Submitted by Anaclaudia Mattos Villalba (anaclaudiamattosvillalba@gmail.com) on 2016-04-09T23:49:33Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao-Josie-Schwartz-Caldas.pdf: 794588 bytes, checksum: edeac2ef5d199f65023941d4036fc463 (MD5) / Approved for entry into archive by cleuza maria medina dos santos (cleuzamai@yahoo.com.br) on 2016-05-09T14:06:58Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertacao-Josie-Schwartz-Caldas.pdf: 794588 bytes, checksum: edeac2ef5d199f65023941d4036fc463 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-09T14:06:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao-Josie-Schwartz-Caldas.pdf: 794588 bytes, checksum: edeac2ef5d199f65023941d4036fc463 (MD5) Previous issue date: 2014 / O peixe Geophagus brasiliensis, nativo brasileiro é explorado comercialmente como peixe ornamental, podendo, no futuro, ter reduzidos os estoques naturais. Com isso, a criopreservação pode garantir a sobrevivência e diversidade genética dessa espécie nativa. O objetivo deste estudo foi testar a eficiência crioprotetora e do Dimetil sulfóxido, Etileno glicol e Glicerol em sêmen de G. brasiliensis, utilizando os parâmetros espermáticos motilidade (taxa e tempo de motilidade), integridade de membrana e DNA, funcionalidade mitocondrial e espécies reativas de oxigênio (ERO). Os machos (n=12) foram obtidos de pescadores profissionais da Laguna dos Patos, tiveram seu sêmen coletado por massagem abdominal e diluído (1:9 v/v) em Betsville Thawing Solution para avaliação dos parâmetros espermáticos. As amostras seminais foram diluídas nos difentes tratamentos com crioprotetores DMSO, EG e GLI nas concentrações (5, 10, 15 e 20%). Sendo então, congeladas em Dryshipper e posteriormente armazenadas em botijão de Nitrogênio líquido à -196ºC, por no mínimo 15 dias. Posteriormente, descongeladas em banho-maria a 37º C por 8 segundos e as análises espermáticas refeitas. Todas as análises espermáticas foram realizadas por citometria de fluxo, exceto a motilidade (taxa e tempo) analisada ao microscópio de contraste de fases. Os resultados foram avaliados estatísticamente no programa Statistix 9.0 (2008). Os tratamentos com BTS, DMSO e EG, nas concentrações de 5%, não diferiram na quantidade de ERO (P>0.05). Os tratamentos com DMSO 10, 15 e 20% obtiveram os melhores resultados de integridade de membrana (P<0.05). A Funcionalidade mitocondrial foi semelhante nos grupos com DMSO 10 e 15% e EG 5% (P>0,05). Todos os tratamentos mantiveram a integridade do DNA (P>0,05). O DMSO 10% apresentou melhores médias de motilidade (taxa e tempo), sendo essas de 24% e de 160 segundos. O DMSO 10% foi o tratamento mais eficiente na criopreservação seminal de G. brasiliensis. / The Geophagus brasiliensis fish, Brazilian native is commercially exploited as ornamental fish, and may in the future have reduced the natural stocks. Thus, cryopreservation can ensure the survival and genetic diversity of this and other native species. The aim of this study was to test the efficiency of the cryoprotectant dimethyl sulfoxide, ethylene glycol and glycerol in semen G. brasiliensis, using the sperm motility parameters (rate and time), membrane and DNA integrity, mitochondrial function and reactive oxygen species (ROS). The fishes (n = 12) were obtained from fishermen of the Patos Lagoon, The semen was collected by abdominal massage and diluted (1:9 v / v) in Betsville Thawing Solution (BTS) for evaluation of sperm parameters. The samples were diluted in cryoprotectant treatments, DMSO, EG and GLI at different concentrations (5, 10, 15 and 20%) and frozen in Dryshipper and subsequently stored in liquid nitrogen (-196 ° C) for at least 15 days. Subsequently thawed in a water bath at 37 ° C for 8 seconds and remade sperm analysis. All analyzes were performed by flow cytometry, except motility (rate and time) analyzed by phase contrast microscopy. The results were evaluated statistically in Statistix 9.0 (2008) program. Treatments with BTS, EG and DMSO, at concentrations of 5%, did not differ in the amount of ROS (p> 0.05). Treatment with DMSO 10, 15 and 20% achieved the best results of membrane integrity (P <0.05). Mitochondrial functionality was similar in the groups with 10 and 15% DMSO and 5% EG (P> 0.05). All treatments were maintained the integrity of DNA (P> 0.05). The 10% DMSO showed better average motility (rate and time) which are 24% and 160 seconds. DMSO 10% was the most effective treatment cryopreservation of semen in G. brasiliensis.

