Atualmente, o Brasil é o segundo maior exportador de carne bovina e o sexto exportador de leite no mundo. Visando melhorar a produtividade da bovinocultura, torna-se importante a aplicação de programas sanitários adequados e eficientes. As doenças virais são preocupações constantes em qualquer programa de sanidade, devido aos grandes prejuízos econômicos que causam e o seu diagnóstico correto depende de técnicas laboratoriais eficientes. O gênero Pestivirus, da família Flaviviridae, possui três espécies reconhecidas que podem infectar bovinos: o vírus da diarreia viral bovina tipo 1 (BVDV-1), o BVDV-2 e o vírus da doença da fronteira (BDV), além de uma espécie atípica proposta como BVDV-3. Causam principalmente distúrbios respiratórios, reprodutivos e digestivos em bovinos, levando a queda de índices de produção. Os objetivos do presente trabalho foram: descrever o uso de uma técnica modificada de detecção de agentes virais que possam estar presentes em insumos utilizados na reprodução assistida e descrever a caracterização patológica e análise filogenética de pestivírus detectados em um surto da doença, sendo os dados apresentados sob a forma de dois artigos. No primeiro, pools de líquidos foliculares colhidos durante a punção ovariana de vacas para coleta de oócitos para produção in vitro de embriões foram selecionados. As amostras foram analisadas para a detecção de BVDV, herpesvirus bovino tipo 1 (BoHV-1) e 5 (BoHV-5) por isolamento viral, RT-PCR e nested PCR, sendo utilizados dois protocolos de extração de DNA e RNA: um convencional e o outro com adição de etapas pré-extração de ácido nucleico, no intuito de reduzir possíveis inibidores de RT-PCR e PCR presentes nas amostras. A utilização da técnica de pré-extração permitiu detectar um maior número de amostras positivas. No segundo trabalho, foi descrito um surto de diarreia viral bovina em um rebanho que foi testado por imunohistoquímica, ELISA, isolamento viral, RT-PCR e sequenciamento de três regiões do genoma. Foram obtidas quatro amostras distintas de BVDV-3 e as principais alterações clinicas foram encontradas nos sistemas digestivo e respiratório, mas lesões de pele e opacidade de córnea também foram observadas. Os resultados encontrados nos trabalhos realizados reforçam a necessidade da verificação quanto à presença de patógenos em materiais biológicos utilizados na reprodução assistida utilizando técnicas sensíveis e que a doença causada por BVDV-3 em bovinos é indistinguível clinicamente das causadas por outros pestivírus, sugerindo que pestivírus atípicos podem estar subdiagnosticados nos rebanhos brasileiros. / Currently, Brazil is the second largest beef and the sixth milk exporter worldwide. To improve the livestock productivity, it becomes important the applying of appropriate and efficient health programs. Viral diseases are constant concerns on any health program due to major economic losses they cause and their correct diagnosis depends of the development of efficient diagnostic techniques. The genus Pestivirus of the family Flaviviridae, has three recognized species which can infect cattle: the bovine viral diarrhea virus type 1 (BVDV-1), BVDV-2 and border disease virus (BDV), and one atypical species putatively named as BVDV-3. These viruses mainly cause respiratory, digestive and reproductive disturbances in cattle, resulting in decrease of production rates. The goals of the present work were: describe the use of a modified procedure in detecting viral agents that may be present on byproducts utilized in assisted reproduction and describe the pathological and phylogenetic frame of pestivirus detected in an outbreak of disease. The data was presented in two papers. In the first study, pooled follicular fluid collected during oocyte retrieval for in vitro embryo production were selected. The samples were analyzed for BVDV, bovine herpesvirus type 1 (BoHV-1) and 5 (BoHV-5) by virus isolation, RT-PCR and nested PCR, using two extraction protocols for DNA and RNA: a conventional and the other with addition of pre-extraction of nucleic acid step, in order to reduce potential inhibitors of PCR and RT-PCR present in the samples. The use of the prenucleic acid procedure allowed detecting a greater number of positive samples. In the second paper, an outbreak of bovine viral diarrhea virus was described and has been tested by immunohistochemistry, ELISA, virus isolation, RT-PCR and sequencing of three regions of the genome. Four different BVDV-3 samples were obtained and major clinical disturbances were found in the digestive and respiratory systems, but skin lesions and corneal opacity were also observed. The results obtained in the works underscore the need in checking for pathogens in biologicals used in assisted reproduction utilizing sensitive techniques and shows that the disease caused by BVDV-3 in cattle is clinically undistinguishable from those caused by other pestiviruses, suggesting that atypical pestivirus may be underdiagnosed in the Brazilian herds.

