A hiperplasia adrenal congênita (HAC) é um grupo de doenças hereditárias causadas por uma deficiência em uma das enzimas necessárias para a síntese de cortisol no cortex adrenal. Mais de 95% de todos os casos de HAC são devidos a 21-Hidroxilase (21-OHD). Existem 3 formas principais, duas com manifestações clínicas no período neonatal, a forma mais grave perdedora de sal (HAC-PS) e a forma virilizante simples (HAC-VS). Além da perda salina, o excesso de andrógenos leva à virilização de recém nascidas femininas. As formas neonatais são chamadas de clássicas, atividade enzimática da 21-OH bastante reduzida, de < 2% na HAC-PS e de 2-10% na HAC-VS. A forma parcial de início tardio é chamada de HAC não clássica (HAC-NC) e a principal manifestação na infância é a adrenarca precoce. Nesta forma a atividade da 21-OH é de 20-60%. Os programas de triagem para HAC visam, principalmente, ao diagnóstico precoce da forma clássica perdedora de sal, mais grave e potencialmente letal. No Brasil, a triagem pública é realizada no Estado de Goiás desde 1997 e em Santa Catarina desde 2001. No Rio Grande do Sul (RS) foi implantada em maio de 2014 na fase IV do Programa Nacional de Triagem Neonatal. A inclusão da HAC trouxe consigo muitos desafios e a exigência de um fluxo de triagem e diagnóstico bem estruturados. O diagnóstico precoce é crucial para prevenir o óbito de lactentes por insuficiência adrenal. Dosa-se, em papelfiltro, a 17OH progesterona (17-OHP). Elevações podem ocorrer em recém-nascidos sem HAC (falso-positivos), devido a situações de estresse perinatal e por prematuridade. Após avaliação dos dados do primeiro ano de triagem para HAC neste estudo, a mediana da idade da coleta nos casos diagnosticados foi de 8 dias (4.25-15.75). Dos 8 casos diagnosticados de maio de 2014 a abril de 2015, 6 casos com forma perdedora de sal (incluindo 1 caso de óbito por coleta tardia do TP aos 38 dias de vida). A incidência encontrada em nosso meio no primeiro ano foi de 1:13.551 casos. Com a estratégia do uso de pontos de corte estratificados pelo peso de nascimento18, o índice total de resultados positivos em nosso meio foi de 0,5% da amostra avaliada (“n” total de 514 bebês), sendo mais frequente em recém nascidos com menos de 2000g de peso ao nascer. Além da confirmação clínica e laboratorial, o genótipo é importante, além de confirmar, para estabelecer gravidade da doença e também para ratificar o diagnostico dos falsos positivos na ausência de uma mutação do gene CYP21A2. Um dos casos confirmados de HAC-PS foi associado a múltiplas malformações e craniossinostose severa, suscitando a hipótese de um a associação com defeito de FGFR2. A correlação genótipo- fenótipo na avaliação dos casos em dois anos da triagem alcançou um alto nível de concordância de 87%. Diagnosticada, portanto, de forma assertiva a HAC forma clássica, instituise a terapia glicocorticóide para as formas virilizante simples e acrescenta-se mineralocorticóide para as formas perdedoras de sal. A triagem neonatal é um importante programa de saúde populacional e visa ao diagnóstico precoce de uma patologia com potencial risco à vida pela perda de sal, além de permitir adequada atribuição de sexo nas meninas com virilização genital e à saúde da criança. Estabelecer os fluxos adequados de triagem e manejo, além de ampliar o conhecimento sobre a HAC, com o reconhecimento dos desfechos e tratamentos adequados é essencial para minimizar as possíveis complicações nesta população de maior vulnerabilidade. / Congenital adrenal hyperplasia (CAH) is a group of inherited diseases caused by a deficiency in one of the enzymes required for the cortisol synthesis by the adrenal cortex. More than 95% of all CAH cases are due to 21-hydroxylase (21-OHD). There are 3 forms, two with neonatal clinical manifestation: salt-wasting CAH (SW-CAH\) and the simple virilizing form (HAC-VS). In addition to salt loss, androgens excess lead to the virilization of female newborn. Neonatal forms are defined as classical CAH. The 21-OHD enzymatic activity in SWCAH is less than <2% and in the SV-CAH 2-10%. A late-onset form, with partial enzymatic defect (20-60%) is called non-classical HAC (NC-CAH) and the main manifestation in childhood is early adrenarche. In Brazil, public health screening has been conducted in the State of Goiás since 1997 and in te Sate of Santa Catarina since 2001. In Rio Grande do Sul (RS) it was implemented in May 2014, in phase IV of the National Neonatal Screening Program. The inclusion of CAH in the local screening program brought many challenges and the need of a well structured screening and diagnosis flowchart. Early diagnosis is crucial to prevent infant death due to adrenal insufficiency. Around de world, the screening programs for CAH main purpose is the early diagnosis of the more severe classical forms, especially SW-CAH. The cortisol precursor 17OH progesterone (17-OHP) is the main disease marker and is measured on filter paper. Elevations may occur in infants without CAH (false positive) due to perinatal stress and prematurity. Of newborns screened in the first year, median age of collection in diagnosed cases was 8 days (4.25-15.75) and 8 patients were diagnosed with CAH (four males, four females). The incidence of CAH in the state was 1:13,551. Six cases were identified as classic salt-was-ting CAH and two were cases of virilizing CAH. The overall rate of positive results was 0.5% (n = 514 infants). The number of false positive results was higher among newborns with birth weight < 2,000 g. In addition to clinical and laboratory confirmation, the genotype is important to confirme 21-OH deficiency, to establish disease severity and also in the absence of a mutation of the CYP21A2 gene to more precise exclude the diagnosis of suspected false positives. One of the confirmed cases of SW-CAH was associated with multiple malformations and severe craniosynostosis, raising the hypothesis of an association with FGFR2 mutation. A high genotype- phenotype correlation of 87% was found in the cases after two years of screening. Once the classic CAH is diagnosed, glucocorticoid therapy is instituted and mineralocorticoid is added for SW-CAH. CAH neonatal screening is an important population health program and aims to the early diagnosis of a pathology with a potential risk due to salt loss crisis. The early detection of cases also allows to adequate sex assignment in girls with genital virilization. Establishing adequate screening flows, proper diagnosis and management, in addition to increase knowledge about the disease, with the appropriate recognition of outcomes and treatments is essential to minimize complications in this population of greater vulnerability.

