanhões tratados passaram a controle e vice-versa após um intervalo de sessenta dias. O sêmen foi avaliado a fresco e após o congelamento. Motilidade e vigor foram avaliados a fresco. Após o descongelamento motilidade, funcionalidade de membrana, integridade de membrana e análise computadorizada da motilidade foram avaliados. Os valores médios para os parâmetros avaliados a fresco no grupo PUFA e controle foram similares. Os valores médios da motilidade total, progressiva e local, hiposmótico, CFDA/PI e análise computadorizada de sêmen suplementados com DHA e o grupo controle pós-descongelamento não diferiram. A associação da suplementação de DHA e Vitamina E adicionada ao diluente não potencializou a capacidade antioxidante do diluente durante o congelamento. A associação da suplementação de DHA e Vitamina E adicionada ao diluente resultou em diminuição da motilidade total e progressiva comparada ao grupo não suplementado (controle). A suplementação de 70 g de farinha de alga Schizochytrium sp rica em DHA e ou a inclusão de 1 mM de vitamina E ao diluente de congelamento de sêmen em pôneis da raça Brasileira não foi eficiente para promover melhoria na viabilidade seminal após a coleta ou mesmo após o congelamento. / Artificial insemination with cooled and frozen semen is an important tool for breeding industry. The first experiment aimed to identify a pH buffer for cooling semen of ponies for 48 h at 5°C and 15°C. The effect of five buffers (TES (N-tris (hydroxymethyl) methyl-2-aminoethanesulfonic acid), PIPES (piperaxin-N, N'-bis (2-ethanesulfonic acid)), BES (N, N-Bis (N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic acid)) was evaluated in a extender composed of skimm milk powder and glucose. Analysis with the BES, MES and TES buffers were performed in fresh semen of eight ponies and in cooled semen for 48 h at 15°C. A sample from each group was used for analysis of motility, pH, osmolarity, hyposmotic test, mitochondrial activity (MTT) and membrane integrity through fluorescent probes. The pH and osmolarity of the extenders without semen were also evaluated. Data were assessed by analysis of variance and Tukey's test, when P <0.05 was considered significant. Osmolarity of the diluted semen did not differ between extenders and was for BES 350.91 ± 11.24 mOsm, MES 350.41 ± 11.76 mOsm and TES 350 ± 12.96 mOsm. The pH of the semen after dilution in the respective extenders varied between the hours (P <0.05) and did not change over time as evidenced by the buffering effect of the extenders. Extender osmolarity was similar between BES (366 ± 5.47 mOsm), MES (370 ± 6.12 mOsm) or TES (371 ± 5.47 mOsm) buffers after dilution and without addition of semen. The pH varied (P <0.05) according to the buffer. In the experiment at 5°C all treatments showed a decrease in the percentage of total, progressive and local motility of the cooled semen after 24 h and 48 h compared to the fresh. However, in the percentage of motile sperm to fresh, 24 h and 48 h at 5°C between treatments was similar. Percentage of spermatozoa reactive to the hyposmotic test, and with mitochondrial activity did not differ between treatments. In the experiment at 15°C total, progressive and local vigor and motility were similar between BES, MES and TES buffers in each period. Osmolarity of the diluted semen did not differ between extenders and was for BES 360.93 ± 10.52 mOsm, MES 361.47 ± 6.79 mOsm and TES 361.56 ± 7.68 mOsm. Due to the individual characteristics of each buffer, diluted semen pH varied between the extenders with the buffers used. Percentage of spermatozoa reactive to the hyposmotic test, with mitochondrial activity and intact membrane observed with CFDA and PI did not differ between treatments. We concluded that BES, MES or TES can be used in the storage and transport of ponies semen for 48 h at 5°C or 15°C. The second experiment aimed to evaluate the influence of polyunsaturated fatty acid supplementation in the fresh and after freezing semen of Brazilian ponies. Eight ponies received their conventional diet (control group) or conventional diet and 70 g of DHA-rich Schizochytrium sp algae meal (PUFA group). The effect of Vitamin E (1 mM, DL-α-tocopherol) added to the freezing diluent for semen was also evaluated on seminal quality, before and after freezing. Semen was collected every 15 days during 60 days. Stallions were reversed in treatments after an interval of sixty days. Semen was evaluated fresh and after freezing. Motility and vigor were estimated in the fresh semen. After thawing motility, membrane functionality, membrane integrity and computed motility analysis were evaluated. Mean values for fresh parameters evaluated in the PUFA and control groups were similar. Mean values of total, progressive and local motility, hyposmotic, CFDA/PI and computerized analysis of semen supplemented with DHA and post-thaw control group did not differ. The combination of DHA and Vitamin E supplementation added to the diluent did not potentiate the antioxidant capacity of the diluent during freezing and resulted in decreased total and progressive motility compared to the non-supplemented group. Supplementation of 70 g of DHA-rich microalgae Schizochytrium sp and the addition of 1 mM vitamin E to the semen freezing diluent in Brazilian ponies was not efficient to promote improvement in seminal viability after collection or even after freezing.