Orientador: Marcos Nogueira Eberlin / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química / Made available in DSpace on 2018-08-26T03:09:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Steola_MarcosPaulo_M.pdf: 3243022 bytes, checksum: 9b7450eb5a75ce0b22ccba84584755de (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A utilização da espectrometria de massas como ferramenta de quantificação de moléculas em matrizes biológicas complexas vem sendo difundida durante os últimos anos, devido ao sua versatilidade, facilidade no preparo das amostras, alta sensibilidade e rapidez na quantificação. A utilização da cromatografia líquida de alta eficiência acoplada à espectrometria de massas uniu o poder de separação da cromatografia líquida com o poder de identificação da espectrometria de massas, proporcionando corridas analíticas mais rápidas e menores limites de detecção. O presente trabalho teve como objetivo validar metodologia para a quantificação de 5 hormônios esteroides (estradiol, cortisol, testosterona, progesterona e androstenediona) em plasma e 2 hormônios esteroides ( estradiol e progesterona) em fluído folicular bovino, utilizando-se cromatografia liquida acoplada a espectrometria de massas, para uso na quantificação de amostras provenientes de duas raças diferentes, Bós taurus e Bós indicus, principais constituintes do rebanho brasileiro, submetidas a duas dietas diferentes. Devido à dificuldade de encontrar matrizes biológicas isentas de hormônios esteroides optou-se pelo uso da técnica de diluição isotópica na validação da metodologia, técnica em que o sinal do hormônio a ser analisado é comparado com seu análogo deuterado, minimizando o efeito da matriz biológica. A metodologia desenvolvida e validada poderá ser utilizada na quantificação de hormônios em matrizes biológicas provenientes de outras raças bovinas, bem como ser aplicada para a quantificação de hormônios esteroides em plasma e fluído folicular em humanos / Abstract: The use of mass spectrometry and quantification of molecules in complex biological matrices tool has been widespread over the last years due to its versatility, ease of sample preparation , high sensitivity and fast quantification . The use of high performance liquid chromatography coupled to mass spectrometry attached the separation power of the liquid chromatography and identification mass spectrometry, giving analytical runs faster and lower detection limits. This study aims to validate the methodology for quantification of 5 steroid hormones ( estradiol , cortisol , testosterone , progesterone and androstenedione ) in plasma and 2 steroid hormones ( estradiol and progesterone ) in bovine follicular fluid , using liquid chromatography with mass spectrometry detector , for use in the quantification of samples from two different breeds , Bos taurus and Bos indicus , the main constituent of the Brazilian herd , subjected to two different diets . Due to the difficulty of finding in biological matrices free steroid hormones, we opted for the use of the isotope dilution technique to validate the methodology , a technique in which the signal of the hormone being examined is compared with its deuterated analogue, minimizing the effect of the biological matrix . The methodology developed and validated may be used in the quantification of hormones in biological matrices from other cattle breeds , as well as be applied to quantify steroid hormones in plasma and follicular fluid in humans / Mestrado / Quimica Analitica / Mestre em Química

Inhibin A and B participate to regulation of gametogenesis. We investigated their applicability as a marker of gametogenesis of men fertility disorders. We monitored the levels of inhibins during the treatment. We interested in their paracrine activity, relationship in sera, follicular fluid and seminal plasma depending on cause of fertility failure. We studied the levels of inhibin B in serum and seminal plasma from 355 men treated for fertility failure, in the context of their andrological and immunological findings (quality of spermiogrammes and acrosome area). We monitored concentration of levels of inhibin A and B in serum and follicular fluids depending on cause of fertility failure, on course and treatment outcome. We took blood samples in the time of the oocytes collection, of the embryotransfer and early pregnancy. The follicular fluids were obtained during the oocytes collection. The levels of both of inhibins were measured by ELISA in all medium (serum, follicular fluid, seminal plasma). We confirm, that inhibin B is useful marker of spermatogenesis in men, but is necessary to examine patient in complex with determination of immunology profile or quality of acrosome. Seminal plasma is, in some indicated cases, more suitable diagnostics material. Similarly inhibin B in women seems to be...

Os mecanismos envolvidos na etiopatogênese da infertilidade em pacientes com endometriose não foram totalmente elucidados. A infertilidade apresentada por pacientes com as formas moderada e grave (estadios III e IV, respectivamente) seria, parcialmente, decorrente de alterações anatômicas pélvicas associadas à endometriose. Entretanto, há evidências de que lesões sutis ou implantes endometrióticos em estágios iniciais (estágio mínimo e leve) também poderiam contribuir com a etiopatogênese da infertilidade. Uma pior qualidade oocitária pode estar envolvida nas menores taxas de implantação após fertilização in vitro encontradas nessas pacientes. Questionamos a possibilidade de haver alterações no microambiente folicular de pacientes inférteis com endometriose, as quais poderiam afetar a aquisição de competência oocitária e, consequentemente, comprometer a fertilidade natural e os resultados dos tratamentos de reprodução assistida em mulheres com esta doença. Sabe-se que, para ser competente e poder ser fertilizado, o oócito precisa estar maduro e ter um fuso morfologicamente funcional, que garanta a fidelidade da segregação cromossômica durante a meiose. Dessa forma, o objetivo deste estudo foi avaliar o potencial impacto de diferentes concentrações de fluido folicular (FF) de mulheres inférteis com e sem endometriose leve sobre a integridade do fuso, alinhamento cromossômico e organização dos microfilamentos de actina de oócitos bovinos maturados in vitro. Realizou-se um estudo experimental, onde amostras de fluido follicular foram consecutivamente obtidas de 22 pacientes inférteis (11 com endometriose leve e 11 com infertilidade por fator tubário e/ou masculino) submetidas à estimulação ovariana para injeção intracitoplasmática de espermatozóide. Oócitos bovinos imaturos foram submetidos à maturação in vitro (MIV) sem adição de fluido follicular (sem fluido) e com 4 concentrações (1%, 5%, 10%, e 15%) de duas amostras de fluido folicular (uma de paciente com endometriose e outra de paciente sem endometriose). Foram realizadas 11 MIVs e cada amostra de fluido follicular foi usada apenas uma vez. Os oócitos foram fixados, marcados por imunofluorescência para visualização morfológica de microtúbulos, cromatina e microfilamentos de actina e, então, analisados por microscopia confocal. A porcentagem de anormalidade de oócitos em MII (fuso normal e cromossomos desalinhados, fuso anormal e cromossomos desalinhados, fuso anormal e cromossomos alinhados) foi significativamente maior naqueles maturados com FF de pacientes com