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Orientadores: Maricilda Palandi de Mello, Fernanda Caroline Soardi / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-23T09:56:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lusa_AnaLeticiaGori_D.pdf: 4582728 bytes, checksum: a14d0d0453e90b4a59cb02532b21d83b (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: A Hiperplasia congênita da Adrenal (HCA) é uma das doenças mais comuns com herança autossômica recessiva. Uma das causas é a deficiência da 21-hidroxilase que surge por mutações no gene CYP21A2. O desequilíbrio na síntese de cortisol causa um estímulo excessivo das glândulas adrenais pelo hormônio adrenocorticotrópico (ACTH) e, consequentemente, à hiperplasia da glândula e ao aumento na síntese de andrógenos. O presente trabalho teve por objetivo clonar e expressar variantes do gene CYP21A2 e, avaliar as variantes enzimáticas da 21-hidroxilase quanto à atividade residual, comparando suas formas nativa e mutantes. Foi também realizado o estudo in silico para se comparar as estruturas das enzimas 21-hidroxilase e 3?-hidroxiesteróide desidrogenase tipo 2 (HSD3B2) avaliando o impacto das alterações provocadas por mutações sobre a estrutura da proteína nativa. Para a enzima 21-hidroxilase, as mutações analisadas quanto à atividade foram: p.Ser113Phe, p.Pro267Leu, p.Val358Ile, p.Arg426Cis e, as combinações p.Ile172Asn+p.Val358Ile e p.Val281Leu+p.Arg426Cis. Nos testes de atividade enzimática, as enzimas com as mutações p.Val358Ile e as combinações p.Ile172Asn+p.Val358Ile e p.Val281Leu+p.Arg426Cis apresentaram valores de atividade residual compatíveis com a forma perdedora de sal. Por outro lado, a enzima com a mutação p.Pro267Leu apresentou atividade residual maior que 50%, compatível com mutações da forma não clássica. As mutações p.Ser113Phe e p.Arg426Cis, por sua vez, apresentaram atividade residual entre 2 e 7% que, em relação aos controles utilizados, foram correspondentes à forma clássica virilizante simples. Os modelos estruturais gerados para as enzimas 21-hidroxilase portadoras da deleção p.(Gln389_Ala391del) e das mutações individuais ou combinadas acima citadas foram comparados ao da enzima nativa. Estudo similar foi realizado com enzimas HSD3B2 nativa e portadoras de duas mutações, p.Pro222Gln e p.Pro222Thr, relacionadas à forma perdedora de sal da deficiência de HSD3B2. Esse estudo demonstrou boa correlação das mutações encontradas nos pacientes com os seus fenótipos tanto no que diz respeito à atividade enzimática quanto às alterações estruturais. Assim, ficou demonstrado que este tipo de abordagem é eficaz para a avaliação dos aspectos funcionais de mutações inéditas / Abstract: Congenital adrenal hyperplasia (CAH) is one of the most common hereditary autosomal recessive diseases. 21-hydroxylase deficiency is one important cause of the disease and results from mutations in CYP21A2 gene. The unbalance in cortisol synthesis leads to excessive stimulation of adrenal glands by adrenocorticotropic hormone (ACTH), consequently, to adrenal hyperplasia and excessive androgen synthesis. The present study aimed to obtain and express CYP21A2 clones carrying sequence variations and to evaluate 21-hydroxylase enzymatic residual activities of variant enzymes in comparision to the wild-type. In silico studies were also performed to compare the structure of 21-hydroxylase and 3?-hydroxysteroid dehydrogenase type 2 (HSDB2) evaluating the impact of mutations upon the native structure of the enzymes. Residual activity analyses for 21-hydroxylase enzyme comprised the mutations p.Ser113Phe, p.Pro267Leu, p.Val358Ile and the combined mutations p.Ile172Asn+p.Val358Ile and p.Val281Leu+p.Arg426Cys. The assays indicated that p.Val358Ile and p.Ile172Asn+p.Val358Ile and p.Val281Leu+p.Arg426Cys reduced CYP21A2 activity to levels corresponding to the salt wasting form. Whereas the enzyme bearing p.Pro267Leu mutation showed residual activity higher than 50% indicating a nonclassic mutation. Conversely, p.Ser113Phe and p.Arg426Cys mutations showed residual activities that varied between 2% and 7% that, compared to controls, corresponded to simple virilizing form. Structural models generated for 21-hydroxylase enzyme with p.(Gln389_Ala391del) and each individual or combined mutations cited above have been compared to the native enzime. Similar study was performed with HSD3B2 enzyme in its native and mutated formas with p.Pro222Gln e p.Pro222Thr that are related to the salt wasting form of HSD3B2 deficiency. This study demonstrated a good genotype-phenotype correlation in patients either for residual activities or for structural changes. Therefore, it has been demonstrated that such analyses are effective to evaluate functional aspects for novel mutations / Doutorado / Genetica Animal e Evolução / Doutora em Genética e Biologia Molecular

A deficiência da 21-hidroxilase é uma doença genética comum, causada por mutações no gene CYP21A2, que codifica a enzima 21-hidroxilase (P450c21). A deficiência da 21-hidroxilase afeta a síntese de cortisol e aldosterona e promove acúmulo de precursores, que são desviados para a síntese de andrógenos. Observa-se três principais fenótipos: a forma clássica virilizante simples (VS), na qual as meninas nascem com virilização da genitália externa e ambos os sexos apresentam virilização pós-natal; a forma perdedora de sal (PS), na qual além da virilização, ambos os sexos apresentam crise de perda de sal no período neonatal; e a forma não clássica (NC), na qual os sintomas de hiperandrogenismo iniciam-se mais tardiamente, na infância, adolescência ou idade adulta. Os estudos in vitro das mutações do CYP21A2 demonstram que existe uma boa correlação do grau de comprometimento da atividade enzimática conferido pelo genótipo com o fenótipo. Entretanto, existem algumas divergências como: pacientes que apresentam quadro clínico e hormonal de forma não clássica, nos quais mutações não são identificadas em um ou em ambos os alelos do CYP21A2, e pacientes que apresentam o fenótipo mais leve do que o predito pelo genótipo. Essas divergências sugerem a presença de fatores moduladores do fenótipo na deficiência da 21-hidroxilase. A primeira hipótese foi de que houvesse mutações no gene P450 óxido-redutase (POR), que codifica uma flavoproteína que doa elétrons para as enzimas microssomais P450, inclusive a P450c21, passo fundamental para a atividade enzimática das mesmas. A segunda hipótese foi de que outras enzimas P450, que não a P450c21, tivessem a capacidade de realizar a 21-hidroxilação extra-adrenal da progesterona e 17OH-progesterona (17OHP), sendo então capazes de modular o fenótipo da perda de sal e/ou virilização. Os citocromos P450 hepáticos CYP2C19 e CYP3A4, responsáveis pelo metabolismo de drogas, são capazes de realizar 21-hidroxilação da progesterona, porém essa atividade nunca foi comparada com a atividade de 21-hidroxilação da P450c21, a fim de que se possa extrapolar a importância dessa atividade extra-adrenal in vivo. A casuística desse estudo constou de 11 pacientes com a forma NC e genótipo incompleto, e 6 pacientes com fenótipo discordante do genótipo (5 com genótipo predizendo forma PS e manifestando forma VS, e 1 com genótipo predizendo VS e apresentando forma NC). O gene POR foi sequenciado em todos 17 pacientes e 10/30 alelos não relacionados apresentavam o polimorfismo A503V. O estudo funcional foi realizado através da expressão em bactéria do P450c21, do POR selvagem (PORwt) e da variante do POR A503V, e de estudo