Durante o processo de criopreservação o espermatozoide passa por diversas mudanças físico-químicas, podendo ocasionar variados graus de lesões as células espermáticas. Determinar o momento do processo de congelação pelo qual o espermatozoide está mais suscetível às injúrias seria importante passo para progresso do processo de congelação e, com isso, a fertilização. O objetivo foi avaliar o efeito do processo de congelação na integridade das membranas plasmática, acrossomal e potencial mitocondrial (PIAIA) integridade das membranas plasmática (MPI), acrossomal (AI), potencial mitocondrial (APM) e citoesqueleto de espermatozoides equinos in natura diluído, 5°C, -55°C e -196°C. Além de, estudar as etapas de refrigeração, congelação e dentro da congelação, a etapa de supercooling. Assim como, verificar o efeito de duas curvas de congelação (-15°C/min e -33°C/min) durante o supercooling 5°C à -55°C, para isto, foram utilizadas duas máquinas de congelação modelo TK 3000. Para desenvolvimento do experimento, o sêmen foi envasado em palhetas de 0,5mL com concentrações de 100x106 espermatozoides/palheta e submetidos a uma curva 1 (rápida; -0,25°C/min de 22°C até 5°C, com período de 20 minutos para estabilização, -33°C/min de 5°C até -80°C e, -10°C/min de -80°C para -120°C) e a outra para uma curva 2 (lenta; -0,25°C/min de 22°C até 5°C, com período de 20 minutos para estabilização, -15°C/min de 5°C até -80°C e, -10°C/min de -80°C até -120°C). Para realização do experimento foram utilizados 4 garanhões com 6 repetições. Os dados obtidos dos procedimentos experimentais foram analisados com auxílio do software Statistical Analysis System for Windows SAS®, versão 9.3 (SAS, 2005). Não houve diferença estatística significativa (P>0,05) entre as duas curvas de congelação usadas. No entanto, houve efeito de tempo (P<0,05) para todas as características estudadas. Quando foi analisado progressivamente a criopreservação in natura diluído, 5°C, -55°C e -196°C, foi observado que as lesões progrediram com a congelação. Entretanto, quando estudado, as etapas do processo de congelação, a refrigeração in natura diluído até 5°C, supercooling dentro da congelação de 5°C até -55°C e congelação -55°C até -196°C, assim, o citoesqueleto sofreu maior despolimerização durante a refrigeração, entretanto, a membrana acrossomal, sofreu danos reduzidos durante esta etapa. Para MPI e APM ocorreu maior porcentagem de redução da integridade no momento final da congelação -55°C até -196°C, assim, como PIAIA influenciada pela redução de MPI e APM, sofrerem mais injúrias, nessa etapa. De uma forma geral, o processo de congelação causa danos irreversíveis ao espermatozoide equino. Sendo que, a refrigeração causou maior despolimerização do citoesqueleto, porém, praticamente não afetou o acrossomo. A redução de células com MPI, APM e PIAIA, ocorre no momento final da congelação -55°C e -196°C. O acrossomo é a membrana que menos lesa com o processo de congelação. Também, observamos similaridade entre as curvas de congelação rápida (-33°C/min) e lenta (-15°C/min), para os parâmetros estudados. Assim, este estudo permitiu avaliar progressivamente a resposta biológica do espermatozoide durante a criopreservação, obtendo um compreensão dinâmica e quantitativa, dos momentos mais críticos para o espermatozoide, para as características avaliadas e técnicas utilizadas. / During the cryopreservation process the sperm cells undergo several physico-chemical changes, which can cause varying degrees of injury to the sperm cells. Determining the timing of the freezing process by which sperm is most susceptible to injury would be an important step in progressing the freezing process and thus fertilization. The objective was to evaluate the effect of the freezing process on the integrity of plasma membranes, acrosomal and mitochondrial potential (PIAIA) plasma membranes integrity (MPI), acrosomal (AI), mitochondrial potential (APM) and equine spermatozoa diluted in natura, 5°C, -55°C and -196°C. In addition to, study the steps of refrigeration, freezing and within freezing, the stage of supercooling. The freezing curves -15°C/min and -33°C/min during supercooling 5°C to -55°C were used to verify the effect of two freezing machines model TK 3000. For the development of the experiment, the semen was packed in 0.5mL straw with concentrations of 100x106 spermatozoa/straws and su-mitted to a curve 1 (fast; -0.25°C/min from 22°C to 5°C, with a period of 20 minutes for stabi-lization, -33°C/min from 5°C to -80°C and -10°C/min from -80°C to -120°C) and the other for a curve 2 (with a period of 20 minutes for stabilization, -15°C/min from -5°C to -80°C and -10°C/min from -80°C to -120°C). For the experiment, 4 stallions with 6 replicates were used. The data obtained from the experimental procedures were analyzed with the aid of Statistical Analysis System for Windows SAS®, version 9.3 (SAS, 2005). There was no significant statistical difference (P> 0.05) between the two freezing curves used. However, there was a time effect (P <0.05) for all the characteristics studied. When cryopreservation was progressively analyzed (semen extender, 5°C, -55°C and -196°C), it was observed that the lesions progressed with freezing. However, when studied, the steps of the freezing process, refrigeration (in natura diluted to 5°C), supercooling within freezing 5°C to -55°C and freezing -55°C to -196°C, thus, the cytoskeleton underwent greater depolymerization during refrigeration; however, the acrosomal membrane was almost not damaged during this stage. For MPI and APM, a higher percentage of integride reduction occurred at the final freezing point -55°C to -196°C, thus, as PIAIA, probably due to MPI and APM, suffered more injuries at this stage. In general, the freezing process causes irreversible damage to the equine sperm. Since, the refrigeration caused greater depolymerization of the cytoskeleton, however, it practically did not affect the acro-some. The reduction of cells with MPI, APM and PIAIA, occurs at the final moment of freezing -55°C and -196°C. The acrosome is the membrane that suffepe damages from freezing process. Also, similarities were observed between the freezing (-33°C/min) and slow (-15°C/min) freezing curves for the studied parameters. Thus, this study allowed to progressively evaluate the spermatozoid biological response during cryopreservation, obtaining a dynamic and quantita-tive understanding of the most critical mommies for the spermatozoon, for the evaluated para-meters and techniques used.