endometriose (1%: 55,56%, 5%: 63,26%, 10%: 54,54%, 15%: 48,84%) quando comparados com oócitos maturados com FF de pacientes controles (1%: 19,15%, 5%: 23,44%, 10%: 25%, 15%: 23,81%) e oócitos maturados sem fluido (23,53%), sem haver diferença entre as concentrações testadas em cada grupo. Pode-se concluir que oócitos bovinos maturados in vitro na presença de FF de mulheres inférteis com endometriose leve têm maior freqüência de anormalidade meiótica. Estes dados sugerem que o FF de mulheres com endometriose pode comprometer a qualidade oocitária por promover danos ao fuso e/ou cromossomos / The mechanisms involved in the etiopathogenesis of infertility in patients with endometriosis have not been fully elucidated. The infertility presented by patients with moderate and severe disease (stages III and IV, respectively) would be partly due to anatomical pelvic changes associated with endometriosis. However, there are evidences that subtle lesions or endometriosis implants in the early stages (stages I and II) might also contribute to the etiophatogenesis of infertility. Impaired oocyte quality may be involved in lower implantation rates after in vitro fertilization in these patients. We question if alterations in the follicular microenvironment of infertile patients with endometriosis might affect oocyte competence acquisition and compromise the natural fertility and assisted reproduction treatment outcomes in women with this disease. It is known that to be competent and capable of fertilizing, the oocyte must be mature and have a morphologically functional spindle, which ensure the fidelity of chromosome segregation during meiosis. Thus, the aim of this study was to evaluate the potential impact of different concentrations of follicular fluid (FF) of infertile women with and without mild endometriosis on spindle integrity, chromosomes alignment and actin microfilaments organization of bovine oocytes in vitro matured. We performed an experimental study, where FF samples were consecutively obtained from 22 infertile patients (11 with mild endometriosis and 11 with tubal or male factors of infertility) submitted to ovarian stimulation for intracytoplasmic sperm injection. Immature bovine oocytes were submitted to in vitro maturation (IVM) without FF and with 4 concentrations (1%, 5%, 10%, and 15%) of 2 samples of FF (1 from a woman with endometriosis and one from a woman without endometriosis). We performed 11 IVM and each FF sample was used only once. The oocytes were then fixed, stained by immunofluorescence for morphological visualization of microtubules, chromatin and actin microfilaments, and then, analyzed by confocal microscopy. The percentage of abnormal MII oocytes was significantly higher for those matured with FF from patients with endometriosis (1%: 55.56%, 5%: 63.26%, 10%: 54.54%, 15%: 48.84%) when compared with oocytes matured with FF from patients without endometriosis (1%: 19.15%, 5%: 23.44%, 10%: 25%, 15%: 23.81%) and those matured without FF (23.53%), with no differences among the tested concentrations in each group. We can conclude that bovine oocytes matured in vitro in the presence of FF from infertile women with mild endometriosis have higher frequency of meiotic abnormalities. These data suggest that FF from women with endometriosis may compromise oocyte quality by promoting spindle and/or chromosomal damage

Au cours de ces dernières années, l’utilisation des acides nucléiques circulants comme outils diagnostiques et/ou pronostiques en cancérologie a largement été documentée. Récemment, le développement du diagnostic prénatal non-invasif a également révélé l’intérêt grandissant de ces biomarqueurs en gynécologie-obstétrique. Les acides nucléiques circulants ou extracellulaires ont la particularité d’être facilement détectables dans les fluides biologiques de l’organisme et sont de deux types: (1) l’ADN libre, courts ou longs fragments d’ADN provenant des processus apoptotiques et/ou nécrotiques cellulaires (2) les microARNs, petites séquences d’ARN non codantes, qui régulent l’expression des gènes en interférant avec leurs ARNm cibles. Sachant qu’il a été démontré que le taux d’ADN libre circulant est anormalement élevé dans certaines conditions pathologiques et que les microARNs sont impliqués dans la régulation de nombreux processus biologiques tels que la folliculogénèse et la stéroïdogénèse, ces deux types d’acides nucléiques pourraient alors constituer des biomarqueurs d’intérêt dans le domaine de l’Assistance Médicale à la Procréation. Dans ce travail de thèse, nous avons à la fois mesuré le taux d’ADN libre et analysé les profils d’expression de plusieurs microARNs d’intérêt par PCR quantitative, dans le liquide folliculaire (LF) de patientes prises en charge en fécondation in vitro (FIV). Nous avons observé des taux d’ADN libre significativement élevés ainsi que des profils d’expression de microARNs spécifiques dans le LF de patientes présentant des anomalies de la réserve ovarienne (telles que le syndrome des ovaires micropolykystiques ou une faible réserve ovarienne). Nous avons ensuite évalué le potentiel des acides nucléiques circulants en tant biomarqueurs prédictifs des résultats en FIV. Nous avons démontré que le taux d’ADN libre intra-folliculaire et l’expression de certains microARNs étaient significativement associés à la qualité des embryons obtenus in vitro ainsi qu’à la survenue d’une grossesse clinique. Les acides nucléiques circulants offrent donc de nouvelles perspectives à la fois d’un point de vue diagnostique et pronostique dans la prise en charge de l’infertilité humaine. / During the last years, the use of circulating nucleic acids as diagnostic and/or prognostic tools in cancerology was widely documented. The recent development of non-invasive prenatal testing also reveals the growing interest of these biomarkers in obstetrics and gynecology. The circulating or extracellular nucleic acids have for particularity to be easily detectable in the biological fluids of the body and there are two types: (1) Cell-free DNA (cfDNA), short or long DNA fragments resulting from cellular apoptosis and/or necrosis (2) microRNAs (miRNAs), small non-coding RNA sequences, which regulate gene expression by interfering with their mRNA targets. Since it was demonstrated that cfDNA level is abnormally increased in some pathological conditions and miRNAs are involved in the regulation of several biological processes such as folliculogenesis and steroidogenesis, these two types of nucleic acids could constitute new biomarkers of interest in Assisted Reproductive Technology. In this thesis work, we quantified the cfDNA level and analysed the expression profiles of some miRNAs by quantitative PCR, in follicular fluid (FF) samples from women undergoing in vitro fertilization (IVF) procedure. We observed significant high cfDNA levels as well as specific miRNA expression profiles in FF from women with ovarian disorders (such as polycystic ovary syndrome or low ovarian reserve). Next, we investigated the potential of circulating nucleic acids as predictive biomarkers of IVF outcomes. We demonstrated that the intra-follicular cfDNA level and some miRNA expressions were significantly associated with in vitro embryo quality and the clinical pregnancy outcome. Therefore, the circulating nucleic acids offer new diagnostic and prognostic perspectives in human infertility management.

