Glioblastoma (GB) é o tumor cerebral humano mais frequente e maligno. O prognóstico dos pacientes com GB permanece alarmante, principalmente devido à baixa eficácia das estratégias terapêuticas atuais além da natureza invasiva desse tipo de câncer. Uma característica de tumores sólidos é apresentar áreas hipóxicas. Microambientes hipóxicos contribuem para a progressão do câncer, resistência ao tratamento e ao prognóstico ruim da doença. Dessa forma, neste trabalho, desenvolvemos um modelo in vitro que se aproxima ao microambiente hipóxico tumoral in vivo. Nossos resultados sugerem que a privação de oxigênio (PO) em combinação com ausência de soro forneceu um ambiente favorável à desdiferenciação das células C6 em células tronco tumorais (CTT). A doxazosina (DOX), um antihipertensivo utilizado na clínica, apresenta efeitos antitumorais em diversos tipos de câncer. Assim, avaliamos o efeito antitumoral da doxazosina em linhagens de glioma de rato (C6) e humano (U138-MG) e a toxicidade do fármaco em culturas primárias de astrócitos e culturas organotípicas de hipocampo. A doxazosina induziu morte celular nas linhagens de glioma e apresentou baixa neurotoxicidade. Além disso, o fármaco inibiu a via da PI3K/Akt e ativou GSK-3β e p53, resultando em indução de apoptose e parada no ciclo celular na fase G0/G1. Considerando a importância da mitocôndria na plasticidade de células tumorais e a resistência ao tratamento apresentada pelos GB, nós analisamos os efeitos da DOX nas interações entre núcleo e mitocôndrias. A DOX induziu biogênese mitocondrial e apoptose nas células C6 e diminuiu secreção de TNF-α. Ao analisar a estrutura química da DOX, encontramos diversas características que indicam que ela possui autofluorescência. Dessa forma, caracterizamos a autofluorescência da DOX em diversos meios. Observamos que há um padrão de distribuição do fármaco nas células C6: ele se encontra ao redor do núcleo e parece estar vesiculado. A superexpressão do receptor do fator de crescimento epidermal (EGFR) está relacionada às formas mais malignas e resistentes de GBs. Portanto, analisamos se a ação antiglioma da DOX está envolvida com EGFR. O tratamento com DOX foi capaz de diminuir os níveis de p-EGFR. O co-tratamento de DOX e AG1478 (inibidor de receptores de tirosina cinase) diminuiu a fosforilação de EGFR e causou necrose. Em vista disso, nossos resultados sugerem que o mecanismo de ação da DOX envolve sinalização de EGFR. Por fim, nós avaliamos os efeitos da DOX livre e nanoencapsulada (DOX-NC) em modelos in vitro e in vivo de glioma. Demonstramos que a DOX-NC induziu morte celular em linhagem de glioma em concentrações 100 vezes menores do que as que utilizamos para a DOX na sua forma livre. Além disso, analisamos o efeito da DOX-NC em culturas organotípicas de hipocampo e, da mesma maneira que o observado com a DOX, a DOX-NC demonstrou baixa toxicidade e diminuiu a área tumoral in vivo, sendo seletiva para células cancerosas. Nesta tese, alteramos o microambiente in vitro de células de glioma, avaliamos os efeitos antitumorais da doxazosina em sua forma livre e nanoencapsulada. Além disso, utilizamos modelos de glioma in vitro e in vivo e em diversos parâmetros celulares, descrevemos a autofluorescência do fármaco e também utilizamos essa característica para avaliar a captação e a distribuição da doxazosina em células de glioma. Nossos resultados contribuíram para aproximar os modelos de estudo com o que ocorre em gliomas in vivo e para evidenciar o potencial terapêutico da doxazosina como um agente antiglioma com baixa toxicidade neural e sistêmica. / Glioblastoma (GB) is the most frequent and malignant human brain tumor. The prognosis of patients with GB remains dismal, mainly due to the low effectiveness of current therapeutic strategies and the invasive nature of this type of cancer. A characteristic of solid tumors is the presence of hypoxic areas. Hypoxic microenvironments contribute to cancer progression, resistance to treatment, and poor prognosis of the disease. Thus, we developed an in vitro model that approximates the hypoxic tumor microenvironment found in vivo. Our results suggest that OD in combination with absence of serum provided an environment favorable to the dedifferentiation of C6 cells in cancer stem cells. Doxazosin (DOX), an antihypertensive used in the clinic, has antitumor effects in several types of cancer. Thus, we evaluated the antitumor effect of DOX on rat (C6) and human (U138-MG) glioma cell lines and drug toxicity in primary astrocyte cultures and organotypic hippocampal cultures. DOX induced cell death in glioma lines and showed low neurotoxicity. In addition, the drug inhibited the PI3K/Akt pathway and activated GSK-3β and p53, resulting in induction of apoptosis and cell cycle arrest in the G0/G1 phase. Considering the importance of mitochondria in the plasticity of tumor cells and the resistance to treatment presented by glioblastomas, we analyzed the effects of DOX the interactions between nucleus and mitochondria. DOX induced mitochondrial biogenesis and apoptosis in C6 cells, and decreased TNF-α secretion. When analyzing the chemical structure doxazosin, we find several characteristics that indicate that it has autofluorescence. Thus, we characterized the autofluorescence of DOX in several media. We observed that there is a pattern of distribution of the drug in the cell: it is around the nucleus and appears to be vesiculated. Overexpression of the Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) is related to the more malignant and resistant forms of GBs. Therefore, we analyzed whether the antiglioma action of DOX is involved with EGFR. DOX treatment was able to decrease p-EGFR levels. Co-treatment of DOX and AG1478 (a receptor tyrosine kinase inhibitor) decreased EGFR phosphorylation and caused necrosis. Thus, our results suggest that the mechanism of action of doxazosin involves EGFR signaling. We evaluated the effects of free and nanoencapsulated doxazosin (DOX-NC) in in vitro and in vivo models of glioma. We demonstrated that nanoencapsulated doxazosin (DOX-NC) induced cell death in a glioma line at concentrations 100 times lower than those used for doxazosin in its free form. In addition, we analyzed the effect of DOX-NC on organotypic hippocampal cultures and, in the same way as observed with DOX, DOX-NC demonstrated low toxicity and decreased tumor area in vivo, being selective for cancer cells. In this dissertation, we altered the in vitro microenvironment of glioma cells, we evaluated the antitumor effects of doxazosin in its free and nanoencapsulated form. In addition, we used glioma models in vitro and in vivo and analyzed several cellular parameters, we described the autofluorescence of the drug and also used this characteristic to evaluate the uptake and distribution of doxazosin in glioma cells. Our results have contributed to approximate the study models with what occurs in gliomas in vivo and to evidence the therapeutic potential of doxazosin as an antiglioma agent with low neural and systemic toxicity.

