Die Dissertation befasste sich mit der Entwicklung einer neuen diagnostischen Methode für in-situ-Gewebeuntersuchungen. Der Ansatzpunkt war die Untersuchung von pathologischen Veränderungen im Gewebe, die sich biochemisch in den Zellen widerspiegeln und deshalb mit schwingungsspektroskopischen Methoden, wie der IR-Spektroskopie, erfassbar sind. Das Ziel der Arbeit war die IR-spektroskopische Charakterisierung und Klassifizierung von benignen, präkanzerösen und malignen Geweben mittels chemometrischer Algorithmen auf der Basis multivariater Informationen der IR-Spektren. Um komplexe spektrale Veränderungen zu charakterisieren und die Ergebnisse statistisch abzusichern, ist für jeden Gewebetyp eine Vielzahl an Spektren erforderlich. Daher wurde zur Spektrenakkumulation das IR-mikrospektroskopische Imaging mittels Focal Plane Array Detektor (FPA) genutzt. Die Herausforderung liegt in der Datenanalyse. Der große Datenumfang macht die Anwendung multivariater Algorithmen notwendig. Angewendet wurden Clusteralgorithmen zur Spektrendifferenzierung und die SIMCA (Soft Independent Modelling of Class Analogies) zur Spektrenklassifizierung. Die Validierung der Ergebnisse erfolgt über die histologische Untersuchung der nach der spektroskopischen Messung gefärbten Gewebedünnschnitte. Die genaue Vorgehensweise bei der Auswertung wird in dieser Arbeit anhand humaner Gewebeproben dargestellt. Die untersuchten Plattenepithelkarzinome und Adenokarzinome gehören zu den epithelialen Tumoren, die oralen bzw. zervikalen Ursprungs sind. Die Übertragbarkeit der spektralen Modelle wurde mit Gewebeproben mehrerer Patienten innerhalb einer und zwischen verschiedenen Tumorarten untersucht. Das ist ein erster Schritt zum Einsatz spektroskopischer Methoden in der medizinischen Forschung und Diagnostik.

Die Zellmembran dient der Zelle nicht nur als äußere Hülle, sondern ist auch an einer Vielzahl von lebenswichtigen Prozessen wie Signaltransduktion oder Zelladhäsion beteiligt. Wasser als integraler Bestandteil von Zellen und der extrazellulären Matrix hat sowohl einen großen Einfluss auf die Struktur von Biomolekülen, als auch selbst besondere Merkmale in eingschränkter Geometrie. Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei Effekte an Modellmembranen untersucht: Erstens der Einfluss des Gegenions an kationischen Lipiden (DODAX, X = F, Cl, Br, I) auf die Eigenschaften des Grenzflächenwassers und zweitens das Vermögen durch Viskositätsänderungen das Wachstum von Nervenzellen anzuregen sowie die einzelnen Stadien der Bildung von neuronalen Netzwerken und deren Optimierung zu charakterisieren. Lipidmultischichten und darin adsorbiertes Grenzflächenwasser wurden mittels Infrarotspektroskopie mit abgeschwächter Totalreflexion untersucht. Nach Charakterisierung von Phasenverhalten und Wasserkapazität der Lipide wurden die Eigenschaften des Wassers durch kontrollierte Hydratisierung bei einem Wassergehalt von einem Wassermolekül pro Lipid verglichen. Durch die geringe Wasserkapazität können in diesem besonderen System direkte Wechselwirkungen zwischen Lipiden und Wasser aus der ersten Hydratationsschale beobachtet werden. Bemerkenswert strukturierte OH-Streckschwingungsbanden in Abhängigkeit des Anions und niedrige IR-Ordnungsparameter zeigen, dass stark geordnete, in ihrer Mobilität eingeschränkte Wassermoleküle an DODAX in verschiedenen Populationen mit unterschiedlich starken Wasserstoffbrückenbindungen existieren und sich vermutlich in kleinen Clustern anordnen. Die zweite Fragestellung hatte zum Ziel, das Wachstum von Nervenzellen auf Membranen zu beleuchten. Auf der Ebene einzelner Zellen wurde untersucht, ob sich in Analogie zu den bisher verwendeten elastischen Substraten, die Viskosität von Membranen als neuartiger physikalischer Stimulus dafür eignet, das mechanosensitive Verhalten von Neuronen zu modulieren. Das Wachstum der Neuronen wurde auf substrat- und polymergestützten Lipiddoppelschichten mittels Phasenkontrastmikroskopie beobachtet. Die Quantifizierung der Neuritenlängen, -auswuchsgeschwindigkeiten und -verzweigungen zeigten kaum signifikante Unterschiede. Diffusionsmessungen (FRAP) ergaben, dass entgegen der Erwartungen, die Substrate sehr ähnliche Fluiditäten aufweisen. Die Betrachtung der zeitlichen Entwicklung des kollektiven Neuronenwachstums, also der Bildung von komplexen Netzwerken, offenbarte robuste „Kleine-Welt“-Eigenschaften und darüber hinaus unterschiedliche Stadien. Diese wurden durch graphentheoretische Analyse beschrieben, um anhand typischer Größen wie dem Clusterkoeffizienten und der kürzesten Pfadlänge zu zeigen, wie sich die Neuronen in einem frühen Stadium vernetzen, im Verlauf eine maximale Komplexität erreichen und letztlich das Netzwerk durch effiziente Umstrukturierung hinsichtlich kurzer Pfadlängen optimiert wird.