No presente trabalho estudou-se o perfil bioquímico do plasma seminal bem como o perfil metabólico de touros Nelore com degeneração testicular. O estudo está apresentado em dois artigos. No Artigo 1, o objetivo foi investigar alguns metabólitos do plasma seminal de touros da raça Nelore para caracterizar valores e avaliar sua relação com as características espermáticas. Foram realizadas 14 colheitas seminais, com intervalos semanais, de 11 touros (n=154). O sêmen foi avaliado para motilidade, vigor, concentração, integridade das membranas plasmática e acrossomal, potencial de membrana mitocondrial, morfologia e pH. O plasma seminal foi submetido às avaliações metabólicas de proteína total, albumina, gama glutamil transferase (GGT), aspartato aminotransferase (AST), alanina aminotransferase (ALT) e fosfatase alcalina (FA). Os dados foram analisados no programa do Statistical Analysis System (SAS Institute Inc., 2004), sendo realizadas estatística descritiva e análise de correlação de Pearson, o nível de significância considerado foi de 5%. Os valores dos metabólitos encontrados no plasma seminal foram descritos e podem ser utilizados como referência para touros Nelore. Também se pode concluir que há relação entre o perfil metabólico do plasma seminal e as características espermáticas. No Artigo 2, o objetivo foi investigar a bioquímica séria e do plasma seminal de touros Nelore com degeneração testicular. Para isso, foram utilizados 22 touros, que foram distribuídos em dois grupos: Grupo Controle (CON; n=11) e Grupo Degeneração (DEG; n=11). Foram realizadas 14 colheitas de sêmen, e 21 colheitas de sangue com intervalos semanais. As avaliações seminais e do plasma seminal foram as mesmas realizadas no estudo do artigo 1 e o sangue foi avaliado quanto às concentrações de proteína total, albumina, fibrinogênio, GGT, AST, creatina-quinase (CK), glicose, lipoproteína de alta densidade (HDL), colesterol, triglicérides, beta-hidroxibutirato (BHB) e ácidos graxos não esterificados (NEFA). Os dados foram submetidos à Análise de Variância, sendo adicionado o fator medidas repetidas no tempo, utilizando-se o comando REPEATED gerado pelo PROC MIXED do SAS, com nível de significância de 5%. Pode-se afirmar que a degeneração testicular em touros Nelore causa elevação de pH do sêmen, bem como elevação da concentração de ALT e diminuição nas concentrações de GGT e FA no plasma seminal. Em relação às proteínas de fase aguda, a degeneração testicular causa diminuição na concentração de albumina. Em adição, este insulto local não altera os metabólitos séricos em touros Nelore. / In the present work the biochemical profile of the seminal plasma and the metabolic profile of Nelore bulls with testicular degeneration were studied. The study was presented in two articles. First in article 1, the objective was to investigate some seminal plasma metabolites of Nellore bulls to characterize values and evaluate their relation with sperm characteristics. Fourteen seed samples were taken, with weekly intervals, of 11 bulls (n = 154). Semen was evaluated for motility, vigor, concentration, plasmatic and acrosomal membrane integrity, mitochondrial membrane potential, morphology and pH. Seminal plasma was submitted to metabolic assessments of total protein, albumin, gamma glutamyl transferase (GGT), aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT) and alkaline phosphatase (AP). Data were analyzed by the Statistical Analysis System (SAS Institute Inc., 2004), with descriptive statistics and Pearson\'s correlation analysis performed, the level of significance considered was 5%. The values of the seminal plasma metabolites found have been described and can be used as reference for Nellore bulls. It can also be concluded that there is a relation between the metabolic profile of seminal plasma and sperm characteristics. In Article 2, the objective was to investigate the seric biochemistry and seminal plasma of Nellore bulls with testicular degeneration. For this, 22 bulls were used, which were distributed in two groups: Control Group (CON; n = 11) and Degeneration Group (DEG; n = 11). There were 14 semen crops and 21 weekly blood sampling. Seminal and seminal plasma evaluations were the same as those performed in the study of article 1 and blood was evaluated for total protein, albumin, fibrinogen, GGT, AST, creatine-kinase (CK), glucose, high density lipoprotein (HDL), cholesterol, triglycerides, beta-hydroxybutyrate (BHB) and non-esterified fatty acids (NEFA). The data were submitted to Variance Analysis, adding the factor measures repeated in time, using the REPEATED command generated by PROC MIXED of the SAS, with significance level of 5%. It can be affirmed that testicular degeneration in Nellore bulls causes elevation of semen pH, as well as elevation of ALT concentration and decrease in GGT and AF concentrations in seminal plasma. In relation to acute phase proteins, testicular degeneration causes a decrease in albumin concentration. In addition, this local insult does not alter serum metabolites in Nellore bulls.

