Sporothrix shenckii, um fungo dimórfico, termo-dependente, é encontrado na natureza associado com matéria orgânica em decomposição, como, espinhos, folhas secas, madeira e também na água. Este fungo é o agente causador da esporotricose, que ocorre com maior freqüência em pessoas que trabalham com o solo e vegetais contaminados com os esporos do fungo, sendo considerada uma doença ocupacional. A contaminação acontece com a inoculação traumática do material contaminado e em alguns casos por inalação dos esporos. Quando infecta o organismo humano, bem como outros mamíferos ou quando cultivado a 37°C, passa para a forma de levedura. É comum em áreas de clima tropical e subtropical, com alta umidade. Apresenta distribuição mundial, sendo que, atualmente no Brasil, são relatados casos em São Paulo, Rio de Janeiro e no Rio Grande do Sul. No Rio de Janeiro, a esporotricose tem sido relatada como doença endêmica, onde o agente etiológico é transmitido de gatos para homens. A esporotricose apresenta caráter crônico, polimórfico e com formação granulamatosa. As formas clínicas e a patogênese dependem do sítio de inoculação do fungo e da resposta imunológica do hospedeiro. O mecanismo de defesa e suscetibilidade do organismo, bem como a disseminação da infecção por este fungo ainda não são totalmente conhecidos. O estado de saúde do paciente contribui diretamente para o estabelecimento da doença, sendo que, alcoolismo, diabete, imunidade comprometida e uso extensivo de drogas imunosupressoras são fatores que podem predispor à infecções severas. Neste trabalho estudamos in vitro a interação do S. schenckii com macrófagos murinos. Por meio de técnicas de fagocitose, ELISA, dosagem de óxido nítrico, viabilidade de leveduras, citometria de fluxo e RT-PCR foram realizados ensaios da atividade de macrófagos. Desta forma foram gerados alguns dados para o melhor entendimento da resposta de defesa nesta doença. Nos estudos realizados, concluímos que os anticorpos gerados nos camundongos pela infecção por S. schenckii foram capazes de induzir a fagocitose do fungo. Também, após a fagocitose das leveduras pelos macrófagos, incubados com laminarina ou manana, houve inibição significativa da produção de TNF-α, indicando que os receptores dectina-l e manose, respectivamente, estão relacionados à produção desta citocina. O soro, contendo os anticorpos do animal infectado, também induziu forte produção desta citocina, mostrando que a entrada do fungo via receptor Fc pode também induzir a produção dessa citocina. Verificamos ainda que a fagocitose de leveduras, pelos macrófagos, na presença de soro de camundongo infectado, induziu alta produção de IL-10. Quando analisamos a expressão de genes presentes nos macrófagos, observamos forte expressão de TLR-2 e MyD-88, na presença das leveduras. Já a expressão de iNOS pelos macrófagos, observamos que foi maior na presença do fungo somente quando as leveduras foram incubadas com o soro, após o período de 72 horas. Em seguida, ao dosar a produção de Óxido Nítrico (NO), verificamos no período de 3 dias de incubação, que houve redução significativa na concentração de NO produzida pelos macrófagos, quando estes foram incubados com o fungo. Porém, quando as leveduras foram opsonizadas pelo soro, houve aumento da produção de NO após 72 horas de incubação. Outra verificação importante foi que os macrófagos foram capazes de destruir as leveduras fagocitadas na presença de soro. / Sporothrix schenckii is a dimorfic fungus, term-dependent, find in nature associated with organic material at decomposition, like thorns, wheat leaves, wood and water. This is the fungi agent that causes sporothricosis, which happens with more frequency with people that work with land and green, contaminated with mold of fungus. That is why it is considered a occupational disease. The contamination happens with traumatic inoculation of material and some cases with inhalation of mold. When a human is infected, as well as other mammals or when cultivate at 37°C, it tums into the yeast form. Is common at tropical and moisture weather areas. Is found all around the world, and nowadays at