A pirapitinga (Piaractus brachypomus) Ã uma espÃcie de peixe exÃtico introduzido no nordeste brasileiro o qual tem grande importÃncia comercial, devido a seu hÃbito alimentar, excelente crescimento, resistÃncia ao manejo em cativeiro e Ãs enfermidades. A criopreservaÃÃo de seu sÃmen pode contribuir nos aspectos econÃmico, genÃtico e meio ambiental da regiÃo e da espÃcie. O objetivo deste trabalho foi desenvolver um protocolo adequado de congelaÃÃo seminal para poder obter motilidades prÃximas ao sÃmen a fresco. Trabalhou-se com o sÃmen d e19 machos maduros de dezembro de 2007 a marÃo de 2008, determinando as caracterÃsticas seminais; a toxicidade dos crioprotetores DMSO 10% e metilglicol 10%, diluÃdos em glicose 5%, ACP 104 e soluÃÃo Ringer das diluiÃÃes de 1:3, 1:5 e 1:7 durante 15 minutos a 4Â C; a criopreservaÃÃo a -196Â C com as mesmas condiluiÃÃes usando palhetas de 0,25 e 0,5 mL, congeladas em vapores de nitrogÃnio lÃquido em caixas de isopor ou em âdry shipperâ, sendo depois transferidas para botijÃes criogÃnicos durante 15 dias. Foram avaliadas as motilidades e velocidades atravÃs da anÃlise seminal auxiliado por computador (CASA) pÃs-descongelaÃÃo; e a morfologia seminal fresco e pÃs-descongelaÃÃo. Os parÃmetros seminais a fresco observados foram: motilidade objetiva mÃdia de 94%, concentraÃÃo de 94 x 10 spzt/mL, volume d e7 mL, Osmolaridade de 317 mOsm/Kg e ph de 8,4. Nos testes de toxicidade nÃo foram encontradas diferenÃas significativas entre o T3 na diluiÃÃo 1:3 comparado com o grupo controle (P=0.06), apresentando motilidade de 80% e VCL de 95 um/s. O melhor mÃtodo de congelamento foi o âdry shipperâ utlizando palhetas de 0,5 mL registrando motilidade de 625 para o T6 na diluiÃÃo de 1:7, entretando, apresentaram baixas velocidades para todos os tratamentos, com melhores resultados de VCL, VSL e VAP para o T6. No sÃmen fresco a morfoanomalia mais encontrada foi a cauda dobrada (20%) e no sÃmen pÃs-descongelaÃÃo, a cauda enrolada (23%). Comparando-se os resultados de morfoanomalia antes e deposi do pÃs-descongelamento foram observadas diferenÃas significativas entre as amostras (P<0,05). Concluiu-se que o sÃmen da Piratininga pode ser preservado em Ringer+Retilglicol 105 em 1:3, sem apresentar altas toxicidades, e criopreservado em Glicose+DMSO 10% utilizando o âdry shipperâ. / The pirapitinga (Piaractus brachypomus) is a species of exotic fish introduced in northeastern Brazil which has great commercial importance due to their feeding habits, excellent growth, resistance management and diseases in captivity. The cryopreservation of their semen may contribute to the economic, environmental and genetic and species of the region. The objective of this study was to develop a protocol suitable for freezing sperm motility to get close to the fresh semen. Worked with the mature male sperm d e19 December 2007 to March 2008, determining the seminal characteristics, the toxicity of the cryoprotectants DMSO and 10% methylglycol 10%, diluted in glucose 5%, ACP 104 and the dilution of Ringer solution 1:3, 1:5 and 1:7 for 15 minutes at 4 Â C, the cryopreservation to -196 Â C with the same condiluiÃÃes using straws of 0.25 and 0.5 mL, frozen in liquid nitrogen vapors in styrofoam boxes or "dry shipper" and then transferred to cryogenic botijÃes for 15 days. We evaluated the motility and velocity through the computer-aided sperm analysis (CASA) after thawing, and sperm morphology fresh and post-thawing. The seminal parameters were observed in fresh: motility average objective of 94%, concentration of 94 x 10 spzt / mL, d e7 mL volume, osmolarity of 317 mOsm / kg and pH of 8.4. In toxicity tests were not significant differences between the T3 in 1:3 dilution compared to the control group (P = 0.06), showing 80% motility and 95 of a VCL / s. The best method of freezing was the "dry shipper" user straws of 0.5 mL recording motility of 625 for T6 in dilution of 1:7, entertain, showed low rates for all treatments, with best results of VCL, VSL and VAP for the T6. In the fresh semen was found more morfoanomalia the tail folded (20%) and the sperm after thawing, the coiled tail (23%). Comparing the results of morfoanomalia deposited before and after the thawing were significant differences between samples (P <0.05). It was concluded that the semen can be preserved in Piratininga Ringer + Retilglicol 105 in 1:3, without high toxicity, and cryopreserved in Glucose + 10% DMSO using the "dry shipper".

