EPEC atípicas (EPECa) são isoladas de surtos diarréicos em crianças, adultos e animais em países industrializados e em desenvolvimento. Hemolisinas são toxinas que atuam sobre a membrana de eritrócitos e de diversos tipos celulares. Tal grupo de toxinas é reconhecido como importante fator de virulência envolvido na patogênese bacteriana, por isso o objetivo foi avaliar a expressão de enterohemolisina em isolados de EPECa e analisar características fenotípicas como interferência do meio de cultivo e adesão a componentes de matriz extracelular. Observou-se prevalência de 5,4% de isolados enterohemolíticos, e variações na expressão da toxina foram associadas à concentrações de lactose e caseína nos meios de cultivo. Além disso, verificou-se forte associação entre produção de enterohemolisina e ligação à fibronectina celular. / Atypical EPEC (aEPEC) are isolated from diarrheal outbreaks in children, adults and animals in industrialized and developing countries. Hemolysins are toxins that act on the red cell membrane and various cell types. This group of toxins is recognized as an important virulence factor involved in the bacterial pathogenesis. The aim of this study was the evaluation of the enterohemolysin expression in aEPEC isolates as interference of the culture media and adhesion to components of extracellular matrix. The prevalence of enterohemolytic isolates was 5.4%, and variations in toxin expression were associated with lactose and casein concentrations in culture media. Moreover, it was found association between production of enterohemolysin and adhesion to cellular fibronectin.

Glioblastoma multiforme (G BM), ou astrocitoma grau IV, é o tumor mais comum e letal do sistema nervoso central. Uma de suas características mais marcantes é seu alto potencial invasivo do tecido normal adjacente. Neste processo, o remodelamento da matriz extracelular, modulado por enzimas que degradam seus componentes e por inibidores destas enzimas, é crucial. Foi descrito que a expressão de MMP-2 e MMP-9, membros da família das metaloproteinases de matriz, aumentam conforme a progressão de astrocitomas. A variante canônica de RECK suprime a invasão tumoral e metástase através da inibição da atividade de, pelo menos, três MMPs: MMP-2, MMP-9 e MMP-14. Uma correlação positiva tem sido observada entre a abundância da expressão de RECK em amostras tumorais e um prognóstico mais favorável para pacientes com diversos tipos de tumores. Neste estudo, variantes de splicing do gene supressor de tumor RECK foram identificadas através da análise de Expressed sequenced Tags (ESTs), isoladas por RT-PCR, sequenciadas e clonadas. Três novas variantes de splicing do gene RECK foram identificadas e caracterizadas. O perfil de expressão dos transcritos de RECK foi determinado através de ensaios de RT-PCR quantitativo em um painel de tecidos normais e, também, durante a progressão de astrocitomas. Foram utilizadas, para esta análise, amostras macro dissecadas de tumores de pacientes com astrocitomas grau I (n=15), II (n=15), III (n=15) e GBMs (n=30). Os resultados mostram que maior expressão de RECK canônico, acompanhada de maior razão de expressão da variante canônica em relação às variantes de splicing alternativo, correlaciona positivamente com maior sobrevida global de pacientes com GBM, sugerindo seu papel como potenciais biomarcadores para o prognóstico destes pacientes. Análise funcional das isoform as de RECK em células U87 MG revelou que as células superexpressando as isoformas não apresentam inibição do processo de invasão celular, como observado para superexpressão da proteína canônica. Dentre as isoformas analisadas, destaca-se RECK-B, isoforma potencialmente ancorada à membrana plasmática por GPI, como a proteína canônica RECK, sugerindo uma possível colocalização destas variantes. Observa-se que células superexpressando RECK-B apresentam maior capacidade tumorigênica. Os resultados indicam que as variantes de RECK e o balanço entre a expressão destas variantes, apresentam um papel importante no comportamento e na agressividade de GBMs, tendo potencial valor na clínica. Além disso, para abrir perspectivas para o estudo das variantes de RECK, o balanço de expressão dos transcritos canônico e alternativos deste gene foi explorado durante os processos de diferenciação osteogênica e adipogênica. Os resultados indicam que a expressão da variante canônica é mais abundante em relação à expressão de suas isoformas em estágios tardios da adipogênese, sendo que o perfil inverso é observado em relação à isoforma B durante a osteogênese, sugerindo que o balanço entre os níveis de expressão das isformas de RECK possui um potencial papel biológico que deve ser explorado durante esses processos. Em conjunto, os resultados demonstram a existência de, pelo menos, três variantes de splicing do gene supressor de tumor RECK com envolvimento na tumorigênese e na diferenciação celular, abrindo novas perspectivas para o estudo e a aplicação do gene RECK na clínica. / Glioblastoma multiforme (GBM) or grade IV astrocytoma is the most common and lethal tumor of the central nervous system. One of the most striking features of GBMs is their invasive potential of the normal surrounding brain tissue. It has been