Orientador: Vera Fernanda Martins Hossepian de Lima / Resumo: Os ácidos graxos poliinsaturados (AGPs) são integrantes da membrana celular espermática, e embora favoreçam sua fluidez, são extremamente susceptíveis ao estresse oxidativo. Nesse contexto, o presente estudo objetivou avaliar a influência da catalase no meio de congelação para criopreservação do sêmen de machos da raça Nelore suplementados com gordura protegida, a fim de evitar a produção das espécies reativas de oxigênio (EROs). Foram utilizados 12 machos da raça Nelore mantidos em pastagem de capim-marandu em lotação contínua e taxa de lotação fixa. Os animais foram divididos em dois grupos: suplementados dos 14 aos 24 meses de idade (S+), ou não suplementados (S-). A colheita de sêmen foi realizada aos 24 meses, e as amostras de sêmen a fresco foram submetidas a analise computadorizada de cinética espermática (CASA). Posteriormente, as amostras foram divididas em duas frações e foram criopreservadas após a adição de meio de congelação, de igual composição, contendo catalase (C+) ou não (C-). Após o descongelamento do sêmen foram realizadas: avaliações de CASA; teste de termorresistência rápido (TTR); integridade das membranas plasmática e acrossomal; potencial mitocondrial, desestabilização da membrana e produção da ERO ânion superóxido (O2 -); produção da EROs; produção in vitro de embriões (PIVE) e quantificação intracitoplasmática de lipídio dos embriões. O delineamento experimental utilizado foi um esquema fatorial 2X2 (suplementação x catalase), totalizando 4 tratamen... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Mestre

Submitted by MEIRIELE MAZZO null (meiriele.mazzo01@etec.sp.gov.br) on 2017-04-20T22:08:30Z No. of bitstreams: 1 mazzo_m_me_dra.pdf: 1614379 bytes, checksum: 8636b12167680e3d5e0c7f98f5feadd0 (MD5) / Approved for entry into archive by Luiz Galeffi (luizgaleffi@gmail.com) on 2017-04-25T18:29:19Z (GMT) No. of bitstreams: 1 mazzo_m_me_ilha.pdf: 1614379 bytes, checksum: 8636b12167680e3d5e0c7f98f5feadd0 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-25T18:29:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 mazzo_m_me_ilha.pdf: 1614379 bytes, checksum: 8636b12167680e3d5e0c7f98f5feadd0 (MD5) Previous issue date: 2017-02-21 / Fipronil é um inseticida de amplo-espectro de ação, utilizado para o controle de pragas nas lavouras e de ectoparasitas na medicina veterinária. O objetivo do trabalho foi avaliar os efeitos tóxicos do fipronil sobre a fertilidade de ratos machos por meio da avaliação da produção de espermatozoides e de danos oxidativos causados no homogenato de testículos, além de avaliar a ação protetora da vitamina E. Ratos Wistar machos pesando aproximadamente 200 g foram divididos em três grupos (n = 6): controle: DMSO (60%) mais salina (40%) por via intraperitoneal (i.p.); fipronil 5: fipronil dissolvido em DMSO (60%) mais salina (40%) (5 mg/kg de peso corporal i.p.); fipronil 5 + vitamina E: fipronil dissolvido em DMSO (60%) mais salina (40%) (5 mg/kg de peso corporal i.p.) e vitamina E (100 mg/kg de peso vivo via oral).Durante 14 dias os animais foram pesados e cada grupo recebeu seu respectivo tratamento conforme citado, sendo que no 15º dia os animais foram eutanasiados e os testículos e epidídimos foram isolados para realização das seguintes análises: concentração de espermatozoides nos epidídimos, atividade das enzimas glutationa peroxidase (GPx) e catalase (CAT), determinação das concentrações de glutationa reduzida (GSH), grupos tióis de proteínas e malondialdeído (MDA) no homogenato dos testículos. Os dados foram analisados por ANOVA seguido pelo teste de Tukey. O fipronil reduziu significantemente a produção de espermatozoides (P < 0,01) e a vitamina E apresentou efeito protetor sobre esse parâmetro. A atividade da enzima GPx aumentou e a da CAT foi significantemente reduzida pelo fipronil (P < 0,001 e P < 0,05, respectivamente) e a vitamina E reestabeleceu as atividades das enzimas para níveis similares aos do grupo controle. Observou-se uma redução significante na concentração de GSH nos testículos dos ratos tratados com fipronil (P < 0,001) em relação ao grupo controle e a vitamina E apresentou uma proteção parcial deste efeito. Não houve alteração na concentração de grupos tióis de proteínas. Houve um aumento significante na concentração de MDA (P < 0,05), indicador de lipoperoxidação, nos animais tratados com fipronil e esse efeito foi diminuído pela vitamina E. Conclui-se que o fipronil afetou a produção de espermatozoides em ratos por apresentar atividade oxidante e que este efeito foi revertido pela vitamina E. / Fipronil is an insecticide with a broad-spectrum of action, used largely in both agricultural crops and veterinary medicine to control pests and ectoparasites. The objective of this study was to evaluate the toxic effects of fipronil on the fertility of male rats by evaluating sperm production and oxidative damage caused in the testis homogenate, as well as the protective action of vitamin E. Male Wistar rats weighing approximately 200 g were divided into three groups (n = 6): control: corn oil orally and DMSO (60%) plus saline (40%) intraperitoneally (i.p.); fipronil 5: fipronil dissolved in DMSO (60%) plus