enzimático in vitro comparando a 21-hidroxilação da P450c21 promovida pela PORwt e POR A503V. Essa comparação foi realizada através de cálculos dos parâmetros que avaliam cinética enzimática (Km, Vmax e Vmax/Km). Apesar da variante POR A503V diminuir significativamente a atividade da P450c17 in vitro, nosso estudo demonstrou que ela não altera a capacidade de 21-hidroxilase da P450c21. Portanto, não existem substituições no POR que justifiquem as discordâncias de fenótipo/genótipo na deficiência da 21-hidroxilase nesta casuística. Para avaliarmos o papel da 21-hidroxilação extra-adrenal, as enzimas P450c21, as enzimas P450 hepáticas CYP2C19 e CYP3A4 e o POR foram expressos em bactéria. A capacidade das enzimas P450c21, CYP2C19 e CYP3A4 de 21- hidroxilar progesterona e 17OHP foram avaliadas in vitro e medidas através dos mesmos parâmetros de cinética enzimática. Comparado com a P450c21, o Vmax/Km da 21-hidroxilação da progesterona pelos CYP2C19 e CYP3A4 foram 17% e 10%, respectivamente. Os citocromos hepáticos não apresentaram atividade de 21-hidroxilação da 17OHP. Considerando que uma atividade residual mínima de 21-hidroxilação da progesterona é satisfatória para produzir quantidades suficientes de aldosterona para se evitar a perda de sal, este estudo sugere que a atividade de 21-hidroxilação extra-adrenal do CYP2C19 e CYP3A4 é capaz de melhorar o fenótipo de perda de sal, mas não o da deficiência de glicocorticóide. O gene CYP2C19, ao contrário do CYP3A4, é extremamente polimórfico, e são descritos vários haplótipos com diferentes atividades enzimáticas, os quais explicam as diferenças no metabolismo de várias drogas utilizadas na prática clínica. O único polimorfismo ultra-metabolizador é o CYP2C19*17, representado por duas substituições na região promotora que aumentam a transcrição do gene em 2-4 vezes. Os indivíduos que apresentam o haplótipo ultra-metabolizador podem ter maior atividade de 21-hidroxilação extraadrenal da progesterona e, dessa forma, não apresentarem a crise de perda de sal. O gene CYP2C19 foi sequenciado nos cinco pacientes com genótipo de forma perdedora de sal e que não desidrataram como predito, e encontramos o haplótipo ultra-metabolizador em homozigose em 1/5 pacientes e em heterozigose em 1/5 pacientes. Heterozigose para o CYP2C19*17 também foi encontrada no grupo controle (indivíduos perdedores de sal com genótipo/fenótipo concordantes). Portanto, o haplótipo CYP2C19*17 em heterozigose é insuficiente para modular a perda de sal e, provavelmente, em homozigose pode evitar a perda de sal. Em conclusão, pela primeira vez descrevemos o efeito modulador de uma variante alélica dos citocromos hepáticos P450 melhorando o fenótipo da forma perdedora de sal; no entanto, os demais casos permanecem com indefinição do genótipo. Estes resultados sugerem que não apenas uma única enzima, mas múltiplas enzimas extra-adrenais estão possivelmente envolvidas na modulação do fenótipo da deficiência da 21-hidroxilase. / Adrenal 21-hydroxylase deficiency is a common genetic disorder, caused by mutations in the CYP21A2 gene, which encodes the 21-hydroxylase P450c21. The 21-hydroxylase deficiency disrupts cortisol and aldosterone biosynthesis and leads to accumulation of androgen precursors. There are 3 main phenotypes: the simple virilizing (SV) form, in which girls present with virilized external genitalia at birth and both sexes present with precocious pseudopuberty; the salt wasting (SW) form, characterized by additional salt-wasting crisis in the neonatal period in both sexes; and the nonclassic (NC) form, in which the hyperandrogenic signs occur later in life, during childhood, adolescence or adulthood. In vitro studies show a good correlation between the degree of enzymatic impairment determined by genotype and phenotype. However, there are some discrepancies as: patients with clinical and hormonal profiles of nonclassic form in whom mutations are not found in one or both alleles, and patients with milder phenotype than the ones predicted by genotyping. These discrepancies suggest the existence of modulatory factors in 21- hydroxylase deficiency phenotype. The first hypothesis was that there were mutations in P450 oxidoreductase (POR), a gene which encodes a flavoprotein that donates electrons for all microsomal P450s, including P450c21, an essential step for P450s activity. The second hypothesis was that other enzymes that not P450c21 could perform extra-adrenal 21-hydroxylation of progesterone and 17OHprogesterone (17OHP), modulating salt balance and virilization. Hepatic drugmetabolizing P450 enzymes CYP2C19 and CYP3A4 can 21-hydroxylate progesterone; however, this activity was never compared to 21-hydroxylation performed by P450c21, in order to determine the importance of this extra-adrenal activity in vivo. The present cohort consisted of 11 patients with nonclassic form and incomplete genotype and 6 patients with genotype/phenotype discrepancies (genotype-predicted SW form and manifested SV form, n=5; genotyped-predicted SV form and manifested NC form, n=1). The POR gene was sequenced in these 17 patients, and 10/30 alleles presented the polymorphism A503V. P450c21, PORwt and POR A503V were expressed in bacteria, assayed in vitro, and the kinetics parameters Km, Vmax and Vmax/Km were calculated. Although POR A503V variant decreases the activity of P450c17, our study showed that it does not alter the 21-hydroxylation by P450c21. Therefore, there are no POR variants in this cohort that could explain discrepancies between genotype and phenotype in 21- hydroxylase deficiency. To evaluate the hypothesis of extra-adrenal 21- hydroxylation, P450c21, CYP2C19, CYP3A4, and POR were expressed in bacteria, assayed in vitro, and kinetic parameters assessed. Compared to P450c21, the Vmax/Km of 21-hydroxylation of progesterone by CYP2C19 and CYP3A4 was 17% and 10%, respectively. Neither CYP2C19 nor CYP3A4 were able to 21-hydroxylate 17OHP. Considering that little 21-hydroxylation activity is enough to produce sufficient amount of aldosterone to avoid the dehydration, this study suggests that extra-adrenal 21-hydroxylation by CYP2C19 and CYP3A4 may be able to ameliorate the mineralocorticoid, but not the glucocorticoid deficiency. CYP2C19 is very polymorphic, and some haplotypes can modify enzymatic activity. For example, the unique ultrametabolizer allele CYP2C19*17 has two polymorphisms in the promoter region that increase gene transcription in 2-4 times. Thus, patients harboring the CYP2C19 ultra-metabolizer allele could present an increased extraadrenal 21-hydroxylation of progesterone, and hence be able to avoid salt wasting crisis. CYP2C19 gene was sequenced in the 5 patients who did not present salt wasting crisis as expected, and 1/5 patients was homozygous and 1/5 patients was heterozygous for the CYP2C19*17 allele. Heterozygosity was also present in the control group (patients with salt wasting form and genotype/phenotype concordance). Therefore, heterozygosity for CYP2C19*17 seems to be insufficient to modulate salt balance but homozygosity might be able to avoid salt wasting crisis. In conclusion, we described for the first time the modulatory effect of an allelic variant of an extra-adrenal P450 enzyme ameliorating the salt wasting phenotype in a patient with 21-hydroxylase deficiency. Taken together with the remaining undefined genotypes, these results suggest that multiple extra-adrenal enzymes, rather than a single one, modulate the phenotypic expression of defects in 21-hydroxylase.