Submitted by Mario BC (mario@bc.ufrpe.br) on 2018-06-13T13:25:06Z No. of bitstreams: 1 Lucia Cristina Pereira Arruda.pdf: 996319 bytes, checksum: 616f336889e4a925389d4de5babc78e7 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-06-13T13:25:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lucia Cristina Pereira Arruda.pdf: 996319 bytes, checksum: 616f336889e4a925389d4de5babc78e7 (MD5) Previous issue date: 2018-02-23 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / Ram semen was diluted (200 x 106 sperm/mL) in Tris-egg yolk (5% glycerol), added of myicetin (0.1, 10, 20, 30, 40, 100, 200, 300, 400 and 1000 nM) and frozen (-196 ° C). After thawing (37°C/30s), kinetics, iMPA, PMM, iROS, LPO, eMP and fertility in vivo (0 and 100 nM myricetin) were evaluated. The analyzes of 0, 1, 10, 100 and 1000 nM of myricetin showed: 10nM myricetin showed lower % RAP (P≤0.05), than 1000nM. Samples of control showed higher (P≤0.05) VAP than 10nM, while samples with 10, 100 and 1000nM of myicetin showed higher BCF (P≤0.05), when compared to control. Miricetin 1000nM presented higher percentage (P <0.05) of cells with LPO, than the control. For 0, 20, 30, 40, 100, 200, 300 and 400 here was no treatment effect (P>0.05) for kinetics and flow cytometry (P> 0.05), there were also no interactions between treatment and time (P> 0.05). For both there was effect of the incubation time, in some evaluated parameters, the PM, VCL, VSL, VAP, LIN, ALH, percentage of cells with intact plasma and acrosomal membrane, oxidative stress and membrane stability were reduced (P <0.05) in all groups, while BCF (P <0.05) increased in all groups.. The pregnancy rate in the 100 nM myricetin group was 50% (5/10) and that of the 10% control (1/10). In the in vitro analysis, it was concluded that myricetin has no antioxidant effect on cryopreserved spermatozoa. However, it improves the pregnancy rate of inseminated sheep. / Sêmen ovino foi diluído (200 x 106 espermatozoides/mL) em Tris-gema de ovo (5% de glicerol), acrescido de miricetina (0, 1, 10, 20, 30, 40, 100, 200, 300, 400 e 1000 nM) e congelado (-196 °C). Após descongelação (37°C/30s), avaliou-se cinética, iMPA, PMM, iROS, LPO, eMP e fertilidade in vivo (0 e 100 nM miricetina). As analises de 0, 1, 10, 100 e 1000 nM de miricetina evidenciaram: miricetina 10nM apresentou menor %RAP (P≤0,05), do que 1000nM. Amostras do controle apresentaram maior (P≤0,05) VAP que o 10nM, enquanto amostras com 10, 100 e 1000nM de miricetina evidenciaram maior BCF (P≤0,05), quando comparadas ao controle. Miricetina 1000nM apresentou maior percentual (P<0,05) de células com LPO, do que o controle. Para 0, 20, 30, 40, 100, 200, 300 e 400 não houve efeito do tratamento (P>0,05) para cinética e citometria de fluxo (P>0,05), também não houve interações entre tratamento x tempo (P>0,05). Para ambos houve efeito do tempo de incubação, em alguns parâmetros avaliados a MP, VCL, VSL, VAP, LIN, ALH, porcentual de células com membrana plasmática e acrossomal intactas, estresse oxidativo e estabilidade de membrana foram reduzidos (P <0,05) em todos os grupos, enquanto que o BCF (P <0,05) aumentou em todos os grupos. A taxa de prenhez no grupo 100 nM de miricetina foi de 50% (5/10) e a do controle 10% (1/10). Nas análises in vitro, conclui-se que a miricetina não tem efeito antioxidante sobre os espermatozoides criopreservados. No entanto, melhora a taxa de prenhez de ovelhas inseminadas.

A composição dos lipídeos de membrana está entre os fatores que podem influenciar a capacidade fecundante do espermatozoide. Sabidamente os lipídeos desempenham papéis indispensáveis na membrana dos espermatozoides, participando dos processos de interação entre gametas e influenciando o comportamento físico-químico dos espermatozoides durante os procedimentos de criopreservação. Estas moléculas apresentam uma ampla gama de propriedades químicas que tornam complexa a sua análise. Atualmente a espectrometria de massas (MS) por ionização e dessorção a laser assistida por matriz (MALDI) representa uma potente ferramenta para a análise de lipídeos. Assim, a proposta deste trabalho buscou verificar a ocorrência de diferença no perfil lipídico de espermatozoides bovinos obtidos por MALDI utilizado técnica de análise direta dos espermatozoides e análise após a extração lipídica pelo método de Bligh e Dyer. Além disso, este trabalho analisou o perfil lipídico de espermatozóides bovinos que receberam ou não suplementação de antioxidantes. Após coleta, lavagem e separação dos espermatozoide, estes foram submetidos à extração lipídica ou destinados íntegros à obtenção do perfil lipídico (método direto). O perfil lipídico do extrato lipídico ou de espermatozoides íntegros foi adquirido por MALDI em modo positivo e com matriz DHB (ácido dihidroxibenzoico). A análise dos dados foi realizado com o software Metaboanalist utilizando ferramentas de análise multivariada (análise de componentes principais - PCA) e de identificação de íons com intensidade diferencial entre grupos de comparação (teste t, volcano plot). Com essas análises foi possível identificar que ocorre diferença no perfil lipídico dos espermatozoides bovinos quando obtidos a partir de análise direta ou extração de lipídeos. Não foram observadas diferentes entre grupos submetidos ou não à suplementação com vitaminas. O método direto é capaz de proporcionar um perfil lipídico representativo e de fácil aquisição. / The membrane lipid composition is amongst the factors that influence the fertilization competence