Rhodopsin-Guanylyl-Zyklasen (RGCs) gehören zur Familie der Enzymrhodopsine, welche sich durch eine Lichtregulation ihrer Enzymaktivität durch ein Rhodopsin (Rh) auszeichnen. Das membranständige Rh ist hierbei mit einer Guanylylzyklase (GC) verbunden, welches nach Lichtaktivierung des Rh GTP zu zyklisiertem GMP (cGMP) umsetzt. Der sekundäre Botenstoff cGMP sowie das verwandte cAMP spielen eine wichtige Rolle in einer Vielzahl von biologischen Prozessen. Die lichtgesteuerte Kontrolle dieser Botenstoffe bietet der Optogenetik somit eine Möglichkeit zur Erforschung ihrer Signalwege und könnte so den Weg zu medizinisch nutzbaren Erkenntnissen weisen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine RGC, gefunden im Genom des Pilzes Catenaria anguillulae aus der Abteilung der Blastocladiomycota, spektroskopisch untersucht. Zu diesem Zweck wurde ein FTIR- und UV-Vis-spektroskopischer Messaufbau entwickelt, der eine parallele Aufzeichnung von UV-Vis- und FTIR-Spektren an derselben Proteinprobe erlaubt. Neben konventionellen Belichtungsmethoden, wurde ein durchstimmbarer Hochleistungspulslaser integriert, welcher den praktisch simultanen Umsatz der Proteinprobe erlaubt. Um auch früheste Prozesse spektroskopisch zu erfassen, wurde zusätzlich ein Hochdruck-Heliumkryostat integriert, der Messungen bis unterhalb des Siedepunkts von Helium ermöglicht (bis ~3 K). Nach der UV-Vis- und FTIR-spektroskopischen Charakterisierung der Photointermediate konnte ein Modell des Photozyklus abgeleitet werden, während Messungen an trunkierten Varianten eine aktive Rolle des N-Terminus in der Enzymregulation aufzeigten. Unter Verwendung eines photolabilen und nichtumsetzbaren GTP-Substrats konnte die Aktivität von RGC und freiem GC in Echtzeit spektroskopisch untersucht werden. Neben der Identifizierung des aktiven Zustands wurde entgegen bisheriger Annahmen gezeigt, dass GTP schon vor Lichtaktivierung an RGC bindet. Die Lichtregulation erfolgt demnach direkt über Modifikationen in der Bindetasche und nicht deren Zugänglichkeit. Ein Aktivierungsmechanismus wurde skizziert, der sowohl die hier vorgelegten Ergebnisse, als auch Ergebnisse vorhergehender Untersuchungen kombiniert. / Rhodopsin guanylyl cyclases (RGCs) belong to the family of enzymerhodopsins, which are characterized by light regulation of their enzyme activity by a rhodopsin (Rh). The embrane-bound Rh is linked to a type III guanylyl cyclase (GC). Upon light activation of Rh, inhibition of GC is abolished and conversion of GTP to cyclic GMP (cGMP) is initiated. The secondary messengers cGMP and the closely related cAMP play important roles in a variety of biological processes. Hence, light-controlled regulation of these messengers provides an opportunity to investigate their signaling pathways using optogenetics and could pave the way for medically useful findings. In this work, a RGC found in the genome of the fungus Catenaria anguillulae from the division of Blastocladiomycota was spectroscopically investigated. For this purpose, an FTIR and UV-Vis spectroscopic measurement setup was developed which supports parallel recording of UV-Vis and FTIR spectra of the same protein sample. In addition to conventional illumination methods, a tunable high-power pulse laser was integrated which allows virtually simultaneous turnover of the protein sample due to its pulse duration in the nanosecond and power in the megawatt range. To investigate the earliest molecular processes a high-pressure helium cryostat was integrated which allows measurements down to below the boiling point of helium (~3 K). Based upon the UV-Vis and FTIR spectroscopic characterization of the photointermediates, a model of the photocycle was derived, while experiments on truncated variants revealed an active role of the N-terminus in enzyme regulation. Using a photolabile and non-convertible GTP substrate, the activity of RGC and free GC could be investigated spectroscopically in real time. In addition to identifying the active state, it was shown, contrary to previous assumptions, that GTP binds to RGC even before light activation. Thus, light regulation occurs directly via modifications in the binding pocket rather than its accessibility. An activation mechanism was outlined that combines both the results presented here and results of previous studies.

