Ruído pode ser definido como um exemplo em um conjunto de dados que aparentemente é inconsistente com o restante dos dados existentes, pois não segue o mesmo padrão dos demais. Ruídos em conjuntos de dados podem reduzir o desempenho das técnicas de Aprendizado de Máquina (AM) empregadas e aumentar o tempo de construção da hipótese induzida, assim como sua complexidade. Dados são geralmente coletados por meio de medições realizadas em um domínio de interesse. Nesse sentido, nenhum conjunto de dados é perfeito. Erros de medições, dados incompletos, errados, corrompidos ou distorcidos, falhas humanas ou dos equipamentos utilizados, dentre muitos outros fatores, contribuem para a contaminação dos dados, e isso é particularmente verdadeiro para dados com elevada dimensionalidade. Sendo assim, a detecção de ruídos é uma tarefa crítica, principalmente em ambientes que exigem segurança e confiabilidade, uma vez que a presença desses pode indicar situações que degradam o desempenho do sistema ou a segurança e confiabilidade das informações. Algoritmos para a detecção e remoção de ruídos podem aumentar a confiabilidade de conjuntos de dados ruidosos. Nesse âmbito, esse trabalho investiga técnicas de detecção de ruído baseadas em distância, em que a remoção de ruídos é feita em uma etapa de pré-processamento, aplicadas a problemas de classificação de dados de Expressão Gênica, caracterizados pela presença de ruídos, elevada dimensionalidade e complexidade. O objetivo é melhorar o desempenho das técnicas de AM empregadas para solucioná-los. Por fim, combinações de técnicas de detecção de ruído são implementadas de modo a analisar a possibilidade de melhorar, ainda mais, o desempenho obtido. / Noise can be defined as an example which seems to be inconsistent with the remaining ones in a data set. The presence of noise in data sets can decrease the performance of Machine Learning (ML) techniques in the problem analysis and also increase the time taken to build the induced hypothesis and its complexity. Data are collected from measurements made which represent a given domain of interest. In this sense, no data set is perfect. Measurement errors, incomplete, corrupted, wrong or distorted examples, equipment problems or human fails, besides many other related factors, help contaminating the data, and this is particularly true for data sets with high dimensionality. For this reason, noise detection is a critical task, specially in domains which demand security and trustworthiness, since the presence of noise can lead to situations which degrade the system performance or the security and trustworthiness of the involved information. Algorithms to detect and remove noise may increase trustworthiness of noisy data sets. Based on that, this work evaluates distance-based noise detection techniques, in which noise removal is done by a pre-processing phase, in gene expression classification problems, characterized by the presence of noise, high dimensionality and complexity. The objective is to improve the performance of ML techniques used to solve these problems. Next, ensembles of noise detection techniques are developed in order to analyze the possibility to further improve the performance obtained.

O agonista beta-adrenérgico ractopamina (RAC) modifica a composição da carcaça suína por aumentar a massa muscular e reduzir a deposição de gordura. O objetivo neste estudo foi avaliar os efeitos do tempo de fornecimento de RAC sobre o desempenho, concentração de ureia plasmática (CUP), características de carcaça e expressão gênica dos receptores beta- adrenérgicos (beta-AR) e das isoformas da cadeia pesada de miosina (MyHC) em suínos em terminação. Oitenta suínos, machos castrados (PV inicial = 69,42 ± 1,24 kg), foram utilizados em um experimento em blocos completos casualizados com cinco tratamentos, oito repetições por tratamento e dois animais por unidade experimental (baia). Os tratamentos consistiram de rações sem RAC (controle) ou com 10 ppm de RAC fornecidas por 7, 14, 21 ou 28 dias préabate. O PV individual e o consumo de ração por baia foram obtidos para determinar o ganho diário de peso (GDP), o consumo diário de ração (CDR) e a conversão alimentar (CA). Amostras de sangue foram coletadas para determinação da CUP. No final do experimento, os animais (PV final = 102,46 ± 1,44 kg) foram abatidos e amostras de pelos e do músculo Longissimus dorsi coletadas. As carcaças foram avaliadas 24 horas post-mortem. As amostras de pelos foram utilizadas para detecção da mutação no gene do receptor de rianodina do tipo 1 (RYR1). A expressão gênica dos beta-AR (subtipos beta1 e beta2) e das isoformas MyHC (I, IIa, IIx/d e IIb) foi quantificada nas amostras de músculo. As análises estatísticas foram realizadas apenas com os animais homozigotos dominantes para a mutação no gene do RYR1. O aumento no período de fornecimento de RAC não afetou (P > 0,05) o PV final, o GDP e o CDR, porém resultou em melhora linear (P < 0,01) na CA. Melhoras (P < 0,05) nas médias semanais de GDP e CA foram observadas durante os primeiros 21 dias de fornecimento de RAC, no entanto, o crescimento animal declinou (P < 0,05) na 4ª semana de tratamento. A CUP apresentou efeito quadrático (P < 0,01) com o aumento na duração do fornecimento de RAC. Houve aumento linear (P <= 0,01) no peso da carcaça quente, na profundidade do músculo Longissimus dorsi, na área de olho de lombo e na relação carne:gordura com o aumento na duração do tratamento com RAC. Não foram detectados efeitos da RAC (P > 0,05) sobre a