saline (40%) (5 mg/kg body weight i.p.); fipronil 5 + vitamin E: fipronil dissolved in DMSO (60%) plus saline (40%) (5 mg/kg body weight i.p.) and vitamin E dissolved in corn oil (100 mg/kg body weight orally). During 14 days the animals were weighed and each group received its respective treatment as mentioned, and on the 15th day the animals were euthanized and the testicles and epididymis were isolated for the following analysis: sperm concentration in the epididymis, activity of the glutathione peroxidase (GPx) and catalase (CAT) enzymes, concentrations of reduced glutathione (GSH), protein thiol groups and malondialdehyde (MDA) in the homogenate of testicles. Data were analyzed by ANOVA followed by the Tukey test. Fipronil significantly reduced sperm production (P < 0.01) and vitamin E had a protective effect on this parameter. The activity of the GPx enzyme increased and that of CAT was significantly reduced by fipronil (P < 0.001 and P < 0.05, respectively) but the vitamin E reestablished the enzyme activities to levels similar to those of the control group. A significant reduction in GSH concentration was observed in the testis of rats treated with fipronil (P < 0.001) compared to the control group and vitamin E showed partial protection against this effect. There was no change in the concentration of thiol groups of proteins. There was a significant increase in the concentration of MDA (P < 0.05), indicative of lipoperoxidation, in the animals treated with fipronil and this effect was reduced by vitamin E. It was concluded that fipronil declined the sperm production of the rats because its oxidant activity and that this effect was reversed by vitamin E.

La alpaca, es un camélido doméstico, económicamente importante en nuestro país por la calidad de su fibra. Al igual que en la mayoría de los mamíferos, se ha intentado caracterizar morfológicamente la estructura de sus espermatozoides, habiendo sido empleados sistemas CASA (iniciales en inglés, que al español significa: Asistencia computarizada de análisis de semen) en base a tinciones simples; por tal motivo, en el presente trabajo empleamos la tinción diferencial Papanicolau para resaltar las estructuras internas y externas. Es una técnica que no altera las superficies estructurales a diferencia de otros protocolos, adicionalmente de usar nuevos programas informáticos que permiten una biometría más precisa, y con menor margen de error. Cada estructura ha sido caracterizada biométricamente, según esto se desarrollaron pruebas cualitativas (es decir, que identifican solo normalidad o anormalidad) para cabeza, región media y cola; así como pruebas cuantitativas tan solo para cabeza, con la finalidad de encontrar parámetros numéricos que nos permitan diagnosticar cada subpoblación espermática de acuerdo a su forma. Las formas de cabeza (Normal, alargada, corta, piriforme, redondeada y con macrocefalia y microcefalia) fueron delimitadas mediante parámetros básicos y derivados, cuyos rangos y medias nos permiten representar numéricamente cada una de las mencionadas formas. En cada uno de los análisis de los eyaculados, se superó el valor predictivo del criterio estricto de Tygerberg (Kruger et al., 1986; 1987), diseñado para humanos, que establece que el límite porcentual de espermatozoides normales para ser considerados fértiles es del 4% y así reafirmar, mediante la morfología, que los machos de fertilidad comprobada de la población en estudio, son aptos para la reproducción. Palabras clave: Alpaca, espermatozoide, tinción Papanicolau, morfología y biometría. / Tesis

A composição dos lipídeos de membrana está entre os fatores que podem influenciar a capacidade fecundante do espermatozoide. Sabidamente os lipídeos desempenham papéis indispensáveis na membrana dos espermatozoides, participando dos processos de interação entre gametas e influenciando o comportamento físico-químico dos espermatozoides durante os procedimentos de criopreservação. Estas moléculas apresentam uma ampla gama de propriedades químicas que tornam complexa a sua análise. Atualmente a espectrometria de massas (MS) por ionização e dessorção a laser assistida por matriz (MALDI) representa uma potente ferramenta para a análise de lipídeos. Assim, a proposta deste trabalho buscou verificar a ocorrência de diferença no perfil lipídico de espermatozoides bovinos obtidos por MALDI utilizado técnica de análise direta dos espermatozoides e análise após a extração lipídica pelo método de Bligh e Dyer. Além disso, este trabalho analisou o perfil lipídico de espermatozóides bovinos que receberam ou não suplementação de antioxidantes. Após coleta, lavagem e separação dos espermatozoide, estes foram submetidos à extração lipídica ou destinados íntegros à obtenção do perfil lipídico (método direto). O perfil lipídico do extrato lipídico ou de espermatozoides íntegros foi adquirido por MALDI em modo positivo e com matriz DHB (ácido dihidroxibenzoico). A análise dos dados foi realizado com o software Metaboanalist utilizando ferramentas de análise multivariada (análise de componentes principais - PCA) e de identificação de íons com intensidade diferencial entre grupos de comparação (teste t, volcano plot). Com essas análises foi