Orientador: Vera Fernanda Martins Hossepian de Lima / Banca: Lindsay Unno Gimenes / Banca: Beatriz da Costa Aguiar Alves Reis / Resumo: Os procedimentos durante a sexagem pelo citômetro de fluxo garantem a acuidade de 85%, mas causam danos na viabilidade espermática que levam a baixa taxa de prenhez após os 90 dias. Os objetivos dessa Dissertação foram: 1) caracterizar a expressão gênica diferencial em transcriptoma de espermatozoides congelados pelo método convencional, sexados por centrifugação em gradiente de densidade ou sexados por citometria de fluxo; 2) comparar as taxas de clivagem e de blastocistos produzidos in vitro de bovinos utilizando sêmen convencional, sexado por citometria de fluxo ou por centrifugação em gradiente de densidade. Os grupos experimentais para sêmen e embriões foram: 1) grupo controle: sêmen convencional submetido ao gradiente de PercollTM 45/90% e respectivos embriões produzidos com esse sêmen; 2) grupo gradiente: centrifugação em gradiente de densidade e respectivos embriões produzidos com esse sêmen; 3) grupo citometria: sêmen sexado pelo citometro de fluxo, submetido ao mini gradiente de PercollTM 45/90% e respectivos embriões produzidos com esse sêmen. O RNA total foi extraído dos espermatozoides (20 x 10 6 células) obtendo-se 400 ng RNA/ 20 x 10 6 células/ animal, ou seja, 20 fg RNA por espermatozoide. Entretanto, não foi posível a construção da biblioteca de cDNA, provavelmente, devido ao alto grau de degradação do RNA. Os Complexos cumulus oócito (COCs) classificados como graus 1, foram aspirados de folículos antrais de 3 a 8 mm de diâmetro a partir de ovários de abatedouros e maturados durante 18 horas em estufa a 38,5°C, 100% de umidade e atmosfera de 5% de CO2 em ar. Os oócitos maturados serão colocados em contato com os espermatozoides previamente preparados para fecundação e incubados por 20 horas em 5% de CO2, na temperatura de 38,5°C. Os prováveis zigotos serão lavados por três vezes em meio SOF (meio sintético de fluido de oviduto) sem SFB e sem glicose e cultivados e transferidos... / Abstract: The procedures for sexing by flow cytometry guarantee the accuracy of 85%, but cause damage in sperm viability leading to lower pregnancy rate after 90 days of pregnancy. The objectives of this study were: 1) to characterize differential gene expression in transcriptome of spermatozoa frozen by conventional method, sexed by density gradient centrifugation, by flow cytometry. 2) Compare blastocyst and cleavageratesproduced in vitro by conventional semen sexed by flow cytometry and by density gradient centrifugation. The experimental groups for semen and embryos were: 1) control group: conventional semen subjected to PercollTM gradient of 45/90% and their embryos produced with this semen, 2) gradientgroup: centrifugation in density gradient and their embryos produced with this semen, 3) cytometry group: semen sexed by flow cytometer, subjected to PercollTMmini gradient 45/90% and their embryos produced with this semen. Total RNA was extracted from sperm (20 x 10 6 cells) and it was possible to extract 400 ngRNA/ 20x10 6 cells/animal or it means, 20 fg of RNA per spermatozoa. However cDNA libraries were not built, probably due a high RNA degradation. The cumulus oocyte complexes (COCs) were classified as grade 1, aspirated from antral follicles with 3-8 mm in diameter, ovariesfromslaughterhouse were used and matured for 18 hours in an incubator at 38.5°C, 100% humidity and atmosphere of 5% of CO2 in air. The matured oocytes are going to be placed in contact with the prepared spermatozoa for fertilization and incubated for 20 hours in 5% CO2 at a temperature of 38.5 °C. Presumptive zygotes are going to be washed three times in SOF (half synthetic oviduct fluid) without FBS and without glucose, cultivated and transferred to plates with four wells containing 500 ul of the same medium used for washing zygotes after fertilization. Embryonic development was evaluated 7-8 days after fertilization. The cleavage and blastocysts rates were ... / Mestre

Orientador: Eunice Oba / Coorientador: Alicio Martins Júnior / Banca: Fernanda da Cruz Landin / Banca: Yeda Fumie Watanabe / Resumo: O objetivo deste estudo foi verificar o efeito de diferentes meios e tempos de refrigeração sobre o desenvolvimento e expressão gênica de embriões bovinos produzidos in vitro. Para tanto, blastocistos D7 foram divididos em três grupos: controle, embriões mantidos em meio SOFaa, em incubadora de CO2, por 6 e 48h; refrigerados, embriões mantidos a 5 °C, em Meio 199, por 24 (M199-24h) e 48h (M199-48h) ou em meio BotuEmbryo®, por 24 (BE-24h) e 48h (BE-48h). Após a refrigeração, os embriões foram cultivados sob as mesmas condições do grupo controle para avaliação da viabilidade embrionária às 6 e 48h, e das taxas de reexpansão e eclosão, às 24 e 48h, respectivamente. Às 6h de cultivo parte dos embriões foi retirada e armazenada para posterior análise de qPCR e TUNEL. Menor porcentagem (P<0,05) de blastocistos viáveis, às 6 e 48h, foi observada no grupo M199-48 em relação ao grupo controle. A taxa de reexpansão não diferiu entre os embriões refrigerados e o grupo controle, porém, menor (P<0,05) taxa de eclosão foi observada nos grupos M199-48h e BE-48h do que no grupo controle. Maior (P<0,05) porcentagem de células apoptóticas foi observada no grupo BE-48h do que nos grupos controle e BE-24h. Os meios e tempos utilizados não alteraram a expressão dos genes HSPA1A, PRDX1, SOD1 e SLC2A1. Portanto, de modo geral, o meio e o tempo de refrigeração não promoveram efeito potencial adverso sobre a viabilidade embrionária, taxa de reexpansão e eclosão, número de células apoptóticas e expressão gênica, sugerindo o emprego do meio BotuEmbryo®, o qual é disponível comercialmente / Abstract: This study was carried out to investigate the effects of different media and cooling times on the development and gene expression of in vitro-derived bovine embryos. Therefore, blastocysts D7 were divided into three groups: control, embryos kept in SOFaa medium, under CO2 incubation, for 6, 24 and 48 hours; cooled embryos, kept in Medium 199, for 24 (M199-24h) and 48 hours (M199-48h) or in BotuEmbryo® medium, for 24 (BE-24h) and 48 hours (M199-48h). After cooling, the embryos were cultured under the same conditions used for the control group for evaluation of embryo viability at 6 and 48 hours, and of re-expansion and hatching rates, at 24 and 48 hours, respectively. At 6h of culture part of the embryos was removed and stored for later analysis of qPCR and TUNEL. Low percentage (P<0.05) of viable blastocysts, at 6 and 48 hours, was observed in group M199-48h than for control group. Re-expansion rate did not differ between cooled embryos and control group, however, lower (P<0.05) hatching rate was observed in M199-48h and BE-48h groups than for control group. Higher (P<0.05) percentage of apoptotic cells was found in BE-48h compared with control and BE-24h groups. Media and cooling times used did not alter the expression of genes HSPA1A, PRDX1, SOD1 and SLC2A1. Thus, overall, medium and cooling time did not promoted potential adverse effect on the embryonic viability, re-expansion and hatching rate, number of apoptotic cells and gene expression, suggesting the use of BotuEmbryo® medium, which is commercially available / Mestre

Orientador: Mirela Tinucci Costa / Coorientador: Renée Laufer Amorim / Banca: Felipe Augusto Ruiz Sueiro / Banca: Noeme Sousa Rocha / Banca: Geovanni Dantas Cassali / Banca: Andrigo Barboza De Nardi / Resumo: Tumores mamários são muito comuns em cadelas e apresentam comportamento biológico semelhante aos que ocorrem nas mulheres, tornando a cadela um excelente modelo de estudo comparativo. A transição epitélio-mesênquima (EMT) facilita a migração celular, favorecendo a ocorrência de metástases, fator que tem influência direta no prognóstico das pacientes com neoplasia mamária. Assim, este estudo objetivou avaliar, pela técnica de imuno-histoquimica, marcadores de EMT em tumores mamários caninos (E-caderina, β-catenina, Vimentina e Citoceratina), além da expressão gênica e protéica de dos genes WNT5A e APC pelas técnicas de RT-qPCR e imuno-histoquímica. Para isto foram utilizadas 98 cadelas, sem predileção por raça ou idade, além de glândulas mamárias normais. Quatro grupos foram formados: (G1) 5 amostras de mamas normais sem alterações histopatológicas; (G2) 28 alterações mamárias benignas; (G3) 56 carcinomas mamários sem metástase e (G4) 14 carcinomas mamários com metástase. Ambos os genes (APC e WNT5A) mostraram maior expressão entre as mamas normais, sem diferença entre neoplasias benignas e malignas (com e sem metástase). O fenótipo de EMT foi identificado pela análise multivariada, pois neoplasias benignas foram fortemente associadas à β-catenina em membrana, escore elevado de citoceratina e negatividade para vimentina nas células epiteliais, enquanto os carcinomas metastáticos foram associados à β-catenina nuclear, baixo escore de E-caderina e positividade para vimentina em suas células epiteliais neoplásicas. Como a presença de β-catenina nuclear é característica da ativação da via de sinalização do Wnt/β-catenina, é possível concluir que esta via está ativada entre as neoplasias mamárias caninas e que o processo de EMT está ocorrendo visto a transformação das células epiteliais das neoplasias benignas em um fenótipo mesenquimal como o observado nas neoplasias ... / Abstract: Mammary tumors are very common in bitches and have a very similar biological behavior to the ones that occur in women, turning it an excellent model for comparative studies. Epithelial-mesenchymal transition (EMT) facilitate migration and the occurrence of metastasis, factor that have direct influence on prognosis. Thus, this study aimed to evaluate, by immunohistochemistry (IHC), EMT markers in canine mammary tumors (e-cadherin, β-catenin, vimentin and cytokeratin). In addition, gene and protein expressions of two genes WNT5A and APC were evaluated by qRT-PCR and immunohistochemistry. To this, 98 bitches with no breed or age predilection, besides normal mammary glands without neoplastic lesions were used to form four groups: (G1) 5 normal mammary samples; (G2) 28 benign mammary lesions; (G3) 56 non-metastatic mammary carcinomas and (G4) 14 metastatic carcinomas. Both genes, APC and WNT5A show higher