Submitted by Erika Demachki (erikademachki@gmail.com) on 2014-09-18T21:25:37Z No. of bitstreams: 2 Tese Benner Geraldo Alves.pdf: 1853659 bytes, checksum: 2636d54e206a039c50bef82427621305 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Rejected by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com), reason: Problemas: -nome do primeiro coorientador: Filho, Benedito Dias de Oliveira. Correto: Oliveira Filho, Benedito Dias de -palavras chaves usou balanço energético estresse térmico Correto: Balanço energético Estresse térmico -citação usou: Alves, Bênner Geraldo - Perfil bioquímico sérico e do fluido folicular e qualidade ovocitária em vacas leiteiras durante o pós-parto no verão e inverno. 2013. 115 f. Tese (Doutorado em Ciência Animal). Programa de Pós-graduação em Ciência Animal (EVZ) - Universidade Federal de Goiás - Goiânia, 2013. Deve-se seguir a NBR 6023. Ex.: ALCÂNTARA, Guizelle Aparecida de. Caracterização farmacognostica e atividade antimicrobiana da folha e casca do caule da myrciarostratadc.(myrtaceae). 2012. 41 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Farmacêuticas) - Universidade Federal de Goiás, Goiânia, 2012. Ou seja, terá que alterar o que aparece nesse campo já registrado automático pelo programa, como: pontuação o sobrenome todo em maiúsculo, etc. on 2014-09-19T13:30:02Z (GMT) / Submitted by Erika Demachki (erikademachki@gmail.com) on 2014-09-22T18:11:38Z No. of bitstreams: 2 Tese Benner Geraldo Alves.pdf: 1853659 bytes, checksum: 2636d54e206a039c50bef82427621305 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Silva (jtas29@gmail.com) on 2014-09-22T19:08:08Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Tese Benner Geraldo Alves.pdf: 1853659 bytes, checksum: 2636d54e206a039c50bef82427621305 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-09-22T19:08:08Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Tese Benner Geraldo Alves.pdf: 1853659 bytes, checksum: 2636d54e206a039c50bef82427621305 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2013-01-24 / Considerável número de publicações têm reportado o declínio da eficiência reprodutiva em vacas leiteiras e existem evidências de associação entre alta produção de leite com distúrbios reprodutivos, predisposição para o balanço energético negativo (BEN) e qualidade inferior do ovócito. Outro fator que contribui para a baixa fertilidade é o estresse térmico (ET), que associado à elevada produção de calor metabólico, torna a vaca lactante mais susceptível aos seus efeitos. No Brasil, a raça Girolando evoluiu zootecnicamente nas últimas décadas e sua maior capacidade de adaptação às condições ambientais, tem se mostrado uma alternativa interessante para a produção de leite nos trópicos. No entanto, até o momento nenhum estudo abordou os efeitos do BEN e do ET sobre o perfil metabólico e do fluido folicular de folículos dominantes, a dinâmica folicular e a qualidade dos ovócitos durante a lactação em diferentes estações do ano, logo o entendimento destes parâmetros torna-se de fundamental importância para avaliação do potencial produtivo da raça. Os resultados deste estudo demonstram que os desafios BEN e ET no início da lactação diminuem o escore de condição corporal e alteram as concentrações séricas e foliculares de diversos metabólitos, indicando que tais mudanças são refletidas no ambiente folicular de folículos dominantes podendo comprometer a qualidade do ovócito e das células da granulosa. Além disso, os dados revelam que variáveis clínicas e meteorológicas podem influenciar a foliculogênese, a dominância folicular e a qualidade ovocitária. Dessa forma, esses resultados são importantes para o entendimento da patogênese da subfertilidade que acomete bovinos leiteiros durante o pós-parto e sob condições ambientais desfavoráveis. / Considerável número de publicações têm reportado o declínio da eficiência reprodutiva em vacas leiteiras e existem evidências de associação entre alta produção de leite com distúrbios reprodutivos, predisposição para o balanço energético negativo (BEN) e qualidade inferior do ovócito. Outro fator que contribui para a baixa fertilidade é o estresse térmico (ET), que associado à elevada produção de calor metabólico, torna a vaca lactante mais susceptível aos seus efeitos. No Brasil, a raça Girolando evoluiu zootecnicamente nas últimas décadas e sua maior capacidade de adaptação às condições ambientais, tem se mostrado uma alternativa interessante para a produção de leite nos trópicos. No entanto, até o momento nenhum estudo abordou os efeitos do BEN e do ET sobre o perfil metabólico e do fluido folicular de folículos dominantes, a dinâmica folicular e a qualidade dos ovócitos durante a lactação em diferentes estações do ano, logo o entendimento destes parâmetros torna-se de fundamental importância para avaliação do potencial produtivo da raça. Os resultados deste estudo demonstram que os desafios BEN e ET no início da lactação diminuem o escore de condição corporal e alteram as concentrações séricas e foliculares de diversos metabólitos, indicando que tais mudanças são refletidas no ambiente folicular de folículos dominantes podendo comprometer a qualidade do ovócito e das células da granulosa. Além disso, os dados revelam que variáveis clínicas e meteorológicas podem influenciar a foliculogênese, a dominância folicular e a qualidade ovocitária. Dessa forma, esses resultados são importantes para o entendimento da patogênese da subfertilidade que acomete bovinos leiteiros durante o pós-parto e sob condições ambientais desfavoráveis.