Brazil, with cases related São Paulo, Rio de Janeiro and Rio Grande do Sul. At Rio de Janeiro, sporothricosis are related like endemic disease, where the etiologic agent is transmitted by cats to men. Sporothricosis is a chronic, polimorfic disease, and with form granulamatosa. The clinical type and the pathogenesis depend on the way of inoculation and the response of immunological system of the host. The defense and suscebility of the organism, as dissemination of infection with this fungi is not yet totally known. The patient\'s health state contributes directly to the disease, as much as alcoholism, diabetes and immunity deficiency and the extensive use of immunosuppressive drugs are factors that can bring to harder infection. Here, we studied in vitro the interaction of S. schenckii with murine macrophages. Using phagocytosis assay, ELISA, dosage of oxide nitric, CFU assay, flow citometry and RT-PCR were analysed activity of macrophages. We produced some results in order to better understand the response of defense with this disease. In the present study, we conclude that antibodies generated in mice by infection with S. schenckii were capable to promote phagocytosis of fungus. Also, when macrophages and yeast were incubated with laminarin or mannan, we had significant decrease in production of TNF-α, showing that receptors dectin-l and manose, respectively, are related with production this cytokine. The antibodies of mice infected with S. schenckii, also produced hard level this cytokine showing that entrance of fungus by receptor Fc can produce TNF- α. Besides, we verify that phagocitosys of yeast, with sera of infected mice, induct hard production of IL-10. When we analysed the expression of genes of macrophages, we observed hard expression of TLR-2 and MyD-88, when yeast were present. However, the expression of iNOS by macrophages, was more hard with yeast only when sera was present, before 72 hours. Similarly, when yeast were opsonized by sera, we had increase of production of NO after 72 hours of incubation. After, macrophage were capable to destruct yeast phagocyted when sera was present.

O sistema capitalista fundado na produção e consumo de bens em escala globalizada trouxe como resultado uma geração de resíduos sólidos urbanos incompatível com a sustentabilidade da vida na Terra. A reciclagem de resíduos sólidos urbanos tem sido uma maneira de minimizar os efeitos negativos desse processo. No Brasil, os catadores de material reciclável são atores reconhecidos social e economicamente como fundamentais para a efetivação da reciclagem. São poucos os estudos sobre a saúde dos catadores e os riscos à saúde a que estão expostos em sua rotina de trabalho. Este estudo buscou identificar possíveis riscos à saúde de catadores em ambientes de trabalho de três cooperativas de reciclagem da área metropolitana da cidade de São Paulo relacionados ao contato com poluição atmosférica na forma de fungos e metais tóxicos, que pudessem levar ao adoecimento a partir da exposição pela via respiratória ou por contato dérmico. Foram aplicados questionários semiestruturados em uma amostra de catadores em três cooperativas da área metropolitana de São Paulo, no intuito de produzir um perfil sociodemográfico desses sujeitos, bem como identificar possíveis exposições e morbidade referida. Foi realizada coleta do ar e de poeira depositada para avaliar a exposição ocupacional a fungos e metais nas cooperativas estudadas. As amostras foram retiradas em pontos fixos de diferentes ambientes de trabalho: balança, bobcat, sala de resíduos eletroeletrônicos, esteira de triagem, prensa, escritório, e refeitório. Como resultado o estudo identificou uma população na faixa etária dos 40 anos, com escolaridade de nível básico e maior participação de mulheres. As doenças mais referidas foram as relacionadas ao sistema respiratório e doenças crônicas não transmissíveis (DCNT). O estudo identificou valores de fungos, mínimos de 116 UFC/m3 monitorados no escritório e máximos de 751 UFC/m3 monitorado na esteira. Os fungos isolados, em ordem decrescente de frequência, foram: Aspergillus spp.