A preocupação com a qualidade do sêmen ovino congelado tem sido motivo de muitas pesquisas, principalmente pela dificuldade da transposição cervical durante a inseminação artificial. Contudo, a inseminação intra-cervical é frequentemente usada em ovinos e resulta em redução da fertilidade com o uso do sêmen congelado. Neste sentido, esse estudo foi dividido em dois experimentos. No 1o experimento foi verificado o potencial da ciclodextrina pré-carregada com colesterol como aditivo ao diluidor na proteção da cinética espermática, integridade das membranas plasmática e acrossomal, função mitocondrial, capacitação espermática e produção de espécies reativas ao oxigênio (ROS) em espermatozoides criopreservados ovinos. Cinco ejaculados de seis carneiros (n = 30) foram divididos em três tratamentos: apenas diluidor (CON); diluidor + colesterol incorporado a ciclodextrina (CLC + CHO); e diluidor + ciclodextrina pura (CLCP). Após a diluição (50x106 espermatozóides/mL), o sêmen foi envasado em palhetas, identificado e criopreservado utilizando um sistema automatizado. Duas palhetas da mesma partida de cada tratamento foram descongeladas (a 37°C durante 30 segundos) e analisadas quanto motilidade (CASA), morfologia dos espermatozoides (DIC), integridade do plasma (PI-H342) e acrossomal (FITC-PSA) membranas, potencial mitocondrial (JC-1), produção de radicais livres (CellRox), peroxidação lipídica (BODIPY) e fluidez da membrana celular (merocianina 540). As comparações entre os grupos foram analisadas pelo PROC MIXED do SAS e o efeito de grupo foi detectado pelo teste de Tukey (p<0,05) ou pela estatística não paramétrica de ordem (Kruskal-Wallis), quando era necessário. No 2º experimento os mesmos ejaculados foram divididos por congelabilidade baseados na motilidade total pós-descongelação (MTPD) e na porcentagem de redução na motilidade total (%RMT) quando comparados o sêmen in natura e o sêmen pós-descongelação (somente diluidor), sendo divididos nos grupos alta (MTPD>60% e %RMT<40%), intermediária (60%>MTPD>40% e 60%>RMT>40%) e baixa (MTPD<40% e %RMT>60%) congelabilidade. Foram analisados os tratamentos CON e CLC+CHO dentro de cada animal e de cada grupo quanto a motilidade (CASA), a integridade das membranas plasmática (PI-H342) e acrossomal (FITC-PSA), potencial mitocondrial (JC-1), peroxidação lipídica (BODIPY) e fluidez da membrana celular (merocianina 540). As comparações foram realizadas por análise de variância (ANOVA) em arranjo fatorial 3X3 (Tratamento CLC+CHO, CON e in natura X grupos alta, intermediária e baixa congelabilidade), as comparações entre os grupos foram analisadas pelo PROC MIXED do SAS e o efeito de grupo foi detectado pelo teste de Tukey (p <0,05) ou pela estatística não paramétrica de ordem (Kruskal-Wallis), quando era necessário. No 1o experimento o tratamento CLC+CHO se mostrou mais eficaz em preservar os parâmetros de motilidade, integridade de membranas e potencial mitocondrial quando comparado aos demais tratamentos. O grupo CLCP mostrou queda nos parâmetros de motilidade, integridade de membrana, potencial mitocondrial, mostrando, com isso, uma queda na preservação espermática. No 2o experimento observou-se que o tratamento CLC+CHO mostrou maior grau de preservação para motilidade total e progressiva, células rápidas, preservação de membranas plasmática e acrossomal e potencial mitocondrial quando comparado ao CON. Esse efeito teve maior significância nos grupos de baixa e intermediária congelabilidade, não sendo tão expressivo no grupo de alta. Pode-se concluir com esse estudo que o tratamento com ciclodextrina acrescida de colesterol contribui para uma melhor preservação dos parâmetros espermáticos do sêmen ovino, principalmente em animais apresentando baixa congelabilidade, contudo não apresenta diferença em ejaculados de alta congelabilidade. / Frozen ram semen has been the subject of many researches, mainly due to the difficulty of cervical transposition during artificial insemination. However, intra-cervical insemination in sheep is often used, resulting in reduced fertility with the use of frozen semen. To this end, this study was divided into two experiments. In the first experiment was verified the potential of cyclodextrin loaded with cholesterol as an additive to the extender in the protection of sperm kinetics, integrity of plasmatic and acrosomal membranes, mitochondrial function, sperm capacitation and production of reactive oxygen species (ROS) in cryopreserved sheep sperm. Five ejaculates from six rams (n = 30) were divided into three treatments: only extender (CON); extender + cyclodextrin loaded with cholesterol (CLC + CHO); and extender + pure cyclodextrin (CLCP). After dilution (50x106 spermatozoa/mL), semen was stored in straws, identified and cryopreserved using an automated system. Two straws from each ejaculate and treatment were thawed (at 37° C for 30 seconds) and analyzed for motility (CASA), morphology of spermatozoa (DIC), plasmatic (PI-H342) and acrosomal (FITC-PSA) membrane integrity, mitochondrial potential (JC-1), production of free radicals (CellRox), lipid peroxidation (BODIPY) and cell membrane permeability (Merocyanine 540). Comparisons between groups were analyzed using PROC MIXED of SAS and the effect of group was detected by Tukey (p <0.05) or by the order of nonparametric statistics (Kruskal-Wallis) test, when necessary. In the 2nd experiment the same ejaculates were divided by freezability based on the total post-thaw motility (TPTM) and the percentage of reduction in total motility (%RTM) when compared fresh and post-thaw semen (only extender), and divided into the groups: high (TPTM ≥ 60% and %RTM ≤ 40%), intermediate (60%> TPTM > 40% and 60%> %RTM > 40%) and low (TPTM ≤ 40% and %RTM ≥ 60%) freezability. CON and CLC + CHO treatments were analyzed within each animal and each group for motility (CASA), plasmatic (PI-H342) and acrosomal (FITC-PSA) membrane integrity, mitochondrial potential (JC-1), lipid peroxidation (BODIPY) and cell membrane permeability (Merocyanine 540). Comparisons were performed by analysis of variance (ANOVA) with a factorial arrangement 3x3 (groups CLC+CHO, CON and fresh X groups high, medium and low freezability), comparisons between groups were analyzed using PROC MIXED of SAS and the group effect was detected by the Tukey test (p < 0.05) or no statistical order parametric (Kruskal-Wallis), when necessary. In the first experimente, CLC + CHO treatment was more effective in preserving the parameters of motility, membrane integrity, and mitochondrial potential compared to other treatments. The CLCP group showed a fall in the parameters of motility, membrane integrity, mitochondrial potential, showing thereby a decrease in sperm preservation. In the 2nd experiment, it was observed that the treatment CLC + CHO showed greater preservation for total and progressive motility, rapid cell preservation, plasmatic and acrosomal membranes and mitochondrial potential when compared to CON. This effect was most significant in the groups of low and intermediate freezability, not being as significant in the group of high freezability. We can conclud from this study that treatment with cyclodextrin loaded with cholesterol contributes to better preservation of sperm parameters in ram semen, especially in animals displaying low freezability, however there where no diference in the high freezability group.