of the spermatozoa. It is also known that lipids play fundamental roles at spermatozoa membranes, participating in many processes, such as spermatozoaoocyte interaction and determining the physical-chemical behavior of spermatozoa membranes during cryopreservation. These molecules show a wide range of chemical properties, making complex its analysis. Currently, mass spectrometry (MS) through matrix-assisted laser desorption ionization (MALDI) represents a powerful tool for lipids analysis. Hence, this proposal aimed to evaluate differences in bovine spermatozoa lipid profile obtained through MALDI using direct sample analysis of spermatozoa or analysis of spermatozoa lipid extract obtained by Bligh-Dyer technique. Moreover, this proposal evaluated lipid profile of spermatozoa from bull that received or not antioxidant supplementation. After collection, washing and separation, the spermatozoa were submitted to lipid extraction or straightforward destined to lipid profile acquisition (direct method). The lipid profiles of spermatozoa lipid extracts or from whole spermatoloza were obtained by MALDI in positive mode with DHB matrix (dihydrozybenzoic acid). Data analysis was performed with Metaboanalyst software using multivariated analysis (Principal component analysis - PCA) and tools for identification of differential ions between comparison groups (t-test, volcano plot). Results show differences in spermatozoa lipid profile obtained by direct method or after lipid extraction. No differences were observed in bovine spermatozoa derived from bulls supplemented or not with vitamins. The direct method can generate a representative and easily obtained lipid profile.

Durante o processo de criopreservação o espermatozoide passa por diversas mudanças físico-químicas, podendo ocasionar variados graus de lesões as células espermáticas. Determinar o momento do processo de congelação pelo qual o espermatozoide está mais suscetível às injúrias seria importante passo para progresso do processo de congelação e, com isso, a fertilização. O objetivo foi avaliar o efeito do processo de congelação na integridade das membranas plasmática, acrossomal e potencial mitocondrial (PIAIA) integridade das membranas plasmática (MPI), acrossomal (AI), potencial mitocondrial (APM) e citoesqueleto de espermatozoides equinos in natura diluído, 5°C, -55°C e -196°C. Além de, estudar as etapas de refrigeração, congelação e dentro da congelação, a etapa de supercooling. Assim como, verificar o efeito de duas curvas de congelação (-15°C/min e -33°C/min) durante o supercooling 5°C à -55°C, para isto, foram utilizadas duas máquinas de congelação modelo TK 3000. Para desenvolvimento do experimento, o sêmen foi envasado em palhetas de 0,5mL com concentrações de 100x106 espermatozoides/palheta e submetidos a uma curva 1 (rápida; -0,25°C/min de 22°C até 5°C, com período de 20 minutos para estabilização, -33°C/min de 5°C até -80°C e, -10°C/min de -80°C para -120°C) e a outra para uma curva 2 (lenta; -0,25°C/min de 22°C até 5°C, com período de 20 minutos para estabilização, -15°C/min de 5°C até -80°C e, -10°C/min de -80°C até -120°C). Para realização do experimento foram utilizados 4 garanhões com 6 repetições. Os dados obtidos dos procedimentos experimentais foram analisados com auxílio do software Statistical Analysis System for Windows SAS&reg;, versão 9.3 (SAS, 2005). Não houve diferença estatística significativa (P&gt;0,05) entre as duas curvas de congelação usadas. No entanto, houve efeito de tempo (P&lt;0,05) para todas as características estudadas. Quando foi analisado progressivamente a criopreservação in natura diluído, 5°C, -55°C e -196°C, foi observado que as lesões progrediram com a congelação. Entretanto, quando estudado, as etapas do processo de congelação, a refrigeração in natura diluído até 5°C, supercooling dentro da congelação de 5°C até -55°C e congelação -55°C até -196°C, assim, o citoesqueleto sofreu maior despolimerização durante a refrigeração, entretanto, a membrana acrossomal, sofreu danos reduzidos durante esta etapa. Para MPI e APM ocorreu maior porcentagem de redução da integridade no momento final da congelação -55°C até -196°C, assim, como PIAIA influenciada pela redução de MPI e APM, sofrerem mais injúrias, nessa etapa. De uma forma geral, o processo de congelação causa danos irreversíveis ao espermatozoide equino. Sendo que, a refrigeração causou maior despolimerização do citoesqueleto, porém, praticamente não afetou o acrossomo. A redução de células com MPI, APM e PIAIA, ocorre no momento final da congelação -55°C e -196°C. O acrossomo é a membrana que menos lesa com o processo de congelação. Também, observamos similaridade entre as curvas de congelação rápida (-33°C/min) e lenta (-15°C/min), para os parâmetros estudados. Assim, este estudo permitiu avaliar progressivamente a resposta biológica do espermatozoide durante a criopreservação, obtendo um compreensão dinâmica e quantitativa, dos momentos mais críticos para o espermatozoide, para as características avaliadas e técnicas utilizadas. / During the cryopreservation process the sperm cells undergo several physico-chemical changes, which can cause varying degrees of injury to the sperm cells. Determining the timing of the freezing process by which sperm is most susceptible to injury would be an important step in progressing the freezing process and thus fertilization. The objective was to evaluate the effect of the freezing process on the integrity of plasma membranes, acrosomal and