Made available in DSpace on 2015-04-22T22:12:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 jorge felipe.pdf: 400342 bytes, checksum: fda0d3451f06f6d3a8aa76dbf9190171 (MD5) Previous issue date: 2009-03-06 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas / The effects of short and long-term contamination by effluent from an urban stream of Manaus on eggs and tadpoles of Osteocephalus taurinus (Anura, Hylidae) werw evaluated. To evaluate the acute effects of contamination a test CL5096h was done , which exposed eggs and tadpoles in Gosner stage 25 to a gradient of increasing concentrations established in geometric progression over a period of 96 hours. Eggs were less resistant to contamination than the tadpoles. The CL5096h for tadpoles was 47.63 mL/L while for the eggs was 25.19 mL/L. At lower concentrations of the experiment with eggs in which no mortality occurred, the tadpoles showed abdominal edema after 96h. To evaluated the effects of chronic exposure to low concentrations of urban sewage, tadpoles in Gosner stage 25 were exposed to three concentrations (9, 18 and 36 mL/L) of effluent until they reach metamorphosis. There were significant differences in growth rate and the size of metamorphosis between control and treatment. There were no significant differences in the number of survivors and length of time larvae. A concentration of 25 mL/L of effluent tested caused deleterious effects on eggs of Osteocephalus taurinus. A concentration of 36 mL/L caused changes in the parameters of developing larvae, and susceptibility to contamination ranged from egg masses. A concentration of 47mL/L caused deleterious effects on tadpoles free swimming. Concentrations of up to 16 mL/L can cause an increase in the average size of tadpoles / Foram avaliados os efeitos em curto e em longo prazo da contaminação por efluentes urbanos de um igarapé de Manaus sobre ovos e girinos de Osteocephalus taurinus (Anura, Hylidae). Para a avaliação de efeitos agudos de contaminação foi realizado um teste CL5096h, que expos ovos e girinos em estágio 25 de Gosner a um gradiente crescente de concentrações estabelecidas em progressão geométrica por um período de 96 horas. Ovos foram menos resistentes à contaminação do que os girinos. A CL5096h para girinos foi de 47,63 mL/L enquanto para os ovos foi de 25,19 mL/L. Nas concentrações mais baixas do experimento com ovos nas quais não ocorreu mortalidade, os girinos apresentaram edemas abdominais após 96h. Para avaliação dos efeitos crônicos da exposição a baixas concentrações de esgoto urbano, girinos no estadio 25 de Gosner foram expostos a três concentrações (9, 18 e 36 mL/L) de efluente até alcançarem a metamorfose. Houve diferenças significativas na taxa de crescimento e no tamanho de metamorfose entre o controle e o tratamento. Não houve diferenças significativas no número de sobreviventes e na duração do período larvário. Uma concentração de 25 mL/L do efluente testado causou efeitos deletérios sobre ovos de Osteocephalus taurinus. Uma concentração de 36 mL/L causou alterações nos parâmetros de desenvolvimento larvário, e a suscetibilidade à contaminação variou entre desovas. Uma concentração de 47mL/L causou efeitos deletérios sobre girinos livre-natantes. Concentrações de até 16 mL/L podem causar um aumento no tamanho médio dos girinos.