possível identificar que ocorre diferença no perfil lipídico dos espermatozoides bovinos quando obtidos a partir de análise direta ou extração de lipídeos. Não foram observadas diferentes entre grupos submetidos ou não à suplementação com vitaminas. O método direto é capaz de proporcionar um perfil lipídico representativo e de fácil aquisição. / The membrane lipid composition is amongst the factors that influence the fertilization competence of the spermatozoa. It is also known that lipids play fundamental roles at spermatozoa membranes, participating in many processes, such as spermatozoaoocyte interaction and determining the physical-chemical behavior of spermatozoa membranes during cryopreservation. These molecules show a wide range of chemical properties, making complex its analysis. Currently, mass spectrometry (MS) through matrix-assisted laser desorption ionization (MALDI) represents a powerful tool for lipids analysis. Hence, this proposal aimed to evaluate differences in bovine spermatozoa lipid profile obtained through MALDI using direct sample analysis of spermatozoa or analysis of spermatozoa lipid extract obtained by Bligh-Dyer technique. Moreover, this proposal evaluated lipid profile of spermatozoa from bull that received or not antioxidant supplementation. After collection, washing and separation, the spermatozoa were submitted to lipid extraction or straightforward destined to lipid profile acquisition (direct method). The lipid profiles of spermatozoa lipid extracts or from whole spermatoloza were obtained by MALDI in positive mode with DHB matrix (dihydrozybenzoic acid). Data analysis was performed with Metaboanalyst software using multivariated analysis (Principal component analysis - PCA) and tools for identification of differential ions between comparison groups (t-test, volcano plot). Results show differences in spermatozoa lipid profile obtained by direct method or after lipid extraction. No differences were observed in bovine spermatozoa derived from bulls supplemented or not with vitamins. The direct method can generate a representative and easily obtained lipid profile.

Estudos sobre a biologia reprodutiva de primatas não humanos são importantes para o desenvolvimento de biotecnologias da reprodução, visando a conservação das espécies. O objetivo deste estudo foi avaliar métodos de criopreservação do sêmen de Callithrix jacchus e C. penicillata. O sêmen foi colhido pelo método da vibroestimulação peniana, de animais adultos mantidos em cativeiro. Imediatamente após a colheita, foram analisadas as variáveis volume, pH, concentração, motilidades total e progressiva, integridade de membrana plasmática, integridade de acrossomo, atividade citoquímica mitocondrial, fragmentação de DNA e morfologia espermática. As amostras foram então refrigeradas em diluidor TEST gema de ovo sem glicerol; após este período, foi adicionado o glicerol a 4 e 6% de concentração e novas análises foram realizadas. O sêmen foi congelado em vapor de nitrogênio e finalmente em imersão em nitrogênio. As amostras foram descongeladas após um período mínimo de um mês e meio, e novas análises realizadas aos 10, 40 e 80 minutos pós-descongelação. Foi observado que o sêmen fresco de C. jacchus e C.penicillata são semelhantes em muitos aspectos. O diluidor TEST gema de ovo com o glicerol tanto a 4 como a 6% de concentração não foi eficaz para a proteção dos espermatozoides das duas espécies durante a criopreservação. São necessários outros estudos para o desenvolvimento de um protocolo de criopreservação do sêmen das duas espécies. Contudo, este trabalho contém informações que podem nortear futuros estudos sobre a criopreservação do sêmen destas e de outras espécies de primatas neotropicais. / Studies on the reproductive biology of nonhuman primates are important for the development of reproductive biotechnologies, in order to species conservation. The aim of this study was to evaluate methods for sperm cryopreservation from Callithrix jacchus and C. penicillata. Semen was collected by penile vibrostimulation from adult animals kept in captivity. Immediately after collection, the variables analyzed were volume, pH, concentration, total and progressive motility, plasma membrane integrity, acrosome integrity, cytochemical mitochondrial activity, DNA fragmentation and morphology. The samples were then chilled in TEST egg yolk extender without glycerol; after this period, the glycerol was added at concentrations of 4 and 6% and further analyzes were performed. The semen was frozen in nitrogen vapour and finally immersion in nitrogen. After a minimum of one month and a half, the samples were thawed and further analysis performed at 10, 40 and 80 minutes after thawing. Fresh semen from C. jacchus and C. penicillata were found to be similar in many aspects. The extender TEST egg yolk with glycerol as much as 4 to 6% concentration was not effective for the protection of spermatozoa from both species during cryopreservation. Further studies are needed to develop a protocol for cryopreservation of semen from both species. However, this work contains information that can guide future studies on sperm cryopreservation of these and other Neotropical primates species.