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / O objetivo do presente trabalho foi realizar um estudo sobre as proteÃnas do plasma seminal e dos espermatozoides e suas associaÃÃes com morfologia espermÃtica e com mÃtodos de coleta e criopreservaÃÃo de sÃmen de touros Bos indicus das raÃas Brahman e GuzerÃ, utilizando uma abordagem proteÃmica. Foram coletadas amostras de sÃmen e as proteÃnas do plasma seminal foram separadas atravÃs de eletroforese bidimensional ou eletroforese bidimensional em gel diferencial e identificadas por espectrometria de massa. O proteoma do plasma seminal dos touros Bos indicus foi descrito identificando as Binder of sperm proteins como as proteÃnas mais abundantes no fluido seminal, enquanto que as spermadhesins formaram o segundo grupo com maior expressÃo. Foram encontradas associaÃÃes positivas e negativas entre as proteÃnas do plasma seminal e a porcentagem de espermatozoides morfologicamente normais constituindo possÃveis marcadores moleculares desta caracterÃstica. Em outro aspecto, foram identificadas diferenÃas no volume do ejaculado e no perfil proteico do plasma seminal touros Bos indicus submetidos a diferentes mÃtodos de coleta de sÃmen (vagina artificial interna e eletroejaculaÃÃo). Baseado nas anÃlises dos gÃis bidimensionais, 22 spots tiveram volumes maiores nas amostras coletadas por vagina artificial interna, correspondendo a 21 proteÃnas. Em contrapartida, 33 spots correspondendo a 26 proteÃnas tiveram maiores volumes nos gÃis de amostras coletadas por eletroejaculaÃÃo. As principais proteÃnas com maior expressÃo em amostras obtidas por vagina artificial interna e eletroejaculaÃÃo eram de origem epididimÃria e das glÃndulas sexuais acessÃrias, respectivamente. No presente trabalho, ainda foram feitas associaÃÃes entre a expressÃo de proteÃnas no plasma seminal e nas cÃlulas espermÃticas com os parÃmetros do sÃmen pÃs-criopreservaÃÃo em touros Bos indicus da raÃa GuzerÃ. Os animais apresentaram, em mÃdia, peso corporal, circunferÃncia escrotal e parÃmetros seminias prÃ-criopreservaÃÃo do sÃmen sem diferenÃa estatÃstica. De acordo com os parÃmetros espermÃticos pÃs-criopreservaÃÃo obtidos pelo sistema computadorizado de anÃlise de sÃmen os animais foram divididos em grupos de alta e baixa congelabilidade. TrÃs proteÃnas do plasma seminal e cinco dos espermatozoides foram mais expressas no grupo de alta congelabilidade. Outras seis proteÃnas do plasma seminal foram mais expressas no grupo de baixa congelabilidade. Os modelos de regressÃo adotados para as intensidades dos spots do plasma seminal e das cÃlulas espermÃticas, bem como as anÃlises de interaÃÃes proteÃna-proteÃna indicam que a maioria das proteÃnas inversamente associadas com a viabilidade espermÃtica pÃs-descongelaÃÃo pode ser expressa como uma resposta a um estresse oxidativo e/ou ataque microbiano antes da criopreservaÃÃo de sÃmen de animais do grupo de baixa congelabilidade nÃo detectado pelas anÃlises convencionais do sÃmen. AtravÃs da utilizaÃÃo de uma abordagem proteÃmica, os resultados encontrados no presente trabalho podem servir de orientaÃÃo para futuras pesquisas que visem identificar marcadores moleculares de processos reprodutivos baseado na expressÃo de proteÃnas no plasma seminal e nas cÃlulas espermÃticas de touros Bos indicus. / The aim of this work was to study seminal plasma and whole sperm proteins and their association with sperm morphology and methods of semen collection and cryopreservation in Bos indicus bulls using a proteomics approach . Seminal plasma proteins were separated by two-dimensional electrophoresis or diferential gel electrophoresis and identified by mass spectrometry gel. Firstly, we described the seminal plasma proteome of Bos indicus bulls, identified the Binder of Sperm Proteins as the more abundant proteins in seminal fluid, while the spermadhesins formed the second group with higher expression. Positive and negative associations were found between seminal plasma proteins and the percentage of morphologically normal spermatozoa constituing possible molecular markers of this characteristic. In other hand, differences were identified in ejaculate volume and seminal plasma protein profile of Bos indicus bulls subjected to different methods of semen collection (internal artificial vagina and electroejaculation). Based on the analysis of two-dimensional gels, 22 spots had larger volumes in samples collected by internal artificial vagina, corresponding to 21 proteins. In contrast, 33 spots had larger volumes of samples collected by electroejaculation corresponding to 26 differents proteins. The proteins with great volume in samples obtained by internal artificial vagina and electroejaculation had epididymal and accessory sex glands origin, respectively. In the present study, others associations have been made among protein expression in seminal plasma and sperm cells and semen parameters after cryopreservation in Bos indicus bulls. The animals had not differences between body weight, scrotal circumference and seminal parameters pre-freezing. After cryopreservation, the semen parameters were analyzed by computer system (CASA) and the animals were divided into groups of low and high freezability. In the high freezability group were more expressed three proteins of seminal plasma and five proteins of sperm. For the group of low freezability were more expressed six different seminal plasma proteins. Regression models adopted for the intensities of the spots in the seminal plasma and sperm cells, as well as analysis of protein-protein interactions, indicate that most of the proteins inversely associated with post -thaw sperm viability may be expressed as a response to an oxidative stress and/or microbial attack before the semen cryopreservation of animals with low freezability. These parameters could not be detected by conventional sperm analysis. This results obtened by applying of the proteomics approach, could serve as guideline for future researchs aimed to identifed molecular markers of reproductive processes based on the expression of proteins in seminal plasma and sperm cells of Bos indicus bulls.