(24,0 %); Penicillium spp. (23,0%); Fusarium spp. (21,0%); Cladosporium spp. (19,0%); Rhizopus spp. (11,0%), Nigrospora spp. (2,0 %); Mucor spp.(0,2%) e Fungos não esporulados (0,1%). Foram identificados baixos valores de metais tóxicos no ar (Al, Ba, Cd, Cr, Cu, Fe, Hg, Mn, Ni, Pb) e em material particulado depositado no solo (Al, As, Ag, Ba, Cd, Cr, Cu, Fe, Hg, Mn, Ni, Pb, Sn, Sr, Zn). Estes resultados indicam maior risco à saúde relacionada a presença de fungos no ar ambiente e com pequeno ou nenhum risco à saúde devido a presença de metais tóxicos no ambiente nas três cooperativas estudadas. Considera-se importante o monitoramento desse tipo de trabalho, considerando-se que a literatura internacional menciona risco de contaminação e a literatura nacional reconhece a fragilidade dos catadores de material reciclável em relação à saúde, dada sua situação de vulnerabilidade social / The capitalist system based on production and consumption of goods in global scale has brought a generation of municipal solid waste incompatible with the sustainability of life on Earth. The recycling of municipal solid waste has been a way to minimize the negative effects of this process. In Brazil, waste collectors are recognized as economic and social actors fundamental to the effectiveness of recycling. There are few studies on the health of waste collectors and the possible health risks present in their daily work routine. This study aimed to identify possible health risks for waste collectors in their work environment in three recycling cooperatives in the metropolitan area of São Paulo, related to atmospheric air pollution in the form of fungi and toxic metals, which could lead to illness from exposure through respiratory or dermal contact pathways. Semi-structured questionnaires were applied to waste collectors from three cooperatives in the metropolitan area of São Paulo, in order to produce a demographic profile of these subjects, and identify potential exposures and referred morbidity. Air and soil deposited dust samples were collected to evaluate occupational exposure to fungi and metals in the studied cooperatives. Samples were taken at fixed sites of different working environments: balance, bobcat, electronics waste room, treadmill, press, office and cafeteria. The study identified a population aged 40 years with basic level of education and greater participation of women. The most frequent diseases were related to the respiratory system and chronic noncommunicable diseases (NCDs). The study identified fungi values ranging from 116 CFU/m3 monitored in the office to 751 CFU/m3 monitored on the treadmill. The isolated fungi in descending order of frequency were: Aspergillus spp. (24.0%); Penicillium spp. (23.0%); Fusarium spp. (21.0%); Cladosporium spp. (19.0%); Rhizopus spp. (11.0%), Nigrospora spp. (2.0%); Mucor spp. (0.2%) and non-sporulating fungi (0.1%). Low levels of toxic metal were identified in the air (Al, Ba, Cd, Cr, Cu, Fe, Hg, Mn, Ni, Pb) and in the deposited particulate matter in the soil (Al, As, Ag, Ba, Cd, Cr , Cu, Fe, Hg, Mn, Ni, Pb, Sn, Sr, Zn). These results indicate a greater health risk related to fungi and small or no risk associated to the presence of toxic metals in the three cooperatives studied. It is important to monitor this type of work, considering that the international literature mentions potential risks of contamination and the national literature recognizes the fragility of waste collectors in relation to health, given their situation of social vulnerability