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:47:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 425505 bytes, checksum: c9e905b211c38a1ec8e1bb112c85e570 (MD5) Previous issue date: 2014-02-27 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / This study was aimed to investigate the effects that different protocols for induction and synchronization of estrus and ovulation, with the use of eCG, BE, CE or GnRH associated with progestin could have on the follicle growth and pre-ovulatory follicle diameter. Furthermore the relationship with progesterone, LH, insulin, cortisol in the follicular fluid concentration and progesterone, cortisol, insulin serum concentrations of cows submitted to protocols. Ninety Nelore suckled cows were divided into six groups, 15 cows per protocol. The protocols consisted in the placement and removal of an intravaginal progesterone device (IPD) (0.75g of progesterone) in the first and eighth day respectively; application of prostaglandin (PGF2 &#61537;) on the eighth day, and except in protocol 1 was used estradiol benzoate (EB) on day 1. The other differences in the delineation of protocols were: Protocol 1 day 1 and day 8 (GnRH); Protocol 2 day 6 (PGF2 &#61537;), day 8 (PGF2 &#61537; + estradiol cypionate (EC)); Protocol 3 day 8 (eCG + EC); Protocol 4 day 8 (eCG + EB); Protocol 5 day 8 (eCG), day 9 (EB); Protocol 6 day 9 (EB). Overall 93.3% (84/90) of cows responded to synchronization protocol. However, it was observed that 28.9% of cows (26/90) did not have a synchronization of a new follicular wave, checked by the number of cows which have not developed a dominant follicle (5/26), cows with early ovulation (15/26) and cows that had a dominant follicle in regression process (6/26). There was no statistical difference in growth and diameter of the pre-ovulatory follicle between protocols. Progesterona, LH, insulina, cortisol concentrations on follicular fluid, as well as in cortisol and insulin serum concentration did nor differ with the protocols used. Although, in protocol 2, lower progesterone concentrations (P<0.05) were observed in the withdrawal of IPD. Twenty seven oocytes were recovered, which were classified according to quality: 1 (n=12), 2 (n=6), 3 (n=7) e 4 (n=2). The antecipation in the prostaglandin application in two days from IPD withdrawal result in lower progesterone concentrations. / O objetivo desse estudo foi verificar os efeitos que diferentes protocolos de indução e sincronização do estro e da ovulação, com utilização de eCG, BE, CE ou GnRH associados a um progestágeno, podem ter sobre o crescimento e diâmetro do folículo pré-ovulatório, e suas relações com a concentração, no fluido folicular, de progesterona, LH, insulina e cortisol, e com a concentração sérica de progesterona, cortisol e insulina das vacas submetidas aos protocolos. Foram utilizadas 90 vacas Nelore solteiras, com mais de nove meses pós-parto, divididas em seis protocolos, sendo 15 vacas por protocolo. Todos os protocolos consistiam na colocação e retirada de um dispositivo intravaginal de progesterona (DIP) (0,75 gramas de progesterona) no primeiro e no oitavo dia, respectivamente; aplicação de prostaglandina (PGF2&#61537;) no oitavo dia; e exceto no protocolo 1, foi utilizado benzoato de estradiol (BE) no dia 1. As outras diferenças no esquema dos protocolos foram: protocolo 1 dia 1 e dia 8 (GnRH); protocolo 2 Dia 6 (PGF2&#61537;), dia 8 (PGF2&#61537;&#61472;&#61483;&#61472;cipionato de estradiol (CE)); protocolo 3 dia 8 (eCG + CE); protocolo 4 dia 8 (eCG + BE); protocolo 5 dia 8 (eCG), dia 9 (BE); protocolo 6 dia 9 (BE). Em geral, 93,3 % (84/90) de vacas responderam ao protocolo de sincronização. Entretanto, foi observado que 28,9 % das vacas (26/90) não apresentaram sincronização eficiente de uma nova onda folicular, constatado pelo número de vacas que não desenvolveram folículo dominante (5/26), as vacas que ovularam precocemente (15/26), e as vacas que tiveram um folículo dominante que estava em processo de regressão (6/26). Não houve diferença estatística no crescimento e diâmetro do folículo pré-ovulatório entre os protocolos. Não houve efeito, entre os protocolos, na concentração no fluido folicular de progesterona, LH, insulina, cortisol, bem como na concentração sérica de cortisol e insulina. Contudo, no protocolo 2, foi verificada menor concentração sérica (P < 0,05) de progesterona na retirada do DIP. Foram recuperados 27 ovócitos, que foram classificados de acordo com a qualidade em 1 (n=12), 2 (n=6), 3 (n=7) e 4 (n=2). A antecipação na aplicação de vprostaglandina, em dois dias da retirada do DIP, resulta em menor concentração de progesterona circulante.