expressão gênica dos beta1-AR e das isoformas MyHC IIa e MyHC IIx/d, porém o aumento no período de fornecimento de RAC tendeu a reduzir linearmente (P = 0,08) a expressão gênica dos beta2-AR. Embora os níveis de RNAm da isoforma MyHC I tenham sido reduzidos linearmente (P < 0,01), a expressão gênica da isoforma MyHC IIb aumentou linearmente (P < 0,01) com o aumento na duração do tratamento com RAC. Portanto, as melhores respostas de desempenho e carcaça ocorreram quando a RAC foi fornecida por 21 e 28 dias, respectivamente. Além disso, o agonista alterou a expressão gênica das isoformas MyHC, e é possível que a ação da RAC esteja relacionada com a população de beta2-AR. / The beta-adrenergic agonist ractopamine (RAC) modifies the swine carcass composition by increasing muscle mass and decreasing fat deposition. The objective in this study was to evaluate the effects of RAC feeding duration on performance, plasma urea nitrogen (PUN) concentration, carcass traits, and gene expression of beta-adrenergic receptors (beta-AR) and myosin heavy chain (MyHC) isoforms in finishing pigs. Eighty barrows (initial BW = 69.42 ± 1.24 kg) were used in a randomized complete block design experiment with five treatments, eight replicates per treatment, and two animals per experimental unit (pen). The dietary treatments consisted of diets containing no RAC (control) or 10 ppm RAC fed for 7, 14, 21, or 28 days before slaughter. Individual pig BW and pen feed disappearance were obtained to determine average daily gain (ADG), average daily feed intake (ADFI), and feed to gain ratio (F:G). Blood samples were collected for determination of PUN concentrations. At the end of the experiment, pigs (final BW = 102.46 ± 1.44 kg) were slaughtered and hair and Longissimus dorsi muscle samples collected. The carcasses were evaluated 24 hours postmortem. Hair samples were used to detect the mutation of the ryanodine receptor type 1 (RYR1) gene. Gene expression of beta-AR (beta1- and beta2-subtypes) and MyHC isoforms (I, IIa, IIx/d, and IIb) was quantified in the muscle samples. Statistical analyses were performed using only the homozygous dominant pigs for the RYR1 gene mutation. Increasing RAC feeding period did not affect (P > 0.05) final BW, ADG, and ADFI, but resulted in a linear improvement (P < 0.01) in F:G. Average weekly improvements (P < 0.05) in ADG and F:G were observed during the first 21 days of RAC feeding, however, animal growth declined (P < 0.05) in the 4th week of treatment. The PUN concentrations showed a quadratic effect (P < 0.01) as RAC feeding duration increased. There were linear increases (P <= 0.01) in hot carcass weight, Longissimus dorsi muscle depth, loin eye area, and muscle to fat ratio as RAC treatment duration increased. No effects of RAC feeding (P > 0.05) were detected for beta1-AR and for isoforms of MyHC IIa and MyHC IIx/d gene expression, but increasing RAC feeding period tended to linearly decrease (P = 0.08) beta2-AR gene expression. Even though mRNA levels of MyHC I isoform decreased linearly (P < 0.01), gene expression of MyHC IIb isoform increased linearly (P < 0.01) as RAC treatment duration increased. Therefore, greater growth and carcass responses occurred when RAC was fed for 21 and 28 days, respectively. Furthermore, the agonist altered the MyHC gene expression and the RAC action may be related to the beta2-AR population.

Linhagens de camundongos AIRmax e AIRmin diferem quanto a reatividade inflamatória aguda às partículas de Biogel. A AIR divergente nessas linhagens está bem estabelecida, no entanto, diferenças na resposta inflamatória crônica ao Biogel ainda não foram descritas. Assim, nós decidimos verificar se o processo de seleção que modificou a resposta inflamatória aguda nessas linhagens, também afetou o desenvolvimento da resposta inflamatória crônica. A infiltração de células no exsudado da linhagem AIRmax foi maior que na linhagem AIRmin em ambos os períodos avaliados (48h e 30d), e no período de 48 horas, os animais AIRmax apresentaram alta produção de citocinas no exsudato inflamatório. Essa linhagem mostrou ainda maior número de genes ativados envolvidos na transdução de sinal, resposta imune e inflamatória. Alguns genes envolvidos com a resposta inflamatória aguda, também apresentaram diferenças após 30 dias. Esses resultados indicam que o processo de seleção para a inflamação aguda pode ter afetado também o desenvolvimento da resposta inflamatória crônica ao Biogel. / AIRmax and AIRmin mouse lines differ in terms of acute inflammatory response after Biogel injection. The distinct AIR in these lines is well established, however, differences in late or chronic inflammatory response to Biogel were not described yet. Thus, we decided to check if the genetic selection that modified the acute inflammatory response in these lines, also affected the development of a chronic inflammatory response. We found that AIRmax mice had higher cellular influx in the inflammatory exudate than AIRmin mice in both analyzed periods (48h and 30d) and that after 48 hours of Biogel injection, AIRmax mice showed higher cytokine levels in inflammatory exudates. This line also showed higher number of up regulated genes in AIRmax than in AIRmin mice involved with inflammatory response, immune response and signal transduction. Some acute inflammatory response genes also showed differences on day 30. Our results indicate that the genetic selection for acute inflammatory response may also have affected the chronic inflammatory response to Biogel.