Submitted by Marcos Anselmo (marcos.anselmo@unipampa.edu.br) on 2016-04-08T15:22:01Z No. of bitstreams: 1 Emily Pansera Waczuk.pdf: 1582858 bytes, checksum: b6530e7a5d41da951557fd7d3947c87d (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-08T15:22:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Emily Pansera Waczuk.pdf: 1582858 bytes, checksum: b6530e7a5d41da951557fd7d3947c87d (MD5) Previous issue date: 2014-03-06 / A Euphorbia tirucalli, popularmente conhecida como avelós, é uma planta tóxica, tradicionalmente usada como um chá na medicina popular brasileira para o tratamento de várias doenças, demonstrando atividades antibacteriana, antiviral e anticarcinogênica. No entanto, não há nenhum relatório científico dos efeitos tóxicos podem surgir a partir de consumo desta planta, bem como os mecanismos pelos quais ela induz sua toxicidade. Portanto, o objetivo do presente estudo foi avaliar in vitroa genotoxicidade e citotoxicidade do extrato aquoso de E. tirucalliem leucócitos humanos usando os testes do ensaio cometa e azul de tripan, respectivamente. Adicionalmente, o efeito do extrato aquoso de E. tirucalli sobre a fragilidade osmótica foi investigada em eritrócitos humanos. Além disso, avaliamos a expressão de genes que codificam enzimas antioxidantes (SOD2, CAT e GPx4)através de qRT-PCR. Os nossos resultados demonstraram que a exposição de E. tirucalli em leucócitos humanos provocou aumentos significativos de danos no DNA nas concentrações mais elevadas testadas (100-150 µg/mL), que foi associada a uma diminuição significativa da viabilidade celular em concentrações de 10 a 150µg/mL. Por outro lado, a E. tirucalli não induziu a hemólise de eritrócitos humanos em todas as concentrações testadas. A exposição de leucócitos humanosàE. tirucalli(10-50µg/mL) causouregulação positiva significativa sobre no RNAm da SOD2 e expressões dos genes daCAT, e diminuiu significativamente o RNAm da GPx4 nas concentrações mais elevadas (100-150µg/mL).Adicionalmente, a expressão genica do gene da SOD2 foi regulada negativamente na maior concentração testada (150 µg/mL). Em resumo, com base nos resultados de genotoxicidade observados em nosso estudo, recomendamos cautela no uso agudo ou crônico deste preparado caseiro.Com todos estes aspectos, nossos resultados sugerem que o extrato da E. tirucalliinduz genotoxicidade e citotoxicidade em leucócitos humanos, possivelmente através da interação com o sistema enzimático antioxidante, assim, aumentando a formação de ROS e diminuindo o nível de tolerância celular para os constituintes químicos desta planta. / Euphorbia tirucalli, popularly known as avelós, is a toxic plant traditionally used as a tea in the Brazilian folk medicine for the treatment of various diseases, by presentingantibacterial, antiviral and anticarcinogenicproperties. However, there is no scientific report regardingthe toxic effects of this plant in human cells which may occurfrom its consumption, as well as the mechanisms by which it induces its toxicity. Therefore, the objectiveof the present study was to evaluate in vitrothe genotoxicity and cytotoxicity potential of aqueous extract of E. tirucalliin human leukocytes using comet assay and trypan blue exclusion respectively. In addition, the effect of the aqueous extract of E. tirucalli on osmotic fragility was investigated in human erythrocytes. Furthermore, we evaluated the qRT-PCR expressions of selected antioxidant mRNA genes (SOD2, CAT and GPx4). Our results demonstrated that exposure of E. tirucalli to human leukocytes caused significant increase in DNA damage at the higher concentrations tested (100-150 µg/mL), which was associated with a significant decrease of cellular viability at concentrations 10 to 150 µg/mL. In contrast, E. tirucallidid not induce hemolysis of human erythrocytes at all the concentrations tested. Exposure of E. tirucalli (10-50µg/mL)to human leukocytes significantly up-regulated the mRNA of SOD2 and CAT genes expressions, and significantly decreasedthe mRNA of GPx4 at higher concentrations (100-150 µg/mL). In addition, the mRNA gene expression of SOD2 was down-regulated at the highest concentration tested (150 µg/mL).In summary, based in the results of genotoxicity observed in our study, we recommend caution in the acute or chronic use of thishomemade prepared.Taken together, our results suggest that the extract aqueous of E. tirucalliinduces genotoxicity and cytotoxicity to human leukocytes, possibly by interacting with the antioxidant enzyme system, thereby, increasing the formation of ROSand decreasing the cellular tolerance level to chemical constituents of this plant. Therefore, we recommend caution in the acute or chronic use of this plant.