expression between normal mammary samples and no difference among benign and malignant tumors (metastatic and non-metastatic). EMT phenotype was identified by multivariate analysis, because benign tumors were stongly associated with membranous β-catenin, high scores of Cytokeratin and no vimentin expression in epithelial cells and metastatic carcinomas were strongly associated to nuclear β-catenin, low E-cadherin expression and vimentin positivity in neoplastic epithelial cells. As nuclear localization of β-catenin is characteristic of Wnt/β-catenin signaling pathway aberrant activation, we can conclude that Wnt/β-catenin signalling pathway is activated among canine mammary tumors and EMT is occuring since benign epithelial cells have been transformed in mesenchymal cells in metastatic tumors. Those findings provide data for a better understanding of cancer progression and open new perspectives about research not only in mammary tumors, but also in other neoplastic types in dogs, facilitating to identify new prognostic factors and ... / Doutor

Introdução: O Meduloblastoma (MB) é o tumor sólido maligno mais comum do sistema nervoso central em crianças. Corresponde a aproximadamente 20% de todos os tumores intracranianos pediátricos, surge no cerebelo e sua origem é embrionária, sendo altamente invasivo. Como tratamento padrão usa-se a ressecção cirúrgica do tumor, quimioterapia e radioterapia crânio-espinhal; porém, a taxa de sobrevida livre de eventos (SLE) em cinco anos para os pacientes de baixo risco é de aproximadamente 70% e a maioria dos pacientes que sobrevivem sofre de efeitos secundários a longo prazo. Portanto, crescem as buscas por novos tratamentos que apresentem menores efeitos colaterais ou que diminuam/eliminem a necessidade de radiação. Vários fatores contribuem para o desenvolvimento e progressão da doença, entre eles, a regulação da expressão gênica por microRNAs (miRNAs). Essas moléculas regulam diversos processos biológicos, exercendo regulação gênica negativa a nível pós-transcricional; no entanto, seu papel em MB ainda é pouco explorado. Objetivo: Avaliar o perfil de expressão de miRNAs diferencialmente expressos em amostras de pacientes portadores de MB e correlacionar seus níveis de expressão com características clínicas dos pacientes, assim como identificar possíveis marcadores de prognóstico. Metodologia: Foram selecionados 15 miRNAs a partir de dados prévios obtidos pela técnica de microarranjo. Foi realizada a expressão desses miRNAs por PCR quantitativa em tempo real (RT-qPCR) e feita a comparação com as características clínicas, utilizando amostras de pacientes portadores de MB adultos e pediátricos (N=51) e amostras de cerebelos não neoplásicos fetais (N=10) e não fetais (N=7). A comparação entre os grupos foi feita por teste de Mann-Whitney e a análise de sobrevida livre de eventos (SLE) e sobrevida global (SG) por curvas de Kaplan-Meier e teste log-rank. A análise multivariada por modelo de regressão de Cox foi utilizada para avaliação dos fatores prognósticos. Resultados: Os miRNAs miR-329, -383, -433, -485-3p, -485-5p, -491-5p, -512-3p, -539-5p estão hipoexpressos nos tumores em relação aos cerebelos fetais e não fetais; o miR-31-5p está hipoexpresso e o miR-199a-5p está hiperexpresso nos tumores em relação ao cerebelos não fetais; o miR-202-3p e o miR-650 estão hipoexpressos nos tumores em relação aos cerebelos fetais. Além disso, os miRNAsmiR-199a-5p e -329 estãoshipoexpressos em pacientes menores que 3 anos, com relação aos maiores de 3 anos; os miRNAs miR-202-3p, -329, -491-4p e -512-3p estão hipoexpressos em pacientes que tiveram grau de ressecção completo do tumor, em comparação aos que tiveram grau incompleto; e os miRNAs miR-202-3p e -512-3p estão hipoexpressos em pacientes classificados como baixo risco em comparação aos classificados como alto risco. Adicionalmente, o miR-211-5p está hipoexpresso nos pacientes com menor sobrevida global e livre de eventos; e o miR-512-3p está hiperexpresso nos pacientes com menor sobrevida global e livre de eventos. Expressão do miR-211-5p foi fator prognóstico independente para SLE quando analisada com as variáveis expressão do miR-512-3p e grupo de risco por modelo de regressão de Cox. Conclusão: É possível observar um padrão diferencial de expressão desses miRNAs no MB, podendo ser biomarcadores importantes para esta doença. Estudos futuros serão realizados para investigar o papel desses miRNAs na progressão desse tumor. / Introduction: Medulloblastoma (MB) is the most common malignant solid tumor of the central nervous system in children,and it arises in the cerebellum with an embrionary origin. MB corresponds to approximately 20% of all pediatric intracranial tumors, and it is highly invasive. The standard treatment relies on tumor surgical resection, chemotherapy and craniospinal radiotherapy; however, the five years event-free survival for low-risk patients is approximately 70%, and most survival patients suffer from long-term side effects. Thus, the search for new treatments with fewer side effects or aiming to reduce/eliminate radiation is of great interest. Several factors contribute to the development