No experimento 1, avaliou-se os efeitos da leptina exógena na concentração sérica de leptina e na expressão do gene LEP no tecido adiposo de novilhas zebuínas pré-púberes. Amostras de tecido adiposo (mesentérico, perirenal e subcutâneo) e de sangue foram obtidas de 36 novilhas, distribuídas nos tratamentos: A) dieta de alta energia; B) dieta de baixa energia; BL) dieta de baixa energia + 4,8 g/kg PV de oLeptin subcutânea, duas vezes ao dia, por 56 dias. A concentração de leptina foi determinada com kit comercial ELISA (Cusabio) específico. Amostras de sangue de quatro novilhas por grupo foram coletadas em seis pontos no tempo, sendo um antes e um após o tratamento hormonal. Dois dias após a obtenção da puberdade, oito novilhas por grupo foram abatidas para coleta de tecido. A expressão gênica foi quantificada nos depósitos de gordura por PCR em tempo real. A oLeptina aumentou transitoriamente a concentração de leptina do grupo BL, com pico (11,1 ± 1,4 ng/mL) após 7 dias do início do tratamento. A leptina sérica do grupo A aumentou linearmente no tempo, enquanto no grupo B, manteve-se constante (4,0 ± 2,0 ng/mL). A dieta A aumentou a expressão de leptina no tecido adiposo em 2,4 vezes; e a administração de oLeptina diminuiu a expressão do gene LEP em cerca de 2,5 vezes, comparando com o grupo controle. A redução na expressão do gene LEP explica a redução na leptina sérica do grupo BL após 30 dias de tratamento hormonal. O objetivo do experimento 2 foi clonar a região codificadora da leptina bovina, transformar leveduras Pichia pastoris KM71H e expressar a proteína no meio de cultura. O gene da leptina foi amplificado em reação de PCR, a partir de amostra de tecido adiposo subcutâneo de novilha do grupo A. Os primers 5\' - ATTGAATTCGTGCCCATCTGCAAGGTC - 3\' (senso) e 5\' - ATTGTCGACGCACCCGGGACTGAGGT - 3\' (antisenso), contendo sítios EcoRI e SalI, foram desenhados com base na sequência do mRNA da leptina bovina (NM 173928.2), substituindo a sequência sinal de secreção nativa pela sequência do Fator do Saccharomyces cereviasiae. O inserto foi clonado nos vetores de expressão pPICZ&alpha;A e pGAPZ&alpha;A (Invitrogen), sendo as leveduras transformadas por eletroporação. Clones com múltiplas cópias do gene foram selecionados em meio YPD + 500 &#956;g/mL de zeocina, e 22 colônias recombinantes foram selecionadas para análise de expressão em pequena escala. Colônias pPICbLep foram inicialmente cultivadas em meio de crescimento (BMGY), sendo transferidas para meio de indução (BMMY), contendo metanol. A indução durou 144 horas. Alíquotas de 200 &#956;l de sobrenadante foram coletadas diariamente, para análise da presença da bLeptina por SDS-PAGE. As colônias pGAPbLep foram cultivadas em meio YPD por 96 h, com coleta de sobrenadante a cada 24 h. As leveduras foram transformadas com sucesso, com os plasmídeos pPICbLep e pGAPbLep, entretanto, apenas as colônias pGAPbLep expressaram uma proteína de 35 kDa, o dobro do tamanho esperado para a bLeptina (17 kDa), provavelmente por ocorrência de dimerização. Mais estudos são necessários sobre os processos de produção de leptina recombinante bovina em Pichia pastoris. / In experiment 1, the effects of exogenous leptin were evaluated on serum leptin levels and on LEP gene expression in the adipose tissue of prepubertal zebu heifers. Adipose tissue (mesenteric, perirenal and subcutaneous) and blood samples were collected from 36 heifers, distributed among treatments: A) high energy diet; B) low energy diet; BL) low energy diet + 4,8 g/kg BW subcutaneous oLeptin, twice daily, for 56 days. Leptin concentration was determined with specific commercial ELISA kit (Cusabio). Blood from four heifer per group was sampled in six time points, one before and one after the hormonal treatment. Two days after puberty attainment , eight heifers per group were slaughter for tissue sampling. Gene expression was quantified in fat depots by real time PCR. The oLeptin increased transiently leptin concentration in group BL, with a peak (11,1 ± 1,4 ng/mL) after 7 days of treatment. Serum leptin in group A increased linearly in time, while in group B it remained constant (4,0 ± 2,0 ng/mL). Diet A enhanced leptin expression in the adipose tissue 2.4-fold, and oLeptin administration decreased de expression 2.5-fold, comparing to the control group. The decrease in LEP gene expression explains the reduction in serum leptin from group BL after 30 d of hormonal treatment. The objective with experiment 2 was to clone de codifying region of bovine leptin, transform KM71H Pichia pastoris yeasts, and express the protein in culture media. The leptin gene was amplified by PCR, from subcutaneous adipose tissue sample from a heifer in group A. Primers 5\' - ATTGAATTCGTGCCCATCTGCAAGGTC - 3\' (forward) and 5\' - ATTGTCGACGCACCCGGGACTGAGGT 3 (reverse), containing EcoRI and SalI restriction sites, were designed based in the mRNA sequence from bovine leptin (NM 173928.2), replacing the native secretion signal sequence by the -factor sequence from Saccharomyces cereviasiae. The insert was cloned in the expression vectors pPICZ&alpha;A and pGAPZ&alpha;A (Invitrogen), and yeasts were transformed by electroporation. Clones with multiple copies of the gene were selected in YPD + 500 &#956;g/mL zeocina, and 22 recombinant colonies were selected for a small-scale expression analysis. pPICbLep colonies were initially cultivated in growth media (BMGY), and then transferred to the induction media (BMMY), containing methanol. The colonies were inducted for 144 h. Supernatant aliquots (200 &#956;l) were collected daily, for bLeptin analysis in SDS-PAGE. pGAPbLep colonies were cultivated in YPD media for 96 h, collecting supernatant samples each 24 h. Yeasts were successfully transformed with the plasmids pPICbLep and pGAPbLep, however, only pGAPbLep colonies expressed a protein with 35 kDa, twice the size expected for the bovine leptin (17 kDa), probably because of dimerization. More studies are necessary about the recombinant bovine leptin production processes in Pichia pastoris.