mitochondrial potential (PIAIA) plasma membranes integrity (MPI), acrosomal (AI), mitochondrial potential (APM) and equine spermatozoa diluted in natura, 5°C, -55°C and -196°C. In addition to, study the steps of refrigeration, freezing and within freezing, the stage of supercooling. The freezing curves -15°C/min and -33°C/min during supercooling 5°C to -55°C were used to verify the effect of two freezing machines model TK 3000. For the development of the experiment, the semen was packed in 0.5mL straw with concentrations of 100x106 spermatozoa/straws and su-mitted to a curve 1 (fast; -0.25°C/min from 22°C to 5°C, with a period of 20 minutes for stabi-lization, -33°C/min from 5°C to -80°C and -10°C/min from -80°C to -120°C) and the other for a curve 2 (with a period of 20 minutes for stabilization, -15°C/min from -5°C to -80°C and -10°C/min from -80°C to -120°C). For the experiment, 4 stallions with 6 replicates were used. The data obtained from the experimental procedures were analyzed with the aid of Statistical Analysis System for Windows SAS&reg;, version 9.3 (SAS, 2005). There was no significant statistical difference (P&gt; 0.05) between the two freezing curves used. However, there was a time effect (P &lt;0.05) for all the characteristics studied. When cryopreservation was progressively analyzed (semen extender, 5°C, -55°C and -196°C), it was observed that the lesions progressed with freezing. However, when studied, the steps of the freezing process, refrigeration (in natura diluted to 5°C), supercooling within freezing 5°C to -55°C and freezing -55°C to -196°C, thus, the cytoskeleton underwent greater depolymerization during refrigeration; however, the acrosomal membrane was almost not damaged during this stage. For MPI and APM, a higher percentage of integride reduction occurred at the final freezing point -55°C to -196°C, thus, as PIAIA, probably due to MPI and APM, suffered more injuries at this stage. In general, the freezing process causes irreversible damage to the equine sperm. Since, the refrigeration caused greater depolymerization of the cytoskeleton, however, it practically did not affect the acro-some. The reduction of cells with MPI, APM and PIAIA, occurs at the final moment of freezing -55°C and -196°C. The acrosome is the membrane that suffepe damages from freezing process. Also, similarities were observed between the freezing (-33°C/min) and slow (-15°C/min) freezing curves for the studied parameters. Thus, this study allowed to progressively evaluate the spermatozoid biological response during cryopreservation, obtaining a dynamic and quantita-tive understanding of the most critical mommies for the spermatozoon, for the evaluated para-meters and techniques used.

Orientador: João Carlos Pinheiro Ferreira / Resumo: O uso do sêmen refrigerado proporciona maiores taxas de prenhez se comparado ao do sêmen congelado. Essa diferença parece estar relacionada às lesões mais severas das membranas espermáticas desencadeadas pelo processo de congelação. Por sua habilidade de se ligar às proteínas ligadoras de espermatozoides e ao íon cálcio, o caseinato de sódio vem sendo estudado como uma substância capaz de inibir a capacitação espermática precoce, uma importante causa de diminuição da taxa de prenhez quando do uso de sêmen congelado. O primeiro objetivo deste estudo foi avaliar a possibilidade de um diluente comercial a base de gema de ovo, destinado à congelação de sêmen bovino, ser empregado para a criopreservação de sêmen bubalino; o segundo objetivo foi investigar o efeito do uso desse diluente, suplementado com caseinato de sódio, na criopreservação de espermatozoides bubalinos, por meio da avaliação dos espermatozoides, por citometria de fluxo, e da cinética espermática, empregando-se o sistema CASA. Na primeira parte do estudo, quando comparados os resultados das avaliações da cinética espermática e integridade das membranas plasmática e acrossomal, observou-se que o processo de congelação seminal promoveu mais danos celulares que o processo de refrigeração. Na segunda parte do estudo, não foram observados efeitos da adição do caseinato de sódio ao diluente a base de gema de ovo. A partir dos resultados do presente estudo foi possível concluir que o diluente a base de gema de ovo testad... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The use of cooled semen results in higher pregnancy rates compared than the use of frozen semen. This result seems to be related to the more severe damages triggered by the freezing process, when compared to those observed during the refrigeration. Due to its ability to bind to sperm-binding proteins and calcium ions, sodium caseinate has been studied as a ubstance capable to prevent early sperm capacitation, a major cause of decreased pregnancy rate after using frozen semen. The first objective of this study was to evaluate if a commercial egg yolk diluent developed for freezing bovine semen could be used for buffalo semen cryopreservation; the second objective was to investigate the effect of this diluent, added with sodium caseinate, during the procedures of buffalo sperm cryopreservation, using flow cytometry and computer-assisted sperm analysis. In the first part of the study, comparing the results of spermatic kinetics and plasma and acrosomal membranes integrity, it was observed that the freezing process resulted in more cell damage than the cooling process. In the second part of the study, no effects of the addition of sodium caseinate to the egg yolk diluent were observed. From the results of the present study it was possible to conclude that the egg yolk-based diluent was suitable for buffalo semen cryopreservation and that the addition of sodium caseinate did not decrease the deleterious effects related to seminal cryopreservation. / Mestre