A refrigeração é a forma mais utilizada para a preservação do sêmen suíno empregado na inseminação artificial. Apesar do constante aprimoramento de diluidores comerciais em favor da manutenção da viabilidade espermática, sabe-se que alterações estruturais e principalmente funcionais ocorrem nestas células em resposta às baixas temperaturas de armazenamento. Além disso, embora tais modificações muitas vezes não sejam identificadas pelas análises de rotina, seus efeitos diretos sobre a capacidade fertilizante do espermatozoide tem sido relatados. Em paralelo, uma gama de estudos buscando identificar possíveis ações do plasma seminal sobre a célula espermática in vitro gera ainda resultados bastante controversos. Diante disso, o presente trabalho buscou avaliar como a presença ou não do plasma seminal durante o processo de refrigeração pode influenciar sobre a resposta do espermatozoide suíno aos eventos de capacitação e hiperativação espermática. Para isso, após serem mantidos sobre refrigeração à 17&deg;C por 72 horas, na presença ou não do plasma seminal, espermatozoides foram submetidos à capacitação in vitro e ao decorrer desta, avaliados quanto às características de motilidade pela análise computadorizada do sêmen; e funcionalidade celular por citometria de fluxo. Resultados obtidos à partir das análises de desordem lipídica, translocação da fosfatidilserina e permeabilidade da membrana plasmática mostraram que espermatozoides suínos refrigerados são capazes de responder à capacitação in vitro de forma semelhante, independente de prévia manutenção ou não, com o plasma seminal. Para os parâmetros de motilidade, bem como o estudo da população espermática hiperativada, foram apresentados resultados semelhantes entre ambos os grupos, o que demonstra a não influencia da prévia exposição ao plasma seminal sobre a mudança do padrão de motilidade espermática. Ainda, parâmetros qualitativos avaliados neste estudo suportam nossa afirmação de que, a ausência de contato entre o espermatozoide suíno e os componentes do plasma seminal durante seu armazenamento não reflete em qualquer efeito prejudicial sobre a qualidade espermática, além de oferecer uma maior resistência à estas células contra lesões de acrossoma (P &lt; 0,05). Desta forma, o presente trabalho concluiu que a remoção do plasma seminal previamente ao armazenamento do espermatozoide suíno à 17 °C por 72 horas não é prejudicial à sua qualidade e funcionalidade, podendo ainda ser benéfica à sua capacidade fertilizante. / Liquid storage is the main form of preservation of boar sperm prior to its use in artificial insemination. Despite the constant improvement of commercial extenders in favor of maintaining sperm viability, it is known that structural and mainly functional alterations occur in these cells in response to low storage temperatures. Furthermore, although these modifications are often not identified by routine analyzes, their direct effects on the fertilizing capacity of spermatozoa have been reported. In view of this, in vitro studies aiming to identify possible actions of seminal plasma as modulator of sperm function have yielded controversial results. Therefore, the present work aimed to evaluate how the presence or absence of seminal plasma during liquid storage may influence the responsiveness of spermatozoa to capacitation and hyperactivation events. For this, liquid boar sperm stored at 17 °C for 72 hours in the presence or not of the seminal plasma were submitted to in vitro capacitation. During the course, sperm motility characteristics were evaluated by computer-assisted semen analysis; and sperm functionality by flow cytometry. Results obtained from lipid disorder, phosphatidylserine translocation and plasma membrane permeability analyzes have shown that liquid boar sperm stored in the presence or not of seminal plasma are able to respond to in vitro capacitation in a similar way. For motility parameters including the study of hyperactivated boar sperm, results were similar for both groups, demonstrating that previous exposure to seminal plasma was not able to influence on sperm motility pattern. In addition, semen quality parameters evaluated in this study support our current observations that the absence of contact between spermatozoa and components of seminal plasma during liquid storage does not reflect any detrimental effect on sperm quality, besides offering greater resistance to these cells against acrosome damages (P &lt; 0.05). Therefore, the present study concluded that the removal of seminal plasma prior to liquid storage of boar spermatozoa at 17 °C for 72 hours is not detrimental to its quality and functionality, and may still be beneficial to its fertilizing capacity.