A conversão do amido, armazenado nas frutas durante seu desenvolvimento, em açúcares, é desempenhada por várias enzimas, constituindo-se em um dos principais processos do amadurecimento. A função das enzimas hidrolíticas, alfa-amilase e beta-amilase, no metabolismo amido-sacarose durante o amadurecimento de bananas, foi avaliada através da determinação dos perfis de transcrição e tradução dos seus genes. Utilizando-se da expressão heteróloga de clones de cDNA das amilases, foi possível obter as proteínas recombinantes, inclusive na sua forma enzimaticamente ativa, bem como induzir a produção de anticorpos policlonais em coelhos, com os quais pode-se acompanhar a variação nos níveis de expressão de cada uma das duas enzimas. O tratamento de bananas com o hormônio etileno induziu a antecipação dos processos de degradação do amido e síntese de açúcares em relação ao grupo de frutas controle. Enquanto no grupo controle, as variações nos níveis de proteína e transcrição relativos à alfa-amilase sugerem que há redução na expressão do gene, no grupo tratado com etileno não foi possível detectar a expressão da proteína, apesar dos incrementos na transcrição e atividade. Tal fato pode ser associado à degradação do grânulo de amido e conseqüente solubilização de proteínas ligadas à sua superfície e ao provável aumento no turnover de proteínas promovidos pelo etileno. Em resposta ao tratamento com etileno, houve antecipação dos picos de atividade relacionados especificamente com a beta-amilase, o mesmo ocorreu na detecção do transcrito e sua proteína. Tais resultados sugerem que em bananas, os padrões de expressão e atividade da beta-amilase estão diretamente relacionados à degradação do amido, respondendo também às variações hormonais na fruta, não sendo possível afirmar o mesmo para alfa-amilase. / The starch breakdown in plants is accomplished by several enzymes and pathways and it is the main feature of the ripening in climacteric fruits, such as banana. The function of the hydrolytic enzymes, alpha-amylase and beta-amylase, in the starch-to-sugar metabolism during banana ripening, was evaluated through the determination of the profiles of transcription and translation of its genes. Using the heterologous expression of amylases cDNA clones, was possible to get recombinant proteins in its enzymatically active form, as well as inducing the production of the polyclonal antibodies in rabbits, and use this to evaluate the expression profile of each one enzyme. The treatment of bananas with the hormone ethylene induced the anticipation of the processes of degradation of starch and synthesis of sugars in relation to the control group. While in the control group the variations of protein and transcription levels for alpha-amylase suggests a reduction in the gene expression, in the ethylene group was not possible to detect the expression of the protein, despite the increments in the transcription and activity. Such fact can be associated with the degradation of the starch granules and the resultant surface protein solubilization, and the probable increase in the protein turnover promoted by ethylene treatment. In response to the ethylene, the peak related to beta-amylase activity has been anticipated and the same was occurred with the transcription and translation of this enzyme. These results suggest that the profile of expression and activity of beta-amylase are directly related to the degradation of starch and do respond to hormonal treatment of banana fruits, which could not be affirmed for the enzyme alpha-amylase.

As células-satélite musculares vêm sendo muito estudadas em diferentes pesquisas, especialmente com o objetivo de aumentar a compreensão do mecanismo de sua ação na regeneração muscular e as respectivas implicações nas diferentes miopatias, visando identificar possíveis alvos terapêuticos. Dois modelos para distrofias, os camundongos Largemy d e Lama2dy2j/J possuem um padrão de degeneração intenso e bastante semelhante, mas com diferenças na expressão de genes envolvidos na cascata de regeneração. Por isso, estes constituem interessantes modelos para o estudo de possíveis diferenças no mecanismo de ativação e atuação das células-satélite no músculo distrófico. Assim, os objetivos específicos deste projeto consistiram em: 1) isolar e caracterizar por citometria de fluxo as populações de células-satélite dos modelos Largemy d e Lama2dy2j/J em comparação com o normal C57Black6, quanto a expressão de marcadores de miogênese e de células-tronco pluripotentes; e 2) estudar e comparar o perfil de expressão gênica destas populações de células satélites através de microarray de expressão. Na caracterização fenotípica das células isoladas do músculo normal, aquelas que aderem mais precocemente (PP1) e mais tardiamente (PP2) mostram um padrão fenotípico semelhante entre si e com características mais próximas às miogênicas. Já a população de células de adesão bem mais tardia (PP6) apresentou um padrão de marcação misto, mantendo as características miogênicas, mas apresentando tambem padrão de células-tronco mesenquimais, sugerindo o fenótipo de células mais imaturas. Nos músculos distróficos, identificamos diferenças na constituição do pool de células presentes inicialmente no músculo, onde na linhagem Lama2dy2j/J há indícios de uma população em estágio proliferativo, enquanto que na linhagem Largemy d há presença de células com maior imaturidade. Os resultados da analise de expressão gênica nas populações caracterizadas se mostraram concordantes com os fenótipos celulares avaliados por citometria. Identificamos a hipo-expressão de genes ligados à regeneração e remodelamento muscular em ambos modelos distróficos. Considerando os genes diferentemente expressos somente em cada um dos modelos, os resultados sugerem ativação de proliferação celular e inibição da diferenciação na linhagem Lama2dy2j/J e distúrbios na miogênese na linhagem Largemy d. Assim, pudemos