described that MMP-2 and MMP-9 expression levels increase during astrocytoma progression. Canonical RECK suppresses tumor invasion and metastasis by negatively regulating at least three matrix metalloproteinases, namely: MMP-9, MMP-2 and MT1-MMP. A positive correlation has been observed between the abundance of RECK express ion in tumor samples and a more favorable prognosis for patients with several types of tumors. In this study, splice variants of the RECK tumor suppressor gene were identified by Expressed Sequence Tag (EST) analysis, isolated by RT-PCR, sequenced and cloned. Three novel alternatively spliced variants of the RECK tumor suppressor gene were identified and characterized. The RECK transcripts expression profiles were investigated using quantitative RT-PCR assays in a normal tissue RNA panel and, also, during astrocytoma progression in macrodissected tumor samples of patients with astrocytoma grades I (n=15), II (n=15), III (n=15) and IV/GBM (n=30). The results show that higher canonical RECK expression, accompanied by a higher ratio of canonical to alternative transcript expression, positively correlated with higher overall survival rate after chemotherapeutic treatment of GBM patients. Our findings suggest that these RECK transcript variants may potentially be used as biomarkers for prognosis of GBM patients. U87 MG cells overexpressing each RECK alternative variant were generated and found to lack the supressive role of cellular invasion processes found upon overexpressing the canonical protein. Among the characterized isoforms, RECK-B stands out, since this isoform is potentially anchored to the cell membrane by a GPI anchor, exactly as the canonical RECK and, also, since cells overexpressing RECK-B display greater tumorigenic capacity. The results indicate that RECK variants and the balance between the expressions of these variants, play an important role in the behavior and aggressiviness of GBMs, therefore have a potential translational application. In addition, in order to investigate new perspectives for the analysis of these isoforms, the expression balance of RECK transcripts was assessed during osteogenesis and adipogenesis, by qRT - PCR. The results show that the expression of the canonical RECK variant is more abundant that that of its alternative isoforms in later stages of adipogenic differentiation. The opposite profile is found regarding RECK-B during osteogenesis, suggesting that the balance between the expressions of these transcripts may have a potential role during these processes. Taken together, the results show the existence of, at least, three alternatively spliced variants of the RECK tumor suppressor gene, which are involved in tumogigenesis and cellular differentiation, o pening new perspectives for studies and clinical application of the RECK gene.

Bone morphogenetic protein-2 (BMP-2) is considered a promising adjuvant for the treatment of bone regeneration. However, BMP-2 delivery in a conventional collagen scaffold needs a high dose to achieve an effective outcome. Moreover, such dosage may lead to serious side effects. The aim of the following thesis was to find clinically acceptable strategies reducing the required dose of BMP-2 by improving the delivery and optimizing the preclinical testing of the new approaches. In all the studies hyaluronic acid (HA) hydrogels was used as a carrier for BMP-2. The HA hydrogel/BMP-2 construct was modified with bioactive matrix components in order to obtain an effective release of BMP-2 and an enhanced bone formation. The most promising were two strategies. In the first one, BMP-2, precomplexed with the glycosaminoglycans dermatan sulfate or heparin prior to loading it into HA hydrogel, protected and prolonged the delivery of the protein, resulting in twofold larger bone formation in comparison to non-complexed BMP-2. In the second strategy, the fibronectin fragment integrin-binding domain (FN) was covalently incorporated into HA hydrogel. The FN remarkably improved the capacity of the material to support the cells attachment and spreading, providing the formation of twice as much bone in comparison to non-functionalized HA hydrogel/BMP-2. Furthermore, the importance of a proper design of the preclinical study for BMP-2 delivery systems was highlighted. Firstly, proper physicochemical handling of BMP-2 showed the improvement in further in vivo activity.  The use of glass storage vials and an acidic formulation buffer was superior to plastic surfaces and physiological pH. Secondly, while regenerative medicine strategy testing required the use of animal models that matched the research questions related to clinical translation, two new animal models were developed. The subperiosteal mandibular and calvarial models in rats were found to be minimally invasive, convenient and rapid solution for the evaluation of a broad range of approaches including bone augmentation, replacement and regeneration. Both models are primarily relevant for the initial testing of the injectable bone engineering constructs.  Those clinically translatable approaches presented here could prove to be a powerful platform for a wider use of BMP-2 in orthopedic, plastic surgery and regenerative medicine research.