In der vorliegenden Arbeit wurde der lichtinduzierte Reaktionszyklus des bakteriellen Phytochroms Agp2 aus Agrobacterium tumefaciens mit FTIR‑ und UV‑Vis‑Spektroskopie untersucht. Der Photorezeptor besteht aus einem photosensorischen Modul und einer signalgebenden Histidin-Kinase-Domäne. Das photosensorische Modul bindet das Tetrapyrrol Biliverdin als Chromophor. Der Grundzustand von Agp2 (Pfr, 750 nm) ist gegenüber dem lichtaktivierten Zustand (Pr, 700 nm) rotverschoben, weshalb Agp2 den Bathyphytochromen zugeordnet wird. Die Untersuchungen erfolgten unter Verwendung von Isotopenmarkierung, H/D-Austauschexperimenten und ortsspezifischer Mutagenese. Daraus ließen sich folgende molekulare Änderungen charakterisieren, welche im Reaktionszyklus von Agp2 erfolgen: Die lichtinduzierte Isomerisierung des Chromophors führt zu einem Übergang vom Pfr- in den Pr-Zustand, wobei zwei Intermediate, Lumi‑F und Meta‑F, durchlaufen werden. Neben der Konformationsänderung des Chromophor‑D‑Rings ist auch die C‑Ring-Propionsäureseitenkette an der Photoreaktion beteiligt. Die C-Ring-Propionsäureseitenkette ist im Pfr-Zustand protoniert und wird im Übergang von Meta-F zu Pr deprotoniert. Der Pr-Zustand weist eine pH-Abhängigkeit auf, welche auf die pH-abhängige Ladung des Histidins 278 der Chromophortasche zurückzuführen ist. Je nach Ladung des Histidins 278 wird die Keto‑ bzw. Enolform der C(19)=O‑Gruppe des D‑Rings stabilisiert. Die Keto/Enol-Tautomerie ist auf eine innerhalb des Chromophors erfolgende Protontranslokation zurückzuführen und moduliert die Relaxation in den Pfr-Zustand. Änderungen der Amid-I-Absorption im Pfr-Pr-Übergang werden der Umstrukturierung der Tongue-Region des photosensorischen Moduls von einer Alpha-helikalen zu einer Beta‑Faltblatt-Struktur zugeordnet. Diese Strukturänderung wird als möglicher Weg der proteininternen Signaltransduktion zwischen photosensorischem und signalgebendem Modul vorgeschlagen. / In this thesis the light-induced reaction cycle of the bacterial phytochrome Agp2 from Agrobacterium tumefaciens was investigated using FTIR and UV‑vis spectroscopy. The photoreceptor comprises a photosensitive module and a signalling histidine kinase domain. The photosensitive module binds the biliverdin tetrapyrrol as chromophore. The Agp2 ground state (Pfr, 750 nm) is red-shifted in comparison with its light-activated state (Pr, 700 nm). Therefore, Agp2 is assigned to the group of bathy phytochromes. The investigations were conducted using isotopically labelled protein, labelled chromophore as well as hydrogen‑deuterium (H‑D) exchange and site-directed mutagenesis. Based on these the following molecular changes could be characterized that occur in the reaction cycle of Agp2: The light-induced isomerization of the chromophore leads to a transition from the Pfr to the Pr state, involving two intermediates, Lumi-F and Meta-F. Besides conformational changes of the chromophore D-ring, the C-ring propionic side chain is involved in the photoreaction as well. The C-ring propionic side chain is protonated in the Pfr state and gets deprotonated in the Meta-F to Pr transition. The Pr state exhibits pH‑dependent alterations which can be explained by pH dependent polarity changes of histidine 278 in the chromophore pocket. Depending on the charge of histidine, the D‑ring C(19)=O group is stabilized either in keto or enol form. The keto/enol tautomerism involves a proton translocation within the chromophore and modulates the relaxation to the Pfr state. The changes in the amide I region in the Pfr-Pr transition are associated with an alpha‑helix to beta‑sheet secondary structure change of the PHY domain tongue‑region. This structural change is proposed as the potential path of signal transduction between the photosensitive and the signalling module.