Introdução: A Hiperplasia Adrenal Congênita por deficiência da 21-hidroxilase (HAC) é uma doença com mortalidade neonatal elevada sendo elegível para programas públicos de Triagem Neonatal (TN). A HAC é causada por mutações no gene CYP21A2, as quais acarretam diferentes comprometimentos da atividade enzimática e resultam em espectro amplo de manifestações clínicas. Apesar da eficiência da TN para diagnosticar os casos graves, a taxa elevada de resultados falso-positivos (RFP), principalmente relacionados à prematuridade, é um dos maiores problemas. Porém, resultados falso-negativos também podem ocorrer em coletas antes de 24 horas de vida. No Brasil, a coleta da amostra neonatal difere entre os municípios, podendo ser no terceiro dia de vida como após. Objetivo: Avaliar se os valores da 17OH-progesterona neonatal (N17OHP) das coletas no terceiro dia de vida diferem significativamente das coletas a partir do quarto dia. Determinar qual percentil (99,5 ou 99,8) pode ser utilizado como valor de corte para a N17OHP, de acordo com o peso ao nascimento e tempo de vida na coleta, a fim de que proporcione taxa menor de RFP. Métodos: Foi avaliada, retrospectivamente, a N17OHP de 271.810 recém-nascidos (Rns) de acordo com o tempo de vida na coleta (G1: 48 - = 72h) e peso ao nascimento (P1: <= 1.500g, P2: 1.501-2.000g, P3: 2.001-2.500g e P4: >= 2.500g), pelo método imunofluorimétrico. Testes com resultados alterados foram confirmados no soro por Espectrometria de Massas em Tandem - LC-MS/MS. Rns afetados e/ou assintomáticos e com valores persistentemente elevados de 17OHP sérica foram submetidos ao estudo molécular, sequenciamento do gene CYP21A2. Resultados: os valores da N17OHP no grupo G1 foram significativamente menores do que em G2 em todos os grupos de peso (p < 0.001). A taxa de RFP em G1 e G2 foi de 0,2% para o percentil 99,8 e de 0,5% para o percentil 99,5 em ambos os grupos. O percentil 99,8 da N17OHP foi o melhor valor de corte para distinguir os Rns não afetados dos afetados, cujos valores são: G1 (P1: 120; P2: 71; P3: 39 e P4: 20 ng /mL) e em G2 (P1: 173; P2: 90; P3: 66 e P4: 25 ng/mL). Vinte e seis Rns do grupo G1 apresentaram a forma perdedora de sal (PS) (13H e 13M), nestes a N17OHP variou de 31 a 524 ng/mL e vinte Rns no grupo G2 (8H e 12M), nestes a N17OHP variou de 53 a 736 ng/mL. Para ambos os grupos foram encontrados três Rns com a forma virilizante simples (1H e 2M) e os valores da N17OHP variaram de 36 a 51 ng/mL. Resultados falso-negativos não foram relatados. O valor preditivo positivo (VPP) no teste do papel filtro foi de 5,6% e 14,1% nos grupos G1 e G2, respectivamente, ao se utilizar o percentil 99,8, e de 2,3% e 7% nos grupos G1 e G2 ao se utilizar o percentil 99,5. Dentre os casos com TN alterada (RFP), 29 deles também apresentaram 17OHP sérica elevada quando dosada por LC-MS/MS. Os casos assintomáticos foram acompanhados até normalização da 17OHP sérica e/ou submetidos ao estudo molecular, que identificou dois Rns com genótipo que prediz a forma não clássica. Conclusão: a melhor estratégia para otimização do diagnóstico da HAC na triagem neonatal é se padronizar valores de corte da N17OHP em dois grupos de acordo com o tempo de vida na coleta (antes e depois de 72 horas), subdivididos em quatro grupos de peso. A utilização dos valores de corte do percentil 99,8 se mantém eficaz no diagnóstico da HAC-21OH na triagem neonatal, reduzindo de forma significativa a taxa de RFP, sem perda do diagnóstico da forma PS / Introduction: Congenital Adrenal Hyperplasia (CAH) due to 21-hydroxylase is disorder with high mortality rate, being eligible for Public Programs of Newborn Screening (NBS). It is caused by mutations in the CYP21A2 gene leading to different impairments of enzyme activity and consequently to a spectrum of clinical manifestations. Despite the efficacy of NBS in diagnosing the severe clinical forms, the main concern is the high rate of false-positive results (FPR), mainly related to prematurity. False-negative results can also occur due to precocious sample collections, especially before 24 hs of life. Neonatal samples are collected at different times across our country, at third day of life or after. Objective: To determine if the values of neonatal 17OH-progesterone (N17OHP) collected on the third day of life differ significantly to the ones collected after the fourth day. To evaluate the best percentile of N17OHP values, according to birth-weight and age at the sample collection, to be used as a cut-off in NBS, in order to result in lower rate of FPR. Methods: N17OHP of 271,810 newborns (NB) according to sample collection time (G1: 48 - = 72 hs) and birth-weight (P1: <= 1,500g, P2: 1,501-2,000g, P3: 2,001-2,500 and P4: >2,500g) were retrospectively evaluated. N17OHP was measured by immunofluorimetric assay. N17OHP tests with altered values were confirmed through serum 17OHP by Tandem Mass Spectrometry - LC-MS/MS. Affected newborns (NB) and those asymptomatic with persistently increased serum 17OHP levels were submitted to molecular analysis, entire CYP21A2 gene sequencing. Results: N17OHP values of G1 on the third day of life were significantly lower than those of G2, in all birth-weight groups (p < 0.001). The FPR rate in G1 and G2 was 0.2% using the 99.8th and 0.5% in G1 and G2 using the 99.5th. The 99.8th percentile of N17OHP values was the best cut-off for distinguishing unaffected from affected NBs: G1 (P1: 120 ng/mL; P2: 71; P3: 39 and P4: 20 ng/mL) and G2 (P1: 173 ng/mL; P2: 90; P3: 66 and P4: 25 ng/mL). Twenty six (13M and 13F) NB were diagnosed with the salt wasting (SW) form, their N17OHP values ranged from 31 to 524 ng/mL. Twenty (8M, 12F) NB were diagnosed with the SW form in G2 group, N17OHP values ranged from 