identificar vias importantes alteradas em cada um dos modelos que explicam parte das diferenças encontradas nos trabalhos anteriores / Muscle satellite cells have been widely studied, especially to understand their mechanism of action in muscle regeneration and correspondent implications in the different dystrophic processes, aiming the identification of potential therapeutic targets. Two mice models for muscular dystrophies, Largemyd and Lama2dy2j/J, have a pattern of an intense and very similar degeneration, but with differences in the expression of genes involved in the regeneration cascade. Therefore, they are interesting models to study possible differences in the mechanism of activation and action of satellite cells in the dystrophic muscle. The main objectives of this project are: 1) to isolate and characterize by flow cytometry, populations of satellite cells from Largemyd and Lama2dy2j/J models, as compared to normal C57Black6, evaluating the presence of myogenic and pluripotent stem cells markers; and 2) to study and compare gene expression profiles of these populations of satellite cells using microarray technique. In the phenotypic characterization of cells harvested from normal muscle, both faster (PP1) and slower (PP2) populations to adhere in culture flasks show similar phenotypic characteristics, which were closer to myogenic phenotype. On the other hand, the population of cells with very delayed adhesion ability (PP6) presented a mixed pattern, maintaining the myogenic characteristics, but associated to positive mesenchymal stem cell´s markers, suggesting a phenotype of more immature cells. In dystrophic muscles, we could identify differences in the constitution of the first pool of cells present in the Lama2dy2j/J muscle where there is evidence of a population in proliferative stage, while in the Largemyd strain, we found more immature cells. Gene expression profile in the characterized populations showed consistent concordance with the cellular phenotypes assessed by flow citometry. In both dystrophic models, we identified down-regulated genes related to regeneration and remodeling of the muscle. Considering only the genes differently expressed in each dystrophic model, data suggest the activation of cell proliferation and inhibition of differentiation pathways in Lama2dy2j/J strain and altered myogenesis in the Largemyd model. Thus, we identified important altered pathways in each of the dystrophic models that could explain most of the differences in gene expression profile in the muscle, described in our previous work

O ferro (Fe) é um dos metais mais importantes para a homeostase. Está envolvido em vários processos fisiológicos como, por exemplo, processo redox, síntese de DNA, metabolismo energético e transporte de biomoléculas. A regulação da concentração deste metal é bem controlada já que o seu excesso pode culminar na produção de espécies reativas de oxigênio que causam dano celular e sua escassez inibe o sistema imunológico. Um dos elementos chaves para o sucesso da cura de doenças infecciosas está na capacidade do hospedeiro em conter a proliferação do microrganismo e na ativação controlada da imunidade celular. Assim como os organismos eucariotos, grande parte dos organismos procariotos necessita de Fe para proliferação e manutenção das atividades biológicas. Deste modo, a interação entre esses dois organismos promove uma batalha para a captura deste metal que pode influenciar no curso de uma doença infecciosa tanto para o beneficio do hospedeiro quanto para o patógeno invasor. A Tuberculose (TB) é a maior causa de morte por doença infecciosa em adultos no mundo sendo responsável pela morte de 1 milhão de pessoas anualmente. Embora a doença tenha grande possibilidade de cura e tratamento disponível para a população, a reincidência de TB é alta e o surgimento de cepas resistentes à antibioticoterapia cresce gradativamente. Diante disso, é necessário compreender cada vez mais o processo fisiopatológico envolvido na TB para buscar novos alvos terapêuticos para cura e redução dos índices de mortalidade. O presente estudo tem como objetivo avaliar a expressão de genes envolvidos na homeostase do ferro em macrófagos humanos após a infecção com Mycobacterium tuberculosis H37Rv e o isolado clinico hipervirulento Mycobacterium tuberculosis Beijing 1471 com e sem suplementação de ferro. Para isso, macrófagos infectados foram lisados para obtenção e purificação de RNA total e o estudo de expressão gênica foi realizado utilizando a tecnologia de PCR em tempo real (RT-qPCR). Além disso, foi determinada a concentração de ferro no sobrenadante dessas culturas bem como o crescimento desses microrganismos no interior dos macrófagos. Genes envolvidos no controle da internalização do Fe em macrófagos foram diferentemente expressos nas culturas infectadas em relação ao controle não infectado. Também foi possível observar que a expressão desses genes varia com o tempo de infecção e com o tratamento com ferro, demostrando que existe um esforço da célula hospedeira em conter a infecção. Não foi observado variação significativa com relação à dosagem de ferro no sobrenadante das culturas infectadas em relação ao controle e o crescimento das micobactérias dentro dos macrófagos não variou de maneira significativa com relação aos tratamentos empregados. Dessa forma, este estudo contribuiu para o esclarecimento da resposta do macrófago frente à infecção com micobactérias que apresentam perfil de virulência distinto entre si e a interação do ferro neste processo patológico. / Iron (Fe) is one of the most important metals to homeostasis. It is involved in various physiological processes such as redox process, DNA synthesis, energy metabolism and transport of biomolecules. The concentration regulation of this metal is well-controlled since its excess can lead to the production of reactive oxygen species that cause cell damage and its scarcity inhibits the immune