and progression of this disease, among them the regulation of gene expression by microRNAs (miRNAs). These molecules regulate diverse biological processes, exerting negative regulation in gene expression at posttranscriptional level, however its role in MB is still poorly explored. Objective: Evaluate the profile of differentially expressed miRNAs in MB samples, correlate their expression levels with patients clinical features, and identify potential prognostic markers. Material and methods: 15 miRNAs were selected based on previous data obtained from a large-scale gene expression analysis using the microarray assay. It was performed their expression and compared with the clinical features of the patients by RT-qPCR. For this, it was used pediatric and adult patients samples (n=51) diagnosed with MB and non-neoplastic fetal (n=10) and non fetal (n=7) cerebellum samples. The comparison between groups was performed by Mann-Whitney test and event-free survival (EFS) analysis and overall survival (OS) by Kaplan-Meier and log-rank test. Multivariate analysis by Cox regression model was used to evaluate the prognostic factors. Results: The miRNAs miR-329, -383, -433, -485-3p, -485- 5p, -491-5p, -512-3p, -539-5p are downregulated in tumors when compared to fetal and nonfetal cerebellum; miR-31-5p is downregulated and miR-199a-5p is upregulated only in tumors compared to non-fetal cerebellum; miR-202-3p and miR-650 are downregulated in tumors only when compared to fetal cerebellum. In addition, miR-199a-5p and miR-329 are downregulated in patients under 3 years old compared to those who are higher than 3 year; miR-202-3p,miR-329, miR-491-5p and miR-512-3p are downregulated in patients who had complete tumor resection compared to those who had incomplete tumor resection; and miR- 202-3p and miR-512-3p are downregulated in low risk patients compared to high risk patients. In addition, miR-211-5p is downregulated and miR-512-3p is upregulated in patients with a poorer event-free survival and overall survival. The expression of miR-211-5p was an independent prognostic factor for EFS when analyzed with the variables miR-512-3p expression and risk group by Cox regression model Conclusion: It is possible to observe a differential pattern of expression of these miRNAs in MB and they may be important biomarkers for this disease. Further studies will be conducted to investigate the role of these miRNAs in the progression of this tumor.

Os gliomas são os tumores mais fatais do sistema nervoso central, para os quais ainda não há tratamento eficaz. Para analisar as bases celulares e moleculares da ação do agente diferenciador e antitumoral ácido retinóico (ATRA) sobre gliomas, foi utilizado, como modelo, a linhagem STl de glioma de rato. Propôs-se: a) analisar os efeitos de ATRA sobre a morfologia, proliferação e morte celular; b) isolar, identificar e caracterizar genes induzidos por ATRA em células STl. Verificou-se que o tratamento com ATRA promove achatamento celular e inibição da síntese de DNA e do crescimento em suspensão de agarose, caracterizando uma completa reversão fenotípica tumoral-normal, a qual não é acompanhada de indução de apoptose. Os genes induzidos por ATRA foram isolados através da construção de bibliotecas subtraídas de cDNA por: RDA (\"Representational Diference Analysis\") e SSH (\"Suppressive Subtractive Hybridization\") acoplados a rastreamento em \"macroarrays\". Foram identificados 10 genes regulados por ATRA durante a reversão fenotípica das células STl: p450rai2, spi3, vegf, cdv-3a, okl38, eya2, gem, retSDR1, aldose redutase-like, e um gene novo, com 61 % de identidade com uma fosfatase de galinha. Este estudo permitiu a caracterização dos efeitos de ATRA sobre STl e identificou novos alvos para futuro desenvolvimento de novas drogas e terapia gênica. / Gliomas are the most fatal central nervous system tumors, for which efficient treatment is still not available. To analyze the cellular and molecular bases for the action of the differentiating and anti-tumor agent retinoic acid (ATRA) in gliomas, the rat glioma STl cell line was used as a model. We proposed: a) to analyze the effects of ATRA in STl cells morphology, growth and apoptosis; b) to isolate, identify and characterize the ATRA-induced genes in STl cells. We demonstrated that ATRA promotes cellular flattening and inhibition of DNA synthesis and growth in agarose suspension, characterizing a complete tumoral to normal phenotypic reversion, which is not accompanied by apoptosis. Subtracted cDNA libraries were generated, using 2 different methodologies: RDA (Representational Difference Analysis) and SSH (Suppressive Subtractive Hybridization) followed by macroarray screening. This allowed identification of 10 ATRA induced genes which are up regulated by ATRA during STl cells phenotypic reversion, namely: p450rai2, spi3, vegf, cdv-3a, okl38, eya2, gem, retSDR1, aldose redutase-like and a new gene with 61 % identity with chicken phosphatase. This study characterized the cellular and molecular effects of ATRA upon STl cells and allowed identification of new targets for future development of new drugs and gene therapy.