Introdução: O câncer de próstata atinge cerca de três quartos da população masculina acima de 65 anos, sendo esta neoplasia o sexto tipo de câncer mais comum no mundo, e o mais prevalente em homens. O receptor de androgênios (AR) desempenha um papel crítico no desenvolvimento normal da próstata, bem como no câncer prostático. Sua atividade transcricional é regulada através da interação com diversas proteínas. O NCoR1 (correpressor de receptores nucleares) está envolvido na diminuição da atividade do AR sobre a transcrição de genes alvo. Objetivos: Desenvolver um modelo de cultura celular de câncer prostático a partir de fragmentos tumorais; identificar o melhor gene normalizador para estudos de expressão gênica em amostras das células em cultivo; avaliar os efeitos do silenciamento do AR e seu corregulador, NCoR1, sobre a proliferação celular e expressão gênica de PSA, um gene alvo do AR, em células de cultura primária e em células de uma linhagem de câncer prostático (LNCaP – Lymph Node Carcinoma of the Prostate). Métodos: Fragmentos de tumores prostáticos coletados após prostatectomia radical ou prostatovesiculectomia foram plaqueados e mantidos em cultivo. As células que proliferaram a partir dos explants foram testadas para marcadores de epitélio (citoqueratinas) e de malignidade (racemase). Após 10 dias, as células foram silenciadas para o AR e, posteriormente, lisadas para a extração de RNA total ou de proteínas. Células LNCaP foram mantidas em cultura e silenciadas para o AR e o NCoR1, sendo avaliada também a proliferação celular nesta última condição. O cDNA obtido a partir das culturas primárias de CaP foi usado para a amplificação do mRNA de oito genes candidatos a normalizadores, além dos mRNAs do AR e PSA. O cDNA das células LNCaP foi usado para amplificação do mRNA do PSA, e o sobrenadante das células coletado para a dosagem do PSA secretado. Resultados: Apenas 47,7% do total de culturas primárias apresentaram adesão dos fragmentos e proliferação de células. Não foi observada associação entre a adesão dos fragmentos e o escore de Gleason dos tumores. As células cultivadas apresentaram positividade para os marcadores de células epiteliais e de malignidade de células prostáticas, indicando que as células em cultivo se tratavam de células tumorais prostáticas. Para análise da expressão gênica nestas células, o gene que mostrou os melhores parâmetros de estabilidade de expressão foi o gene SDHA, e a melhor combinação de dois genes sugerida neste estudo foi SDHA e ALAS1. O silenciamento do receptor de androgênios foi observado 48 horas após a transfecção com siRNAs, sendo observada uma diminuição nos níveis do mRNA já em 24 horas após a transfecção. Observou-se uma diminuição da expressão gênica do PSA em 24 horas, em resposta à diminuição dos níveis do AR, tanto em cultura primária de CaP quanto na linhagem LNCaP. Em células LNCaP, a transfecção com siRNAs específicos para o NCoR1 não depletou completamente os níveis proteicos, porém estes diminuíram em 24, 48 e 72 horas após a transfecção. Foi verificado um aumento da expressão gênica de PSA 48 horas após o silenciamento do NCoR1, em células tradadas com diidrotestosterona. Não foi observado aumento da secreção de PSA no sobrenadante das células em cultivo 48 horas após o silenciamento. A proliferação das células LNCaP foi diminuída nos grupos transfectados com siRNAs específicos para o NCoR1 e siRNAs inespecíficos, em relação com grupo controle. Conclusões: O modelo de cultura celular a partir de fragmentos tumorais prostáticos é viável, e proporciona uma boa amostragem de células para análises moleculares de câncer de próstata sob diferentes condições experimentais. No entanto, a taxa de sucesso dos cultivos é moderada. Neste modelo, em que foram testados diversos genes em relação à sua estabilidade de expressão, o gene SDHA apresentou uma boa estabilidade, ao contrário de outros genes frequentemente utilizados como genes de referência sem nenhuma análise prévia de sua expressão, como beta-actina, GAPDH e beta-2-microglobulina. Assim, o SDHA, ou ainda a combinação SDHA e ALAS1, é indicado para as estratégias de normalização neste tipo de amostra. O silenciamento do AR em células tumorais prostáticas diminuiu a expressão gênica de PSA, como esperado. O silenciamento de seu correpressor, NCoR1, aumentou os níveis de mRNA do PSA, indicando