El glicocálix espermático es una estructura altamente compleja desde el punto de vista estructural, composicional y funcional. En este contexto, la presencia y localización de los componentes que conforman el glicocálix espermático ha sido descrita en diferentes especies de mamíferos utilizando mayoritariamente lectinas. De igual forma, se han registrado cambios en los patrones de unión a lectinas durante eventos fisiológicos del espermatozoide como la capacitación o la reacción acrosómica. El objetivo de este trabajo fue caracterizar los sitios de unión a lectinas en espermatozoides de diferentes especies de mamíferos y describir los cambios que se producen durante ciertos eventos fisiológicos como la capacitación o la reacción acrosómica. En una primera fase, se identificaron los patrones de unión a lectinas en el delfín mular (Tursiops truncatus) antes y después de la capacitación in vitro. Como resultados, se obtuvo que los patrones de unión mayoritarios para las lectinas Peanut agglutinin (PNA) y Wheat germ agglutinin (WGA) cambiaban tras la capacitación in vitro. Por el contrario, los patrones de unión mayoritarios para las lectinas Aleuria aurantia agglutinin (AAA) y Concanavalin A (Con A) no sufrieron cambios tras la capacitación. En una segunda fase, se analizaron los sitios de unión para las lectinas PNA, WGA, AAA, Con A y Pisum sativum agglutinin (PSA) en espermatozoides de cerdo (Sus scrofa) antes y después de la capacitación in vitro y tras la inducción de la reacción acrosómica, después de la incubación durante 1 y 4 h en un medio capacitante. De esta forma, los patrones de unión a lectinas cambiaron mayoritariamente en aquellos espermatozoides sometidos a la inducción de la reacción acrosómica tras 4 h de incubación en un medio capacitante. En la tercera fase, se utilizó una técnica novedosa mediante microscopía electrónica de barrido de emisión de campo (FE-SEM) para evaluar los cambios cuantitativos y cualitativos en los sitios de unión a la lectina Con A tras la capacitación in vitro durante 1 y 4 h en espermatozoides humanos. Como resultado, se registró una disminución progresiva y significativa de los sitios de unión a Con A a lo largo del tiempo de capacitación y una redistribución hacia la zona apical de la región acrosomal. La metodología anteriormente mencionada fue utilizada para valorar los cambios en los sitios de unión de la lectina AAA en el espermatozoide humano durante la cuarta fase. De esta forma, se observó una disminución progresiva de los sitios de unión a AAA durante la capacitación in vitro.

O presente trabalho foi composto de dois estudos distintos. O Estudo I, com um foco conservacionista, teve como objetivo a avaliação e comparação de diferentes métodos de criopreservação de sêmen de bugio-preto (Alouatta caraya). Para tanto, o estudo foi dividido em dois experimentos: Experimento I composto de dois ensaios no primeiro ensaio foram comparados dois diluidores comerciais BotuBOV e Test-yolk buffer (TYB) e no segundo ensaio foram comparados dois métodos de criopreservação de sêmen congelação lenta e vitrificação; Experimento II avaliação dos efeitos da adição de DHA e de Trolox (análogo da vitamina E) ao diluidor para criopreservação de sêmen. O diluidor TYB apresentou melhores resultados quando comparados ao BotuBOV. A congelação lenta apresentou melhores resultados quando comparada à vitrificação. Não houve diferença entre o diluidor controle e os diluidores com Trolox, DHA ou combinação dos dois (DHAT), com exceção da integridade de acrossoma, que foi significativamente menor para o diluidor DHAT. Conclui-se que são necessários mais estudos, com utilização de outras doses de DHA e Trolox, além de outros antioxidantes. O Estudo II, com foco em pesquisa biomédica, teve como objetivo a criopreservação de sêmen de macaco-rhesus (Macaca mulata) e avaliação da qualidade pós-descongelação por meio de fecundação in vitro (FIV). Para tanto, o estudo foi dividido em três experimentos: Experimento I avaliação e comparação de dois métodos de criopreservação de sêmen congelação lenta e vitrificação; Experimento II avaliação e comparação de quatro métodos de preparação do sêmen pós-descongelação lavagem simples (LS), swim-up (SU), separação por gradiente de densidade (SGD) e filtragem em lã de vidro (FLV); Experimento III avaliação da qualidade seminal pós-descongelação por meio de FIV. A congelação lenta apresentou melhores resultados que a vitrificação (p<0,05). LS apresentou os melhores resultados, seguido por SGD e SU, enquanto FLV apresentou os piores resultados. LS e SGD foram utilizados para avaliação da qualidade seminal por meio de FIV, utilizando sêmen fresco como controle. As taxas de fecundação (média±EPM%) para oócitos MI inseminados com sêmen fresco (43.5±16.4) foram significativamente maiores (p<0,05) que LS (2.0±2.0), mas não diferiram de SGD (25.1±14.2). Não houve diferença na taxa de blastocistos (média±EPM%) entre os tratamentos (variação de 0 a 11.9±7.9). As taxas de fecundação para oócitos MII inseminados com sêmen fresco (41.4±3.6) também foram significativamente maiores que SGD e LS (18.4±6.9 e 12.7±7.7, respectivamente), assim como a taxa de blastocistos (64.7±13.6; 4.7±4.7; 30.9±13.8, respectivamente). Conclui-se