53 to 736 ng/mL. Three NB were diagnosed with the simple virilizing form (1M and 2F) in G1 and G2, their N17OHP values ranged from 36 to 51 ng/mL. False-negative results were not reported. The positive predictive value (PPV) of an altered neonatal test using the 99.8 percentile was 5.6% and 14.1% in G1 and G2, respectively, and using the percentile 99.5 was 2.3% and 7% in G1 and G2, respectively. Among cases with abnormal N17OHP result (RFP), 29 of them still presented with increased serum 17OHP levels through LC-MS/MS. Asymptomatic cases were followed up until normalization of serum 17OHP and/or submitted to molecular analysis, which identified two Rns with genotype that predicts the nonclassical form. Conclusions: the best strategy to optimize the CAH-NBS is to adjust N17OHP levels into two groups according to age at sample collection (before and after 72 hs), subdivided into four birth-weight groups. The use of N17OHP values according to the 99.8th remains effective to perform the CAH diagnosis CAH and significantly reduces the RFP rate without loss of diagnosis of the severe clinical forms

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:22:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2948.pdf: 23947670 bytes, checksum: 9a003bcb76beeab320966ed23e79f8b6 (MD5) Previous issue date: 2010-04-30 / Universidade Federal de Minas Gerais / The aim of this study was to evaluate the effects of vertical jump associated with anabolic androgenic steroids (AAS) on the biochemical, biomechanical and morphological properties, and the expression of the main genes responsible for remodeling in the calcaneal tendon (CT), superficial flexor tendon (TFS) and deep flexor tendon (TFP) in rats Animals were divided into four experimental groups: Sedentary (S), Trained (T) (vertical jump, 50 80% body weight load, 7 weeks, 5 days/week), AAS-treated sedentary rats (AAS) (5 mg/kg of body mass, twice a week).), and AAS-treated and trained animals (AAST). The techniques performed were: zymography (to analyze the metalopeptidase activity - MMP-2); biomechanical test (cross-sectional area, displacement at maximum load, maximum stress, maximum strain, and elastic modulus); morphology and real time PCR. The training promoted an increased in MMP-2 activity in the three regions of TFS, while the AAS treatment or the combination of training and AAS decreased both MMP-2 concentration and active form in all regions of the SFT. The biomechanical test showed that AAS increased tendon rigidity (i.e., lower elasticity and capacity to resist load) and the effects were enhanced by the combination of AAS and training. The DFT was the most affected by training, AAS, and the interaction of both. Take together the morphology and stereology showed that training increases the vascularity and cellularity, while the AAS combined with training reduced these two parameters in the three evaluated tendons. Gene expression showed that training did not increase the main genes expression responsible for tissue resistance: collagen type I and III, but the AAS or the association with training promoted a downregulation of expression in these genes on all tendons regions. In conclusion, the exercise increased remodeling and differently modulates the genes expression related to ECM remodeling in tendon. The AAS administration and combination with exercise induce negative effects, providing a poor remodeling and increasing risk of tendons injury. / O objetivo desse estudo foi avaliar os efeitos do salto vertical em associação com esteróide anabólico androgênico (EAA) nas propriedades bioquímicas, biomecânicas, morfológicas e a expressão dos principais genes responsáveis pelo remodelamento do tendão calcâneo (TC), tendão flexor superficial (TFS) e tendão flexor profundo (TFP) de ratos. Ratos Wistar foram divididos em quatro grupos experimentais: animais sedentários (S); animais sedentários com a administração de EAA (EAA) (5 mg/kg de peso corporal, duas vezes por semana); animais treinados (T) (salto vertical na água com carga de 50 a 80% do peso corporal do animal, duração de 7 semanas 5 dias/semana) e animais treinados com a administração de EAA (EAAT). Foram utilizadas as técnicas: de zimografia (para analisar a atividade da metalopeptidase - MMP-2); teste biomecânico (área de secção transversa, deslocamento até a carga máxima, tensão máxima, deformação máxima, e módulo de elasticidade); morfologia dos tendões e real time PCR. A zimografia mostrou que o treinamento aumentou a atividade da MMP-2 em todas as regiões do TFS enquanto o EAA ou associação de ambos reduziu a atividade da mesma em todas as regiões analisadas. O teste biomecânico mostrou que o EAA aumentou a rigidez dos tendões (baixa elasticidade e capacidade de resistir carga), e os efeitos foram reforçados pela associação de ambos, EAA e treino. O TFP foi o mais afetado pelo treinamento, EAA, e pela interação de ambos. A morfologia juntamente com a estereologia mostrou que o treinamento aumenta a vascularização e celularidade, enquanto o EAA associado ao treinamento reduz esses dois parâmetros nos 3 tendões avaliados. A expressão gênica mostrou que o treinamento não aumentou a expressão dos principais genes responsáveis pela resistência tecidual: colágeno tipo I e III, mas o EAA ou a associação com o treinamento promoveram uma redução na expressão desses genes em todas as regiões dos tendões. Assim, conclui-se que o exercício aumentou o remodelamento e modulou diferentemente a expressão de genes relacionados com o remodelamento da MEC no tendão. Já a administração de EAA e associação com o exercício acarretaram efeitos negativos no tendão, propiciando um remodelamento deficiente que pode estar relacionado com a ocorrência de lesões.