que sua ausência resulta em um aumento da atividade transcricional do AR. A menor taxa de proliferação nos grupos transfectados pode estar mais relacionada ao estresse da transfecção do que à ausência de NCoR1 nas células. Mais análises poderão confirmar os efeitos da ausência deste correpressor sobre a resposta das células tumorais prostáticas, o que abrirá caminho para um melhor entendimento da fisiopatologia dos tumores prostáticos. / Introduction: Prostate cancer (PCa) occurs in seventy-five percent of men over 65 years old, and it is the sixth most common type of cancer in the world and the most prevalent in men. Androgen receptor (AR) plays a critical role in normal prostate gland development and also in prostate cancer. Its transcriptional activity is regulated by protein interaction and NCoR1 (nuclear receptor co-repressor) decreases the AR activity on target genes transcription. Objectives: To develop a prostate cancer cell culture model from tumor fragments; to identify the best housekeeping gene for gene expression studies in that cultured cells; to evaluate the effects of AR and NCoR1 silencing on cell proliferation and PSA gene expression, a AR target gene, in cells of primary culture of PCa and in a prostate cancer cell line, LNCaP. Methods: PCa fragments obtained from radical prostatectomy or prostatovesiculectomy were plated and maintained in culture. Proliferating cells were tested for markers of epithelium (cytokeratin) and malignancy (racemase). After ten days, cells were transfected with AR siRNAs and then lysed for total RNA or protein extraction. LNCaP cells were silenced for AR and NCoR1, and proliferation rate was also measured in the last condition. cDNA obtained from primary culture was used to amplify eight candidate to housekeeping genes mRNA, and also AR and PSA mRNA. cDNA from LNCaP cells was used to amplify PSA mRNA, and the cells supernatant was collected to dose secreted PSA. Results: Only 47.7% of the total number of primary cultures had fragment adhesion and cell proliferation. There was no association between explants adhesion and tumor Gleason’s score. Cells were positive for epithelium and malignancy markers, confirming the growth of prostate cancer cells. For gene expression analysis in these cells, the gene showing the best parameters of stability of expression was SDHA, and the best combination of two genes was SDHA and ALAS1. AR silencing was observed in 48 hours after siRNA transfection, with a decrease of mRNA levels in 24 hours after transfection. There was a decrease of PSA gene expression in 24 hours, either in primary culture or in LNCaP cells. In LNCaP cells, transfection with NCoR1 siRNA did not depleted entirely the protein levels. However, the levels of NCoR1 decreased in 24, 48, and 72 hours after transfection in relation to control group. There was an increase of PSA gene expression in 48 hours after NCoR1 siRNA transfection in cells treated with dihydrotestosterone. There was no increase in PSA secretion in cells supernatant in response to NCoR1 silencing. LNCaP cell proliferation was decreased in both transfected groups, the specific siRNA to NCoR1 and the unspecific control, in relation to control group. Conclusions: the culture cell model from explants of prostate cancer is practicable, and provides a good cell sampling to molecular analysis of prostate cancer under different experimental conditions. Nevertheless, the successful rate of cultures is moderate. In this model, several genes were tested for expression stability, and SDHA had presented the best values, unlike others classical housekeeping genes, as beta-actin, GAPDH and beta-2-microglobulin. Thus, SDHA, or the combination of SDHA and ALAS1, is indicated to normalization strategies in these samples. The silencing of AR in prostate cancer cells had decreased PSA gene expression, as expected. The silencing of its co-repressor, NCoR1, had increased the PSA mRNA levels, indicating that the absence of this coregulator results in an increase of AR transcriptional activity. The smaller proliferation of transfected groups in relation to control group could be related to the transfection stress, more than to the absence of NCoR1. More analysis can confirm the effects of NCoR1 silencing on tumor cells proliferation rate, and contribute to a better understanding of prostate tumors pathophysiology.