Die vorliegende Arbeit behandelt die elektrochemische Synthese (elektrochemische Polymerisation und Copolymerisation) und die Charakterisierung der Redox- und sensorischen Eigenschaften neuer funktionalisierter Polymere für die Ionensensorik. Die Funktionalisierung wird sowohl in der Polymer-Hauptkette (Polysalene) als auch in der Polymer-Seitenkette (ein Thiophen-Copolymer: 3-Methylthiophen/6-Hydroxy-2-(2-(3-thienyl)-ethoxy)-acetophenon) dargestellt. Die Redox-Prozesse der funktionalisierten Polymere wurden mit spektroelektrochemischen Methoden: ESR-, UV-Vis-NIR- und FTIR-Spektroelektrochemie charakterisiert. Durch diese Methoden konnten während der elektrochemischen Oxidation von funktionalisierten leitfähigen Polymeren verschiedene Polymer- bzw. Copolymer-Ladungsträger nachgewiesen werden: Polaronen, Bipolaronen beim Thiophen-Copolymer, zwei Polaronen auf einer Polymerkette im Singulettezustand beim Poly(3-methylthiophen) und eine diamagnetische Spin-Spin-Wechselwirkung zwischen ungepaarten Elektronen der Cu(II)-Ionen und der ungepaarten Elektronen von bisphenolischen Ligand-Kationradikalen beim Poly[Cu(II)-salen]. Sensorische Eigenschaften gegenüber Ni(II)-Ionen wurden durch Potentiometrie an einem Poly[Ni(II)-salen]-Derivat getestet. Es zeigt eine gute potentiometrische Ni(II)-Ionenselektivität (der Logarithmus des potentiometrischen Selektivitätskoeffizienten liegt im Bereich von -0.5 bis -1.5) in Anwesenheit von Cd(II), Mn(II), Zn(II) und Na(I).

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Die vorliegende Arbeit behandelt die elektrochemische Synthese (elektrochemische Polymerisation und Copolymerisation) und die Charakterisierung der Redox- und sensorischen Eigenschaften neuer funktionalisierter Polymere für die Ionensensorik. Die Funktionalisierung wird sowohl in der Polymer-Hauptkette (Polysalene) als auch in der Polymer-Seitenkette (ein Thiophen-Copolymer: 3-Methylthiophen/6-Hydroxy-2-(2-(3-thienyl)-ethoxy)-acetophenon) dargestellt. Die Redox-Prozesse der funktionalisierten Polymere wurden mit spektroelektrochemischen Methoden: ESR-, UV-Vis-NIR- und FTIR-Spektroelektrochemie charakterisiert. Durch diese Methoden konnten während der elektrochemischen Oxidation von funktionalisierten leitfähigen Polymeren verschiedene Polymer- bzw. Copolymer-Ladungsträger nachgewiesen werden: Polaronen, Bipolaronen beim Thiophen-Copolymer, zwei Polaronen auf einer Polymerkette im Singulettezustand beim Poly(3-methylthiophen) und eine diamagnetische Spin-Spin-Wechselwirkung zwischen ungepaarten Elektronen der Cu(II)-Ionen und der ungepaarten Elektronen von bisphenolischen Ligand-Kationradikalen beim Poly[Cu(II)-salen]. Sensorische Eigenschaften gegenüber Ni(II)-Ionen wurden durch Potentiometrie an einem Poly[Ni(II)-salen]-Derivat getestet. Es zeigt eine gute potentiometrische Ni(II)-Ionenselektivität (der Logarithmus des potentiometrischen Selektivitätskoeffizienten liegt im Bereich von -0.5 bis -1.5) in Anwesenheit von Cd(II), Mn(II), Zn(II) und Na(I).