Glioblastoma multiforme (G BM), ou astrocitoma grau IV, é o tumor mais comum e letal do sistema nervoso central. Uma de suas características mais marcantes é seu alto potencial invasivo do tecido normal adjacente. Neste processo, o remodelamento da matriz extracelular, modulado por enzimas que degradam seus componentes e por inibidores destas enzimas, é crucial. Foi descrito que a expressão de MMP-2 e MMP-9, membros da família das metaloproteinases de matriz, aumentam conforme a progressão de astrocitomas. A variante canônica de RECK suprime a invasão tumoral e metástase através da inibição da atividade de, pelo menos, três MMPs: MMP-2, MMP-9 e MMP-14. Uma correlação positiva tem sido observada entre a abundância da expressão de RECK em amostras tumorais e um prognóstico mais favorável para pacientes com diversos tipos de tumores. Neste estudo, variantes de splicing do gene supressor de tumor RECK foram identificadas através da análise de Expressed sequenced Tags (ESTs), isoladas por RT-PCR, sequenciadas e clonadas. Três novas variantes de splicing do gene RECK foram identificadas e caracterizadas. O perfil de expressão dos transcritos de RECK foi determinado através de ensaios de RT-PCR quantitativo em um painel de tecidos normais e, também, durante a progressão de astrocitomas. Foram utilizadas, para esta análise, amostras macro dissecadas de tumores de pacientes com astrocitomas grau I (n=15), II (n=15), III (n=15) e GBMs (n=30). Os resultados mostram que maior expressão de RECK canônico, acompanhada de maior razão de expressão da variante canônica em relação às variantes de splicing alternativo, correlaciona positivamente com maior sobrevida global de pacientes com GBM, sugerindo seu papel como potenciais biomarcadores para o prognóstico destes pacientes. Análise funcional das isoform as de RECK em células U87 MG revelou que as células superexpressando as isoformas não apresentam inibição do processo de invasão celular, como observado para superexpressão da proteína canônica. Dentre as isoformas analisadas, destaca-se RECK-B, isoforma potencialmente ancorada à membrana plasmática por GPI, como a proteína canônica RECK, sugerindo uma possível colocalização destas variantes. Observa-se que células superexpressando RECK-B apresentam maior capacidade tumorigênica. Os resultados indicam que as variantes de RECK e o balanço entre a expressão destas variantes, apresentam um papel importante no comportamento e na agressividade de GBMs, tendo potencial valor na clínica. Além disso, para abrir perspectivas para o estudo das variantes de RECK, o balanço de expressão dos transcritos canônico e alternativos deste gene foi explorado durante os processos de diferenciação osteogênica e adipogênica. Os resultados indicam que a expressão da variante canônica é mais abundante em relação à expressão de suas isoformas em estágios tardios da adipogênese, sendo que o perfil inverso é observado em relação à isoforma B durante a osteogênese, sugerindo que o balanço entre os níveis de expressão das isformas de RECK possui um potencial papel biológico que deve ser explorado durante esses processos. Em conjunto, os resultados demonstram a existência de, pelo menos, três variantes de splicing do gene supressor de tumor RECK com envolvimento na tumorigênese e na diferenciação celular, abrindo novas perspectivas para o estudo e a aplicação do gene RECK na clínica. / Glioblastoma multiforme (GBM) or grade IV astrocytoma is the most common and lethal tumor of the central nervous system. One of the most striking features of GBMs is their invasive potential of the normal surrounding brain tissue. It has been described that MMP-2 and MMP-9 expression levels increase during astrocytoma progression. Canonical RECK suppresses tumor invasion and metastasis by negatively regulating at least three matrix metalloproteinases, namely: MMP-9, MMP-2 and MT1-MMP. A positive correlation has been observed between the abundance of RECK express ion in tumor samples and a more favorable prognosis for patients with several types of tumors. In this study, splice variants of the RECK tumor suppressor gene were identified by Expressed Sequence Tag (EST) analysis, isolated by RT-PCR, sequenced and cloned. Three novel alternatively spliced variants of the RECK tumor suppressor gene were identified and characterized. The RECK transcripts expression profiles were investigated using quantitative RT-PCR assays in a normal tissue RNA panel and, also, during astrocytoma progression in macrodissected tumor samples of patients with astrocytoma grades I (n=15), II (n=15), III (n=15) and IV/GBM (n=30). The results show that higher canonical RECK expression, accompanied by a higher ratio of canonical to alternative transcript expression, positively correlated with higher overall survival rate after chemotherapeutic treatment of GBM patients. Our findings suggest that these RECK transcript variants may potentially be used as biomarkers for prognosis of GBM patients. U87 MG cells overexpressing each RECK alternative variant were generated and found to lack the supressive role of cellular invasion processes found upon overexpressing the canonical protein. Among the characterized isoforms, RECK-B stands out, since this isoform is potentially anchored to the cell membrane by a GPI anchor, exactly as the canonical RECK and, also, since cells overexpressing RECK-B display greater tumorigenic capacity. The results indicate that RECK variants and the balance between the expressions of these variants, play an important role in the behavior and aggressiviness of GBMs, therefore have a potential translational application. In addition, in order to investigate new perspectives for the analysis of these isoforms, the expression balance of RECK transcripts was assessed during osteogenesis and adipogenesis, by qRT - PCR. The results show that the expression of the canonical RECK variant is more abundant that that of its alternative isoforms in later stages of adipogenic differentiation. The opposite profile is found regarding RECK-B during osteogenesis, suggesting that the balance between the expressions of these transcripts may have a potential role during these processes. Taken together, the results show the existence of, at least, three alternatively spliced variants of the RECK tumor suppressor gene, which are involved in tumogigenesis and cellular differentiation, o pening new perspectives for studies and clinical application of the RECK gene.