system. One of the key elements for the cure of infectious diseases is the host\'s ability to contain the spread of the organism and control activation of cellular immunity. Just as eukaryotes, most prokaryotes organisms require Fe for its proliferation and maintenance of biological activities. Thus, the interaction between these two organisms promotes a battle to capture this metal that can influence the course of an infectious disease either to the benefit of the host or to the invading pathogen. Tuberculosis (TB) is the leading cause of death from infectious disease among adults worldwide and is responsible for the death of 1 million people annually. Although the disease has high possibility of cure and treatment available to the population, the recurrence of TB is high and the emergence of resistant strains to antibiotics grows gradually. Therefore, it is necessary to understand more the pathophysiological process involved in TB to seek new therapeutic targets for healing and reduction in mortality. The present study aims to evaluate the expression of genes involved in iron homeostasis in human macrophages after infection with Mycobacterium tuberculosis H37Rv and the hypervirulent clinical isolate Mycobacterium tuberculosis Beijing in 1471 with and without iron supplementation. For this, macrophages were lysed and purificated to obtain total RNA, and the study of gene expression was performed using the technology of Real-time PCR (RT-qPCR). Furthermore, the iron concentration in the supernatant of these cultures was determined as well as growth of these microorganisms in macrophages. Genes involved in controlling internalization of Fe in macrophages were differently expressed in infected compared to uninfected control cultures. It was also observed that the expression of these genes varies with the time of infection and treatment with iron, showing that there is an effort of host cell to contain the infection. No significant variation was observed onto the iron dosage in the supernatant of infected compared to control cultures and the growth of mycobacteria inside macrophages did not vary significantly between treatments. Thus, this study contributed to the clarification of the macrophage response to infection with mycobacteria that have distinct virulence profile among themselves and the interaction of the iron in this disease process.

INTRODUÇÃO: A obesidade é um grave problema de saúde pública, sendo definida como o acúmulo excessivo de gordura, possivelmente decorrente do desequilíbrio, por um longo período, entre a quantidade de energia ingerida e o gasto energético. OBJETIVO: Investigar a contribuição dos polimorfismos dos genes CD40, ICAM-1, VCAM, E-selectina, LIGHT, RAGE e CX3CR1 na associação com a obesidade. CASUÍSTICA E MÉTODOS: O estudo foi realizado no Instituto Dante Pazzanese de Cardiologia (IDPC) e no Hospital Universitário da Universidade de São Paulo (HU/USP), com 199 indivíduos (40 com peso normal, 55 com sobrepeso e 104 obesos) brasileiros, sem vínculo genético, de etnias branca, parda, negra e amarela, de ambos os sexos (55 homens e 144 mulheres), com idade entre 30 e 68 anos. Foi realizado o estudo dos polimorfismos dos genes CD40 (rs1883832) C&#62;T, CX3CR1 (rs3732379) C&#62;T, CX3CR1 (rs3732378) G&#62;A, E-selectina (rs5368) C&#62;T, ICAM-1 (rs1799969) G&#62;A, ICAM-1 (rs281432) C&#62;G, LIGHT (rs344560) G&#62;A, LIGHT (rs2291668) C&#62;T, RAGE (rs2070600) G&#62;A, RAGE (rs2236493) C&#62;T e VCAM (rs3176878) C&#62;T, por pirossequenciamento, a análise da expressão dos genes LIGHT, CX3CR1, RAGE e ICAM-1, pela PCR em tempo real, e as dosagens das formas solúveis de PAI-1, IL-6, TNF-&#945;, resistina, adiponectina e leptina, utilizando o sistema LUMINEX. RESULTADOS: As frequências alélica e genotípica dos polimorfismos estudados CD40 (rs1883832) C&#62;T, CX3CR1 (rs3732379) C&#62;T, CX3CR1 (rs3732378) G&#62;A, E-selectina (rs5368) C&#62;T, ICAM-1 (rs1799969) G&#62;A, ICAM-1 (rs281432) C&#62;G, LIGHT (rs344560) G&#62;A, LIGHT (rs2291668) C&#62;T, RAGE (rs2070600) G&#62;A, RAGE (rs2236493) C&#62;T e VCAM (rs3176878) C&#62;T não apresentaram associação significativa com a obesidade. Foi encontrada associação na análise da expressão do CX3CR1 com a obesidade e também foi encontrada associação do polimorfismo ICAM-1 (rs281432) G&#62;C com a expressão do gene RAGE em indivíduos com peso normal. CONCLUSÕES: Não houve associação dos polimorfismos CD40 (rs1883832) C&#62;T, CX3CR1 (rs3732379) C&#62;T, CX3CR1 (rs3732378) G&#62;A, E-selectina (rs5368) C&#62;T, ICAM-1 (rs1799969) G&#62;A, ICAM-1 (rs281432) C&#62;G, LIGHT (rs344560) G&#62;A, LIGHT (rs2291668) C&#62;T, RAGE (rs2070600) G&#62;A, RAGE (rs2236493) C&#62;T e VCAM (rs3176878) C&#62;T com a obesidade, mas houve associação da expressão do gene CX3CR1 com a obesidade. Houve, também, associação do polimorfismo ICAM-1 (rs281432) G&#62;C com a expressão do gene RAGE em indivíduos de peso normal. / Background: Obesity is a serious health problem and it is defined as an excessive fat accumulation which is caused by an imbalance between the amount of energy intake and energy expenditure over a long period. Objective: The main objective of this study was to investigate the contribution of CD403 ICAM-1, VCAM, E-selectin, LIGHT, RAGE e CX3CR1 gene polymorphisms and its association with obesity. Material and Methods: The study was realized at Dante Pazzanese Institute of Cardiology and University Hospital of São Paulo University. There were included 199 individuals (40 normal weight, 55 overweight and 104 obese), all Brazilian, with no genetic link, from all ethnics in both genders (55 men and 144 women), aged between 30 and 68 years. The study of CD40 (rs1883832) C>T, CX3CR1 (rs3732379) C>T, CX3CR1 (rs3732378) G>A, E-selectin (rs5368) C>T, ICAM-1 (rs1799969) G>A , ICAM-1 (rs281432) C>G, LIGHT (rs344560) G>A, LIGHT (rs2291668) C>T, RAGE (rs2070600) G>A, RAGE (rs2236493) C>T and VCAM (rs3176878) C>T