Orientador: Humberto Tonhati / Coorientador: Daniele Fernanda Jovino / Coorientador: Larissa Fernanda Simielli Fonseca Noronha / Banca: Marcia Cristina de Sena Oliveira / Banca: Rodrigo Pelicioni Savegnago / Resumo: A mastite é a principal doença que acomete os rebanhos leiteiros e promove grandes perdas na produção devido a alterações na composição do leite e prejuízos na saúde do animal, aumentando assim os custos de produção. Caracteriza-se pela resposta inflamatória da glândula mamária a agentes infecciosos, alterando sua fisiologia e metabolismo. Estudo de expressão gênica vem sendo empregado em vários organismos com a finalidade de identificar genes relacionados com características economicamente importantes como resistência a doenças. Com o objetivo de compreender melhor os mecanismos de resposta imune envolvidos no fenótipo de resistência/susceptibilidade à mastite, foi realizada a quantificação da expressão relativa dos genes do Fator Estimulador de Colônias de Granulócitos 3 (CSF3) e Lactoperoxidase (LPO), em leite de búfalas mestiças saudáveis e com mastite, por meio da técnica de PCR quantitativa em tempo real (qRT-PCR). Para isso, foi realizada a extração de RNA total, com Trizol, de células somáticas do leite de doze animais diagnosticados com mastite e de doze animais livres da infecção. Foram realizadas análises de qualidade e quantificação do RNA total e das contaminações por DNA genômico para garantir a integridade das amostras. A quantificação da expressão gênica foi realizada por meio do método do Delta Delta Ct. Os genes GAPH, HPRT1, EEF1A1 e RPLP0, foram selecionados na literatura, e testados como genes de referência. As análises referentes às quanti... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Not available / Mestre

Orientador: Humberto Tonhati / Coorientador: Daniele Fernanda Jovino Gimenez / Coorientador: Nedenia Bonvino Stafuzza / Banca: Eliane Gasparino / Banca: Lucia Galvão de Albuquerque / Banca: Luciana Correia de Almeida Regitano / Banca: Tiago Santana Balbuena / Resumo: A mastite em búfalas leiteiras causa perdas econômicas devido à diminuição da produção de leite, além de ter um efeito negativo no bem-estar dos animais. Deste modo, foram realizados dois estudos: o objetivo do estudo I foi avaliar o nível de expressão dos genes da lactoferrina (LTF), fator de necrose tumoral alfa (TNF-α), interleucina-1 beta (IL-1β), interleucina-8 (IL-8), e toll-like receptors 2 (TLR-2) e 4 (TLR-4) em búfalas Murrah com e sem mastite subclínica. Amostras de leite de 12 búfalas com mastite e 12 de búfalas sem mastite foram coletadas, para a extração de RNA, síntese de cDNA e validação dos perfis de expressão por qRT-PCR. O ΔΔCt foi estimado utilizando contrastes ortogonais da expressão dos genes alvo corrigidos para a expressão dos genes housekeeping entre os tratamentos. A expressão dos genes TLR-2, TLR-4, TNF-α, IL-1β e IL-8 foi regulada positivamente em búfalos com mastite, enquanto que o gene LTF não apresentou expressão diferencial. O estudo desses genes da função imune que são ativos na glândula mamária é importante para o desenvolvimento de estratégias destinadas a preservar a saúde do úbere. O objetivo do estudo II foi avaliar as proteínas presentes no soro do leite de búfalas com e sem mastite subclínica, utilizando uma abordagem proteômica para identificar proteínas diferencialmente expressas e potencial biomarcador para a doença. Para isso, 16 amostras de leite de búfalas Murrah foram coletadas, sendo oito animais com e oito animais sem mastite su... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Mastitis in dairy buffalo causes economic losses due to decreased milk production, along with having a negative effect on the animals' welfare. Thus, two studies were performed: the objective of study I was to evaluate the expression levels of lactoferrin (LTF), tumor necrosis factor alpha (TNF-α), interleukin-1 beta (IL-1β), interleukin- 8 (IL-8) and toll-like receptors 2 (TLR-2) and 4 (TLR-4) in Murrah buffaloes with and without subclinical mastitis. Milk samples were collected from 12 buffaloes with mastitis and 12 buffaloes without mastitis for RNA extraction, cDNA synthesis, and validation