A deficiência da 21-hidroxilase é uma doença genética comum, causada por mutações no gene CYP21A2, que codifica a enzima 21-hidroxilase (P450c21). A deficiência da 21-hidroxilase afeta a síntese de cortisol e aldosterona e promove acúmulo de precursores, que são desviados para a síntese de andrógenos. Observa-se três principais fenótipos: a forma clássica virilizante simples (VS), na qual as meninas nascem com virilização da genitália externa e ambos os sexos apresentam virilização pós-natal; a forma perdedora de sal (PS), na qual além da virilização, ambos os sexos apresentam crise de perda de sal no período neonatal; e a forma não clássica (NC), na qual os sintomas de hiperandrogenismo iniciam-se mais tardiamente, na infância, adolescência ou idade adulta. Os estudos in vitro das mutações do CYP21A2 demonstram que existe uma boa correlação do grau de comprometimento da atividade enzimática conferido pelo genótipo com o fenótipo. Entretanto, existem algumas divergências como: pacientes que apresentam quadro clínico e hormonal de forma não clássica, nos quais mutações não são identificadas em um ou em ambos os alelos do CYP21A2, e pacientes que apresentam o fenótipo mais leve do que o predito pelo genótipo. Essas divergências sugerem a presença de fatores moduladores do fenótipo na deficiência da 21-hidroxilase. A primeira hipótese foi de que houvesse mutações no gene P450 óxido-redutase (POR), que codifica uma flavoproteína que doa elétrons para as enzimas microssomais P450, inclusive a P450c21, passo fundamental para a atividade enzimática das mesmas. A segunda hipótese foi de que outras enzimas P450, que não a P450c21, tivessem a capacidade de realizar a 21-hidroxilação extra-adrenal da progesterona e 17OH-progesterona (17OHP), sendo então capazes de modular o fenótipo da perda de sal e/ou virilização. Os citocromos P450 hepáticos CYP2C19 e CYP3A4, responsáveis pelo metabolismo de drogas, são capazes de realizar 21-hidroxilação da progesterona, porém essa atividade nunca foi comparada com a atividade de 21-hidroxilação da P450c21, a fim de que se possa extrapolar a importância dessa atividade extra-adrenal in vivo. A casuística desse estudo constou de 11 pacientes com a forma NC e genótipo incompleto, e 6 pacientes com fenótipo discordante do genótipo (5 com genótipo predizendo forma PS e manifestando forma VS, e 1 com genótipo predizendo VS e apresentando forma NC). O gene POR foi sequenciado em todos 17 pacientes e 10/30 alelos não relacionados apresentavam o polimorfismo A503V. O estudo funcional foi realizado através da expressão em bactéria do P450c21, do POR selvagem (PORwt) e da variante do POR A503V, e de estudo enzimático in vitro comparando a 21-hidroxilação da P450c21 promovida pela PORwt e POR A503V. Essa comparação foi realizada através de cálculos dos parâmetros que avaliam cinética enzimática (Km, Vmax e Vmax/Km). Apesar da variante POR A503V diminuir significativamente a atividade da P450c17 in vitro, nosso estudo demonstrou que ela não altera a capacidade de 21-hidroxilase da P450c21. Portanto, não existem substituições no POR que justifiquem as discordâncias de fenótipo/genótipo na deficiência da 21-hidroxilase nesta casuística. Para avaliarmos o papel da 21-hidroxilação extra-adrenal, as enzimas P450c21, as enzimas P450 hepáticas CYP2C19 e CYP3A4 e o POR foram expressos em bactéria. A capacidade das enzimas P450c21, CYP2C19 e CYP3A4 de 21- hidroxilar progesterona e 17OHP foram avaliadas in vitro e medidas através dos mesmos parâmetros de cinética enzimática. Comparado com a P450c21, o Vmax/Km da 21-hidroxilação da progesterona pelos CYP2C19 e CYP3A4 foram 17% e 10%, respectivamente. Os citocromos hepáticos não apresentaram atividade de 21-hidroxilação da 17OHP. Considerando que uma atividade residual mínima de 21-hidroxilação da progesterona é satisfatória para produzir quantidades suficientes de aldosterona para se evitar a perda de sal, este estudo sugere que a atividade de 21-hidroxilação extra-adrenal do CYP2C19 e CYP3A4 é capaz de melhorar o fenótipo de perda de sal, mas não o da deficiência de glicocorticóide. O gene CYP2C19, ao contrário do CYP3A4, é extremamente polimórfico, e são descritos vários haplótipos com diferentes atividades enzimáticas, os quais explicam as diferenças no metabolismo de várias drogas utilizadas na prática clínica. O único polimorfismo ultra-metabolizador é o CYP2C19*17, representado por duas substituições na região promotora que aumentam a transcrição do gene em 2-4 vezes. Os indivíduos que apresentam o haplótipo ultra-metabolizador podem ter maior atividade de 21-hidroxilação extraadrenal da progesterona e, dessa forma, não apresentarem a crise de perda de sal. O gene CYP2C19 foi sequenciado nos cinco pacientes com genótipo de forma perdedora de sal e que não desidrataram como predito, e encontramos o haplótipo ultra-metabolizador em homozigose em 1/5 pacientes e em heterozigose em 1/5 pacientes. Heterozigose para o CYP2C19*17 também foi encontrada no grupo controle (indivíduos perdedores de sal com genótipo/fenótipo concordantes). Portanto, o haplótipo CYP2C19*17 em heterozigose é insuficiente para modular a perda de sal e, provavelmente, em homozigose pode evitar a perda de sal. Em conclusão, pela primeira vez descrevemos o efeito modulador de uma variante alélica dos citocromos hepáticos P450 melhorando o fenótipo da forma perdedora de sal; no entanto, os demais casos permanecem com indefinição do genótipo. Estes resultados sugerem que não apenas uma única enzima, mas múltiplas enzimas extra-adrenais estão possivelmente envolvidas na modulação do fenótipo da deficiência da 21-hidroxilase. / Adrenal 21-hydroxylase deficiency is a common genetic disorder, caused by mutations in the CYP21A2 gene, which encodes the 21-hydroxylase P450c21. The 21-hydroxylase deficiency disrupts cortisol and aldosterone biosynthesis and leads to accumulation of androgen precursors. There are 3 main phenotypes: the simple virilizing (SV) form, in which girls present with virilized external genitalia at birth and both sexes present with precocious pseudopuberty; the salt wasting (SW) form, characterized by additional salt-wasting crisis in the neonatal period in both sexes; and the nonclassic (NC) form, in which the hyperandrogenic signs occur later in life, during childhood, adolescence or adulthood. In vitro studies show a good correlation between the degree of enzymatic impairment determined by genotype and phenotype. However, there are some discrepancies as: patients with clinical and hormonal profiles of nonclassic form in whom mutations are not found in one or both alleles, and patients with milder phenotype than the ones predicted by genotyping. These discrepancies suggest the existence of modulatory factors in 21- hydroxylase deficiency phenotype. The first hypothesis was that there were mutations in P450 oxidoreductase (POR), a gene which encodes a flavoprotein that donates electrons for all microsomal P450s, including P450c21, an essential step for P450s activity. The second hypothesis was that other enzymes that not P450c21 could perform extra-adrenal 21-hydroxylation of progesterone and 17OHprogesterone (17OHP), modulating salt balance and virilization. Hepatic drugmetabolizing P450 enzymes CYP2C19 and CYP3A4 can 21-hydroxylate progesterone; however, this activity was never compared to 21-hydroxylation performed by P450c21, in order to determine the importance of this extra-adrenal activity in vivo. The present cohort consisted of 11 patients with nonclassic form and incomplete genotype and 6 patients with genotype/phenotype discrepancies (genotype-predicted SW form and manifested SV form, n=5; genotyped-predicted SV form and manifested NC form, n=1). The POR gene was sequenced in these 17 patients, and 10/30 alleles presented the polymorphism A503V. P450c21, PORwt and POR A503V were expressed in bacteria, assayed in vitro, and the kinetics parameters Km, Vmax and Vmax/Km were calculated. Although POR A503V variant decreases the activity of P450c17, our study showed that it does not alter the 21-hydroxylation by P450c21. Therefore, there are no POR variants in this cohort that could explain discrepancies between genotype and phenotype in 21- hydroxylase deficiency. To evaluate the hypothesis of extra-adrenal 21- hydroxylation, P450c21, CYP2C19, CYP3A4, and POR were expressed in bacteria, assayed in vitro, and kinetic parameters assessed. Compared to P450c21, the Vmax/Km of 21-hydroxylation of progesterone by CYP2C19 and CYP3A4 was 17% and 10%, respectively. Neither CYP2C19 nor CYP3A4 were able to 21-hydroxylate 17OHP. Considering that little 21-hydroxylation activity is enough to produce sufficient amount of aldosterone to avoid the dehydration, this study suggests that extra-adrenal 21-hydroxylation by CYP2C19 and CYP3A4 may be able to ameliorate the mineralocorticoid, but not the glucocorticoid deficiency. CYP2C19 is very polymorphic, and some haplotypes can modify enzymatic activity. For example, the unique ultrametabolizer allele CYP2C19*17 has two polymorphisms in the promoter region that increase gene transcription in 2-4 times. Thus, patients harboring the CYP2C19 ultra-metabolizer allele could present an increased extraadrenal 21-hydroxylation of progesterone, and hence be able to avoid salt wasting crisis. CYP2C19 gene was sequenced in the 5 patients who did not present salt wasting crisis as expected, and 1/5 patients was homozygous and 1/5 patients was heterozygous for the CYP2C19*17 allele. Heterozygosity was also present in the control group (patients with salt wasting form and genotype/phenotype concordance). Therefore, heterozygosity for CYP2C19*17 seems to be insufficient to modulate salt balance but homozygosity might be able to avoid salt wasting crisis. In conclusion, we described for the first time the modulatory effect of an allelic variant of an extra-adrenal P450 enzyme ameliorating the salt wasting phenotype in a patient with 21-hydroxylase deficiency. Taken together with the remaining undefined genotypes, these results suggest that multiple extra-adrenal enzymes, rather than a single one, modulate the phenotypic expression of defects in 21-hydroxylase.