Estudos sobre a biologia reprodutiva de primatas não humanos são importantes para o desenvolvimento de biotecnologias da reprodução, visando a conservação das espécies. O objetivo deste estudo foi avaliar métodos de criopreservação do sêmen de Callithrix jacchus e C. penicillata. O sêmen foi colhido pelo método da vibroestimulação peniana, de animais adultos mantidos em cativeiro. Imediatamente após a colheita, foram analisadas as variáveis volume, pH, concentração, motilidades total e progressiva, integridade de membrana plasmática, integridade de acrossomo, atividade citoquímica mitocondrial, fragmentação de DNA e morfologia espermática. As amostras foram então refrigeradas em diluidor TEST gema de ovo sem glicerol; após este período, foi adicionado o glicerol a 4 e 6% de concentração e novas análises foram realizadas. O sêmen foi congelado em vapor de nitrogênio e finalmente em imersão em nitrogênio. As amostras foram descongeladas após um período mínimo de um mês e meio, e novas análises realizadas aos 10, 40 e 80 minutos pós-descongelação. Foi observado que o sêmen fresco de C. jacchus e C.penicillata são semelhantes em muitos aspectos. O diluidor TEST gema de ovo com o glicerol tanto a 4 como a 6% de concentração não foi eficaz para a proteção dos espermatozoides das duas espécies durante a criopreservação. São necessários outros estudos para o desenvolvimento de um protocolo de criopreservação do sêmen das duas espécies. Contudo, este trabalho contém informações que podem nortear futuros estudos sobre a criopreservação do sêmen destas e de outras espécies de primatas neotropicais. / Studies on the reproductive biology of nonhuman primates are important for the development of reproductive biotechnologies, in order to species conservation. The aim of this study was to evaluate methods for sperm cryopreservation from Callithrix jacchus and C. penicillata. Semen was collected by penile vibrostimulation from adult animals kept in captivity. Immediately after collection, the variables analyzed were volume, pH, concentration, total and progressive motility, plasma membrane integrity, acrosome integrity, cytochemical mitochondrial activity, DNA fragmentation and morphology. The samples were then chilled in TEST egg yolk extender without glycerol; after this period, the glycerol was added at concentrations of 4 and 6% and further analyzes were performed. The semen was frozen in nitrogen vapour and finally immersion in nitrogen. After a minimum of one month and a half, the samples were thawed and further analysis performed at 10, 40 and 80 minutes after thawing. Fresh semen from C. jacchus and C. penicillata were found to be similar in many aspects. The extender TEST egg yolk with glycerol as much as 4 to 6% concentration was not effective for the protection of spermatozoa from both species during cryopreservation. Further studies are needed to develop a protocol for cryopreservation of semen from both species. However, this work contains information that can guide future studies on sperm cryopreservation of these and other Neotropical primates species.

A produção in vitro de embriões (PIVE) vem se destacado como biotecnologia reprodutiva nos rebanhos bovinos, porém ainda com algumas limitações. A diferença de fertilidade entre touros é uma delas e dentre os atributos espermáticos que podem impactar na PIVE, pouco se sabe sobre a composição do núcleo espermático. Sendo assim, este trabalho teve como objetivo principal identificar quais aspectos nucleares do espermatozoide caracterizam a diferença nos índices de PIVE. Para tanto, o estudo foi dividido em 3 experimentos nos quais foi utilizado o banco de dados da empresa In Vitro Brasil para seleção de touros de alta (AF) e baixa (BF) taxa de desenvolvimento embrionário (taxa de blastocisto/taxa de clivados; n=5 touros/grupo). No primeiro experimento, foi realizado a avaliação da cromatina para susceptibilidade ao desafio ácido (SCSA modificado), deficiência de protaminação (CMA3) e fragmentação do DNA (COMETA). Apenas a deficiência de protaminação apresentou diferença entre os grupos, entretanto a porcentagem de células positivas para o CMA3 foi baixa, não sendo possível atribuir a esta alteração as diferenças de fertilidade encontradas. No segundo experimento, foi realizada a avaliação de proteômica do núcleo espermático destes touros. Para tanto, as amostras foram incubadas com detergente CTAB para remoção de parte da membrana e cauda, extração das proteínas, digestão com tripsina e análise por espectrometria de massas. A quantificação das proteínas foi avaliada pelo índice iBAQ obtido após a identificação dos peptídeos e a média deste índice comparado entre os grupos para identificação das proteínas diferencialmente expressas. Foram identificadas 196 proteínas, 21 diferencialmente expressas, sendo 17 hiperexpressas no grupo AF e 4 hiperexpressas no grupo BF. Dentre elas, proteínas relacionadas ao processo de espermatogênese, fecundação e motilidade. No terceiro experimento, com objetivo de identificar as marcações epigenéticas relacionadas com a diferença de fertilidade in vitro, foi realizado a avaliação das estruturas de nucleossomos utilizando a enzima MNase para posteriormente utilização na técnica de imunoprecipitação das marcações de histona. Entretanto, não foi identificado a presença de nucleossomos no DNA espermático bovino, inviabilizando análises posteriores. Sendo assim, a avalição da metilação de DNA foi escolhida como marcação epigenética para ser estudada. Neste caso, foi utilizada a técnica de RRBS (reduced representation of bisulfite sequencing) para identificar as citosinas diferencialmente metiladas (CDM) entre os grupos AF e BF. Foram identificadas 440 CDM, sendo 327 hipometiladas e 113 hipermetiladas no grupo AF. Além disto, 184 genes contendo estas CDM foram identificados, entretanto nenhum processo biológico foi enriquecido por estes genes. Foi possível concluir com este trabalho que a fertilidade in vitro pode ser considerada de caráter multifatorial, sendo que alterações pequenas de integridade de cromatina não afetam diretamente, já proteínas relacionadas a espermatogênese, motilidade e fecundação podem ter relação com o fenótipo fertilidade estudado. Dentre as marcações epigenética estudadas, as estruturas de nucleossomo pareceram estar ausentes no espermatozoide bovino, e a metilação de DNA não apresenta impacto significativo no perfil de fertilidade. / In vitro embryo production (IVP) has been highlighted as reproductive biotechnique in bovine herds, but still with some limitations. The fertility difference between bulls is one of them and among the sperm attributes that can impact on IVP, little is known about the composition of the bovine sperm nucleus. Therefore, this work had as main goal to identify which sperm nuclear aspects characterize the difference in the IVP index. Then, the study was divided in 3 experiments in which the database of the company In Vitro Brasil was used for selection of bulls with high (HF) and low (LF) embryo development rate (blastocyst rate/cleavage rate; n=5 bulls/group). In the first experiment, chromatin analysis of susceptibility to acid denaturation (modified SCSA), protamine deficiency (CMA3) and DNA fragmentation (COMET assay) were performed. Only protamine deficiency presented difference between groups, however the percentage of CMA3 positive cells was low and it was not possible to attribute to this alteration the fertility difference between groups. In the second experiment, proteomic analysis of the sperm nucleus of these bulls was performed. For that, samples were incubated with CTAB detergent to remove part of the membrane and tail, submitted to protein extraction, trypsin digestion and mass spectrometry analysis. The amount of the proteins was evaluated by the iBAQ index obtained after the identification of peptides and the average of this index compared to identify the differentially expressed proteins. In this experiment, 196 proteins were identified, 21 differentially expressed, being 17 overexpressed in the HF and 4 overexpressed in LF group. Among them, proteins related to the spermatogenesis, fertilization and motility. In the third experiment, in order to identify the epigenetic marks related to in vitro fertility differences it was performed the evaluation of the nucleosome structures using the MNase enzyme to later utilization of immunoprecipitation of the histone marks technique. However, the presence of nucleosomes in bovine sperm DNA was not identified, unfeasible further analysis. Thus, the evaluation of DNA methylation was chosen as epigenetic mark to be studied. In this case, the RRBS (reduced representation of bisulfite sequencing) technique was used to identify the differentially methylated cytosines (DMC) between the two groups. In this experiment, it was identified 440 DMC, being 327 hypomethylated and 113 hypermethylated in HF group. In addition, 184 genes containing these DMCs were identified, however no biological process enrichment was identified with these genes. In conclusion, this study indicated that in vitro fertility characterization can be multifactorial; small changes in chromatin integrity do not directly affect, but proteins related to spermatogenesis, motility and fertilization may be related to the fertility phenotype studied. Among the epigenetic marks studied, nucleosome structures were absent in bovine spermatozoa, and DNA methylation did not have a significant impact on the fertility profile.