A preocupação com a qualidade do sêmen ovino congelado tem sido motivo de muitas pesquisas, principalmente pela dificuldade da transposição cervical durante a inseminação artificial. Contudo, a inseminação intra-cervical é frequentemente usada em ovinos e resulta em redução da fertilidade com o uso do sêmen congelado. Neste sentido, esse estudo foi dividido em dois experimentos. No 1o experimento foi verificado o potencial da ciclodextrina pré-carregada com colesterol como aditivo ao diluidor na proteção da cinética espermática, integridade das membranas plasmática e acrossomal, função mitocondrial, capacitação espermática e produção de espécies reativas ao oxigênio (ROS) em espermatozoides criopreservados ovinos. Cinco ejaculados de seis carneiros (n = 30) foram divididos em três tratamentos: apenas diluidor (CON); diluidor + colesterol incorporado a ciclodextrina (CLC + CHO); e diluidor + ciclodextrina pura (CLCP). Após a diluição (50x106 espermatozóides/mL), o sêmen foi envasado em palhetas, identificado e criopreservado utilizando um sistema automatizado. Duas palhetas da mesma partida de cada tratamento foram descongeladas (a 37°C durante 30 segundos) e analisadas quanto motilidade (CASA), morfologia dos espermatozoides (DIC), integridade do plasma (PI-H342) e acrossomal (FITC-PSA) membranas, potencial mitocondrial (JC-1), produção de radicais livres (CellRox), peroxidação lipídica (BODIPY) e fluidez da membrana celular (merocianina 540). As comparações entre os grupos foram analisadas pelo PROC MIXED do SAS e o efeito de grupo foi detectado pelo teste de Tukey (p&lt;0,05) ou pela estatística não paramétrica de ordem (Kruskal-Wallis), quando era necessário. No 2º experimento os mesmos ejaculados foram divididos por congelabilidade baseados na motilidade total pós-descongelação (MTPD) e na porcentagem de redução na motilidade total (%RMT) quando comparados o sêmen in natura e o sêmen pós-descongelação (somente diluidor), sendo divididos nos grupos alta (MTPD&gt;60% e %RMT&lt;40%), intermediária (60%&gt;MTPD&gt;40% e 60%&gt;RMT&gt;40%) e baixa (MTPD&lt;40% e %RMT&gt;60%) congelabilidade. Foram analisados os tratamentos CON e CLC+CHO dentro de cada animal e de cada grupo quanto a motilidade (CASA), a integridade das membranas plasmática (PI-H342) e acrossomal (FITC-PSA), potencial mitocondrial (JC-1), peroxidação lipídica (BODIPY) e fluidez da membrana celular (merocianina 540). As comparações foram realizadas por análise de variância (ANOVA) em arranjo fatorial 3X3 (Tratamento CLC+CHO, CON e in natura X grupos alta, intermediária e baixa congelabilidade), as comparações entre os grupos foram analisadas pelo PROC MIXED do SAS e o efeito de grupo foi detectado pelo teste de Tukey (p &lt;0,05) ou pela estatística não paramétrica de ordem (Kruskal-Wallis), quando era necessário. No 1o experimento o tratamento CLC+CHO se mostrou mais eficaz em preservar os parâmetros de motilidade, integridade de membranas e potencial mitocondrial quando comparado aos demais tratamentos. O grupo CLCP mostrou queda nos parâmetros de motilidade, integridade de membrana, potencial mitocondrial, mostrando, com isso, uma queda na preservação espermática. No 2o experimento observou-se que o tratamento CLC+CHO mostrou maior grau de preservação para motilidade total e progressiva, células rápidas, preservação de membranas plasmática e acrossomal e potencial mitocondrial quando comparado ao CON. Esse efeito teve maior significância nos grupos de baixa e intermediária congelabilidade, não sendo tão expressivo no grupo de alta. Pode-se concluir com esse estudo que o tratamento com ciclodextrina acrescida de colesterol contribui para uma melhor preservação dos parâmetros espermáticos do sêmen ovino, principalmente em animais apresentando baixa congelabilidade, contudo não apresenta diferença em ejaculados de alta congelabilidade. / Frozen ram semen has been the subject of many researches, mainly due to the difficulty of cervical transposition during artificial insemination. However, intra-cervical insemination in sheep is often used, resulting in reduced fertility with the use of frozen semen. To this end, this study was divided into two experiments. In the first experiment was verified the potential of cyclodextrin loaded with cholesterol as an additive to the extender in the protection of sperm kinetics, integrity of plasmatic and acrosomal membranes, mitochondrial function, sperm capacitation and production of reactive oxygen species (ROS) in cryopreserved sheep sperm. Five ejaculates from six rams (n = 30) were divided into three treatments: only extender (CON); extender + cyclodextrin loaded with cholesterol (CLC + CHO); and extender + pure cyclodextrin (CLCP). After dilution (50x106 spermatozoa/mL), semen was stored in straws, identified and cryopreserved using an automated system. Two straws from each ejaculate and treatment were thawed (at 37° C for 30 seconds) and analyzed for motility (CASA), morphology of spermatozoa (DIC), plasmatic (PI-H342) and acrosomal (FITC-PSA) membrane integrity, mitochondrial potential (JC-1), production of free radicals (CellRox), lipid peroxidation (BODIPY) and cell membrane permeability (Merocyanine 540). Comparisons between groups were analyzed using PROC MIXED of SAS and the effect of group was detected by Tukey (p &lt;0.05) or by the order of nonparametric statistics (Kruskal-Wallis) test, when necessary. In the 2nd experiment the same ejaculates were divided by freezability based on the total post-thaw motility (TPTM) and the percentage of reduction in total motility (%RTM) when compared fresh and post-thaw semen (only extender), and divided into the groups: high (TPTM &ge; 60% and %RTM &le; 40%), intermediate (60%&gt; TPTM &gt; 40% and 60%&gt; %RTM &gt; 40%) and low (TPTM &le; 40% and %RTM &ge; 60%) freezability. CON and CLC + CHO treatments were analyzed within each animal and each group for motility (CASA), plasmatic (PI-H342) and acrosomal (FITC-PSA) membrane integrity, mitochondrial potential (JC-1), lipid peroxidation (BODIPY) and cell membrane permeability (Merocyanine 540). Comparisons were performed by analysis of variance (ANOVA) with a factorial arrangement 3x3 (groups CLC+CHO, CON and fresh X groups high, medium and low freezability), comparisons