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / Novas exigÃncias de mercado sÃo estabelecidas e com estas, novos modelos produtivos, com menor impacto ambiental, devem ser adotados para atender as necessidades dos consumidores, sem que resulte em prejuÃzos à produtividade do sistema. Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar a eficiÃncia da bioestimulaÃÃo (Efeito Macho) pela taxa de concepÃÃo e pariÃÃo de cabras inseminadas artificialmente com sÃmen fresco. Para tanto, foram avaliadas a taxa de fertilidade e pariÃÃo de 73 cabras, pertencentes ao grupo genÃtico Saanen e seus mestiÃos com Anglonubiano, submetidas à inseminaÃÃo artificial, que tiveram o estro induzido e sincronizado pelo efeito macho. O experimento ocorreu durante os perÃodos chuvoso (marÃo-abril) e seco (agosto-setembro) de 2012. Foram coletados dados referentes Ãs variÃveis climÃticas (TA: temperatura ambiente; e UR: umidade relativa do ar) para o cÃlculo do ITU (Ãndice de temperatura e umidade). Os dados foram submetidos à anÃlise estatÃstica a 5% de probabilidade. O ITU foi mais elevado (P<0,05) para o perÃodo chuvoso, e assumiu valores acima dos ideais para caprinos, apresentando situaÃÃo de emergÃncia para o perÃodo chuvoso, e de perigo para o perÃodo seco. O efeito macho mostrou-se eficiente independente da Ãpoca do ano, resultando em 94,5% cabras em estro. A duraÃÃo do primeiro estro foi semelhante entre o perÃodo chuvoso e seco, com mÃdia geral de 23,4 horas. O intervalo entre inÃcio do efeito macho e manifestaÃÃo do estro de 11 dias, havendo uma maior manifestaÃÃo de estro (primeiro estro) logo na primeira semana para ambos os perÃodos. Em geral, 65% das cabras retornaram em estro, sendo o intervalo entre o inÃcio do efeito macho e a manifestaÃÃo do segundo estro foi maior (P<0,05) para o perÃodo chuvoso (27,8 dias), isto està relacionado ao tipo de ciclo estral, onde houve um maior (P<0,05) nÃmero de ciclos normais (20) para este perÃodo, e um elevado (P<0,05) nÃmero de ciclos curtos (15) para o perÃodo seco. A fertilidade para o perÃodo seco (57,6%) foi proporcionalmente superior ao perÃodo chuvoso (44,4%). No entanto, a taxa de pariÃÃo mostrou uma tendÃncia (P=0,57) a ser superior para o perÃodo seco. Esta menor taxa para o perÃodo chuvoso pode estar relacionado à alta variaÃÃo climÃtica observada durante o perÃodo experimental. Em geral, o segundo estro foi mais propÃcio à resultar em fertilidade, seja para o perÃodo chuvoso ou seco. Com isso, conclui-se que a inseminaÃÃo artificial de cabras com estro induzido e sincronizado pelo uso do efeito macho à um manejo que pode ser empregado para a produÃÃo de caprinos resultando em Ãndices reprodutivos satisfatÃrios. / New market requirements are established and with them, new production models it should be adopted to meet the consumers demands, without resulting in damage to system productivity, with less environmental impact. The aim this study was to evaluate the effectiveness of Male Effect by fertility rate of goats inseminated artificially. Thus, we evaluated the fertility and calving rates of 73 goats belonging to genetic group Saanen and its crossbred. This does had their estrus induced and synchronized by the male effect and it were artificially inseminated with fresh semen. The experiment took place during the rainy (March-April) and dry (August-September) seasons of 2012. We collected data on climatic variables (RT: room temperature; and RH: relative humidity) for calculating the THI (temperature and humidity index). Data were analyzed statistically at 5% probability. The THI was higher (P<0.05) in the rainy season, and it assumed values above ideal for goats, with an emergency situation to the rainy season, and dangerous situation to the dry season. The male effect was effective regardless of season, it resulting in 94.5% of estrus. The duration of the first estrus was same between the rainy and dry season, it had a mean duration of 23.4 hours. The interval between the onset of the male effect and estrus was 11 days, and there was a greater manifestation of estrus (first heat) in the first week for both seasons. Overall, 65 % of goats returned in estrus, it been the interval between the onset of the male effect and second estrus manifestation was greater (P<0.05) during the rainy season (27.8 days). This is related to the estrous cycle length, where there was a greater (P <0.05) number of normal estrus cycles (20) during rainy season, and high (P <0.05) number of short estrus cycles (15) during dry season. The fertility during the dry season (57.6 %) was proportionally greater than rainy season (44.4 %). However, the calving rate showed a trend (P = 0.57) to be higher the dry season. This lower rate during rainy season may be related to high climate variability observed during this experimental period. The second estrus was more like to result in fertility, during rainy or dry season. This indicates that the artificial insemination of goats with induced and synchronized estrus by male effect is a management can be utilized in goat production systems resulting in satisfactory reproductive rates.

nÃo hà / O presente estudo avaliou os efeitos da inclusÃo de 13% de farelo de castanha de caju (CNM) na dieta de carneiros Morada Nova nos parÃmetros seminais e proteÃnas do plasma seminal. Vinte carneiros foram distribuÃdos em dois grupos iguais: grupo castanha de caju (CNG) e grupo controle (COG). O CNG e COG receberam 13% e 0% de CNM na dieta durante 90 dias. Os grupos foram comparados para peso corporal, circunferÃncia escrotal, parÃmetros seminais e proteÃnas do plasma seminal, utilizando o MÃtodo de Shotgun Proteomics. Peso corporal e circunferÃncia escrotal aumentaram durante os 90 dias do perÃodo experimental em ambos grupos, porÃm nÃo existiu diferenÃa significativa entre CNG e COG. Contudo, apÃs 60 dias, o consumo de matÃria seca foi inferior no CNG (2,9  0,1; aos 90 dias) em relaÃÃo ao COG (3,4  0,1; aos 90 dias). Os parÃmetros seminais nÃo diferiram entre CNG e COG. A anÃlise shotgun proteomics identificou isoaspartil peptidase L asparaginase, gliceraldeÃdo 3 fosfato desidrogenase e prostaglandina H2 D isomerase com alta expressÃo no CNG