Orientador: Edson Rosa Pimentel / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-17T20:40:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Almeida_MarcosdosSantosde_M.pdf: 1553509 bytes, checksum: 83b5ab6bad050eff3b5f36b0524643b3 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: A eletroacupuntura (EA) tem sido utilizada amplamente para o tratamento de uma variedade de doenças inflamatórias e para o alivio da dor. No entanto, não há relatos na literatura sobre o efeito da EA na composição e organização da matriz extracelular (MEC) de tendões em processo de cicatrização. Objetivo: Investigar através de análises bioquímicas e morfológicas, o efeito da EA durante o pico de síntese dos componentes da MEC, 15 dias após transecção parcial do tendão calcâneo de ratos. Materiais e Métodos: Ratos Wistar machos com 60 dias de idade foram divididos em 3 grupos: Não tenotomizados (G1), tenotomizados (G2) e tenotomizados e submetidos a EA (G3). Agulhas de acupuntura (AC) foram inseridas nos pontos E-36 e B-57 e uma corrente elétrica com onda farádica bipolar assimétrica na freqüência de 2 Hz e intensidade de 2-4 Volts foi aplicada nas agulhas por 20 minutos, 3 vezes por semana em dias alternados, em um total de 6 sessões. Análises bioquímicas foram feitas através da SDS-PAGE, dosagem de proteínas não colagênicas (PNCs), glicosaminoglicanos (GAGs) e hidroxiprolina. Análise da metaloproteinase-2 (MMP-2) foi realizada por zimografia. Para análise morfológica em microscopia de luz comum, os cortes foram corados com hematoxilina-eosina (HE) e azul de toluidina (AT). Para análise em microscopia de polarização os cortes foram corados com Ponceau SS e a birrefringência foi avaliada em termos de valor de média de cinza em pixels utilizando um analisador de imagem. Resultados: EA nos pontos utilizados não alterou a concentração de PNCs, GAGs ou a atividade enzimática da MMP-2 nos tendões transeccionados. Já a concentração de hidroxiprolina foi significativamente aumentada nestes tendões quando tratados com EA. Na análise morfológica nos cortes corados com HE e AT, aparentemente não houve alterações na composição nem na organização da MEC. No entanto, na análise da birrefringência houve uma maior reorganização das fibras de colágeno no grupo tratado com EA. Conclusão: Nossos resultados indicam que a EA pode oferecer benefícios terapêuticos para o tratamento de lesões tendíneas através do aumento do conteúdo do colágeno e da reorganização molecular de suas fibras / Abstract: Electroacupuncture (EA) has been used to treat a variety of inflammatory diseases and pain relief. Therefore, there are no reports in the literature about the effect of EA on the composition and organization of the extracellular matrix (ECM) of tendons in the healing process. Objective: To investigate by morphological and biochemical analysis, the effect of EA during the peak of synthesis of ECM components, 15 days after partial transection of the Achilles tendon of rats. Methods: Male Wistar rats with 60 days old were divided into three groups: no tenotomized (G1), tenotomized (G2) and tenotomized and submitted to EA (G3). Acupuncture (AC) needles were inserted in the E-36 and B-57 points and an electrical current with asymmetrical bipolar faradic wave at frequency of 2 Hz and intensity of 2-4 Volts was applied to the needles for 20 minutes, 3 times per week on alternate days, for a total of 6 sessions. Biochemical analyses were done by SDS-PAGE, dosage of non collagenous proteins (NCPs), glycosaminoglycans (GAGs) and hydroxyproline. Analysis of metalloproteinase-2 (MMP-2) was carried out by zymography. For morphological analyses, the sections were stained with hematoxilin-eosin (HE) and toluidine blue. For polarization microscopy analysis the sections were stained with Ponceau SS and birefringence was evaluated in terms of gray average values in pixels using an image analyzer. Results: EA at points used did not alter the concentration of NCPs, GAGs or the enzymatic activity of MMP-2 in transected tendons. However, the concentration of hydroxyproline was significantly increased when these tendons were treated with EA. In the morphological analysis, apparently there were no changes in the composition and organization of the ECM. However, analysis of the birefringence showed higher reorganization of collagen fibers in the group treated with EA. Conclusion: Our results indicate that EA may offer therapeutic benefits for treatment of tendon injuries by increasing the content of collagen and the molecular reorganization of its fibers / Mestrado / Anatomia / Mestre em Biologia Celular e Estrutural