Os mecanismos envolvidos na etiopatogênese da infertilidade em pacientes com endometriose não foram totalmente elucidados. A infertilidade apresentada por pacientes com as formas moderada e grave (estadios III e IV, respectivamente) seria, parcialmente, decorrente de alterações anatômicas pélvicas associadas à endometriose. Entretanto, há evidências de que lesões sutis ou implantes endometrióticos em estágios iniciais (estágio mínimo e leve) também poderiam contribuir com a etiopatogênese da infertilidade. Uma pior qualidade oocitária pode estar envolvida nas menores taxas de implantação após fertilização in vitro encontradas nessas pacientes. Questionamos a possibilidade de haver alterações no microambiente folicular de pacientes inférteis com endometriose, as quais poderiam afetar a aquisição de competência oocitária e, consequentemente, comprometer a fertilidade natural e os resultados dos tratamentos de reprodução assistida em mulheres com esta doença. Sabe-se que, para ser competente e poder ser fertilizado, o oócito precisa estar maduro e ter um fuso morfologicamente funcional, que garanta a fidelidade da segregação cromossômica durante a meiose. Dessa forma, o objetivo deste estudo foi avaliar o potencial impacto de diferentes concentrações de fluido folicular (FF) de mulheres inférteis com e sem endometriose leve sobre a integridade do fuso, alinhamento cromossômico e organização dos microfilamentos de actina de oócitos bovinos maturados in vitro. Realizou-se um estudo experimental, onde amostras de fluido follicular foram consecutivamente obtidas de 22 pacientes inférteis (11 com endometriose leve e 11 com infertilidade por fator tubário e/ou masculino) submetidas à estimulação ovariana para injeção intracitoplasmática de espermatozóide. Oócitos bovinos imaturos foram submetidos à maturação in vitro (MIV) sem adição de fluido follicular (sem fluido) e com 4 concentrações (1%, 5%, 10%, e 15%) de duas amostras de fluido folicular (uma de paciente com endometriose e outra de paciente sem endometriose). Foram realizadas 11 MIVs e cada amostra de fluido follicular foi usada apenas uma vez. Os oócitos foram fixados, marcados por imunofluorescência para visualização morfológica de microtúbulos, cromatina e microfilamentos de actina e, então, analisados por microscopia confocal. A porcentagem de anormalidade de oócitos em MII (fuso normal e cromossomos desalinhados, fuso anormal e cromossomos desalinhados, fuso anormal e cromossomos alinhados) foi significativamente maior naqueles maturados com FF de pacientes com endometriose (1%: 55,56%, 5%: 63,26%, 10%: 54,54%, 15%: 48,84%) quando comparados com oócitos maturados com FF de pacientes controles (1%: 19,15%, 5%: 23,44%, 10%: 25%, 15%: 23,81%) e oócitos maturados sem fluido (23,53%), sem haver diferença entre as concentrações testadas em cada grupo. Pode-se concluir que oócitos bovinos maturados in vitro na presença de FF de mulheres inférteis com endometriose leve têm maior freqüência de anormalidade meiótica. Estes dados sugerem que o FF de mulheres com endometriose pode comprometer a qualidade oocitária por promover danos ao fuso e/ou cromossomos / The mechanisms involved in the etiopathogenesis of infertility in patients with endometriosis have not been fully elucidated. The infertility presented by patients with moderate and severe disease (stages III and IV, respectively) would be partly due to anatomical pelvic changes associated with endometriosis. However, there are evidences that subtle lesions or endometriosis implants in the early stages (stages I and II) might also contribute to the etiophatogenesis of infertility. Impaired oocyte quality may be involved in lower implantation rates after in vitro fertilization in these patients. We question if alterations in the follicular microenvironment of infertile patients with endometriosis might affect oocyte competence acquisition and compromise the natural fertility and assisted reproduction treatment outcomes in women with this disease. It is known that to be competent and capable of fertilizing, the oocyte must be mature and have a morphologically functional spindle, which ensure the fidelity of chromosome segregation during meiosis. Thus, the aim of this study was to evaluate the potential impact of different concentrations of follicular fluid (FF) of infertile women with and without mild endometriosis on spindle integrity, chromosomes alignment and actin microfilaments organization of bovine oocytes in vitro matured. We performed an experimental study, where FF samples were consecutively obtained from 22 infertile patients (11 with mild endometriosis and 11 with tubal or male factors of infertility) submitted to ovarian stimulation for intracytoplasmic sperm injection. Immature bovine oocytes were submitted to in vitro maturation (IVM) without FF and with 4 concentrations (1%, 5%, 10%, and 15%) of 2 samples of FF (1 from a woman with endometriosis and one from a woman without endometriosis). We performed 11 IVM and each FF sample was used only once. The oocytes were then fixed, stained by immunofluorescence for morphological visualization of microtubules, chromatin and actin microfilaments, and then, analyzed by confocal microscopy. The percentage of abnormal MII oocytes was significantly higher for those matured with FF from patients with endometriosis (1%: 55.56%, 5%: 63.26%, 10%: 54.54%, 15%: 48.84%) when compared with oocytes matured with FF from patients without endometriosis (1%: 19.15%, 5%: 23.44%, 10%: 25%, 15%: 23.81%) and those matured without FF (23.53%), with no differences among the tested concentrations in each group. We can conclude that bovine oocytes matured in vitro in the presence of FF from infertile women with mild endometriosis have higher frequency of meiotic abnormalities. These data suggest that FF from women with endometriosis may compromise oocyte quality by promoting spindle and/or chromosomal damage