Toda medida, desde que feita por um instrumento real, tem uma imprecisão associada. Neste trabalho, abordamos a questão das imprecisões em experimentos de microarranjos de cDNA de dois canais, uma tecnologia que tem sido muito explorada nos últimos anos e que ainda é um importante auxiliar nos estudos de expressões gênicas. Dezenas de milhares de representantes de genes são impressos em uma lâmina de vidro e hibridizados simultaneamente com RNA mensageiro de duas amostras diferentes de células. Essas amostras são marcadas com corantes fluorescentes diferentes e a lâmina, após a hibridização, é digitalizada, obtendo-se duas imagens. As imagens são analisadas com programas especiais que segmentam os locais que estavam os genes e extraem estatísticas dos píxeis de cada local. Por exemplo, a média, a mediana e a variância das intensidades do conjunto de píxeis de cada local (o mesmo é feito normalmente para uma área em volta de cada local, chamada de fundo). Estimadores estatísticos como o da variância nos dão uma estimativa de quão precisa é uma certa medida. Uma vez de posse das estimativas das intensidades de cada local, para se obter a efetiva expressão de um gene, algumas transformações são feitas nos dados de forma a eliminar variabilidades sistemáticas. Neste trabalho, mostramos como podem ser feitas as análises a partir de uma medida de expressão gênica com um erro estimado. Mostramos como estimar essa imprecisão e estudamos, em termos de propagação da imprecisão, os efeitos de algumas transformações realizadas nos dados, por exemplo, a remoção do viés estimado pelo método de regressão local robusta, mais conhecido como \\textit{lowess}. Uma vez obtidas as estimativas das imprecisões propagadas, mostramos também como utilizá-las na determinação dos genes diferencialmente expressos entre as amostras estudadas. Por fim, comparamos os resultados com os obtidos por formas clássicas de análise, em que são desconsideradas as imprecisões das medidas. Concluímos que a modelagem das imprecisões das medidas pode favorecer as análises, já que os resultados obtidos em uma aplicação com dados reais de expressões gênicas foram condizentes com os que encontramos na literatura. / Any measurement, since it is made for a real instrument, has an uncertainty associated with it. In the present paper, we address this issue of uncertainty in two-channel cDNA Microarray experiments, a technology that has been widely used in recent years and is still an important tool for gene expression studies. Tens of thousands of gene representatives are printed onto a glass slide and hybridized simultaneously with mRNA from two different cell samples. Different fluorescent dyes are used for labeling both samples. After hybridization, the glass slide is scanned yielding two images. Image processing and analysis programs are used for spot segmentation and pixel statistics computation, for instance, the mean, median and variance of pixel intensities for each spot. The same statistics are computed for the pixel intensities in the background region. Statistical estimators such as the variance gives us an estimate of the accuracy of a measurement. Based on the intensity estimates for each spot, some data transformations are applied in order to eliminate systematic variability so we can obtain the effective gene expression. This paper shows how to analyze gene expression measurements with an estimated error. We presented an estimate of this uncertainty and we studied, in terms of error propagation, the effects of some data transformations. An example of data transformation is the correction of the bias estimated by a robust local regression method, also known as \\textit{lowess}. With the propagated errors obtained, we also showed how to use them for detecting differentially expressed genes between different conditions. Finally, we compared the results with those obtained by classical analysis methods, in which the measurement errors are disregarded. We conclude that modeling the measurements uncertainties can improve the analysis, since the results obtained in a real gene expressions data base were consistent with the literature.

Submitted by Natalia Vieira (natalia.vieira@famerp.br) on 2016-05-20T18:11:47Z No. of bitstreams: 1 aneliserusso_tese.pdf: 3261901 bytes, checksum: 7194c2477e2a3932223f1bf8aaa91f60 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-20T18:11:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 aneliserusso_tese.pdf: 3261901 bytes, checksum: 7194c2477e2a3932223f1bf8aaa91f60 (MD5) Previous issue date: 2015-11-23 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Introduction: Susceptibility to enviromental agents as well as its adverse effects health depend on the personal genetic profile. Some individuals can present increased risk to develop cancer due to differences in biometabolism. Changes in the biotransformation mechanism of endogenous and exogenous compounds by oxidation reactions may be related to the tumorigenesis process. Differential expression of the genes involved in this xenobiotic metabolizing, such as cytochrome P450 (CYP) family members and others oxygenases, can change the activation process of toxic agents and lead to the oral cavity tumor development. Therefore, the individual differences of gene expression of this pathway associated to smoking and drinking can present significant risk factor for neoplasia. Objective: To identify the pattern of the gene expression involved in the biotransformation mechanism of endogenous and xenobiotic compounds in oral cavity tumors, aiming at identifing susceptibility biomarkers to this cancer type. Methods: Eight