que, espermatozoides criopreservados foram capazes de fertilizar oócitos e os embriões atingiram o estágio de blastocisto. A SGD selecionou espermatozoides pós-descongelação de melhor qualidade para FIV em macacos-rhesus, quando comparada à LS / This work was divided in two studies. The objective of Study I was to test and compare different cryopreservation methods for sperm from black-and-gold howler monkeys (Alouatta caraya), with a focus on species conservation. The study was divided in two experiments. Experiment I composed of two trials the first trial compared two commercial extenders BotuBOV and Test-yolk buffer (TYB), and the second trial compared two cryopreservation methods slow freezing and vitrification; Experiment II evaluation of the effects of DHA and Trolox (vitamin E analog) as additives to the freezing extender. TYB had better results when compared to BotuBOV. Slow freezing had better results when compared to vitrification. There was no difference between control extender (TYB) and extender containing Trolox, DHA or a combination of both (DHAT), except for acrosome integrity, which was significantly lower for DHAT. In conclusion, more studies are necessary, using other doses of DHA and Trolox, as well as other antioxidants. The objective of Study II was to assess the quality of frozen-thawed sperm from rhesus macaques (Macaca mulatta) by in vitro fertilization (IVF). The study was divided in three experiments. Experiment I evaluation and comparison of two cryopreservation methods slow freezing and vitrification; Experiment II evaluation and comparison of four preparation methods for frozen-thawed sperm simple wash (SW), swim-up (SU), density gradient centrifugation (DGC), and glass wool filtration (GWF); and Experiment III evaluation of frozen-thawed sperm quality by IVF. Slow freezing had better results when compared to vitrification (p<0,05). SW had better results, followed by DGC and SU, while GWF had the worse results. SW and DGC were further evaluated by IVF. Fertilization rates (mean±SEM%) with MI oocytes using fresh sperm were significantly higher (43.5±16.4) than with SW (2.0±2.0) and did not differ from DGC (25.1±14.2). There was no difference in blastocyst rates between treatments (range 0 to 11.9±7.9). Fertilization rates with MII ova were also significantly higher with fresh sperm (41.4±3.6) than DGC and SW (18.4±6.9 and 12.7±7.7, respectively), and more blastocysts developed from MIIs fertilized with fresh sperm (64.7±13.6) than SW and DGC (4.7±4.7 and 30.9±13.8, respectively). In conclusion, frozen-thawed sperm were able to fertilize oocytes and embryos reached the blastocyst stage. DGC yielded better frozen-thawed sperm for IVF in rhesus macaques, when compared with SW

Este trabalho teve como objetivo principal avaliar o sêmen da jararaca ilhoa, Bothrops insularis, quanto ao volume, motilidade, vigor e concentração, além de verificar se estes paramentos estão relacionados ao comprimento ou massa dos animais ou se variam ao longo das estações, uma vez que esta espécie possui ciclo reprodutivo sazonal. Para tanto, foram avaliadas amostras de sêmen de 18 machos, com comprimento rostro-cloacal (CRC) variando de 43,5 a 73,70 cm, pertencentes ao plantel do Laboratório de Ecologia e Evolução do Instituto Butantan, entre os meses de agosto de 2012 e maio de 2013. O sêmen de Bothrops insularis apresentou coloração variando de esbranquiçada a amarelada e consistência cremosa e espessa. Foi possível observar amostras de sêmen viáveis em todos os 18 animais avaliados, indicando que animais com CRC igual ou acima de 43,5 cm já são sexualmente maduros. O espermatozoide de Bothrops insularis é filiforme, possui cabeça alongada, fina e com formato pontiagudo, seguindo o padrão morfológico descrito para outros Squamata. Não foi observada nenhuma relação entre o comprimento, massa e cada um dos parâmetros seminais avaliados. Foi observada variação significativa da motilidade e da concentração do sêmen de Bothrops insularis entre as estações, porém o volume e o vigor do sêmen não variaram. Foi no outono, época de cópula da espécie, que o sêmen apresentou as maiores médias para os parâmetros avaliados. / This study aimed to evaluate sperm parameters of the golden lancehead, Bothrops insularis, including appearance, sperm motility, vigor, volume and concentration, determine if these parameters varied with body size or weight and to verify whether these vestments vary throughout seasons, since this species has a seasonal reproductive cycle. Samples of semen of 18 males with snout-vent length (SVL) ranging from 43.5 to 73.70 cm, belonging to the squad of the Ecology and Evolution Laboratory at Instituto Butantan, were collected between August 2012 and May 2013. Sperm color from Bothrops insularis ranged from whitish to yellowish, and a creamy and thick consistency. Viable sperm was observed in samples from all 18 males evaluated, indicating that animals with SVL equal to or above 43.5 cm are sexually mature. Sperm of Bothrops insularis is thready, has elongated, thin and pointed shaped head, following the morphological pattern described for other Squamata. No relationship between length, mass and each of seminal parameters evaluated was observed. Significant variation of concentration and motility of semen from Bothrops insularis between seasons was observed, but volume and vigor did not change. It was during Fall, mating season of the species, that sperm had the highest means for all parameters evaluated.