between groups were analyzed using PROC MIXED of SAS and the group effect was detected by the Tukey test (p &lt; 0.05) or no statistical order parametric (Kruskal-Wallis), when necessary. In the first experimente, CLC + CHO treatment was more effective in preserving the parameters of motility, membrane integrity, and mitochondrial potential compared to other treatments. The CLCP group showed a fall in the parameters of motility, membrane integrity, mitochondrial potential, showing thereby a decrease in sperm preservation. In the 2nd experiment, it was observed that the treatment CLC + CHO showed greater preservation for total and progressive motility, rapid cell preservation, plasmatic and acrosomal membranes and mitochondrial potential when compared to CON. This effect was most significant in the groups of low and intermediate freezability, not being as significant in the group of high freezability. We can conclud from this study that treatment with cyclodextrin loaded with cholesterol contributes to better preservation of sperm parameters in ram semen, especially in animals displaying low freezability, however there where no diference in the high freezability group.

A jararaca-ilhoa (Bothrops insularis) é uma serpente endêmica e criticamente ameaçada de extinção que atualmente possui uma população estimada de 2.100 indivíduos restritos a uma única ilha no Estado de São Paulo, a Ilha da Queimada Grande. Esta vulnerabilidade levou à criação de um programa de reprodução em cativeiro para a espécie que, entre outras ações, propõe o desenvolvimento e aplicação de biotécnicas reprodutivas, tais como avaliação e preservação seminal e inseminação artificial. Este trabalho teve como objetivos: (1) avaliar três diluidores (HAM F-10, ACP-120&reg; e BWW) em três diluições diferentes (1:100, 1:200 e 1:500 &micro;L) e determinar qual o melhor protocolo de incubação para o sêmen de B. insularis; (2) avaliar um protocolo de inseminação artificial na espécie e (3) avaliar três diferentes sistemas de refrigeração (geladeira, banho-maria em geladeira e isopor tipo BotuFLEX&reg; )a fim de determinar qual deles é capaz de preservar melhor a motilidade do sêmen da jararaca-ilhoa por um período de até 48 h. Verificamos que as amostras de sêmen diluídas com o meio HAM F-10 na diluição 1:100 &micro;L apresentaram os melhores resultados para motilidade e motilidade progressiva e, desta forma, foi o protocolo de diluição seminal eleito para a inseminação artificial realizada. O protocolo de inseminação artificial foi realizando de maneira segura e minimamente invasiva nos animais, no entanto, até o momento não houve detecção de prenhez nas fêmeas inseminadas. A refrigeração se mostrou um método eficiente para a manutenção da motilidade e motilidade progressiva do sêmen de B. insularis por até 48 h pois, no período de duração do experimento, não foi verificada queda significativa nos parâmetros avaliados em nenhum dos sistemas de refrigeração. Foi observada, ao longo deste trabalho, uma alta incidência de decapitações nos espermatozoides de boa parte dos machos, o que pode comprometer seriamente a fertilidade do plantel estudado. Acreditamos, com os resultados deste projeto, ter elucidado questões fundamentais acerca do melhor diluidor e diluição a ser utilizada na manipulação do sêmen de B. insularis, assim como ter demonstrado que protocolos de refrigeração seguros e versáteis são capazes de manter a motilidade seminal por até 48 h, permitindo a troca de material genético entre diferentes plantéis no Brasil ou até mesmo com a população nativa da Ilha da Queimada Grande. O conhecimento gerado a partir deste estudo também servirá como base para estudos que visem o estabelecimento e aprimoramento de outras biotécnicas reprodutivas e a criação, em um futuro breve, de um banco de germoplasma da espécie. / The golden lancehead (Bothrops insularis) is a venomous pitviper endemic from Ilha da Queimada Grande, a small island located 40 miles off the coast of southeastern Brazil. Due to its small population (about 2000 individuals), highly restricted range, continuous decrease in habitat quality and illegal trading, B. insularis is currently listed as critically endangered in the IUCN Red List. As a consequence, efforts have been directed towards the development of a captive breeding program that involves both natural and assisted reproduction. Nonetheless, successful application of assisted reproductive technologies such as artificial insemination and semen cryopreservation in B. insularis requires a clear understanding of the reproductive physiology of this species, particularly aspects of sperm quality and production, and conservation. Thus, this study aims on: (1) determining which extenders (ACP-120, BWW and HAM-F10) and dilutions are better suited for maintenance of sperm motility; (2) testing an artificial insemination protocol in B. insularis maintained in captivity; (3) evaluating three different cooling systems (refrigerator, water bath on refrigerator and BotuFLEX&reg;) to determine which one is able to preserve the semen motility of the golden lancehead for a period up to 48 hours. We found that semen samples diluted with HAM F-10 medium at a 1: 100&micro;L dilution had the best motility and progressive motility results. To date, no pregnancies have been detected in inseminated females. Therefore, further studies and the improvement of this protocol for the species are required. We observed that all three cooling methods work successfully, maintaining the motility and progressive semen motility without significant changes for 48h, which demonstrates versatility in the preservation and transportation of this material, including from field work. With our results, we have elucidated fundamental questions about both the best diluent and dilution to be used, as well as refrigeration systems that ensure the maintenance of semen motility up to 48 hours. This is crucial for allowing the exchange of genetic material between different Brazilian Institutions and the income of material from Ilha da Queimada Grande, what may minimize problems due to consanguinity, besides serving as a basis for future studies on seminal cryopreservation protocols and the creation of germplasm banks.