tissue samples of patients with oral cavity squamous cell carcinoma and eight adjacent non-tumor tissue samples were used. Expression of 92 genes CYP450 family and other oxygenases was quantifited by duplicate reactions of real time qPCR using “TaqMan® Array Human CYP450 and other Oxygenases 96-well fast plate” (Applied Biosystems). For statistical analysis was performed D'Agostino & Pearson omnibus normality test, followed by One-sample T test (data that showed normal distribution), and Wilcoxon signed rank test (data that did not present normal distribution) using GraphPad Prism v.5 program. Correction for multiple testing of Benjamini-Hochberg False Discovery Rate was applied to correct false positives. Bioinformatics tool was used to understand the biological system functions and to associate the differential expressed genes with specific metabolic pathways. Results: Of the 96 investigated genes involved in biotransformation mechanism (excepting the four reference genes), 12 genes showed differential expression in carcinoma tissue of oral cavity squamous cell type compared to non-tumor tissue (p<0.05). Only CYP27B1 gene presented increased expression in the oral cavity tumors, whereas CYP27A1, CYP2E1, CYP2R1, CYP2J2, CYP2U1, CYP4F12, CYP4X1, PTGIS, ALOX12, CYP4B1 and MAOB genes showed reduced expression. After correction by multiple tests, only PTGIS gene presented differential expression, with reduced expression. After data survey bioinformatics, five proteins were observed involved in the metabolism of arachidonic acid associated with important inflammatory processes in carcinogenesis (CYP2E1, CYP2J2, CYP2U1, ALOX12 and PTGIS). Conclusion: Genes involved in the carcinogens oxidation reactions showed differential expression in tumors of oral cavity. The enzymes encoded by these genes play an important role in the arachidonic acid metabolism, only pathway related to PTGIS enzyme, significant after analysis of statistical correction. The arachidonic acid and/or metabolites derived this pathway may modulate others metabolisms in which these enzymes are involved and can influence the regulation of important physiological mechanisms in tumorigenesis process. / Introdução: A suscetibilidade aos agentes ambientais e seus efeitos adversos à saúde dependem do perfil genético individual. Alguns indivíduos podem apresentar risco aumentado de desenvolver o câncer devido às diferenças no biometabolismo. Alterações no mecanismo de biotransformação de compostos endógenos e exógenos por reações de oxidação podem estar relacionadas com o processo de tumorigênese. Expressão diferencial de genes envolvidos nesse metabolismo de xenobióticos, tais como, os membros da família do citocromo P450 (CYP) e outras oxigenases, podem alterar o processo de ativação de agentes tóxicos e levar ao desenvolvimento do tumor de cavidade oral. Desse modo, as diferenças individuais de expressão gênica desta via associadas ao tabagismo e etilismo podem apresentar-se como significante fator de risco para neoplasias. Objetivo: Identificar o padrão de expressão de genes envolvidos no mecanismo de biotransformação de compostos endógenos e xenobióticos em tumores de cavidade oral, visando identificar biomarcadores de suscetibilidade para este tipo de câncer. Casuística e Métodos: Foram analisadas oito amostras de tecido de pacientes com diagnóstico patológico de carcinoma espinocelular de cavidade oral e oito amostras de tecidos não-tumorais adjacentes. A expressão de 92 genes da família CYP450 e outras oxigenases foi quantificada por reações em duplicata de PCRq em tempo real por meio do ensaio TaqMan® Array Human CYP450 and other Oxygenases 96-well fast plate (Applied Biosystems). Para análise estatística, foi realizado teste de normalidade de D'Agostino & Pearson omnibus normality test, seguido dos testes One-sample T test (dados com distribuição normal) e Wilcoxon signed rank test (dados que não apresentaram distribuição normal) no programa GraphPad Prism v.5. A correção para múltiplos testes de Benjamini-Hochberg False Discovery Rate foi aplicada para corrigir falsos positivos. Foram utilizadas ferramentas de bioinformática para compreender as funções do sistema biológico e associar os genes diferencialmente expressos com vias metabólicas específicas. Resultados: Dentre os 96 genes investigados envolvidos no mecanismo de biotransformação (excetuando-se os quatro genes de referência), 12 genes apresentaram expressão diferencial em tecido de carcinoma do tipo escamoso de cavidade oral, comparado ao tecido não-tumoral (P<0,05). Somente o gene CYP27B1 apresentou expressão aumentada nos tumores, enquanto os genes CYP27A1, CYP2E1, CYP2R1, CYP2J2, CYP2U1, CYP4F12, CYP4X1, PTGIS, ALOX12, CYP4B1 e MAOB apresentaram expressão reduzida. Após a correção para múltiplos testes, apenas o gene PTGIS apresentou expressão diferencial nos tumores. Após o levantamento de bioinformática, foram observadas cinco proteínas envolvidas no metabolismo do ácido araquidônico, associado com processos inflamatórios importantes na carcinogênese (CYP2E1, CYP2J2, CYP2U1, ALOX12 e PTGIS). Conclusão: Genes que participam de reações de oxidação de carcinógenos apresentam expressão diferencial em tumores de cavidade oral. Enzimas codificadas por esses genes possuem papel importante no metabolismo do ácido araquidônico, única via relacionada à enzima PTGIS, significante após análise de correção estatística. O ácido araquidônico e/ou os metabólitos provenientes desta via podem modular outros metabolismos, nos quais essas enzimas atuam e podem influenciar a regulação de mecanismos fisiológicos importantes no processo de tumorigênese.