Adipositas und das polyzystische Ovarsyndrom (PCOS) sind häufig Gründe für Anovulation, Infertilität und unerfüllten Kinderwunsch. Sowohl Adipositas als auch das PCOS können zu einem Ungleichgewicht zwischen Anti- und Prooxidanzien im menschlichen Körper führen. Durch Übergewicht der Prooxidanzien ensteht oxidativer Stress. Reaktive Sauerstoffspezies (reactive oxygen species, ROS) fallen vermehrt an und oxidieren Lipoproteine zu „oxidized low density lipoproteins“ (oxLDL). Durch Bindung von oxLDL an den „lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor-1 (LOX-1)“ wird Apoptose und Autophagie induziert. Wir vermuten, dass sich diese Prozesse auch in der Follikelflüssigkeit (FF), dem Milieu der Eizelle, abspielen und zum Absterben reifender Follikel und somit zur Anovulation und Infertilität führen. Das Ziel dieser Arbeit war es, zu untersuchen, welchen Einfluss Adipositas, hormonelle Stimulation und PCOS auf die enzymatischen Antioxidanzien Superoxiddismutase (SOD), Katalase, Glutathionperoxidase (GPx) und Glutathionreduktase (GR) sowie auf den oxLDL-Spiegel haben. Es wurden Serum und FF von Frauen unter IVF (in vitro Fertilisation) -Therapie untersucht, die anhand ihres Body Mass Index (BMI), des Taille-Hüft-Quotienten (T/H-Quotient) sowie des PCOS in vier Gruppen eingeteilt wurden. Die Konzentration an oxLDL als Repräsentant des oxidativen Systems und die Aktivität der Enzyme SOD, Katalase, GPx und GR, Repräsentaten des antioxidativen Systems, wurden im Serum vor Stimulationsbeginn und zum Zeitpunkt der Follikelpunktion sowie in der FF gemessen. Adipöse Frauen mit und ohne PCOS hatten höhere Konzentrationen an oxLDL in der FF als normalgewichtige. Die oxLDL-Konzentrationen der FF waren 1000-fach niedriger als die der Seren. Interessanterweise waren auch die Katalase-Aktivitäten in der FF adipöser Frauen mit und ohne PCOS höher als die der normalgewichtigen. Zusammenfassend lässt sich folgern, dass erhöhte oxLDL-Konzentrationen in der FF von adipösen Frauen, unabhängig vom Vorliegen eines PCOS, mit einer gesteigerten Katalase-Aktivität und einer niedrigeren IVF-Erfolgsrate assoziiert sind.:Inhaltsverzeichnis Bibliographie III Abkürzungsverzeichnis IV 1. Einleitung 1 1.1. Infertilität 1 1.2. PCOS 2 1.2.1. Definition des PCOS 2 1.2.2. PCOS und Adipositas 3 1.3. Oxidativer Stress 4 1.3.1. Reaktive Sauerstoffspezies 4 1.3.2. Superoxiddismutase (SOD) – Schutz vor Superoxidradikalen 5 1.3.3. Katalase – Schutz vor H2O2 5 1.3.4. Glutathionperoxidase (GPx) und Glutathionreduktase (GR) 5 1.4. Oxidativer Stress, „oxidized low density lipoprotein“(oxLDL) und 6 Adipositas 1.5. Oxidativer Stress, antioxidative Enzyme und Infertilität 7 1.6. Ziele der Arbeit 9 2. Material und Methoden 10 2.1. Patientinnen und Material 10 2.2. Methoden 12 2.2.1. Follikelspektrumanalyse – Kontamination mit Blutbestandteilen 12 2.2.2. Proteinbestimmung 12 2.2.3. Bestimmung der SOD-Aktivität 13 2.2.4. Bestimmung der Katalase-Aktivität 14 2.2.5. Bestimmung der GPx-Aktivität 15 2.2.6. Bestimmung der GR-Aktivität 16 2.2.7. Bestimmung der oxLDL-Konzentration mittels ELISA 17 2.3. Statistische Auswertung 18 3. Ergebnisse 19 3.1. Vergleich der Proteinkonzentrationen in Seren und FF 19 3.2. Erhöhte SOD-Aktivität in der FF im Vergleich zum Serum 20 3.3. Erhöhte Katalase-Aktivität bei Adipositas unabhängig vom PCOS-Status 21 3.4. Erhöhte GPx-Aktivität bei adipösen Patientinnen ohne PCOS 22 3.5. Erhöhte GR-Aktivität bei Adipositas unabhängig vom PCOS-Status 23 3.6. Erhöhte oxLDL-Konzentrationen in der FF adipöser Patientinnen 25 unabhängig vom PCOS-Status 3.7. Schwangerschaftsrate der vier Patientengruppen 26 4. Diskussion 28 4.1. Das oxidative System 28 4.1.1. LOX-1 und oxLDL – Stand der Forschung 28 4.1.2. OxLDL – Diskussion der Methode 29 4.1.3. OxLDL – Konzentration im Serum 30 4.1.4. Einfluss der hormonellen Stimulationstherapie auf oxLDL 31 4.1.5. OxLDL – Konzentration in der FF 32 4.1.6. Oxidativer Status - Zusammenfassung 34 4.2. Das antioxidative System 34 4.2.1. SOD-Aktivität im Serum 35 4.2.2. SOD-Aktivität in der FF 35 4.2.2. Katalase, ein klinischer Parameter zur Bestimmung des 36 oxidativen Stress? 4.2.3. Zelltod als Ursache für erhöhte Enzymaktivitäten bei Adipositas? 36 4.2.5. Grenzen der Studie 37 4.3. Schlussfolgerung und Ausblick 38 5. Zusammenfassung 40 6. Literaturverzeichnis 44 7. Anhang 59 7.1. Tabellenverzeichnis 59 7.2. Abbildungsverzeichnis 59 7.3. Eidesstattliche Versicherung 60 7.4. Werdegang 61 7.5. Danksagung 63

No presente estudo avaliamos o impacto da adição de fluido folicular (FF) de mulheres inférteis sem e com endometriose em estágios iniciais (I/II) e avançados [(III/IV) sem e com endometrioma] ao meio de maturação in vitro (MIV) sobre as taxas de normalidade meiótica de oócitos bovinos. Avaliamos se a L-carnitina (LC) e os ácidos graxos ômega-3 [n3, ácidos docosahexaenóico (DHA) e eicosapentaenoico (EPA)] são capazes de prevenir os danos meióticos em oócitos bovinos induzidos por FF de mulheres inférteis com endometriose I/II e III/IV durante a MIV. Para isso, realizamos um estudo experimental utilizando modelo bovino. Trinta e duas amostras de FF foram colhidas de 24 mulheres inférteis com endometriose (8 com I/II, 8 com III/IV sem endometrioma e 8 III/IV com endometrioma no ciclo) e 8 sem endometriose (controle) que foram submetidas à estimulação ovariana controlada para realização de injeção intracitoplasmática de espermatozoide. Complexos cumulus-oócitos (CCOs) imaturos de bovinos foram submetidos à MIV divididos em 9 grupos: sem FF (sem-FF), com 1% de FF de mulheres inférteis sem endometriose (FFControle) e com endometriose (FFEI/II, FFEIII/IV e FFEendometrioma) suplementados ou não com LC (0,6mg/mL) e ácidos graxos ômega-3 (0,4 nM de