A criopreservação do sêmen suíno ainda é um desafio devido a extensão dos danos causados pelo choque-frio. Os espermatozoides oriundos da fração rica do ejaculado suíno possuem a membrana plasmática mais estável, são mais resistentes ao choque-frio e a reação acrossomal precoce do que aqueles oriundo da fração total do ejaculado. Com isso, o uso do plasma seminal oriundo dessa fração do ejaculado suíno também poderia aumentar a criotolerância dos espermatozoides suínos e/ou reverter os danos oriundo da criopreservação. Entretanto, a grande maioria das técnicas de avaliação espermática inclui apenas um parâmetro de funcionalidade espermática. Por outro lado, quanto mais características espermáticas analisadas, mais fiel se torna a avaliação quanto ao potencial fertilizante da amostra. Nesse contexto, esse trabalho objetivou a validação de uma técnica de análise espermática por citometria de fluxo para a avaliação simultânea da integridade das membranas plasmática e acrossomal e potencial de membrana mitocondrial. Além de avaliar os efeitos da adição/manutenção do plasma seminal oriundo da fração rica do ejaculado suíno sobre a cinética espermática, integridade das membranas plasmática e acrossomal e potencial de membrana mitocondrial, fluidez e peroxidação das membranas espermáticas, fosforilação do aminoácido tirosina, taxa de fertilidade e de prenhez precoce. A técnica sugerida em nosso trabalho é capaz de detectar (R2 &#61; 0,9356; p &lt; 0,01) simultaneamente os espermatozoides com a membrana plasmática e acrossomal integras e alto potencial de membrana mitocondrial (PIAIA). O plasma seminal da fração rica do ejaculado suíno gera benefícios para a cinética espermática melhorando a motilidade total e progressiva dos espermatozoides descongelados (p &lt; 0,05). Por outro lado, a manutenção/adição de plasma seminal oriundo da fração rica do ejaculado suíno, não é capaz de alterar (p &gt; 0,05) os espermatozoides PIAIA, a fosforilação do aminoácido tirosina, a fluidez e a peroxidação das membranas espermáticas. Entretanto, essas características devem ser cuidadosamente interpretadas, uma vez que, a fluidez e a peroxidação das membranas espermáticas são alteradas (p &lt; 0,05) pelo processo de centrifugação. As taxas de fertilidade e de prenhez precoce também não foram influenciadas (p &gt; 0,05) pela adição de plasma seminal oriundo da fração rica do ejaculado suíno. Portanto, podemos concluir que o plasma seminal da fração rica possui efeito benéfico sobre a fisiologia dos espermatozoides pós-descongelação, melhorando a criopreservação do sêmen suíno. / Boar semen cryopreservation is still a challenge due to the extension of cold shock damage. Boar spermatozoa arising from sperm-rich ejaculate fraction are reported to have a more stable plasma membrane, more resistant to cold shock and premature acrosome reaction than spermatozoa from the whole ejaculate. Thus, seminal plasma arising from whole sperm-rich fraction can increase cryotolerance of boar spermatozoa, and in other domestic species it has the ability to reverse cryopreservation damage. However, the majority of actual sperm evaluation techniques include a single sperm parameter, which makes the sperm characterization of a single population difficult. In this context, this work was performed to validate a sperm flow cytometry fourfold coloration technique for the simultaneous evaluation of plasma and acrosomal membrane integrity and mitochondrial membrane potential. Furthermore, we evaluate the seminal plasma arising from whole sperm-rich fraction effects on sperm kinetics, plasma and acrosomal membrane integrity and mitochondrial membrane potential, tyrosine phosphorylation, membrane fluidity and peroxidation, fertility and early pregnancy rate. The proposed technique is able (R2 &#61; 0.9356; p &lt; 0.01) to simultaneous detection of plasma and acrosomal membrane integrity and high mitochondrial membrane potential (IPIAH). Seminal plasma arising from whole sperm-rich fraction is able to improve (p &lt; 0.05) total and progressive motility. Furthermore, seminal plasma arising from whole sperm-rich fraction maintenance/addition was not able to improve (p &gt; 0.05) the IPIAH sperm population, tyrosine phosphorylation, membrane fluidity and peroxidation. However, these sperm characteristics need to be carefully interpreted, once, membrane fluidity and peroxidation could be influenced (p &lt; 0.05) by centrifugation. Fertility and early pregnancy rate we not improved (p &gt; 0.05) by seminal plasma addition. Therefore, we concluded that sperm fourfold coloration can be used to evaluate simultaneously plasma and acrosomal membranes integrity and mitochondrial membrane potential and that whole sperm-rich fraction seminal plasma can be beneficial to post-thawed sperm physiology, thereby improving boar semen cryopreservation.