of expression profiles by qRT-PCR. The ΔΔCt was estimated using orthogonal contrasts of the target genes expression adjusted for the expression of the housekeeping genes between both treatments. The expression of the TLR-2, TLR-4, TNF-α, IL-1β and IL-8 genes were upregulated in buffaloes with mastitis, while the LTF gene showed no differential expression. The study of these immune function genes that are active in the mammary gland is important for the development of strategies aimed at preserving the health of the udder. The objective of study II was to evaluate the proteins present in the milk whey from buffaloes with and without subclinical mastitis, using a proteomic approach to identify differentially expressed proteins and potential biomarkers for the disease. For this, 16 samples of Murrah buffalo milk were collected, comprised of eight animals with and eight animals without sub... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Edvaldo Aparecido Amaral da Silva / Coorientador: Renake Nogueira Teixeira / Banca: João Nakagawa / Banca: Maria Marcia Pereira Sartori / Banca: Ivan de Godoy Maia / Banca: Heloísa Oliveira dos Santos / Resumo: As principais condições ambientais, que afetam a degradação de clorofila em sementes de soja, são a seca e temperaturas extremamente altas, que acompanham as mudanças climáticas verificadas nas últimas décadas em algumas regiões do Brasil. O objetivo desse estudo foi realizar uma caracterização fisiológica em lotes de sementes de soja com diferentes porcentagens de sementes verdes, avaliar os efeitos da retenção de clorofila na qualidade fisiológica (germinação, vigor e longevidade) e na qualidade do óleo de sementes de soja além de avaliar a expressão de genes relacionados com esse fenômeno, considerando influências genéticas e ambientais. Foram avaliados 37 lotes de sementes de soja que apresentaram sementes verdes, de cultivares produzidas por produtores rurais (condições não controladas) em diferentes municípios do Brasil na safra 2014/2015. Os lotes com as maiores e as menores porcentagens de sementes verdes de cada cultivar foram selecionados com a finalidade de realizar uma caracterização fisiológica nas sementes dos lotes. Posteriormente, cinco lotes foram selecionados e organizados em duas combinações (Influência Ambiental e Influência Genotípica) e, após a classificação e divisão em amostras de sementes verdes e amarelas, foram avaliados quanto a qualidade fisiológica das sementes (viabilidade inicial, germinação, vigor e longevidade), parâmetros bioquímicos durante o armazenamento, qualidade do óleo (teor de óleo, teor de tocoferóis e tocotrienóis, teor de clorofil... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The main environmental conditions affecting the degradation of chlorophyll in soybean seeds are drought and extremely high temperatures that accompany the dramatic climatic changes observed in the last decades in some regions of Brazil. The aim of this study was to perform a physiological characterization in soybean seed lots with different percentages of green seeds, to evaluate the effects of chlorophyll retention on physiological quality (germination, vigor and longevity) and soybean oil quality and to evaluate the expression of genes related to this phenomenon, considering genetic and environmental influences. Overall, 37 soybean seed lots that presented green seeds of cultivars produced under real growing conditions (uncontrolled conditions) in different cities of Brazil in the 2014/2015 harvest season were evaluated. Lots with the largest and smallest percentages of green seeds of each cultivar were selected with the purpose of performing a physiological characterization in seed lots. Subsequently, five lots were selected and organized into two combinations (Environmental Influence and Genotypic Influence) and, after classification and division into green and yellow seed samples, the physiological quality of seeds (initial viability, germination, vigor and longevity) (tocopherol and tocotrienol, oil and total chlorophyll contents and oxidative stability), and expression of genes associated with chlorophyll retention (D1, D2, PPH2 and NYC1_1). The results showed that, regardless of cultivar or production region, lots with higher percentage of green seeds have lower physiological quality. In addition, it was verified that seeds with chlorophyll retention showed lower physiological quality (initial viability, germination, vigor and longevity), lower oil quality, with presence of residual chlorophylls, lower oxidative stability and lower tocopherol index and expression of D1, D2 ... / Doutor