were conducted by pyrosequencing. The analysis of LIGHT, CX3CR1, RAGE and ICAM-1 gene expression were performed by real-time PCR and the measurements of PAI-1, IL- 6, TNF-a, resistin, leptin and adiponectin soluble forms using LUMINEX system. Results: The allele and genotype frequency of CD40 (rs1883832) C>T, CX3CR1 (rs3732379) C>T, CX3CR1 (rs3732378) G>A, E-selectin (rs5368) C>T, ICAM-1 (rs1799969) G>A , ICAM-1 (rs281432) C>G, LIGHT (rs344560) G>A, LIGHT (rs2291668) C>T, RAGE (rs2070600) G>A, RAGE (rs2236493) C>T and VCAM (rs3176878) C>T gene polymorphisms showed no significant association with obesity. There was found association in the analysis of CX3CR1 expression with obesity and it was found association of ICAM-1 gene polymorphism (rs281432) G>C with RAGE gene expression in the normal weight group. Conclusion: There was no association of CD40 (rs1883832) C>T, CX3CR1 (rs3732379) C>T, CX3CR1 (rs3732378) G>A, E-selectin (rs5368) C>T, ICAM-1 (rs1799969) G>A , ICAM-1 (rs281432) C>G, LIGHT (rs344560) G>A, LIGHT (rs2291668) C>T, RAGE (rs2070600) G>A, RAGE (rs2236493) C>T and VCAM (rs3176878) C>T gene polymorphisms with obesity. However, it was found association of CX3CR1 gene expression with obesity and an association of ICAM-1 (rs281432) G>C gene polymorphism with RAGE gene expression in normal weight individuals.

O produto do gene thi1 de Arabidopsis thaliana está provavelmente envolvido na biossíntese de tiamina (vitamina B1) e na proteção do DNA organelar contra danos. Estudos sobre a biossíntese da tiamina em plantas sugerem uma localização plastidial para este mecanismo, o que está de acordo com a existência de um peptídeo de trânsito cloroplástico (TP) na região N-terminal de THI1. Por outro lado, em leveduras a tiamina é sintetizada em mitocôndrias. Interessantemente, o cDNA de thi1 de A. thaliana complementa uma cepa de levedura com disrupção no gene homólogo thi4. A análise da seqüência de aminoácidos de THI1 revelou a presença de uma região capaz de formar uma estrutura do tipo a-hélice anfifílica, freqüentemente encontrada em preseqüências mitocondriais, localizada logo após o peptídeo de trânsito cloroplástico. O papel desta região na localização da proteína THI1 nas mitocôndrias foi comprovado a partir de ensaios envolvendo construções de genes quiméricos (contendo ou não a putativa seqüência de direcionamento mitocondrial) e um gene repórter (uidA). Estas construções foram introduzidas em plantas de tabaco e a localização da atividade GUS foi determinada nas frações subcelulares das plantas transgênicas. Análise direta da presença de THI1 nas mitocôndrias e cloroplastos de Arabidopsis foi realizada via imunolocalização. Também foram fornecidas evidências que as duas isoformas organelares são codificadas por um único transcrito nuclear. Experimentos de transcrição/tradução in vitro indicaram a ocorrência de dois produtos da tradução a partir de códons de iníciação em fase de leitura. Mutações sítio-específicas na seqüência de thi1 acoplados à experimentos usando a proteína fluorescente verde (GFP) mostraram que a tradução no primeiro AUG determina a localização da proteína nos cloroplastos, enquanto que a tradução no segundo AUG é responsável pelo endereçamento da proteína às mitocôndrias. A análise do contexto para início da tradução revelou que a região em torno do primeiro AUG é mais favorável para a tradução do mRNA de thi1. Além disso, observou-se a presença de uma forte estrutura em "grampo de cabelo" próximo ao segundo códon AUG, indicando um contexto subótimo capaz de interferir na tradução. Estas observações confirmaram os dados obtidos a partir da tradução in vitro na qual a iniciação se dá preferencialmente no primeiro AUG o que pode sugerir uma maior necessidade da proteína nos plastídeos. / Arabidopsis thaliana thi1 gene product is probably involved in both thiamine biosynthesis as well as protection of organellar DNA from damage. Studies of thiamine biosynthesis in plants suggest a plastid location for the pathway, which is in agreement with the predicted THI1 N-terminal chloroplastic transit peptide (TP). On the other hand, thiamine is synthesized in mitochondria in yeast cells. Interestingly, A. thaliana thi1 cDNA complements a yeast strain disrupted for the homologous thi4 gene. Analysis of THI1 amino acid sequence revealed the presence of a putative amphiphilic a-helix, which is typical for mitochondrial presequences, located downstream of the chloroplast transit peptide. The role of this sequence on mitochondrial import has been shown by chimeric gene constructs (carrying or not the putative mitochondrial presequence) and the uidA reporter gene. These constructions have been introduced into tobacco plants and the GUS activity has been measured in subcellular fractions of transgenic plants. Direct analysis of THIp in mitochondria and chloroplasts has been done via ImmunoGold labelling experiments. Additional evidence suggested that the two organellar isoforms were encoded by a single nuclear transcript. In vitro transcription/translation experiments revealed the presence of two translational products by a differential usage of two in-frame translational start codons. Coupling site-specific mutations on THI1 encoding sequence with green fluorescent protein (GFP) gene fusions showed that translation initiation in the first AUG directs translocation of THI1 to plastids. However, when translation initiates from the second AUG THI1 is addressed to mitochondria. Analysis of the translation efficiency of thi1 mRNA revealed that the best context for translation initiation is present at the first AUG. In addition, it has been shown a suboptimal context at the second AUG and a strong stem-and-loop structure which is likely to slow translation. These observation confirm the in vitro translation data in which translation occurs preferentially in the first AUG, what could suggest a higher requirement of the protein in plastids.