No presente trabalho estudou-se o perfil bioquímico do plasma seminal bem como o perfil metabólico de touros Nelore com degeneração testicular. O estudo está apresentado em dois artigos. No Artigo 1, o objetivo foi investigar alguns metabólitos do plasma seminal de touros da raça Nelore para caracterizar valores e avaliar sua relação com as características espermáticas. Foram realizadas 14 colheitas seminais, com intervalos semanais, de 11 touros (n=154). O sêmen foi avaliado para motilidade, vigor, concentração, integridade das membranas plasmática e acrossomal, potencial de membrana mitocondrial, morfologia e pH. O plasma seminal foi submetido às avaliações metabólicas de proteína total, albumina, gama glutamil transferase (GGT), aspartato aminotransferase (AST), alanina aminotransferase (ALT) e fosfatase alcalina (FA). Os dados foram analisados no programa do Statistical Analysis System (SAS Institute Inc., 2004), sendo realizadas estatística descritiva e análise de correlação de Pearson, o nível de significância considerado foi de 5%. Os valores dos metabólitos encontrados no plasma seminal foram descritos e podem ser utilizados como referência para touros Nelore. Também se pode concluir que há relação entre o perfil metabólico do plasma seminal e as características espermáticas. No Artigo 2, o objetivo foi investigar a bioquímica séria e do plasma seminal de touros Nelore com degeneração testicular. Para isso, foram utilizados 22 touros, que foram distribuídos em dois grupos: Grupo Controle (CON; n=11) e Grupo Degeneração (DEG; n=11). Foram realizadas 14 colheitas de sêmen, e 21 colheitas de sangue com intervalos semanais. As avaliações seminais e do plasma seminal foram as mesmas realizadas no estudo do artigo 1 e o sangue foi avaliado quanto às concentrações de proteína total, albumina, fibrinogênio, GGT, AST, creatina-quinase (CK), glicose, lipoproteína de alta densidade (HDL), colesterol, triglicérides, beta-hidroxibutirato (BHB) e ácidos graxos não esterificados (NEFA). Os dados foram submetidos à Análise de Variância, sendo adicionado o fator medidas repetidas no tempo, utilizando-se o comando REPEATED gerado pelo PROC MIXED do SAS, com nível de significância de 5%. Pode-se afirmar que a degeneração testicular em touros Nelore causa elevação de pH do sêmen, bem como elevação da concentração de ALT e diminuição nas concentrações de GGT e FA no plasma seminal. Em relação às proteínas de fase aguda, a degeneração testicular causa diminuição na concentração de albumina. Em adição, este insulto local não altera os metabólitos séricos em touros Nelore. / In the present work the biochemical profile of the seminal plasma and the metabolic profile of Nelore bulls with testicular degeneration were studied. The study was presented in two articles. First in article 1, the objective was to investigate some seminal plasma metabolites of Nellore bulls to characterize values and evaluate their relation with sperm characteristics. Fourteen seed samples were taken, with weekly intervals, of 11 bulls (n = 154). Semen was evaluated for motility, vigor, concentration, plasmatic and acrosomal membrane integrity, mitochondrial membrane potential, morphology and pH. Seminal plasma was submitted to metabolic assessments of total protein, albumin, gamma glutamyl transferase (GGT), aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT) and alkaline phosphatase (AP). Data were analyzed by the Statistical Analysis System (SAS Institute Inc., 2004), with descriptive statistics and Pearson\'s correlation analysis performed, the level of significance considered was 5%. The values of the seminal plasma metabolites found have been described and can be used as reference for Nellore bulls. It can also be concluded that there is a relation between the metabolic profile of seminal plasma and sperm characteristics. In Article 2, the objective was to investigate the seric biochemistry and seminal plasma of Nellore bulls with testicular degeneration. For this, 22 bulls were used, which were distributed in two groups: Control Group (CON; n = 11) and Degeneration Group (DEG; n = 11). There were 14 semen crops and 21 weekly blood sampling. Seminal and seminal plasma evaluations were the same as those performed in the study of article 1 and blood was evaluated for total protein, albumin, fibrinogen, GGT, AST, creatine-kinase (CK), glucose, high density lipoprotein (HDL), cholesterol, triglycerides, beta-hydroxybutyrate (BHB) and non-esterified fatty acids (NEFA). The data were submitted to Variance Analysis, adding the factor measures repeated in time, using the REPEATED command generated by PROC MIXED of the SAS, with significance level of 5%. It can be affirmed that testicular degeneration in Nellore bulls causes elevation of semen pH, as well as elevation of ALT concentration and decrease in GGT and AF concentrations in seminal plasma. In relation to acute phase proteins, testicular degeneration causes a decrease in albumin concentration. In addition, this local insult does not alter serum metabolites in Nellore bulls.