quando comparado COG. Ao mesmo tempo, 12 proteÃnas do plasma seminal apresentaram baixa expressÃo no CNG, identificadas como beta galactosidase, caltrina, beta mannosidase, glutationa peroxidase, sorbitol desidrogenase, clusterina, albumina and serotransferrina. AlÃm disso, 20 proteÃnas detectadas no plasma seminal do COG foram ausentes no CNG e cinco proteÃnas foram presentes somente nos carneiros que receberam dieta hiperlipÃdica. Em conclusÃo, o presente estudo descreveu, pela primeira vez, os efeitos de uma dieta hiperlipÃdica nos parÃmetros do sÃmen fresco e do plasma seminal de carneiros. Enquanto os critÃrios seminais nÃo foram afetados, proteÃnas especÃficas do fluido seminal foram alteradas em decorrÃncia da dieta com castanha de caju. Visto os aspectos multifuncionais dessas proteÃnas, nÃs sugerimos que certos aspectos da fertilidades de carneiros podem ser alteradas se a castanha de caju for fornecida. / The present study was carried out to evaluate the effects of 13% of cashew nut meal (CNM) inclusion in the diet of Morada Nova rams on semen parameters and seminal plasma proteins. Twenty rams were distributed in two equal groups: cashew nut group (CNG) and control group (COG). The CNG and COG received 13% and 0% of CNM in the diet for 90 days. The groups were compared for live weight, scrotal circumference, seminal parameters and seminal plasma proteins, using shotgun proteomics. Body weight and scrotal circumference increased during the 90-day experimental period in both cashew nut-fed and control groups but with no differences between CNG and COG. However, after 60 days until 90 days, percentage of dry matter intake (% live weight) was inferior in CNG (2,9  0,1; at 90 days) group than COG (3,4  0,1; at 90 days). The sperm quality parameters were not different between CNG and COG.The shotgun proteomics analysis identified isoaspartyl peptidase L asparaginase, glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase and prostaglandin H2 D isomerase with higher expression in the cashew nut group as compared to animals receiving the control diet. Conversely, 12 seminal plasma proteins had lower expression in the cashew nut group, identified as beta galactosidase, caltrin, beta mannosidase, glutathione peroxidase, sorbitol dehydrogenase, clusterin, albumin and serotransferrin. Moreover, 20 proteins detected in the seminal plasma of the control animals were absent in the cashew nut fed animals and five were present only in the rams receiving the high fat diet. In conclusion, the present study describes, for the first time, the effects of a high fat diet on parameters of the fresh semen and seminal plasma proteins of rams. While sperm criteria were not affected, specific seminal fluid proteins did change as the result of cashew nut feeding. Given the multifunctional aspects of such proteins, we suggest that certain aspects of the ram fertility can be altered if cashew nut is provided.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / The aim this study were (i) to map and identify proteins in seminal plasma of New Zealand white rabbits strain, using the techniques of two-dimensional electrophoresis coupled to mass spectrometry and to estimate associations between these proteins with sperm parameters and (ii) characterize expression of the nerve growth factor polypeptide beta ( -NGF) and its cognate neurotrophic receptor tyrosine kinase type 1 (NTRK1), and nerve growth factor receptor (NGFR) at gonads and sex glands in adult New Zealand white rabbits as well as the NGF concentration in seminal plasma of sexually mature animals, using RT - PCR and immunohistochemistry. Also was measured the NGF concentration in the blood and seminal plasma by ELISA. Study 1 was performed at Federal University of CearÃ, in Fortaleza-Ce. Semen samples were collected from 18 adult rabbits, using an artificial vagina. After collecting proceeded to the evaluation of semen quality parameters: total motility, individual progressive motility, sperm concentration, sperm morphology and functional tests: membrane integrity (HOST), acrosomal integrity and vitality. The seminal plasma was obtained by centrifugation of semen, and subjected to two-dimensional electrophoresis. Gels were stained with colloidal Coomassie, scanned and analyzed in PDQuest application. The individual spots were excised from the gels, digested with trypsin, and submitted to mass spectrometry (ESI-QUAD-TOF) to identification. The results were subjected to statistical analysis to verify the existence of associations between the presence and / or intensity of the spots present in the protein maps of seminal plasma with the semen quality parameters. The associations between the parameters of ejaculated sperm and the expression of seminal plasma proteins of rabbits were estimated by multiple regression models using the REG procedure of SAS statistical application (v.9.0, 2002) with STEPWISE selection. 232  69.5 spots/gel were detected with 34 spots consistently present in all gels. These 34 spots corresponded to 15% of the total number of spots, representing 32% of the optical intensity of all the spots. Mass spectrometry identified approximately 95% of the detected spots (identified: 220 spots; analyzed: 232 spots), which corresponded to 87 different proteins. The most abundant proteins were the annexins, zeta-globin, lipocalin, FAM 115 protein and a serpins cluster. Other proteins also have been identified, such as transferrin, heat shock protein, glutathione transferase and others. The NGF (protein nerve growth factor) presence also has been identified which has been reported in other species such as ovulation induction factor. This 87 proteins identified in seminal plasma of rabbits participate mainly of biological processes associated with cellular processes (65.25%), regulation (64.25%) and response to stimuli (22.9%). Significant associations were observed between the proteins identified in seminal plasma of rabbits with sperm evaluated parameters such as individual progressive motility, sperm viability, cells with morphology and functional membranes have been associated with specific proteins. Associations were