Introdução: A Hiperplasia Adrenal Congênita por deficiência da 21-hidroxilase (HAC) é uma doença com mortalidade neonatal elevada sendo elegível para programas públicos de Triagem Neonatal (TN). A HAC é causada por mutações no gene CYP21A2, as quais acarretam diferentes comprometimentos da atividade enzimática e resultam em espectro amplo de manifestações clínicas. Apesar da eficiência da TN para diagnosticar os casos graves, a taxa elevada de resultados falso-positivos (RFP), principalmente relacionados à prematuridade, é um dos maiores problemas. Porém, resultados falso-negativos também podem ocorrer em coletas antes de 24 horas de vida. No Brasil, a coleta da amostra neonatal difere entre os municípios, podendo ser no terceiro dia de vida como após. Objetivo: Avaliar se os valores da 17OH-progesterona neonatal (N17OHP) das coletas no terceiro dia de vida diferem significativamente das coletas a partir do quarto dia. Determinar qual percentil (99,5 ou 99,8) pode ser utilizado como valor de corte para a N17OHP, de acordo com o peso ao nascimento e tempo de vida na coleta, a fim de que proporcione taxa menor de RFP. Métodos: Foi avaliada, retrospectivamente, a N17OHP de 271.810 recém-nascidos (Rns) de acordo com o tempo de vida na coleta (G1: 48 - = 72h) e peso ao nascimento (P1: <= 1.500g, P2: 1.501-2.000g, P3: 2.001-2.500g e P4: >= 2.500g), pelo método imunofluorimétrico. Testes com resultados alterados foram confirmados no soro por Espectrometria de Massas em Tandem - LC-MS/MS. Rns afetados e/ou assintomáticos e com valores persistentemente elevados de 17OHP sérica foram submetidos ao estudo molécular, sequenciamento do gene CYP21A2. Resultados: os valores da N17OHP no grupo G1 foram significativamente menores do que em G2 em todos os grupos de peso (p < 0.001). A taxa de RFP em G1 e G2 foi de 0,2% para o percentil 99,8 e de 0,5% para o percentil 99,5 em ambos os grupos. O percentil 99,8 da N17OHP foi o melhor valor de corte para distinguir os Rns não afetados dos afetados, cujos valores são: G1 (P1: 120; P2: 71; P3: 39 e P4: 20 ng /mL) e em G2 (P1: 173; P2: 90; P3: 66 e P4: 25 ng/mL). Vinte e seis Rns do grupo G1 apresentaram a forma perdedora de sal (PS) (13H e 13M), nestes a N17OHP variou de 31 a 524 ng/mL e vinte Rns no grupo G2 (8H e 12M), nestes a N17OHP variou de 53 a 736 ng/mL. Para ambos os grupos foram encontrados três Rns com a forma virilizante simples (1H e 2M) e os valores da N17OHP variaram de 36 a 51 ng/mL. Resultados falso-negativos não foram relatados. O valor preditivo positivo (VPP) no teste do papel filtro foi de 5,6% e 14,1% nos grupos G1 e G2, respectivamente, ao se utilizar o percentil 99,8, e de 2,3% e 7% nos grupos G1 e G2 ao se utilizar o percentil 99,5. Dentre os casos com TN alterada (RFP), 29 deles também apresentaram 17OHP sérica elevada quando dosada por LC-MS/MS. Os casos assintomáticos foram acompanhados até normalização da 17OHP sérica e/ou submetidos ao estudo molecular, que identificou dois Rns com genótipo que prediz a forma não clássica. Conclusão: a melhor estratégia para otimização do diagnóstico da HAC na triagem neonatal é se padronizar valores de corte da N17OHP em dois grupos de acordo com o tempo de vida na coleta (antes e depois de 72 horas), subdivididos em quatro grupos de peso. A utilização dos valores de corte do percentil 99,8 se mantém eficaz no diagnóstico da HAC-21OH na triagem neonatal, reduzindo de forma significativa a taxa de RFP, sem perda do diagnóstico da forma PS / Introduction: Congenital Adrenal Hyperplasia (CAH) due to 21-hydroxylase is disorder with high mortality rate, being eligible for Public Programs of Newborn Screening (NBS). It is caused by mutations in the CYP21A2 gene leading to different impairments of enzyme activity and consequently to a spectrum of clinical manifestations. Despite the efficacy of NBS in diagnosing the severe clinical forms, the main concern is the high rate of false-positive results (FPR), mainly related to prematurity. False-negative results can also occur due to precocious sample collections, especially before 24 hs of life. Neonatal samples are collected at different times across our country, at third day of life or after. Objective: To determine if the values of neonatal 17OH-progesterone (N17OHP) collected on the third day of life differ significantly to the ones collected after the fourth day. To evaluate the best percentile of N17OHP values, according to birth-weight and age at the sample collection, to be used as a cut-off in NBS, in order to result in lower rate of FPR. Methods: N17OHP of 271,810 newborns (NB) according to sample collection time (G1: 48 - = 72 hs) and birth-weight (P1: <= 1,500g, P2: 1,501-2,000g, P3: 2,001-2,500 and P4: >2,500g) were retrospectively evaluated. N17OHP was measured by immunofluorimetric assay. N17OHP tests with altered values were confirmed through serum 17OHP by Tandem Mass Spectrometry - LC-MS/MS. Affected newborns (NB) and those asymptomatic with persistently increased serum 17OHP levels were submitted to molecular analysis, entire CYP21A2 gene sequencing. Results: N17OHP values of G1 on the third day of life were significantly lower than those of G2, in all birth-weight groups (p < 0.001). The FPR rate in G1 and G2 was 0.2% using the 99.8th and 0.5% in G1 and G2 using the 99.5th. The 99.8th percentile of N17OHP values was the best cut-off for distinguishing unaffected from affected NBs: G1 (P1: 120 ng/mL; P2: 71; P3: 39 and P4: 20 ng/mL) and G2 (P1: 173 ng/mL; P2: 90; P3: 66 and P4: 25 ng/mL). Twenty six (13M and 13F) NB were diagnosed with the salt wasting (SW) form, their N17OHP values ranged from 31 to 524 ng/mL. Twenty (8M, 12F) NB were