EPEC atípicas (EPECa) são isoladas de surtos diarréicos em crianças, adultos e animais em países industrializados e em desenvolvimento. Hemolisinas são toxinas que atuam sobre a membrana de eritrócitos e de diversos tipos celulares. Tal grupo de toxinas é reconhecido como importante fator de virulência envolvido na patogênese bacteriana, por isso o objetivo foi avaliar a expressão de enterohemolisina em isolados de EPECa e analisar características fenotípicas como interferência do meio de cultivo e adesão a componentes de matriz extracelular. Observou-se prevalência de 5,4% de isolados enterohemolíticos, e variações na expressão da toxina foram associadas à concentrações de lactose e caseína nos meios de cultivo. Além disso, verificou-se forte associação entre produção de enterohemolisina e ligação à fibronectina celular. / Atypical EPEC (aEPEC) are isolated from diarrheal outbreaks in children, adults and animals in industrialized and developing countries. Hemolysins are toxins that act on the red cell membrane and various cell types. This group of toxins is recognized as an important virulence factor involved in the bacterial pathogenesis. The aim of this study was the evaluation of the enterohemolysin expression in aEPEC isolates as interference of the culture media and adhesion to components of extracellular matrix. The prevalence of enterohemolytic isolates was 5.4%, and variations in toxin expression were associated with lactose and casein concentrations in culture media. Moreover, it was found association between production of enterohemolysin and adhesion to cellular fibronectin.

Made available in DSpace on 2014-08-20T14:30:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese_Bianca_Palma_Santana.pdf: 5946140 bytes, checksum: fbcbf4959ad9ccac3ca669ef232ffb3b (MD5) Previous issue date: 2011-12-06 / The development of scaffolds for tissue engineering should be biocompatible, where the degradation products should not be cytotoxic, tumorigenic, nephrotoxic or cause any toxic effects to the body. Despite the widespread use in tissue engineering, there is an effort to improve the functionality of this material for future applications. Important parameters should be observed in connection with properties that could influence the behavior of cells: pore size, pore shape, and surface treatment, for example. Among the materials used for the production of scaffolds, natural polymers have been the most widely used, given its high design flexibility and degradability. Scaffolds using nano-materials allow a greater similarity to natural extracellular matrix and these systems could be combined with biological inducers (eglectins) to address specific biological responses. The aim of our research is to obtain an alginate hydrogel functionalized nano/micro fiber based hydroxyapatite and titanium dioxide as well as bioactive substances (lectins), to the application in vitro for later use in the pulp tissue regeneration / O desenvolvimento de scaffolds para aplicação na engenharia tecidual deve ser biocompatível, onde os produtos de degradação não devam ser citotóxicos, tumorigênicos, nefrotóxicos ou causar qualquer outro efeito tóxico ao organismo. Apesar do largo uso em engenharia tecidual, existe um esforço para melhorar a funcionalidade deste material para futuras aplicações. Parâmetros importantes deveriam ser observados em relação às propriedades que poderiam influenciar o comportamento celular: tamanho dos poros, formato dos poros, e tratamento da superfície, por exemplo. Dentre os materiais utilizados pela produção de scaffolds, os polímeros naturais têm sido os mais empregados, dada a sua grande flexibilidade de desenho e degradabilidade. Scaffolds utilizando nano-materiais permitem uma similaridade maior com a matriz extracelular natural e estes sistemas poderiam ser combinados com indutores biológicos (por exemplolectinas) para direcionar respostas biológicas específicas. O objetivo geral de nossa pesquisa é obter um hidrogel de alginato funcionalizado com nano/micro fibras a base de hidroxiapatita e dióxido de titânio, bem como substâncias bioativas (lectinas), visando à aplicação in vitro para futura utilização em regeneração do tecido pulpar

Avaliamos a capacidade de indução de migração, invasão e secreção de protease pelo peptídeo derivado da laminina, C16 (KAFDITYVRLKF, cadeia g1) em linhagem celular (CAC2) de carcinoma adenóide cístico humano. Laminina g1 foi imunolocalizada no carcinoma adenóide in vivo e in vitro. Ensaio de ferida, em câmara bipartite e em vídeo microscopia (time-lapse) mostraram que C16 estimula migração em células CAC2. C16 também estimulou invasão em ensaio com câmaras bipartites cobertas com Matrigel. Invasão depende de atividade de protease. Zimografia mostrou que C16 aumentou secreção de MMPs 2 e 9. Diferentes vias de sinalização podem estar relacionadas com os efeitos de C16. Immunoblot revelou que C16 aumentou a fosforilação de AKT e ERK. Para o estudo de possíveis receptores do peptídeo, preparações de membrana foram passadas em colunas de afinidade com C16 acoplado. Banda de 40kDa foi eluída e analisada por espectrometria de massa (LC-MS/MS) que identificou a cadeia a1 do colágeno. O fragmento de colágeno eluído poderia ser parte de um complexo protéico envolvendo C16. Integrinas são receptores de colágeno e candidatas a fazerem