observed for several proteins with the same sperm parameter. According to literature, this is first report about the proteome of seminal plasma of rabbits and its role on the seminal parameters. Knowledge of these proteins contributes to a better understanding of the regulatory mechanisms of seminal plasma on sperm function in rabbits. Study 2 was conducted at Università Degli Studi di Perugia in the city of Perugia-Pe, Italy. It was evaluated the expression of NGF protein that was previously identified during study 1. The immunoreactivity and gene expression of NGF and cognate receptors were detected in testis, prostate and seminal vesicle. The highest levels of NGF and NTRK1 transcripts were found in prostate, while intermediate expressions were found in testis. NGFR transcripts were expressed at the same level on both the testis and prostate, and were more abundant than in seminal vesicles. The widespread distribution of NGF in all glandular cells of the prostate, coupled with its high abundance of mRNA on confirm that the prostate is a major source of this neurotrophin in rabbits. In conclusion, the present data suggest that NGF is involved in developmental system and spermatogenesis of testis rabbits and that NGF can act as a potential factor for induction of ovulation, being abundantly present in seminal plasma. / Os objetivos deste estudo foram (i) mapear e identificar as proteÃnas do plasma seminal de coelhos da raÃa Nova ZelÃndia Branca, utilizando as tÃcnicas de eletroforese bidimensional associada à espectrometria de massa e estimar associaÃÃes entre essas proteÃnas com os parÃmetros espermÃticos e (ii) caracterizar a expressÃo do fator de crescimento nervoso, poliptido beta ( -NGF), e os seus receptores cognatos neurotrÃficos da tirosina-quinase de tipo 1 (NTRK1) e receptor fator de crescimento nervoso (NGFR) nas gÃnadas e glÃndulas sexuais de coelhos da raÃa Nova ZelÃndia Branca, bem como as concentraÃÃes de NGF no plasma seminal de animais sexualmente maduros, utilizando as tÃcnicas de RT - PCR e imunohistoquÃmica. TambÃm foi dosada a concentraÃÃo da NGF no sangue e no plasma seminal atravÃs da tÃcnica de ELISA. O estudo 1 foi realizado na Universidade Federal do CearÃ, na cidade de Fortaleza-Ce. Foram coletados amostras de sÃmen de 18 coelhos adultos, utilizando- se uma vagina artificial. ApÃs a coleta procedeu-se a avaliaÃÃo dos parÃmetros qualidade seminal: motilidade, vigor, concentraÃÃo espermÃtica, morfologia espermÃtica e os testes funcionais: integridade de membrana, integridade acrossomal e vitalidade. O plasma seminal foi obtido pela centrifugaÃÃo do sÃmen, e submetido à eletroforese bidimensional. Os gÃis foram corados com Coomassie coloidal, digitalizados e analisados no aplicativo PDQuest. Os spots foram cortados individualmente dos gÃis, digeridos com tripsina, e submetidos à identificaÃÃo por espectrometria de massa (ESI- QUAD-TOF). Os resultados obtidos foram submetidos a avaliaÃÃo estatÃstica para verificar a existÃncia de associaÃÃes entre entre a presenÃa e/ou intensidade dos spots presentes nos mapas protÃicos do plasma seminal com os parÃmetros de qualidade seminal. As associaÃÃes entre os parÃmetros dos espermatozoides ejaculados e a expressÃo das proteÃnas do plasma seminal dos coelhos foram estimadas por modelos de regressÃo mÃltipla usando o procedimento REG do aplicativo estatÃstico SAS (v.9.0, 2002) com a seleÃÃo STEPWISE. Foram detectados 232  69,5 spots protÃicos por gel, com 34 spots presentes consistentemente em todos os gÃis. Esses 34 spots corresponderam a 15 % do total do nÃmero de spots, representando 32 % da intensidade Ãptica de todos os spots. A espectometria de massa identicou aproximadamente 95% dos spots detectados (220 spots de um total de 232), que corresponderam a 87 proteÃnas diferentes. As proteÃnas mais abundantes foram as anexinas, zeta-globina, lipocalinas, proteina FAM 115 e um grupamento de serpinas. Outras proteÃnas tambÃm foram identificadas, tais como: transferrina, heat shock protein, glutationa transferase, entre outras. TambÃm foi identificada apresenÃa da proteÃna fator de crescimento nervoso (NGF) que tem sido relatada em outras espÃcies como fator de induÃÃo à ovulaÃÃo. As 87 proteÃnas identificadas no plasma seminal de coelhos participam principalmente dos processos biolÃgicos associados a processos celulares (65,25 %), regulaÃÃo (64,25 %) e resposta a estÃmulos (22,9 %). Foram observadas associaÃÃes significativas entre as proteÃnas identificadas no plasma seminal de coelhos com os parÃmetros espermÃticos avaliados,tais como vigor, nÃmero de cÃlulas viÃveis, morfologia espermÃtica e cÃlulas com membranas funcionais foram associados com proteÃnas especÃficas. Foram observadas associaÃÃes de vÃrias proteÃnas com um mesmo parÃmetro espermÃtico. De acordo com a literatura, este representa o primeiro relato sobre o proteoma do plasma seminal de coelhos e seu papel sobre os parÃmetros seminais. O conhecimento dessas proteÃnas contribuirà para uma melhor compreensÃo dos mecanismos de regulaÃÃo do plasma seminal sobre a funÃÃo espermÃtica em coelhos. O estudo 2 foi conduzido na Università Degli Studi di Perugia, na cidade de Perugia-Pe, ItÃlia. Foi avaliada a expressÃo da proteÃna NGF que foi previamente identificada no estudo 1. A imunorreatividade e a expressÃo gÃnica da NGF e os seus receptores cognatos foram detectados nos testÃculos, prÃstata e vesÃcula seminal. Os nÃveis mais elevados de NGF e NTRK1 transcritos foram encontrados na prÃstata, enquanto expressÃes intermediÃrias foram encontradas no testÃculo. NGFR transcritos foram expressos nos mesmos nÃveis em ambos os testÃculos e da prÃstata e eram mais abundantes do que nas vesÃculas seminais. A distribuiÃÃo generalizada de NGF em todas as cÃlulas glandulares da prÃstata, juntamente com a sua abundÃncia de RNAm relativo, confirmam que a prÃstata à das principais fontes desta neurotrofina em coelhos. Em conclusÃo, os presentes dados sugerem que o sistema NGF està envolvido no desenvolvimento testicular e espermatogÃnese de coelhos e que o NGF pode atuar como um potencial fator de induÃÃo à ovulaÃÃo, sendo abundantemente presentes no plasma seminal.