La infertilitat és una malaltia que afecta a un 15% de les parelles en edat reproductiva. En la meitat dels casos, el problema té un origen masculí. Però, tot i els avenços existents en la fisiologia de la reproducció, encara hi han un 10% de parelles amb una infertilitat d'origen desconegut. Així, aprofitant les noves tecnologies existents tal com la proteòmica (gels 2D, anàlisis per MS/MS, etc.) es va decidir realitzar un estudi de l'espermatozoide humà per tal d'aprofundir en el coneixement de les proteïnes implicades en la fertilització. Primer, es va realitzar un estudi per descriure part del proteoma de l'espermatozoide humà. Es van descriure 98 proteïnes, localitzant-les en un mapa 2D. Un 22% d'aquestes proteïnes es van descriure per primera vegada com a presents en l'espermatozoide humà. D'un 11% no se'n coneix la funció, mentre que un 23% tenen una funció relacionada amb la transcripció, la síntesi proteica o l'intercanvi proteic. Aquesta dada és sorprenent ja que, fins fa poc, es creia que l'únic objectiu de l'espermatozoide era portar el material genètic masculí fins l'oòcit femení. La resta de proteïnes tenen una funció que s'engloba dintre d'aquestes categories: 23% relacionades amb la producció d'energia; 11% relacionades amb el cicle cel·lular, l'apoptosis i l'estrès oxidatiu; 10% relacionades amb el citoesquelet, el flagel i el moviment cel·lular; 9% relacionades amb la transducció de senyal; 7% relacionades amb el reconeixement cel·lular; i, per últim, un 6% té una funció relacionada amb el metabolisme. D'aquestes 98 proteïnes (amb 3 proteïnes noves d'un altre estudi realitzat al laboratori), es va fer un estudi comparant la seva abundància relativa entre pacients astenozoospèrmics i controls (donants de semen). D'aquesta comparació, es van trobar 17 proteïnes amb una abundància relativa diferent entre pacients i donants. Aquestes proteïnes són ACTB, ANXA5, COX6B, H2A, PIP i el seu precursor,i dos punts corresponents a S100A9; totes aquestes es troben disminuïdes en els pacients. La resta de proteïnes son la forma precursora de CLU, DLD, FH, SEMG1, a més d'HSPA2, IMPA1, PSMB3, TEX12 i un punt que conté dos proteïnes: MPST i la forma precursora d'ECH1. Totes aquestes proteïnes es troben augmentades en pacients. La majoria d'aquestes proteïnes es poden agrupar en tres grans grups: proteïnes relacionades amb la producció d'energia (COX6B, DLDpre, FHpre i ECH1pre), amb l'estructura i el moviment (ACTB, PIP i PIPpre, H2A i SEMG1), i senyalització cel·lular i regulació ( ANXA5, S100A9 i IMPA1). A més, es va realitzar un estudi paral·lel estudiant les mateixes 101 proteïnes, però amb pacients normozoospèrmics (sense cap causa aparent d'infertilitat) i donants de semen de fertilitat probada. Donat el caràcter tan exclusiu de les mostres, nomès es van poder comparar sis pacients versus 5 donants. Tot i això, es van trobar dos proteïnes amb diferències a la seva abundància relativa. Aquestes proteïnes són la PDIA3 i la TEX12. Aquestes dades, però, no es poden considerar com a definitives, ja que el valor obtingut per a aquestes mostres de p (p<0.001) ens indica que un de cada 100 resultats pot ser degut a l'atzar. Així, una d'aquestes proteïnes pot ser un fals possitiu.Amb aquests valors quantitatius, es va realitzar una agrupació no dirigida per tal de veure si aquestes proteïnes ens agrupaven les mostres segons el seu fenotip. Per a la comparació "astenozoospèrmics vs donants", l'agrupació va ser possitiva; en una branca de l'arbre resultant, teníem tots els pacients i, a l'altra, tots els donants.Per últim, es va posar a punt la metodologia DIGE en mostres d'espermatozoides humans. Tot i que es necessitaran més dades per a acabar d'ajustar el procediment, els primers resultats són encoratjadors. / Infertility is a disease that affects 15% of couples at reproductive age. In about a half, the problem has a male origin. Conventional 1-DE has in the past provided a wealth of information concerning the major sperm proteins. However, so far there are relatively few reports exploiting the potential of the present proteomic tools to identify and to study additional yet-unidentified important proteins present in human spermatozoa. In this work, 2-DE of proteins from spermatozoa led to the identification of 98 different proteins. The function of these proteins turned out to be energy production (23%), transcription, protein synthesis, transport, folding and turnover (23%), cell cycle, apoptosis and oxidative stress (10%), signal transduction (8%), cytoskeleton, flagella and cell movement (10%), cell recognition (7%), metabolism (6%) and unknown function (11%). As many as 23% of the proteins identified have not been previously described as being expressed in human spermatozoa. Also, asthenozoospermia is one of the most common findings present in infertile males, but its aetiology remains unknown in most cases. Present proteomic tools now offer the opportunity to identify proteins which are differentially expressed in asthenozoospermic semen samples and potentially involved in infertility. In this work, we compared the expression of 101 sperm protein spots in 20 asthenozoospermic samples to that of 10 semen donor controls using two-dimensional proteomic analysis. This results in seventeen protein spots, that have been identified at different amounts in the asthenozoospermic samples compared with controls. These are cytoskeletal actin-B, annexin-A5, cytochrome C oxidase-6B, histone H2A, prolactin-inducible protein and precursor, calcium binding protein-S100A9 (2 spots), clusterin precursor, dihydrolipoamide dehydrogenase precursor, fumarate hydratase precursor, heat shock protein-HSPA2, inositol-1 monophosphatase, 3-mercapto-pyruvate sulfurtransferase/dienoyl-CoA isomerase precursor, proteasome subunit-PSMB3, semenogelin 1 precursor and testis expressed sequence 12. The detected amount of these proteins enabled the grouping of asthenozoospermic sperm samples in an unsupervised clustering analysis. So, in conclusion, we have identified several proteins present at different amount in asthenozoospermic sperm samples. These proteins could be candidates towards the development of diagnostic markers, and open up the opportunity to gain further insight into the pathogenic mechanisms involved in asthenozoospermia.