Orientador: Maria Célia Bertolini / Banca: Heloisa Sobreiro Selistre de Araujo / Banca: Ana Paula Ulian de Araujo / Resumo: Neste trabalho foi realizado o isolamento do cDNA e do gene que codifica a proteína semelhante à Pho85p de Saccharomyces cerevisiae, em Neurospora crassa. Um fragmento de 1,1 kb correspondendo à seqüência nucleotídica do gene em N. crassa foi amplificado e confirmado por sequenciamento, o qual foi utilizado no rastreamento de uma biblioteca de cDNA de N. crassa, resultando em um plasmídeo contendo a ORF que codifica a Ncpho85 e as seqüências upstream e downstream à ORF. Este inserto foi seqüenciado, a ORF isolada apresentou 1014 bp, a região upstream contém 304 bp e a downstream 561 nucleotídeos. Após sequenciamento do cDNA, a seqüência polipeptídica da proteína foi comparada com outras proteínas semelhantes à Pho85p de fungos miceliares, leveduriformes além de S. cerevisiae. Esta ORF isolada foi utilizada no rastreamento de uma biblioteca genômica de N. crassa, possibilitando o isolamento de um plasmídeo contendo a seqüência genômica, o qual foi submetido a sequenciamento. No inserto foi possível confirmar a presença do intron (de 89 bp) no nucleotídeo 69, confirmando os dados existentes no banco de dados de N. crassa. A expressão do gene foi analisada ao longo do crescimento do fungo, em diferentes meios de cultivo, através de experimentos de Northern blot. A presença de duas bandas de hibridização, uma de 2,2 kb e uma 2,7 kb foi observada em todos os experimentos realizados. Um pico de expressão dos dois transcritos ocorreu no tempo de 12 horas, sendo mais evidente para o transcrito de menor tamanho, o qual seria o transcrito do cDNA isolado anteriormente. Resultados preliminares da expressão da proteína ao longo do crescimento do fungo foram obtidos por Western blot. Apenas uma banda da proteína foi observada, a qual apresentou o tamanho aproximado de 40 kDa, próximo ao tamanho da proteína NcPHO85, deduzida a partir da seqüência do cDNA. / Abstract: In this study we performed the isolation of the cDNA and the gene that codes for the Pho85p-like protein from Saccharomyces cerevisiae in Neurospora crassa. A fragment of 1.1 kb corresponding to the nucleotide sequence of the gene from N. crassa was amplified by PCR and confirmed by DNA sequencing. This fragment was used to screen a N. crassa cDNA library resulting in a plasmid containing the ORF plus and the upstream and downstream regions. The insert from the plasmid was sequenced and the ORF showed to have 1014 bp, whereas the upstream and downstream regions had 304 bp and 561 bp, respectively. After sequencing the cDNA, the polypeptide sequence was compared to the same protein from mycelial fungi and yeasts. The isolated ORF was used to screen a N. crassa genomic library leading to the isolation of a plasmid containing the genomic sequence. After DNA sequencing the insert showed the presence of an intron (89 bp) starting at nucleotide 69. This result was in agreement with the information from the N. crassa database. Gene expression analysis during the vegetative growth in different media was performed by Northern blot. Two hybridization bands were observed in the experiments, one of 2.2 kb and another one of 2.7 kb. The maximum expression of both transcripts happened at 12 h of growth, this was more pronounced for the smaller transcript, which probably is the transcript of the isolated cDNA. Preliminary results of protein expression during vegetative growth were obtained by Western blot analysis. Only one band with approximately 40 kDa was observed, the expected size for the NcPHO85 protein sequence deduced from the cDNA sequence. In order to evaluate the role of this protein in glycogen metabolism and in other cellular functions in N. crassa we started the gene inactivation. / Mestre

Orientador: Paula Rahal / Banca: Ana Carolina Gomes Jardim / Banca: Wilson Araújo da Silva Júnior / Banca: Ana Elizabete Silva / Banca: Sônia Maria Oliani / Resumo: GPC3 (Glipican-3) é membro de uma família de proteoglicano de heparina sulfatada (HSPG). O GPC3 pode atuar controlando a migração celular, regulação negativa do crescimento celular e indução de apoptose. Esse gene é relatado por estar hipoexpresso em vários tipos de cânceres, o que pode resultar no crescimento celular descontrolado e contribuir para o fenótipo maligno de alguns tumores. O objetivo desse estudo foi analisar o mecanismo de ação do gene GPC3 em carcinoma renal de células claras (CCRCC). Primeiramente, foi construído o vetor de expressão e transfectado nas linhagens celulares de carcinoma renal ACHN e 786-O. A expressão de GPC3 foi analisada usando qRT-PCR e imunohistoquímica. A proliferação celular foi avaliada usando o MTT e o ensaio de formação de colônia. Análises de apoptose e ciclo celular foram avaliadas por citometria de fluxo. Foi observado que o gene GPC3 estava com baixa expressão em amostras de carcinoma renal de células claras e nas linhagens celulares quando comparado com amostras renais normais. Foi observado que a expressão de RNAm e os níveis de proteína GPC3 aumentaram após a transfecção com o vetor de expressão contendo a ORF de GPC3 nas linhagens celulares. A taxa de proliferação celular diminuiu nas células superexpressando GPC3 em ambas as linhagens, ACHN e 786-O (p<0,01). A apoptose não foi observada nas linhagens celulares de carcinoma renal superexpressando GPC3 (p > 0,05); entretanto, ocorreu um aumento na população de células na fase G1 do ciclo celular (p< 0,05). Esses resultados sugerem que o gene GPC3 reduz a taxa de proliferação celular por meio da parada do ciclo celular na fase G1 em carcinoma renal / Abstract: Background: GPC3 (Glypican 3) is a member of the family of glypican heparan sulfate proteoglycans (HSPG). The GPC3 gene may play a role in controlling cell migration, negative regulation of cell growth and induction of apoptosis. This gene is reported to be downregulated in several cancers, which can result in uncontrolled cell growth and which can also contribute to the malignant phenotype of some tumors. The purpose of this study was to analyze the mechanism of action of the GPC3 gene in clear cell renal cell carcinoma (CCRCC). Methods: First, we constructed the expression vector and transfected renal carcinoma cell lines. GPC3 expression was analyzed using qRT-PCR and immunohistochemistry. We evaluated cell proliferation using MTT and colony formation assays. Apoptosis and cell cycle analyses were evaluated using flow cytometry. Results: We observed that the GPC3 gene was downexpressed in the clear cell renal cell carcinoma samples and in cell lines, which were both compared to normal renal samples. We observed that GPC3 mRNA expression and protein levels increased after the transfection into ACHN and 786-O cell lines. We found that the cell proliferation rate decreased in cells overexpressing GPC3 in both cell lines, ACHN and 786-O (p < 0.01). Also, apoptosis in the renal cell carcinoma cell line was not observed in cells overexpressing GPC3 (p > 0.05), but there was an increase in the cell population during the G1 phase in the cell cycle (p< 0.05). Conclusion: We suggest that the GPC3 gene reduced the cell proliferation rate through cell cycle arrest during the G1 phase in renal cell carcinoma / Doutor