Orientadora: Maria Célia Bertolini / Banca: Nilce Maria Martinez Rossi / Banca: Rafael Silva Rocha / Banca: Carlos Takeshi Hotta / Banca: Iran Malavazi / Resumo: The fungus Neurospora crassa, a model organism in studies of gene expression, metabolism, photobiology and circadian rhythm, is able to respond and adapt to different environmental stresses, such as heat shock, pH changes, nutrient limitation, osmotic stress, and others. Besides that, N. crassa has the genome sequenced and collections of knocked-out strains are avalaible to the scientific community. A systematic screening analysis performed with mutant strains in genes encoding transcription factors led to identify proteins involved in the glycogen metabolism regulation in this fungus. Glycogen and trehalose are storage carbohydrates that functions as a carbon and energy reserve. Trehalose can also protect membranes and proteins, increasing the tolerance to adverse conditions. In this work, some transcription factors were functionally characterized regarding their role in glycogen and trehalose metabolism regulation. The first condition investigated was the influence of the circadian clock in the glycogen metabolism. We observed that the glycogen accumulation and the expression of genes encoding glycogen synthase (gsn) and glycogen phosphorylase (gpn) are rhythmic in a wild-type strain and dependent on the FREQUENCY (FRQ) oscillator, the core component of the N. crassa circadian clock. The VOS-1 transcription factor, that is controlled by clock and can act in the connection between clock and glycogen metabolism, binds to gsn and gpn promoters rhythmically. However, the expres... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Doutor

Proteínas FtsH são metaloproteases pertencentes à família AAA (ATPases Associadas a Diversas Atividades Celulares), e estão presentes em todos os reinos dos seres vivos. Estas proteases utilizam a energia liberada da hidrólise do ATP para desempenhar suas diversas atividades celulares. Em Escherichia coli, as proteases FtsH se organizam em um homohexamero na membrana plasmática, sendo que este complexo atua na degradação de proteínas mal dobradas. Em Arabidopsis, o hetero-complexo FtsH localizado na membrana dos tilacóides é formados por isômeros do tipo A (FtsH1/FtsH5) e do tipo B (FtsH2/FtsH8). Sua atividade proteolítica está relacionada ao controle de qualidade organelar, degradando proteínas mal dobradas e de vida curta. O complexo está envolvido também na degradação da proteína D1 do PSII, danificada por danos foto-oxidativo. Embora as FtsH cloroplastidiais sejam bem caracterizadas em termos genéticos e moleculares, o mecanismo de regulação do complexo ainda não foi esclarecido, o que torna interessante a busca por fatores proteicos adicionais. Em investigações anteriores nosso grupo de pesquisa encontrou um candidato potencial, denominado FIP (FtsH5 Interacting Protein), que pode modular a atividade ATPásica e/ou proteásica do complexo. Fip está presente na membrana dos tilacóides e mostrou interação com FtsH5 in vivo e in vitro. Neste trabalho foram realizados ensaios de duplo híbrido de leveduras, utilizando deleções da proteína FIP, bem como substituições de resíduos de cisteína por alanina. Os resultados revelaram que a interação entre FIP e FtsH5 é mantida somente quando duas regiões ricas em cisteína estão presentes na sequência de FIP. Essa região compreende 46 aminoácidos, com 4 resíduos de cisteína conservados, e ensaios com 7 diferentes substituições desses resíduos por alanina não mostraram interação com FtsH5, o que corrobora a hipótese de que os resíduos de cisteína são necessários para a interação. Experimentos de análise de expressão utilizando PCR em tempo real, sob