The knowledge of the proteins that are present in the spermatozoa is an essential step towards the comprehension of their normal function and their potential alterations associated to infertility. Although many studies have been performed in human male infertility, many of the causes still remain unknown, partly due to the fact that the proteins and the mechanisms involved in spermiogenesis and in sperm function are not known in detail. Therefore, the proteomic study of the human spermatozoa through mass spectrometry is relevant both, towards improving our fundamental knowledge and the mechanisms involved in the normal sperm physiology, as well as towards a better understanding of the male infertility. This doctoral thesis has contributed to the identification of the human sperm proteome through two-dimensional gels and mass spectrometry. Moreover, it has identified new correlations between the abundance of certain proteins and the seminal parameters related to male infertility such as the protamine content, DNA damage and sperm motility giving rise to the identification of potential diagnostic markers. In addition, the potential correlations between the protamine content and the presence of the protamine 2 precursors in the sperm cell from patients and the assisted reproductive outcomes have also been studied. Another point studied in the present thesis has been the determination, through immunofluorescent techniques, of the presence of nucleosomes and other proteins with a potential epigenetic function present in spermatozoon fractions selected through density gradients. Moreover, a protocol for the isolation of human sperm nuclei has been implemented to further identify, through mass spectrometry, minor nuclear proteins that may be important for normal sperm functioning or the embryo development.KEYWORDS: Spermatozoon, Protamines, Proteome, Male infertility, Epigenetics / El coneixement de les proteïnes que formen part de l'espermatozoide és un aspecte clau per comprendre el seu funcionament normal i les seves possibles alteracions associades a la infertilitat. Tot i la gran quantitat d'estudis sobre la infertilitat humana masculina, moltes de les seves causes es troben encara desconegudes degut, en part, a que les proteïnes i els mecanismes implicats en l'espermatogènesi i la funció de la cèl·lula espermàtica no es coneixen en detall. Per tant, l'estudi proteòmic de l'espermatozoide humà a través de l'espectrometria de masses és rellevant tant pel coneixement d'aspectes fonamentals com pel millor enteniment de la infertilitat masculina. Aquesta tesi doctoral ha contribuït a la identificació del proteoma de l'espermatozoide humà a través de gels bidimensionals i espectrometria de masses. Addicionalment s'han identificat relacions entre la abundància de certes proteïnes i paràmetres seminals relacionats amb la infertilitat masculina tals com el contingut de protamines, el dany al DNA o la motilitat dels espermatozoides donant lloc a la identificació de potencials marcadors diagnòstics. A més, s'han buscat les possibles correlacions entre el contingut de protamines i la presència de precursor de protamina 2 als espermatozoides de pacients amb els resultats de reproducció assistida. Un altre aspecte tractat ha estat la determinació, mitjançant tècniques immunofluorescents, de la presència de nucleosomes i altres proteïnes presents a fraccions d'espermatozoides seleccionades a través de gradients de densitat amb una funció potencial epigenètica. A més, s'ha implementat un protocol per aïllar nuclis d'espermatozoides humans per tal de poder identificar a través d'espectrometria de masses proteïnes nuclears minoritàries possiblement importants pel desenvolupament embrionari i el funcionament de l'espermatozoide no patològic. / RESUMEN EN CASTELLANO:El conocimiento de las proteínas que forman parte del espermatozoide es un aspecto clave para la comprensión de su funcionamiento normal i de sus posibles alteraciones asociadas a la infertilidad. A pesar de la gran cantidad de estudios sobre la infertilidad humana masculina, muchas de sus causas se encuentran aún desconocidas. Esto es debido, en parte, a que las proteínas y los mecanismos implicados en la espermatogénesis i la función de la célula espermática no se conocen en detalle. Por lo tanto, el estudio proteómico del espermatozoide humano a través de la espectrometría de masas es relevante tanto para el conocimiento de aspectos fundamentales como para el mejor entendimiento de la infertilidad masculina. Esta tesis doctoral ha contribuido en la identificación del proteoma del espermatozoide humano a través de geles bidimensionales i espectrometría de masas. Adicionalmente se han identificado relaciones entre la abundancia de ciertas proteínas i parámetros seminales relacionados con la infertilidad masculina tales como el contenido de protaminas, el daño en el DNA o la movilidad de los espermatozoides dando lugar a la identificación de potenciales marcadores diagnósticos. Además, se han buscado posibles correlaciones entre el contenido de protaminas i la presencia de precursor de protamina 2 en los espermatozoides de pacientes con los resultados de reproducción asistida. Otro aspecto tratado ha sido la determinación, mediante técnicas inmunofluorescentes, de la presencia de nucleosomas i otras proteínas presentes en fracciones de espermatozoides seleccionadas a través de gradientes de densidad con una función potencial epigenética. Además, se ha implementado un protocolo de aislamiento de núcleos de espermatozoides humanos con el objetivo de poder identificar a través de espectrometría de masas proteínas nucleares minoritarias posiblemente importantes para el desarrollo embrionario i el funcionamiento del espermatozoide no patológico. PALABRAS CLAVE: Espermatozoide, Protaminas, Proteoma, Infertilidad masculina, Epigenética