FundaÃÃo Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Cientifico e TecnolÃgico / Esta tese de doutorado apresenta um estudo sobre a utilizaÃÃo de dois bioprodutos, o primeiro a base de extrato lÃquido da palma forrageira gigante (Opuntia ficus indica) liofilizado e o segundo a Ãgua de coco em pà ACP-104, como diluente de sÃmen de curimatà comum (Prochilodus brevis). Este estudo foi motivado pela escassez de informaÃÃes sobre o sÃmen da espÃcie, dos bioprodutos testados e pela necessidade de desenvolver um protocolo de resfriamento e criopreservaÃÃo utilizando sÃmen de curimatà comum associados aos bioprodutos à base de palma forrageira e ACP-104. A tese està apresentada em trÃs capÃtulos. O primeiro capÃtulo trata de um artigo de revisÃo contendo as biotÃcnicas empregadas na conservaÃÃo de gametas. Nele relatam-se as tÃcnicas de resfriamento, congelaÃÃo e descongelaÃÃo de sÃmen e avaliaÃÃo morfolÃgica e computadorizada de espermatozoides de curimatà comum (P. brevis). O segundo capÃtulo objetiva a criopreservaÃÃo e anÃlise morfolÃgica dos espermatozoides de curimatà comum (P. brevis) diluÃdos em soluÃÃes a base de extrato de palma forrageira gigante (O. ficus) liofilizado, ACP (Ãgua de coco em pÃ) e soluÃÃo de glicose a 5%. Neste experimento foi utilizado o programa computacional CASA (Computer-Assisted Sperm Analyser) para analisar as propriedades de trajetÃria e velocidade dos espermatozoides para cada soluÃÃo estudada. Esta pesquisa teve como objetivo principal avaliar os efeitos da criopreservaÃÃo do sÃmen de curimatà comum (P.brevis), utilizando como diluente o extrato de palma forrageira gigante (O. ficus) liofilizado (EPFL). A metodologia empregada na criopreservaÃÃo do sÃmen de curimatÃ, utilizando os diluentes ELPF 30%; ELPF 50%, ACP-104 e Glicose 5%, permitiu a obtenÃÃo de taxas de motilidade pÃs-descongelamento superiores a 60%. O melhor meio de congelaÃÃo seminal de P. brevis, nas condiÃÃes testadas à o que utiliza a associaÃÃo do ACP-104 com o DMSO 10%. A metodologia empregada na criopreservaÃÃo do sÃmen de curimatà (P. brevis), utilizando os diluentes ELPF 30%; ELPF 50%, ACP-104 e Glicose a 5%, foram adequadas, permitindo a obtenÃÃo de taxas de motilidade pÃs-descongelamento superiores a 60%. Os resultados expressivos foram aqueles obtidos quando se utilizou a associaÃÃo do ACP-104 e DMSO 10%. Os demais tratamentos podem ser considerados num programa de reproduÃÃo assistida, jà que apresentaram desempenho dentro dos padrÃes de utilizaÃÃo de sÃmen criopreservados na espÃcie Prochilodus brevis. / This thesis presents a study on the use of two bioproducts, the first base of liquid extract of giant cactus pear (Opuntia ficus indica) lyophilized and the second the coconut powder ACP-104 as diluent semen common curimatà (Prochilodus brevis). This study was motivated by the scarcity of information about the semen of species of tested bioproducts and the need to develop a protocol for cooling and cryopreservation of semen using common curimatà associated with bioproducts based on cactus pear and ACP-104. The thesis is presented in three chapters. The first chapter is a review article containing biotechnologies employed in the preservation of gametes. Report him to the techniques of cooling, freezing and thawing of semen and morphological and computerized assessment of sperm of common curimatà (P. brevis). The second chapter aims to morphological analysis and cryopreservation of sperm of common curimatà (P. brevis) diluted in solutions based on extracts of giant cactus pear (O. ficus) lyophilized, ACP (coconut milk powder) and glucose solution 5%. In this experiment the computer program CASA (Computer-Assisted Sperm Analyser) was used to analyze the properties of trajectory and speed of sperm for each solution studied. This research aimed to evaluate the effects of cryopreservation of semen from common curimatà (P.brevis), using as diluent extract giant cactus pear (O. ficus) lyophilized (EPFL). The methodology used in sperm cryopreservation of curimatà using the diluents ELPF 30%; ELPF 50%, ACP-104 and 5% dextrose, afforded the rate of post-thaw motility higher than 60%. The best way of semen freezing P. brevis, the tested conditions is what uses the association of ACP-104 with 10% DMSO. The methodology used in sperm cryopreservation of curimatà (P. brevis) using diluents ELPF 30%; ELPF 50%, ACP-104 and 5% glucose were suitable, capable of producing rates higher post-thaw motility 60%. The significant results were those obtained when using the combination of ACP-104 and 10% DMSO. The other treatments may be considered an assisted reproductive program, as presented within the performance standards for the use of cryopreserved semen in species Prochilodus brevis.

CoordenaÃÃo de AperfeÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Os objetivos deste estudo foram: 1) avaliar os aspectos da interaÃÃo das Binder of SPerm proteins (BSP) presentes no plasma seminal de caprinos e as principais proteÃnas do leite; 2) determinar se as BSP homÃlogas do plasma seminal de equinos, suÃnos e ovinos possuem propriedades de ligaÃÃo as proteÃnas do leite semelhante Ãs BSP bovinas; 3) investigar a interaÃÃo das proteÃnas do plasma seminal de caprinos e os componentes dos diluidores à base de lecitina de soja; 4) identificar as proteÃnas do plasma seminal de touros Curraleiro (PÃ-duro) associadas à circunferÃncia escrotal e os parÃmetros seminais. Para tanto, o leite desnatado tratado termicamente foi incubado com as proteÃnas do plasma seminal de caprinos e, aplicados em coluna cromatogrÃfica de gel filtraÃÃo na presenÃa e na ausÃncia de cÃlcio. AlÃm disso, o leite desnatado foi fracionado em duas fraÃÃes, MF-1 (proteÃnas do soro de leite) e MF-2 (caseÃnas), e posteriormente incubadas com as proteÃnas do plasma seminal de caprinos, seguida pela aplicaÃÃo em coluna de gel filtraÃÃo. As fraÃÃes foram eluÃdas e analisadas por Western blot. Adicionalmente, outras anÃlises foram realizadas para avaliar as propriedades desta ligaÃÃo. No primeiro procedimento, uma placa de ELISA foi sensibilizada com leite desnatado tratado termicamente e, em seguida, incubadas com diluiÃÃes em sÃrie de BSP