parte desse complexo. Células CAC2 expressaram as integrinas av, a5, b3 and b1. Silenciamento dessas integrinas promoveu redução da migração e secreção de protease induzidas por C16. Sugerimos que C16 estimularia migração, invasão e secreção de protease em células de carcinoma adenóide cístico através de integrinas a5b1 e avb3. O sinal gerado por C16 seria transduzido pelas vias AKT e ERK1/2. / We studied induction of migration, invasion and protease activity by laminin-derived peptide C16 (KAFDITYVRLKF, g1 chain) in a cell line (CAC2) from adenoid cystic carcinoma. Laminin g1 was immunolocalized in adenoid cystic carcinoma in vivo and in vitro. C16 increased migratory activity of CAC2 cells, as shown by monolayer wound assay, Transwell migration assay and time-lapse video microscopy. This peptide also stimulated cell invasion in Transwell chambers coated with Matrigel. Invasion depends on protease activity. Zymograms showed that C16 increased secretion of MMPs 2 and 9. Different signaling pathways could be related to C16 regulation in CAC2 cells. Immunoblot showed that C16 increased phosphorylation of both AKT and ERK compared to controls. To study putative receptors of this peptide we used affinity chromatography. Membrane preparations were run through C16-affinity columns. A 40kDa band was eluted and analyzed by mass spectrometry (LC-MS/MS) identifying a collagen a1 chain. The collagen fragment eluted could be part of a protein complex involving C16. This protein complex may include integrins, which are collagen receptors. CAC2 cells exhibited av, a5, b3 and b1 integrins. siRNA knockdown of these integrins inhibited both C16-induced migration and protease activity. We propose that C16 increases migration, invasion and protease activity of a human salivary gland adenoid cystic carcinoma cell line through a5b1 and avb3 integrins. The signal generated by C16 is transduced by AKT and ERK1/2 signaling pathways.

Introdução: A doença intersticial pulmonar é um importante fator prognóstico na esclerose sistêmica (ES). O prognóstico das pneumonias intersticiais não específicas (NSIP) associadas às colagenoses tem sido descrito como melhor do que o da forma idiopática. Levanta-se a hipótese de que o processo de remodelamento e reparo do parênquima pulmonar nessas duas formas da doença sejam diferentes. Objetivos: Comparar os mecanismos de reparo e remodelamento entre a NSIP associada a ES e a NSIP idiopática. Observar o impacto dos mesmos nas provas de função pulmonar e na sobrevida. Métodos: Foram analisadas 40 biópsias de pacientes com o diagnóstico de NSIP (18 biópsias de NSIP associada a ES e 22 na forma idiopática). As informações clínicas e as provas de função pulmonar foram obtidas através da revisão dos prontuários. As lâminas foram revisadas por três patologistas. Foram comparadas as densidades epitelial, vascular, bem como a atividade vascular dos dois grupos utilizando o método de imuno-histoquímica. Para isso foram utilizados os anticorpos anti- citoqueratina 7 (CK-7), anti- proteína-a do surfactante (SP-A), antimarcador de célula endotelial CD-34 (CD34), e anti-molécula da adesão vascular 1 (VCAM-1). Também foi comparado o padrão de remodelamento da matriz septal e vascular, usando os métodos histoquímicos da resorcina (fibras elásticas) e picrosírius (colágeno). Uma análise estatística foi realizada comparando os resultados dos dois grupos, o impacto do remodelamento nas provas de função pulmonar e a influência na sobrevida. Resultados: A densidade das células epiteliais foi menor na NSIP-ES, do que na forma idiopática (p<0,0001). Já os pneumócitos tipo II e as células de Clara encontraram-se diminuídos no grupo idiopático (p=0,02). Uma diminuição na densidade vascular foi encontrada na NSIP-ES quando comparada à forma idiopática (p<0,0001); no entanto, a atividade vascular medida pelo VCAM-1 foi maior no grupo da NSIP-ES (p<0.0001). O conteúdo das fibras elásticas e colágeno septal, bem como o das fibras elásticas na parede vascular, estavam aumentados no grupo da ES quando comparados à forma idiopática (p=0,01; p=0,001 e p<0,0001, respectivamente). Não houve diferença estatística entre o colágeno da parede vascular, no grau de obstrução vascular ou associação entre os parâmetros de remodelamento e reparo do parênquima pulmonar na sobrevida dos dois grupos. Dentre as provas de função pulmonar, a DCO/Hb foi mais afetada no grupo da ES (59% do valor predito na ES e 97% no grupo idiopático). Foi observada uma associação direta entre a densidade vascular e a DCO/Hb (p=0,02). Após o seguimento de 36 meses, não foi observada diferença no prognóstico dos dois grupos. Conclusão: Os processos de remodelamento e reparo do parênquima pulmonar parecem ser diferentes entre os dois grupos. Apesar de o processo fibrótico ser mais intenso na NSIP-ES, isso parece não estar associado a um pior prognóstico, como tem sido descrito na forma idiopática. Como o processo de elastose e a expressão do VCAM-I são mais intensos na