A fissura lábio-palatina não-sindrômica (FLP NS) é uma doença multifatorial, determinada pela interação entre fatores genéticos e ambientais e sua incidência é estimada entre 0,34 e 2,29 a cada 1000 nascimentos. Trata-se de uma embriopatia causada por erros durante a morfogênese orofacial, a qual depende de uma fina regulação de mecanismos como proliferação celular, remodelagem de matriz extracelular, e transição epitélio-mesenquimal. Apesar de intensos esforços para se determinar fatores genéticos e ambientais de susceptibilidade, a etiologia desta malformação permanece pouco compreendida. Vários loci associados às FLP NS vêm sendo identificados por meio de estudos de mapeamento gênico convencionais, entretanto, a grande maioria dos resultados não se replica em diferentes estudos, e não há clareza acerca do efeito funcional das variantes detectadas. Neste contexto, uma abordagem interessante para investigar a etiologia da doença é a análise de expressão gênica, que pode ser utilizada para identificar alterações de vias biológicas que convergem na manifestação do quadro clínico. Em vista disso, neste trabalho nós utilizamos a análise do transcriptoma de células-tronco de polpa dental de pacientes portadores de FLP NS, com o intuito de identificar padrões de expressão relacionados a mecanismos biológicos relevantes para a embriopatogênese da doença. Obtivemos padrões de expressão que sugerem desregulação de mecanismos associados à remodelagem de matriz extracelular e à transição epitélio-mesenquimal. Além disso, ao utilizarmos diferentes condições de cultura celular, verificamos em uma nova amostra de pacientes a desregulação de vias biológicas relacionadas ao reparo de DNA e checkpoint do ciclo celular. Nossos dados revelam a aplicabilidade das células-tronco de polpa dental para este tipo de abordagem, e indicam que tais perfis de expressão podem levar ao acometimento da morfogênese lábio-palatina. Além disso, mostramos pela primeira vez uma conexão entre desregulação de expressão gênica e a documentada maior incidência de formas esporádicas de câncer em famílias segregando a FLP NS. Nossos resultados abrem novas possibilidades para a investigação da etiologia das FLP NS, e ajudarão na compreensão dos eventos embrionários que predispõem a essa malformação. / Non-syndromic cleft lip and palate (NSCL/P) is a multifactorial disease determined by the interplay between genetic and environmental factors, with a variable incidence of 0.34-2.29:1000 births. This malformation arises from errors during lip and palate morphogenesis, which requires tight regulation of biological mechanisms such as cellular proliferation, extracellular matrix remodelling, and epithelial-mesenchymal transition. Albeit much effort has been put into determining the genetic and environmental factors underlying disease susceptibility, the aetiology of NSCL/P remains obscure. Many candidate loci have been identified through conventional gene mapping strategies, however, there is a general lack of reproducibility across studies, and there is no consensus with regard to the functional implications of the identified genetic variants. In this context, an alternative approach resides in assessing differential expression patterns to identify alterations in biological networks that could lead to phenotype manifestation. Here, we analysed the transcriptome of dental pulp stem cells from NSCL/P patients in order to pinpoint dysregulated pathways involved in the embryopathogenesis of the disease. We encountered expression patterns related to dysregulation of extracellular matrix remodelling and epithelial mesenchymal transition. Moreover, by subjecting a novel NSCL/P sample to differential cell culture conditions, we observed abnormal transcription of genes partaking in DNA repair and cell cycle checkpoint pathways. Our results show the applicability of dental pulp stem cells to this strategy and suggest that the observed expression patterns could lead to impairment of lip and palate morphogenesis. Moreover, we described for the first time a connection between abnormal gene expression in these individuals and the elevated occurrence of sporadic cancer types in NSCL/P families. Our results open new possibilities to investigate the aetiology of NSCL/P and provide further insight into the ontogenetic events underlying disease predisposition.