diagnosed with the SW form in G2 group, N17OHP values ranged from 53 to 736 ng/mL. Three NB were diagnosed with the simple virilizing form (1M and 2F) in G1 and G2, their N17OHP values ranged from 36 to 51 ng/mL. False-negative results were not reported. The positive predictive value (PPV) of an altered neonatal test using the 99.8 percentile was 5.6% and 14.1% in G1 and G2, respectively, and using the percentile 99.5 was 2.3% and 7% in G1 and G2, respectively. Among cases with abnormal N17OHP result (RFP), 29 of them still presented with increased serum 17OHP levels through LC-MS/MS. Asymptomatic cases were followed up until normalization of serum 17OHP and/or submitted to molecular analysis, which identified two Rns with genotype that predicts the nonclassical form. Conclusions: the best strategy to optimize the CAH-NBS is to adjust N17OHP levels into two groups according to age at sample collection (before and after 72 hs), subdivided into four birth-weight groups. The use of N17OHP values according to the 99.8th remains effective to perform the CAH diagnosis CAH and significantly reduces the RFP rate without loss of diagnosis of the severe clinical forms

Os gliomas são tumores cerebrais intracraniais caracterizados pelo seu rápido crescimento e pela sua resistência à quimioterapia e radioterapia atuais. Assim, a procura por novos agentes terapêuticos com múltiplos mecanismos de ação têm identificado o ácido <font face=\"symbol\">g-linolênico (GLA), antiinflamatórios não esteroidais (AINEs) e compostos contendo rutênio como possíveis candidatos. Dessa forma, a principal proposta deste projeto foi entender melhor o mecanismo de ação dessas drogas sobre as células C6 de glioma de rato. Foram analisadas proteínas envolvidas no controle do ciclo celular, apoptose, angiogênese, invasão e migração através de RT-PCR e Western Blotting após tratamento in vitro e in vivo. Alterações da expressão de ciclina D1, E2F-1, pRb, p27, p21, p16, p65, c-myc, ERK1/2, nm23 e <font face=\"symbol\">b, MMP-2, Brevican GPI e Secretado, Tenascina-R, Tenascina-C, VEGF-A, Flt1, Flk1, Bax, PPAR<font face=\"symbol\">g, p53, COX-2, EP1, 2, 3 e 4, Ku70 e 80 foram encontradas. Em conclusão, o GLA e o complexo Rutênio-Ibuprofeno possuem múltiplos alvos que levam à inibição da proliferação celular. / Gliomas are intracranial tumors of cerebral origin characterized for its rapid growth and resistance to both conventional chemotherapy and radiotherapy. The search for new therapeutics agents with multiple mechanisms of action has identified <font face=\"symbol\">g-linolenic acid (GLA), nonsteroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) and ruthenium containing compounds as possible candidates. The aim of this study was to better know the mechanism of action of these drugs on C6 rat glioma cells. Expression of proteins involved in control of the cell cycle, apoptosis, angiogenesis, invasion and migration was analyzed using RT-PCR and Western Blotting methods after treatment in vitro and in vivo. Alterations in cyclin D1, E2F-1, pRb, p27, p21, p16, p65, c-myc, ERK1/2, nm23 e <font face=\"symbol\">b, MMP-2, GPI and Secreted Brevican, Tenascin-R, Tenascin-C, VEGF-A, Flt1, Flk1, Bax, PPAR<font face=\"symbol\">g, p53, COX-2, EP1, 2, 3 and 4, Ku70 and 80 expression were observed. In conclusion, GLA and Ruthenium-Ibuprofen complex has multiple target wich translate into the inhibition of proliferation.

Os gliomas são tumores cerebrais intracraniais caracterizados pelo seu rápido crescimento e pela sua resistência à quimioterapia e radioterapia atuais. Assim, a procura por novos agentes terapêuticos com múltiplos mecanismos de ação têm identificado o ácido <font face=\"symbol\">g-linolênico (GLA), antiinflamatórios não esteroidais (AINEs) e compostos contendo rutênio como possíveis candidatos. Dessa forma, a principal proposta deste projeto foi entender melhor o mecanismo de ação dessas drogas sobre as células C6 de glioma de rato. Foram analisadas proteínas envolvidas no controle do ciclo celular, apoptose, angiogênese, invasão e migração através de RT-PCR e Western Blotting após tratamento in vitro e in vivo. Alterações da expressão de ciclina D1, E2F-1, pRb, p27, p21, p16, p65, c-myc, ERK1/2, nm23 e <font face=\"symbol\">b, MMP-2, Brevican GPI e Secretado, Tenascina-R, Tenascina-C, VEGF-A, Flt1, Flk1, Bax, PPAR<font face=\"symbol\">g, p53, COX-2, EP1, 2, 3 e 4, Ku70 e 80 foram encontradas. Em conclusão, o GLA e o complexo Rutênio-Ibuprofeno possuem múltiplos alvos que levam à inibição da proliferação celular. / Gliomas are intracranial tumors of cerebral origin characterized for its rapid growth and resistance to both conventional chemotherapy and radiotherapy. The search for new therapeutics agents with multiple mechanisms of action has identified <font face=\"symbol\">g-linolenic acid (GLA), nonsteroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) and ruthenium containing compounds as possible candidates. The aim of this study was to better know the mechanism of action of these drugs on C6 rat glioma cells. Expression of proteins involved in control of the cell cycle, apoptosis, angiogenesis, invasion and migration was analyzed using RT-PCR and Western Blotting methods after treatment in vitro and in vivo. Alterations in cyclin D1, E2F-1, pRb, p27, p21, p16, p65, c-myc, ERK1/2, nm23 e <font face=\"symbol\">b, MMP-2, GPI and Secreted Brevican, Tenascin-R, Tenascin-C, VEGF-A, Flt1, Flk1, Bax, PPAR<font face=\"symbol\">g, p53, COX-2, EP1, 2, 3 and 4, Ku70 and 80 expression were observed. In conclusion, GLA and Ruthenium-Ibuprofen complex has multiple target wich translate into the inhibition of proliferation.