ES, isso sugere que o processo inflamatório tem um papel mais importante na patogênese e no processo de remodelamento e reparo da ES do que na forma idiopática. No entanto, outros estudos são necessários para validar a importância desses resultados e sua utilização para fins terapêuticos e de prognóstico / Background: The presence of Interstitial lung disease is a well recognized prognostic factor in systemic sclerosis (SSc). As the prognosis in nonspecific interstitial pneumonia (NSIP) has been described to be better in collagen vascular disorders compared to the idiopathic forms, it is conceivable that the mechanisms of repair and remodeling are different between these two forms of the disease. Objectives: To compare the mechanisms of repair and remodeling between SSc associated nonspecific pneumonia and the idiopathic form, as well as their impact on pulmonary function tests and survival rates. Methods: Biopsies from 18 patients with SSc-associated NSIP and 22 with idiopathic NSIP were analyzed. Clinical data and pulmonary function test results were obtained by retrospective chart review. All H&E slides were reviewed by three pathologists. The epithelial and vascular densities and vascular activity were compared between the two groups by immunohistochemistry with antibodies directed against cytokeratin-7, surfactant protein-a, CD34, and VCAM-1, as well as septal and vascular matrix remodeling using histochemical stains (picrosirius and resorcin). Statistical analyses were performed to compare the results of these various studies with clinical parameters (e.g. pulmonary function tests) and survival between the groups. Results: Epithelial cell density was lower in SSc-NSIP when compared with idiopathic-NSIP (p<0.0001). Type II pneumocytes and Clara cells were reduced in idiopathic NSIP (p=0.02). A decrease in microvessel density was found in SSc-NSIP compared to idiopathic-NSIP (p<0.0001). The vascular activity measured by VCAM-1 expression was higher in NSIP-SSc when compared to the idiopathic group (p<0.0001). A direct association between vascular density and DLCO/HB was found (p=0.02). Among pulmonary function tests the DLCO/HB was affected to a greater extent in the SSc group (59% of the predicted value in SSc and 97% in the idiopatic group). The content of septal collagen and elastic fibers, as well as the elastic fibers in the vascular wall, were higher in the SSc group (p=0.01, p=0.001 and p<0.0001, respectively). There were no differences in the collagen content of the vascular wall, vascular grade, or survival between the two groups. There was no difference in the survival rate between the two groups after a follow-up of 36 months. Conclusions: Alterations in the pulmonary epithelium and vasculature seem to differ in the SSc-NSIP when compared to the idiopathic form of the disease. Although the fibrotic process is more intense in the SSc group, it does not seem to affect the prognosis of these patients, contrary to what has been described in idiopatic lung fibrosis. Because the elastotic process and VCAM-1 expression are higher in the SSc group, this might suggest that inflammatory mechanisms affecting the elastic fiber system and vasculature could play a greater role in the pathogenesis and pulmonary remodeling process of SSc-NSIP than in idiopathic-NSIP. Further studies may be required to assess the significance of these findings and explore if they can provide prognostic and/or treatment information

Introdução: A doença intersticial pulmonar é um importante fator prognóstico na esclerose sistêmica (ES). O prognóstico das pneumonias intersticiais não específicas (NSIP) associadas às colagenoses tem sido descrito como melhor do que o da forma idiopática. Levanta-se a hipótese de que o processo de remodelamento e reparo do parênquima pulmonar nessas duas formas da doença sejam diferentes. Objetivos: Comparar os mecanismos de reparo e remodelamento entre a NSIP associada a ES e a NSIP idiopática. Observar o impacto dos mesmos nas provas de função pulmonar e na sobrevida. Métodos: Foram analisadas 40 biópsias de pacientes com o diagnóstico de NSIP (18 biópsias de NSIP associada a ES e 22 na forma idiopática). As informações clínicas e as provas de função pulmonar foram obtidas através da revisão dos prontuários. As lâminas foram revisadas por três patologistas. Foram comparadas as densidades epitelial, vascular, bem como a atividade vascular dos dois grupos utilizando o método de imuno-histoquímica. Para isso foram utilizados os anticorpos anti- citoqueratina 7 (CK-7), anti- proteína-a do surfactante (SP-A), antimarcador de célula endotelial CD-34 (CD34), e anti-molécula da adesão vascular 1 (VCAM-1). Também foi comparado o padrão de remodelamento da matriz septal e vascular, usando os métodos histoquímicos da resorcina (fibras elásticas) e picrosírius (colágeno). Uma análise estatística foi realizada comparando os resultados dos dois grupos, o impacto do remodelamento nas provas de função pulmonar e a