A refrigeração é a forma mais utilizada para a preservação do sêmen suíno empregado na inseminação artificial. Apesar do constante aprimoramento de diluidores comerciais em favor da manutenção da viabilidade espermática, sabe-se que alterações estruturais e principalmente funcionais ocorrem nestas células em resposta às baixas temperaturas de armazenamento. Além disso, embora tais modificações muitas vezes não sejam identificadas pelas análises de rotina, seus efeitos diretos sobre a capacidade fertilizante do espermatozoide tem sido relatados. Em paralelo, uma gama de estudos buscando identificar possíveis ações do plasma seminal sobre a célula espermática in vitro gera ainda resultados bastante controversos. Diante disso, o presente trabalho buscou avaliar como a presença ou não do plasma seminal durante o processo de refrigeração pode influenciar sobre a resposta do espermatozoide suíno aos eventos de capacitação e hiperativação espermática. Para isso, após serem mantidos sobre refrigeração à 17&deg;C por 72 horas, na presença ou não do plasma seminal, espermatozoides foram submetidos à capacitação in vitro e ao decorrer desta, avaliados quanto às características de motilidade pela análise computadorizada do sêmen; e funcionalidade celular por citometria de fluxo. Resultados obtidos à partir das análises de desordem lipídica, translocação da fosfatidilserina e permeabilidade da membrana plasmática mostraram que espermatozoides suínos refrigerados são capazes de responder à capacitação in vitro de forma semelhante, independente de prévia manutenção ou não, com o plasma seminal. Para os parâmetros de motilidade, bem como o estudo da população espermática hiperativada, foram apresentados resultados semelhantes entre ambos os grupos, o que demonstra a não influencia da prévia exposição ao plasma seminal sobre a mudança do padrão de motilidade espermática. Ainda, parâmetros qualitativos avaliados neste estudo suportam nossa afirmação de que, a ausência de contato entre o espermatozoide suíno e os componentes do plasma seminal durante seu armazenamento não reflete em qualquer efeito prejudicial sobre a qualidade espermática, além de oferecer uma maior resistência à estas células contra lesões de acrossoma (P &lt; 0,05). Desta forma, o presente trabalho concluiu que a remoção do plasma seminal previamente ao armazenamento do espermatozoide suíno à 17 °C por 72 horas não é prejudicial à sua qualidade e funcionalidade, podendo ainda ser benéfica à sua capacidade fertilizante. / Liquid storage is the main form of preservation of boar sperm prior to its use in artificial insemination. Despite the constant improvement of commercial extenders in favor of maintaining sperm viability, it is known that structural and mainly functional alterations occur in these cells in response to low storage temperatures. Furthermore, although these modifications are often not identified by routine analyzes, their direct effects on the fertilizing capacity of spermatozoa have been reported. In view of this, in vitro studies aiming to identify possible actions of seminal plasma as modulator of sperm function have yielded controversial results. Therefore, the present work aimed to evaluate how the presence or absence of seminal plasma during liquid storage may influence the responsiveness of spermatozoa to capacitation and hyperactivation events. For this, liquid boar sperm stored at 17 °C for 72 hours in the presence or not of the seminal plasma were submitted to in vitro capacitation. During the course, sperm motility characteristics were evaluated by computer-assisted semen analysis; and sperm functionality by flow cytometry. Results obtained from lipid disorder, phosphatidylserine translocation and plasma membrane permeability analyzes have shown that liquid boar sperm stored in the presence or not of seminal plasma are able to respond to in vitro capacitation in a similar way. For motility parameters including the study of hyperactivated boar sperm, results were similar for both groups, demonstrating that previous exposure to seminal plasma was not able to influence on sperm motility pattern. In addition, semen quality parameters evaluated in this study support our current observations that the absence of contact between spermatozoa and components of seminal plasma during liquid storage does not reflect any detrimental effect on sperm quality, besides offering greater resistance to these cells against acrosome damages (P &lt; 0.05). Therefore, the present study concluded that the removal of seminal plasma prior to liquid storage of boar spermatozoa at 17 °C for 72 hours is not detrimental to its quality and functionality, and may still be beneficial to its fertilizing capacity.