A filogenia dos diferentes grupos de Cnidaria permanece de certa forma pouco resolvida, uma vez que não há um consenso de quais são as relações entre as diferentes classes e ordens que compõem o filo. A espermiotaxonomia vem sendo utilizada como critério filogenético em diversos grupos de Metazoa. Para Cnidaria são poucos os trabalhos descrevendo a morfologia do sistema reprodutor masculino e do espermatozoide em nível de microscopia de luz e de microscopia eletrônica de transmissão. Exemplares das espécies Tamoya haplonema e Chiropsalmus quadrumanus (Cubozoa), Lychnorhiza lucerna e Chrysaora lactea (Scyphozoa), foram coletados próximos ao Centro de Biologia Marinha da Universidade de São Paulo e junto às bases do Instituto Oceanográfico da USP (Base de Cananéia e Base de Ubatuba) nos meses de agosto a outubro de 2014 e de abril a junho de 2015. Amostras das espécies Carukia barnesi, Chironex fleckeri e Chiropsella bronzie (Cubozoa) e Cassiopea sp. (Scyphozoa) foram coletadas ao longo da costa leste australiana de março a maio de 2016. Para a descrição histológica e histoquímica da gônada masculina, amostras do tecido gonadal foram fixadas em paraformaldeído 4% preparado com água do local da coleta e tampão fosfato de sódio 0,2M por 24 horas e as amostras foram processadas de acordo com o protocolo para historesina. Fragmentos da gônada masculina foram fixados em solução Karnovsky modificado (glutaraldeído 2,5% e 0,08% de paraformaldeído em tampão cacodilato de sódio 0,1 M, pH 7,4) e solução de Glutaraldeído (2.5% glutaraldeido em tampão cacodilato de sódio 0.1M em água do mar filtrada a vácuo, pH 7.2-7.4). Em seguida as amostras foram processadas de acordo com protocolo de microscopia eletrônica transmissão. Na presente dissertação é descrito de forma comparada o processo de espermatogênese dos cubozoários T. haplonema e C. quadrumanus através da histologia e histoquímica evidenciando o ciclo gonadal de ambos (capítulo 1). Descreve-se a espermatogênese e morfologia do espermatozoide, através da microscopia de luz e ultraestrutura para as espécies de Cubozoa T. haplonema, C. quadrumanus, Carukia barnesi, Chironex fleckeri e Chiropsella bronzie (Capítulo 2). Para as espécies de Scyphozoa Lychnorhiza lucerna, Chrysaora lactea e Cassiopea sp. descreve-se o processo de espermatogênese através da microscopia de luz e da microscopia eletrônica de transmissão, além do aspecto macroscópico da gônada masculina (Capítulo 3). Adicionalmente, nas considerações finais, é ressaltada a morfologia comparada dos espermatozoides de todas as espécies aqui estudadas evidenciando possíveis características únicas de cada classe, enumerando eventuais caracteres diagnósticos dos espermatozoides das espécies estudadas (Capítulo 4) / The phylogeny of the different groups of cnidarians remains elusive, since there is no consensus of what are the relationships between the different classes and orders that comprise the phylum. The spermiotaxonomy has been used as phylogenetic criteria in different groups of Metazoa. For Cnidaria there are few studies describing the morphology of the male reproductive system and sperm at the level of light microscopy and transmission electron microscopy. Specimens of the species Tamoya haplonema and Chiropsalmus quadrumanus (Cubozoa), Lychnorhiza lucerna and Chrysaora lactea (Scyphozoa), were collected near the Marine Biology Center of the University of São Paulo and near the bases of the Oceanographic Institute of USP (Cananéia and Ubatuba Bases) from August to October 2014 and from April to June 2015. Samples of the species Carukia barnesi, Chironex fleckeri and Chiropsella bronzie (Cubozoa) and Cassiopea sp. (Scyphozoa), were collected along the Australian east coast from March to May 2016. For histological and histochemistry description of the male gonads, samples were fixed in 4% paraformaldehyde prepared with water from the collection site and sodium phosphate buffer 0.2M for 24 hours. After that, the samples were processed following the protocol for historesin. Fragments of male gonads were fixed in modified Karnovsky solution (2.5% glutaraldehyde and 0.08% paraformaldehyde in 0.1 M sodium cacodylate buffer, pH 7.4) and glutaraldehyde (2.5% glutaraldehyde in cacodylate buffer 0.1M sodium in seawater vacuum Millipore filtered, pH 7.2-7.4). Then the samples were processed according to transmission electronic microscopy protocol. In this dissertation it is described the comparative spermatogenesis of the cubozoans T. haplonema and C. quadrumanus, under histology and histochemistry, showing the gonadal cycle (Chapter 1). We also describe the spermatogenesis and sperm morphology, under light microscopy and ultrastructure, for the Cubozoa species T. haplonema, C. quadrumanus, Carukia barnesi, Chironex fleckeri and Chiropsella bronzie (Chapter 2). For the Scyphozoa species, Lychnorhiza lucerna, Chrysaora lactea and Cassiopea sp., we describe the spermatogenesis process, under light transmission electronic microscopy, describing the macroscopic structure of the male gonad (Chapter 3). Additionally, in the final chapter, it is highlighted the comparative morphology of sperm of all species studied, evidencing possible unique features of each class, enumerating possible sperm characters (Chapter 4)