influência na sobrevida. Resultados: A densidade das células epiteliais foi menor na NSIP-ES, do que na forma idiopática (p<0,0001). Já os pneumócitos tipo II e as células de Clara encontraram-se diminuídos no grupo idiopático (p=0,02). Uma diminuição na densidade vascular foi encontrada na NSIP-ES quando comparada à forma idiopática (p<0,0001); no entanto, a atividade vascular medida pelo VCAM-1 foi maior no grupo da NSIP-ES (p<0.0001). O conteúdo das fibras elásticas e colágeno septal, bem como o das fibras elásticas na parede vascular, estavam aumentados no grupo da ES quando comparados à forma idiopática (p=0,01; p=0,001 e p<0,0001, respectivamente). Não houve diferença estatística entre o colágeno da parede vascular, no grau de obstrução vascular ou associação entre os parâmetros de remodelamento e reparo do parênquima pulmonar na sobrevida dos dois grupos. Dentre as provas de função pulmonar, a DCO/Hb foi mais afetada no grupo da ES (59% do valor predito na ES e 97% no grupo idiopático). Foi observada uma associação direta entre a densidade vascular e a DCO/Hb (p=0,02). Após o seguimento de 36 meses, não foi observada diferença no prognóstico dos dois grupos. Conclusão: Os processos de remodelamento e reparo do parênquima pulmonar parecem ser diferentes entre os dois grupos. Apesar de o processo fibrótico ser mais intenso na NSIP-ES, isso parece não estar associado a um pior prognóstico, como tem sido descrito na forma idiopática. Como o processo de elastose e a expressão do VCAM-I são mais intensos na ES, isso sugere que o processo inflamatório tem um papel mais importante na patogênese e no processo de remodelamento e reparo da ES do que na forma idiopática. No entanto, outros estudos são necessários para validar a importância desses resultados e sua utilização para fins terapêuticos e de prognóstico / Background: The presence of Interstitial lung disease is a well recognized prognostic factor in systemic sclerosis (SSc). As the prognosis in nonspecific interstitial pneumonia (NSIP) has been described to be better in collagen vascular disorders compared to the idiopathic forms, it is conceivable that the mechanisms of repair and remodeling are different between these two forms of the disease. Objectives: To compare the mechanisms of repair and remodeling between SSc associated nonspecific pneumonia and the idiopathic form, as well as their impact on pulmonary function tests and survival rates. Methods: Biopsies from 18 patients with SSc-associated NSIP and 22 with idiopathic NSIP were analyzed. Clinical data and pulmonary function test results were obtained by retrospective chart review. All H&E slides were reviewed by three pathologists. The epithelial and vascular densities and vascular activity were compared between the two groups by immunohistochemistry with antibodies directed against cytokeratin-7, surfactant protein-a, CD34, and VCAM-1, as well as septal and vascular matrix remodeling using histochemical stains (picrosirius and resorcin). Statistical analyses were performed to compare the results of these various studies with clinical parameters (e.g. pulmonary function tests) and survival between the groups. Results: Epithelial cell density was lower in SSc-NSIP when compared with idiopathic-NSIP (p<0.0001). Type II pneumocytes and Clara cells were reduced in idiopathic NSIP (p=0.02). A decrease in microvessel density was found in SSc-NSIP compared to idiopathic-NSIP (p<0.0001). The vascular activity measured by VCAM-1 expression was higher in NSIP-SSc when compared to the idiopathic group (p<0.0001). A direct association between vascular density and DLCO/HB was found (p=0.02). Among pulmonary function tests the DLCO/HB was affected to a greater extent in the SSc group (59% of the predicted value in SSc and 97% in the idiopatic group). The content of septal collagen and elastic fibers, as well as the elastic fibers in the vascular wall, were higher in the SSc group (p=0.01, p=0.001 and p<0.0001, respectively). There were no differences in the collagen content of the vascular wall, vascular grade, or survival between the two groups. There was no difference in the survival rate between the two groups after a follow-up of 36 months. Conclusions: Alterations in the pulmonary epithelium and vasculature seem to differ in the SSc-NSIP when compared to the idiopathic form of the disease. Although the fibrotic process is more intense in the SSc group, it does not seem to affect the prognosis of these patients, contrary to what has been described in idiopatic lung fibrosis. Because the elastotic process and VCAM-1 expression are higher in the SSc group, this might suggest that inflammatory mechanisms affecting the elastic fiber system and vasculature could play a greater role in the pathogenesis and pulmonary remodeling process of SSc-NSIP than in idiopathic-NSIP. Further studies may be required to assess the significance of these findings and explore if they can provide prognostic and/or treatment information