DHA e 0,6 nM de EPA) (FFControle+LC+n3, FFEI/II+LC+n3, FFEIII/IV+LC+n3 e FFEendometrioma+LC+n3). Após 22-24h de MIV, os oócitos foram denudados, fixados e armazenados para realização de imunofluorescência para visualização do fuso meiótico e cromossomos por microscopia confocal. As taxas de metáfase II (MII) e de MII normais foram comparadas entre os 9 grupos utilizando o teste do qui-quadrado (p<0,05). Um total de 1686 CCOs imaturos foram submetidos à MIV, e 1401 oócitos foram visualizados por microscopia confocal. A adição de FF de mulheres com endometriose ao meio de MIV reduziu a taxa de MII normais (FFEI/II: 62,2%, FFEIII/IV: 70,2% e FFEendometrioma: 72,7%) comparado aos grupos sem-FF (87,2%) e FFControle (87,2%). O grupo FFEendometrioma (69,3%) apresentou a menor taxa de MII comparado a todos os demais grupos (sem-FF: 91,9%, FFControle: 89,2%, FFControle+LC+n3: 89,2%, FFEI/II: 85,4%, FFEI/II+LC+n3: 85,3%, FFEIII/IV: 80,7%, FFEIII/IV+LC+n3: 90,8%, FFEndometrioma+LC+n3: 86,4%). O grupo FFEIII/IV apresentou menor taxa de MII comparado ao grupo sem-FF. No grupo com FFControle, a adição de LC+n3 não alterou as taxas de MII (89,2% vs 89,2) e de MII normais (87,2% vs 82,5%). No grupo FFEI/II, a adição de LC+n3 aumentou a taxa de MII normais (84,5% vs. 62,2%). No grupo FFEIII/IV a adição de LC+n3 aumentou a taxa de MII normais (70,2% vs 84,1%) e de MII (90,8%), que passou a ser semelhante a dos grupos sem-FF e FFControle. No grupo FFEendometrioma a adição de LC+n3 aumentou a taxa de MII normais (86,4%), comparado ao grupo FFEendometrioma (69,3%), a qual foi similar a dos grupos sem-FF e FFControle. Portanto, o FF de mulheres com endometriose prejudica o fuso meiótico e o alinhamento cromossômico de oócitos bovinos, independentemente, do estágio da doença. Entretanto, o avanço da endometriose e a presença de endometrioma parecem ter um impacto ainda mais negativo na qualidade oocitária, prejudicando também a maturação nuclear. A adição de LC+n3 previne os danos meióticos oocitários provocados pelo FF de mulheres com endometriose em estágios iniciais e avançados. Dessa forma, sugerimos que inflamação, o estresse oxidativo e a desregulação da ?-oxidação são fatores envolvidos na alteração da qualidade oocitária e, consequente, piora da fertilidade natural de mulheres com endometriose. / In the present study, we evaluated the impact of the addition of follicular fluid (FF) from infertile women without and with endometriosis in the early (I/II) and advanced stages [(III/IV) with and without endometrioma] to the in vitro maturation (IVM) medium on the meiotic normality rates of bovine oocytes. We evaluated whether L-carnitine (LC) and omega-3 fatty acids [n3, docosahexaenoic (DHA) and eicosapentaenoic acid (EPA)] were able to prevent bovine meiotic oocyte damage induced by FF from infertile women with endometriosis in stages I/II and III/IV during IVM. For this, we performed an experimental study using bovine model. Thirty-two FF samples were collected from 24 infertile women with endometriosis (8 with I/II, 8 with III/IV without endometrioma and 8 III/IV with endometrioma in the cycle) and 8 without endometriosis (control) who underwent to controlled ovarian stimulation for intracytoplasmic sperm injection. Immature cumulus oocytes complexes(COCs) of bovines were submitted to IVM divided into 9 groups: without FF (No-FF), with 1% FF of infertile women without endometriosis (FFControl) and with endometriosis (FFEI/II, FFEIII/IV and FFEendometrioma) supplemented or not with LC (0.6 mg/mL) and omega-3 fatty acids (0.4 nM DHA and 0.6 nM EPA) (FFControl+LC+n3, FFEI/II+LC+n3, FFEIII/IV+LC+n3 and FFEendometrioma+LC+n3). After 22-24h of IVM, the oocytes were denuded, fixed and stored for subsequent immunofluorescence to visualize the meiotic spindle and chromosomes by confocal microscopy. The metaphase II (MII) and normal MII rates were compared between the 9 groups using the chi-square test (p <0.05). A total of 1686 immature COCs were submitted to IVM, and 1401 oocytes were visualized by confocal microscopy. Addition of FF from women with endometriosis to the IVM medium decreased the rate of normal MII (FFEI/II: 62.2%, FFEIII/IV: 70.2% and FFEendometrioma: 72.7%) compared to the No-FF (87.2%) and FFControl (87.2%) groups. The FFEendometrioma group (69.3%) presented the lowest rate of MII compared to all other groups (No-FF: 91.9%, FFControl: 89.2%, FFControl+LC+n3: 89.2%, FFEI/II: 85.4%, FFEI/II+LC+n3: 85.3%, FFEIII/IV: 80.7%, FFEIII/IV+LC+n3: 90.8%, FFEndometrioma+LC+n3: 86.4%). The FFEIII/IV group had a lower MII rate compared to the No-FF group. In the group with FFControl, the addition of LC+n3 did not change the rates of MII (89.2% vs 89.2%) and normal MII (87.2% vs 82.5%). In the FFEI/II group, the addition of LC+n3 increased the normal MII rate (84.5% vs 62.2%). In the FFEIII/IV group, the addition of LC+n3 increased the normal MII rate (70.2% vs 84.1%) and MII (90.8%), which was similar to that of the No-FF and FFControl. In the FFEendometrioma group, the addition of LC+n3 increased the normal MII rate (69.3% vs 86.4%) which was similar to No-FF and FFControl groups. Therefore, the FF of women with endometriosis impairs the meiotic spindle and the chromosomal alignment of bovine oocytes, regardless of the stage of the disease. However, the progression of endometriosis and the presence of endometrioma appear to have an even more negative impact on oocyte quality, and also impairs nuclear maturation. The addition of LC+n3 prevents meiotic oocyte damages induced by FF from women with endometriosis in the early and advanced stages. Thus, we suggest that inflammation, oxidative stress and deregulation of ?-oxidation are factors involved in the alteration of oocyte quality and, consequently, worsening of the natural fertility of women with endometriosis.