Orientador: Fabiana Ferreira de Souza / Resumo: A membrana espermática é caracterizada por uma significativa quantidade de lipídios relacionados com funções específicas da célula, tais como fusogenicidade e permeabilidade, necessárias para o espermatozoide alcançar e fundir-se ao oócito. O perfil lipídico dos espermatozoides difere entre as espécies e indivíduos da mesma espécie, o que pode conferir maior ou menor manutenção da integridade plasmática e crioresistência, uma vez que a exposição desta célula a baixas temperaturas modifica a composição e a organização lipídica da membrana, diminuindo a longevidade e consequentemente sua capacidade fecundante. A presença e a quantidade de lipídios específicos, como as fosfatidilcolinas, esfingomielinas, seminolipídios, plasmalogênios e ácidos graxos com diferentes graus de saturação, além do colesterol exercem importantes funções associadas aos processos de capacitação, motilidade, viabilidade e preservação da integridade da membrana espermática. Assim, um maior estudo sobre a composição lipídica do sêmen e a influência destas macromoléculas sobre a qualidade espermática após a criopreservação possibilitará desenvolver novas estratégias para tornar a célula espermática mais resistente frente ao processo de criopreservação. / Doutor

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / The ruminant fertility is influenced by intrinsic sperm factors, like chromatin or proteins. Considering that the reproductive efficiency is dependent on a balanced and feasible nutrition, the cashew nut meal (CNM) is a low cost byproduct that must be analyzed for possible effects on sperm chromatin and proteins.Study 1:. The objectives of study 1 were to determine failures of chromatin condensation, expression levels and cellular localizations of histones; H3.3, H2B and H4, respectively in spermatozoa from low (LF) vs. high fertility (HF) bulls. The data were analyzed by t test and Pearson correlation (P < 0.05). We demonstrated that aniline blue staining was different within LF (1.73 (0.55, 0.19)) and HF Groups (0.67 (0.17, 0.06) (P < 0.0001), which was also negatively correlated with in vivo bull fertility (r = -0.90; P < 0.0001). Although those histones were consistently immune-detectable and specifically localized in bull sperm, this was not different between the two groups. Except H2B variants, H3.3 and H4 showed 100% identity and conserved among bovine, mouse and human. The H2B variants were more conserved between bovine and human than those of mouse. In conclusion, we showed that H2B, H3.3 and H4 were detectable in bull spermatozoa and that sperm chromatin condensation status, changed by histone retention, is related with bull fertility. Study 2: The objectives of study 2 were evaluate the effects of 13% of CNM inclusion in the diet of Morada Nova rams on the semen parameters, chromatin integrity and sperm proteins. Twenty rams were distributed in two equal groups: cashew nut group (CNG) and control group (COG) that received 13% and 0% of CNM in the diet for 90 days, respectively. The groups were compared for live weight, scrotal circumference, seminal parameters, chromatin integrity and sperm protein profile at 0, 45 and 90 days of the experiment. The data were evaluated by GLM for repeated measures (P < 0.05). At 90 days, CNG (69.00% (7.38; 2.33)) presented percentage of motile sperm superior than control group (60,00% (9,43; 2,98)) (P<0.05). There was not effect from the diet with CNM on chromatin integrity. But, the percentages of protein expression from ODF1 and H2B were larger in the CNG (P<0.05). The proteins: ODF1, GPX4, FTL and H2B were negatively correlated with sperm chromatin quality. In conclusion, the cashew nut meal did not affect negatively the semen quality. / A fertilidade em ruminantes à influenciada por fatores intrÃnsecos espermÃticos como a cromatina e as proteÃnas. Considerando que a eficiÃncia reprodutiva do macho depende de uma nutriÃÃo balanceada e viÃvel, o farelo de castanha de caju (FCC) à um subproduto de baixo custo que deve ser analisado quanto a possÃveis efeitos na integridade cromatÃnica e proteica dos espermatozoides. Estudo 1: O estudo 1 teve como objetivos determinar: falhas na condensaÃÃo da cromatina, nÃveis de expressÃo e localizaÃÃo celular das histonas: H3.3, H2b e H4B, respectivamente, em espermatozoides de touros de baixa (BF) e alta fertilidade (AF). Os dados foram avaliados pelo teste t e correlaÃÃo de Pearson (P < 0,05). Os resultados do teste do azul de anilina foram diferentes entre os grupos BF (1.73 (0.55, 0.19)) e AF (0,67 (0,17, 0,06) (P < 0,0001), os quais tambÃm foram negativamente correlacionados com a fertilidade in vivo de touros (r = -0,90; P < 0,0001). Apesar das histonas terem sido consistentemente imunodetectadas e localizadas nos espermatozoides, estas nÃo apresentaram diferenÃas entre os grupos. As proteÃnas H3.3 e H4 apresentaram 100% de identidade e foram conservadas entre bovinos, murinos e seres humanos. Entretanto, as variantes H2B foram mais conservadas entre touros e humanos do que entre humanos e camundongos. Em conclusÃo, as proteÃnas H2B, H3.3 e H4 foram detectÃveis em espermatozoides de touros e a condensaÃÃo da cromatina espermÃtica, alterada pela retenÃÃo de histonas, à relacionada com a fertilidade de touros. Estudo 2: O estudo 2 objetivou avaliar os efeitos da inclusÃo de 13% de FCC na dieta de carneiros Morada Nova sobre as caracterÃsticas seminais, integridade de cromatina e perfil das proteÃnas espermÃticas. Vinte carneiros foram divididos em dois grupos: castanha (GCA) e controle (GCO).que receberam na dieta 13% e 0% de FCC durante 90 dias, respectivamente. Os grupos foram comparados quanto ao peso vivo, circunferÃncia escrotal, parÃmetros seminais, integridade de cromatina e perfil das proteÃnas espermÃticas aos 0, 45 e 90 dias de experimento. Os dados foram analisados pelo mÃtodo GLM para medidas repetidas (P < 0,05). Aos 90 dias o GCA (69,00% (7,38; 2,33) apresentou porcentagem de espermatozoides mÃveis superior ao GCO (60,00% (9,43; 2,98)) (P<0.05). NÃo houve efeito da dieta contendo FCC sobre a integridade da cromatina. PorÃm, os percentuais das proteÃnas ODF1 e H2B foram mais elevados nos carneiros do GCA (P < 0,05). As proteÃnas: ODF1, GPX4, FTL e H2B foram negativamente correlacionadas com a qualidade da cromatina espermÃtica. Em conclusÃo, a inclusÃo de FCC na dieta de carneiros nÃo afetou negativamente a qualidade seminal.