condições de estresse salino e estresse a frio, revelaram que os genes que codificam FIP e FtsH5 têm sua expressão regulada de modo antagônico, o que sugere que FIP possa atuar como modulador negativo da atividade proteásica do complexo FtsH. / Metalloprotease FtsH proteins are members of the AAA family (ATPases Associated with Diverse Cellular Activities), and are present in all kingdoms of living organisms. These proteases use energy of ATP hydrolysis to perform its various cellular activities. In Escherichia coli, FtsH proteases are organized in a homo-hexamer in the cytoplasmic membrane, and this complex acts in the degradation of misfolded proteins. In Arabidopsis, the FtsH hetero-complex located in the thylakoid membrane is formed by type A (FtsH1/FtsH5) and type B (FtsH2/FtsH8) isomers. Its proteolytic activity is involved in organellar quality control by degrading misfolded and short-lived proteins. The complex is also involved in the degradation of the D1 protein of PSII, damaged by photo-oxidative damage. Although the chloroplast FtsH are well characterized genetically and molecularly, the regulatory mechanism of the complex remains unclear, which makes it interesting to search for additional protein factors. In earlier studies our research group has found a potential candidate called FIP (FtsH5 Interacting Protein), which can modulate the ATPase and/or protease activity of the complex. FIP is present in the membrane of the thylakoids and showed interaction with FtsH5 in vivo and in vitro. In this study yeast two-hybrid assays were performed using FIP protein deletions, and substitutions of cysteine to alanine residues. The results showed that the interaction between FIP and FtsH5 is maintained only when two cysteine rich regions are present in the sequence of FIP. This region contains 46 amino acids with four conserved cysteine residues and 7 different assays with alanine replacements of these residues showed no interaction with FtsH5, which corroborates the hypothesis that the cysteine residues are required for the interaction. Expression experiments analysis using realtime PCR, under conditions of salt stress and cold stress, revealed that the genes encoding FtsH5 and FIP have its expression regulated in an antagonistic way, suggesting that FIP can act as a negative modulator of the activity FtsH protease of the complex.

Orientador: Raquel Mantuaneli Scarel Caminags / Banca: Rui Barbosa de Brito junior / Banca: Karina Gonzales Silverio Ruiz / Banca: Daniela Leal Zandim Barcelos / Banca: Joni Augusto Cirelli / Resumo: / Abstract: / Doutor

Orientador: Fernanda da Cruz Landim / Resumo: O objetivo do presente estudo foi avaliar o benefício da substituição do soro fetal bovino (SFB) pelo fator de crescimento semelhante à insulina tipo I (IGF-1) durante a maturação in vitro (MIV) ou cultivo in vitro (CIV), sobre qualidade embrionária e expressão de genes em embriões pré- e pós-compactação. Delineamento experimental foi fatorial 3 x 3 (três suplementos de MIV e três de CIV), com 9 grupos experimentais. Foram realizadas 20 réplicas (oócitos ≈ 400/grupo). Complexos cúmulus-oócito (COCs) graus I e II foram maturados in vitro com a adição de 10% de SFB (SFB), ou 3 mg/mL polivinil-álcool (PVA), ou PVA + 100 ng/mL de IGF-1 (IGF) a 38,5 ºC em 5% de CO2 em ar por 22 a 24 horas. Foram fertilizados e incubados durante 18 horas. Os zigotos foram cultivados com a adição de: 2,5% de SFB (SFB), ou 3 mg/mL de PVA (PVA), ou PVA + 100 ng/mL de IGF-1 (IGF) por sete dias a 38,5ºC em 5% de CO2 em ar. As taxas de clivagem e blastocisto foram avaliadas após 48 e 168 horas de cultivo, respectivamente. A técnica simplificada de coloração diferencial de células da massa celular interna (MCI) e trofoectoderma (TE) foi utilizada para avaliar a distribuição celular de blastocistos (n = 155) e a técnica de TUNEL para avaliação do índice de apoptose (n = 207). Concentrações de glicose e lactato obtidas do meio MIV utilizaram-se para analisar o metabolismo de glicose. mRNA foi extraído de embriões de 6 – 8 células colhidos após 66 horas post-inseminação (4 pools de 15 embriões por grupo) e d... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Doutor