purificadas e plasma seminal caprino, seguido por incubaÃÃo com anticorpos primÃrio e secundÃrios. Na segunda anÃlise, o leite desnatado, caseÃnas, &#945;-lactalbumina, &#946;-lactoglobulina diluÃdas em sÃrie foram gotejadas sobre uma membrana de nitrocelulose e, posteriormente, as membranas foram incubadas com plasma seminal de caprinos. A interaÃÃo foi detectada pela incubaÃÃo com anticorpos primÃrios e secundÃrios. No terceiro experimento, os espermatozoides epididimÃrios foram incubados com: (1) citrato/glicose + plasma seminal caprino, (2) plasma seminal caprino + diluidor leite, e (3) diluidor leite + plasma seminal de caprino. ApÃs o perÃodo de incubaÃÃo, as proteÃnas da membrana de espermatozoides foram extraÃdas e analisadas por Western blot. No segundo estudo, o leite desnatado foi incubado com as proteÃnas do plasma seminal de bovino, equino, suÃno e ovino, separadamente, e em seguida, foram aplicados em coluna cromatografia de filtraÃÃo em gel. AlÃm disso, a interaÃÃo de componentes de diluidores à base de lecitina de soja (Andromed e BioxcellÂ) foi investigada por cromatografia de filtraÃÃo em gel e ultracentrifugaÃÃo. Uma alÃquota de diluidor à base de lecitina de soja foi incubada com as proteÃnas do plasma seminal de caprinos e aplicadas em coluna de gel filtraÃÃo. As fraÃÃes foram eluÃdas e, apÃs este procedimento, as amostras foram analisadas por Western blot. A anÃlise por ultracentrifugaÃÃo foi realizada na ausÃncia e na presenÃa de vesÃculas de fosfolipÃdios oriundas de diluidores a base de lecitina de soja, Andromed e BioxcellÂ. As vesÃculas isoladas foram incubadas com as proteÃnas do plasma seminal de caprino. ApÃs a ultracentrifugaÃÃo, a presenÃa de BSP no sobrenadante e no sedimento foi analisada por Western Blot. Adicionalmente, o plasma seminal de dez touros Curraleiro (PÃ-duro) foi analisado por 2-D eletroforese. Os gÃis corados por Coomassie foram analisados no aplicativo PDQuestÂ. Nossos resultados demonstraram que as proteÃnas de BSP do plasma seminal caprino se ligam Ãs proteÃna do leite, especialmente, as caseÃnas e &#946;-lactoglobulina. AlÃm disso, estas proteÃnas interagem com as vesÃculas de fosfolipÃdios presentes nos diluidores Andromed e BioxcellÂ. As BSP de bovinos, equinos e suÃnos tambÃm se ligam aos componentes do leite. Jà as BSP de ovinos nÃo interagem com os componentes do leite desnatado. Nossas analises demonstraram que vinte e sete spots proteÃcos se correlacionam com pelo menos um parÃmetro reprodutivo. Em resumo, nossos resultados indicam que as BSP de caprinos se ligam Ãs proteÃnas do leite e aos fosfolipÃdios do diluidor Andromed e BioxcellÂ. Isto sugere que estes componentes tÃm um papel significativo na proteÃÃo de espermatozoide de caprinos, pois sequestram as BSP presentes no sÃmen. Nossos resultados sugerem que as BSP homÃlogas presentes no plasma seminal de equinos e suÃnos apresentam propriedades de ligaÃÃo Ãs proteÃnas do leite semelhantes Ãs BSP bovinas. AlÃm disso, o plasma seminal de touros Curraleiro (PÃ-duro) tem potenciais proteÃnas relacionadas com parÃmetros de qualidade seminal. Estes resultados sÃo de grande interesse, visto que elucida aspectos relacionados aos mecanismos de proteÃÃo dos espermatozoides pelos diluidores, para o desenvolvimento de novos diluidores livre de produtos de origem animal e na identificaÃÃo de proteÃnas com potencial à marcadores de fertilidade no plasma seminal de bovino. / The objectives of this study were: 1) to evaluate aspects of interaction between goat seminal plasma proteins and milk proteins; 2) to determine if homolog Binder of Sperm Proteins (BSP) from stallion, boar and ram seminal share the binding properties of the bovine BSP for the milk proteins; the mechanism of bovine sperm protection by milk is similar in different species of mammals; 3) to investigate the interactions of BSP proteins present in goat seminal plasma and phospholipids from soybean lecithin-based extender; 4) to identify seminal plasma proteins associated with scrotal circumference and sperm parameters. Heated skimmed milk was incubated with goat seminal plasma proteins and loaded onto Sepharose CL-4B column both in the presence and absence of calcium. Fractions were eluted and evaluated by Western blots using anti-goat BSP antibodies. Also, we fractionated milk into two fractions, MF-1 (mostly whey proteins) and MF-2 (mostly caseins), which were incubated with goat seminal plasma proteins and passed through gel filtration columns. Eluted fractions were then analysed by immunoblotting with anti-BSP antibodies. In addition, a series of analysis was conducted to evaluate binding properties involving milk and seminal plasma proteins. In the first procedure, an ELISA plate was saturated with heated skimmed milk and then incubated with serial dilutions of purified BSP proteins, goat seminal plasma proteins and anti-goat BSP. In a second analysis, heated skimmed milk, casein, &#945;-lactalbumin and &#946;-lactoglobulin were spotted onto a nitrocellulose membrane with serial dilutions. Membranes were then overlaid with goat seminal plasma proteins. Binding between milk and seminal plasma components were detected by successive incubations with primary and secondary antibodies. A third set of analysis was conducted to evaluate interactions among ejaculated and caudal epididymal sperm, milk and goat seminal plasma proteins. Epididymal sperm from each animal was incubated with: (1) citrate-glucose medium followed by seminal plasma; (2) with seminal plasma followed by milk extender; (3) with milk extender followed by seminal plasma (Fig. 1). Both ejaculated and epididymal goat sperm were also incubated with citrate-glucose medium without seminal plasma, as positive and negative controls, respectively. Following incubations, sperm membrane proteins were extracted and the presence of goat BSP proteins was assessed by Western blot Furthermore, heated skim milk was incubated with seminal plasma proteins from bulls, stallions, boars and rams and then loaded onto gel filtration column. The proteins were eluted and fractions were analysed by immunoblotting. Moreover, the interaction of hospholipids vesicles from soybean lecithin-based