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / O objetivo do presente trabalho foi realizar um estudo sobre as proteÃnas do plasma seminal e dos espermatozoides e suas associaÃÃes com morfologia espermÃtica e com mÃtodos de coleta e criopreservaÃÃo de sÃmen de touros Bos indicus das raÃas Brahman e GuzerÃ, utilizando uma abordagem proteÃmica. Foram coletadas amostras de sÃmen e as proteÃnas do plasma seminal foram separadas atravÃs de eletroforese bidimensional ou eletroforese bidimensional em gel diferencial e identificadas por espectrometria de massa. O proteoma do plasma seminal dos touros Bos indicus foi descrito identificando as Binder of sperm proteins como as proteÃnas mais abundantes no fluido seminal, enquanto que as spermadhesins formaram o segundo grupo com maior expressÃo. Foram encontradas associaÃÃes positivas e negativas entre as proteÃnas do plasma seminal e a porcentagem de espermatozoides morfologicamente normais constituindo possÃveis marcadores moleculares desta caracterÃstica. Em outro aspecto, foram identificadas diferenÃas no volume do ejaculado e no perfil proteico do plasma seminal touros Bos indicus submetidos a diferentes mÃtodos de coleta de sÃmen (vagina artificial interna e eletroejaculaÃÃo). Baseado nas anÃlises dos gÃis bidimensionais, 22 spots tiveram volumes maiores nas amostras coletadas por vagina artificial interna, correspondendo a 21 proteÃnas. Em contrapartida, 33 spots correspondendo a 26 proteÃnas tiveram maiores volumes nos gÃis de amostras coletadas por eletroejaculaÃÃo. As principais proteÃnas com maior expressÃo em amostras obtidas por vagina artificial interna e eletroejaculaÃÃo eram de origem epididimÃria e das glÃndulas sexuais acessÃrias, respectivamente. No presente trabalho, ainda foram feitas associaÃÃes entre a expressÃo de proteÃnas no plasma seminal e nas cÃlulas espermÃticas com os parÃmetros do sÃmen pÃs-criopreservaÃÃo em touros Bos indicus da raÃa GuzerÃ. Os animais apresentaram, em mÃdia, peso corporal, circunferÃncia escrotal e parÃmetros seminias prÃ-criopreservaÃÃo do sÃmen sem diferenÃa estatÃstica. De acordo com os parÃmetros espermÃticos pÃs-criopreservaÃÃo obtidos pelo sistema computadorizado de anÃlise de sÃmen os animais foram divididos em grupos de alta e baixa congelabilidade. TrÃs proteÃnas do plasma seminal e cinco dos espermatozoides foram mais expressas no grupo de alta congelabilidade. Outras seis proteÃnas do plasma seminal foram mais expressas no grupo de baixa congelabilidade. Os modelos de regressÃo adotados para as intensidades dos spots do plasma seminal e das cÃlulas espermÃticas, bem como as anÃlises de interaÃÃes proteÃna-proteÃna indicam que a maioria das proteÃnas inversamente associadas com a viabilidade espermÃtica pÃs-descongelaÃÃo pode ser expressa como uma resposta a um estresse oxidativo e/ou ataque microbiano antes da criopreservaÃÃo de sÃmen de animais do grupo de baixa congelabilidade nÃo detectado pelas anÃlises convencionais do sÃmen. AtravÃs da utilizaÃÃo de uma abordagem proteÃmica, os resultados encontrados no presente trabalho podem servir de orientaÃÃo para futuras pesquisas que visem identificar marcadores moleculares de processos reprodutivos baseado na expressÃo de proteÃnas no plasma seminal e nas cÃlulas espermÃticas de touros Bos indicus. / The aim of this work was to study seminal plasma and whole sperm proteins and their association with sperm morphology and methods of semen collection and cryopreservation in Bos indicus bulls using a proteomics approach . Seminal plasma proteins were separated by two-dimensional electrophoresis or diferential gel electrophoresis and identified by mass spectrometry gel. Firstly, we described the seminal plasma proteome of Bos indicus bulls, identified the Binder of Sperm Proteins as the more abundant proteins in seminal fluid, while the spermadhesins formed the second group with higher expression. Positive and negative associations were found between seminal plasma proteins and the percentage of morphologically normal spermatozoa constituing possible molecular markers of this characteristic. In other hand, differences were identified in ejaculate volume and seminal plasma protein profile of Bos indicus bulls subjected to different methods of semen collection (internal artificial vagina and electroejaculation). Based on the analysis of two-dimensional gels, 22 spots had larger volumes in samples collected by internal artificial vagina, corresponding to 21 proteins. In contrast, 33 spots had larger volumes of samples collected by electroejaculation corresponding to 26 differents proteins. The proteins with great volume in samples obtained by internal artificial vagina and electroejaculation had epididymal and accessory sex glands origin, respectively. In the present study, others associations have been made among protein expression in seminal plasma and sperm cells and semen parameters after cryopreservation in Bos indicus bulls. The animals had not differences between body weight, scrotal circumference and seminal parameters pre-freezing. After cryopreservation, the semen parameters were analyzed by computer system (CASA) and the animals were divided into groups of low and high freezability. In the high freezability group were more expressed three proteins of seminal plasma and five proteins of sperm. For the group of low freezability were more expressed six different seminal plasma proteins. Regression models adopted for the intensities of the spots in the seminal plasma and sperm cells, as well as analysis of protein-protein interactions, indicate that most of the proteins inversely associated with post -thaw sperm viability may be expressed as a response to an oxidative stress and/or microbial attack before the semen cryopreservation of animals with low freezability. These parameters could not be detected by conventional sperm analysis. This results obtened by applying of the proteomics approach, could serve as guideline for future researchs aimed to identifed molecular markers of reproductive processes based on the expression of proteins in seminal plasma and sperm cells of Bos indicus bulls.