extender (Andromed and BioxcellÂ) and goat BSP proteins was investigated by gel filtration chromatography and ultracentrifugation analysis. An appropriate volume of soybean-based extender was incubated with goat seminal plasma proteins and passed through a gel filtration column. Proteins were eluted and fractions analysed by Western blot. Ultracentrifugation analysis was performed in the absence or in the presence of phospholipid vesicles. These vesicles were isolated from soybean lecithin extender and incubated with goat seminal proteins. The presence of goat BSP proteins in the supernatant and in the pellet was assessed by Western blot. In addition, seminal samples from ten Curraleiro Bulls were subjected to 2-D electrophoresis and Coomassie blue-stained gels analyzed with PDQuest software. Our results demonstrated that goat BSP proteins bound to milk protein, specially caseins and &#946;-lactoglobulin. In addition, these proteins interact with phospholipids vesicles of Andromed and BioxcellÂ. Bull, stallion and boar BSP proteins also bind to milk protein, whereas ram BSP proteins did not bind. Also, we identified that twenty and seven protein spots presented significant correlation with at least one reproductive parameter. In summary, our results indicate that goat BSP proteins bind to milk proteins and phospholipids from Andromed and Bioxcell semen extender. This suggests that these components play a significant role in protecting goat sperm by sequestrating all BSP proteins in semen. We also demonstrated that BSP homologs in boar, stallion seminal plasma share the binding properties of the bovine BSP for the milk proteins. Additionally, Curraleiro seminal plasma has potential proteins related to quality sperm parameters and they should be tested as putative fertility markers. These findings are of considerable interest in view of the mechanisms of sperm protection by extender constituents, for the development of novel extender free of animal components and the identification of proteins as potential biomarkers of fertility in bovine seminal plasma.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / O presente trabalho tem como objetivo determinar o melhor mÃtodo de congelaÃÃo e envase de sÃmen humano, quando comparado o mÃtodo rÃpido com o lento e o envase em palhetas de 0,25ml com criotubos de 2ml, utilizando como variÃveis a morfologia e motilidade dos espermatozÃides antes e apÃs a criopreservaÃÃo. Trata-se de um estudo experimental, de validaÃÃo de tÃcnica laboratorial. Foi desenvolvido no Centro de ReproduÃÃo Assistida do CearÃ. Foram analisadas dezoito amostras de sÃmen de dezoito voluntÃrios. As amostras foram submetidas à anÃlise da morfologia e motilidade espermÃtica prÃvia à criopreservaÃÃo. Foi determinada ainda uma curva de motilidade espermÃtica nas primeiras trÃs horas. O meio TEST-YOLK foi utilizado como crioprotetor. Depois de adicionado o crioprotetor, o sÃmen foi dividido em partes iguais e envasado em criotubos e palhetas. Metade dos criotubos e das palhetas foi submetida a criopreservaÃÃo pelo mÃtodo rÃpido (RT e RP, respectivamente) e a outra metade pelo mÃtodo lento (LT e LP, respectivamente). Em seguida, as amostras foram descongeladas e determinadas as morfologias, bem como as motilidades logo apÃs a descongelaÃÃo e a cada hora durante trÃs horas. AnÃlise estatÃstica foi realizada pelo programa de SPSS for Windows versÃo 11.0.0. Houve uma queda, estatisticamente significante, da motilidade apÃs a criopreservaÃÃo, motilidade inicial de 58,1% e motilidades nos diferentes tratamentos de 30,3% (LT), 21,1% (LP), 27% (RT) e 19,2% (RP). TambÃm houve uma diminuiÃÃo significante da morfologia normal apÃs a criopreservaÃÃo, em relaÃÃo à morfologia inicial (14,2%), mas nÃo foi observada diferenÃa entre os mÃtodos (12,8%, 12,6%, 12,6% e 12,4%; RP, RT, LP e LT, respectivamente). O mÃtodo LT foi o que obteve uma curva de motilidade espermÃtica mais prÃxima da observada no sÃmen in natura. Conclui-se que o mÃtodo LT foi o que menos afetou a motilidade espermÃtica e que, apesar de ter sido observada uma piora significativa da morfologia espermÃtica apÃs a criopreservaÃÃo, nÃo houve diferenÃa entre os mÃtodos. Palavras-chaves: CriopreservaÃÃo; PreservaÃÃo do SÃmen; EspermatozÃide; ReproduÃÃo / This research has as objective determines the best freezing method and storage of human semen, when compared the fast method with the slow method and the storage in 0,25ml straws with cryotubes of 2ml, using as variables the morphology and motility of the spermatozoa before and after the cryopreservation. It is an experimental study, laboratorial technique validation. It was developed in the Assisted Reproduction Center of CearÃ. Eighteen semen samples from eighteen men were analyzed. The samples were submitted to the analysis of the morphology and motility previous the cryopreservation. It was still determined a spermatozoa motility curve in the first three hours. TEST-YOLK was used as cryoprotective media. After having added the TEST-YOLK media, the semen was divided in same parts and storage in cryotubes and straws. Half of the cryotubes and of the straws was cryopreserved by the fast method (RT and RP, respectively) and the other half by the slow method (LT and LP, respectively). The samples were thawed and analyzed the morphologies, as well as the motilities soon after the thawed and every hour for three hours. Statistical analysis was done by the SPSS program - Windows version 11.0.0. Motility of spermatozoa decrease after the cryopreservation, initial motility was 58,1% and motilities in the different treatments were 30,3% (LT), 21,1% (LP), 27% (RT) and 19,2% (RP). There was a significant decrease of the normal morphology after the cryopreservation, in relation to the initial morphology, but difference was not observed among the methods (RP=12,8%, RT=12,6%, LP=12,6% e LT=12,4%). The motility of LT method was closer than that obtained in the fresh semen. The method LT showed the best recovery of motile cells after freezing and thawing. There was not difference among the methods when appraised the morphology. Key-Word: Cryopreservation; Semen preservation; Spermatozoa; Reproduction.