Os fungos entomopatogênicos, como Metarhizium anisopliae, têm despertado grande interesse como agentes no controle de insetos-pragas. Estas espécies de fungos são especializadas na secreção de um complexo enzimático constituído de proteases, lipases e quitinases, entre outras, estando relacionadas com patogenicidade e virulência. Neste contexto a foi analisada a secreção de quitinases pelos isolados IBCB 167, IBCB 360, IBCB 384 e IBCB 425 de M. anisopliae var. anisopliae, como identificado molecularmente. Contudo, alguns aspectos morfológicos analisados mostram pequenas diferenças entre estes isolados. Para produção de quitinases, os isolados foram cultivados em fermentação submersa na presença e ausência de indutores e em fermentação em estado sólido, tendo crisálida como substrato. A maior síntese de quitinase intracelular foi obtida para IBCB 425 no meio contendo extrato de levedura mais glicose (EG). Visando a produção da enzima extracelular e disponibilidade de fonte de carbono, o meio extrato de levedura mais crisálida (EC), sob agitação foi padronizado para fermentação submersa (FSbm). Os maiores níveis enzimáticos intracelulares para os isolados IBCB 167, IBCB 360, IBCB 384 e IBCB 425 foram obtidos entre 72 h e 216 h e para a forma extracelular entre 96h e 144h. A produção quitinásica em fermentação sólida (FSS) utilizando crisálida como fonte de carbono foi otimizada por delineamento composto central rotacional (DCCR, tendo como variáveis o tempo de crescimento e umidade. O melhor produtor de quitinase em FSS foi o isolado IBCB 360. A análise do secretoma mostrou um maior número de proteínas quando os isolados foram cultivados na presença do indutor, com destaque para o isolado IBCB 425. A maioria das proteínas secretadas pelos isolados IBCB 167 e IBCB 384, foram identificadas, estando entre elas a endo-N-acetyl--D-glucosaminidase, enzima do complexo quitinolítico. As quitinases produzidas pelos quatro isolados foram parcialmente purificadas em DEAE Celulose, obtendo-se dois picos de atividade quitinásica. O processo de purificação foi continuado para o IBCB 384 em coluna de exclusão molecular, obtendo se um único pico de atividade quitinásica, analisado por electrospray. A temperatura ótima de atividade para as quitinases produzida em FSS pelos isolados IBCB 167, IBCB 360, IBCB 384 e IBCB 425 variou de 50ºC a 60ºC e pH ótimo de atividade ficou na faixa de 5,0 - 5,5. As quitinases dos isolados mantiveram-se estáveis nas temperaturas de 30ºC e 40ºC e em uma ampla faixa de pH. Os sais BaCl2 e MnCl2 ativaram as quitinases dos isolados IBCB 167 e IBCB 425. Além disso, todas as quitinases foram tolerantes ao - mercaptoetanol. O comportamento cinético de todas as quitinases foi Michaeliano e a maior afinidade pelo substrato foi para a quitinase do isolado IBCB 360. Já os experimentos in vivo e in vitro mostraram que o isolado IBCB 425 foi melhor na fase pré-infecção e isolado IBCB 384 foi melhor na fase pós infecção, sendo o mais virulento. Portanto, os isolados M. anisopliae têm se mostrado como bons produtores de quitinases, com boa estabilidade a temperatura e pH além de outras características distintas que provavelmente estão relacionadas com o potencial de patogenicidade e virulência de cada isolado. / Entomopathogenic fungi such as Metarhizium anisopliae, have been attracting great interest as agents to control insect pests. These species of fungi are specialized in the secretion of an enzymatic complex consisting of proteases, lipases and chitinases, among others which are related to pathogenicity and virulence. In this context the secretion of chitinase by IBCB 167, IBCB 360, IBCB 384 and IBCB 425 isolated from M. anisopliae var. anisopliae molecularly identified, were analyzed. However, some structural features analyzed showed small differences among these isolates. For chitinase production, the isolates were grown in submerged culture in the presence and absence of inducers and under solid state fermentation with chrysalis as substrate. The enhanced synthesis of intracellular chitinase was obtained with IBCB 425 using yeast extract plus glucose (EG). Aiming to produce the extracellular enzyme and the carbon source available, the medium yeast extract and chrysalis (EC), was standardized to SbmF. The high intracellular enzymes levels produced by IBCB 167, IBCB 360, IBCB 384 and IBCB 425 isolates were obtained between 72 h and 216 h and for the extracellular form between 96h and 144h. The chitinase production in SSF using chrysalis as carbon source was optimized by CCRD, having the time of growth and moisture as variables. The best producer of chitinase in SSF was the isolated IBCB 360. The analysis of the secretome showed a great number of proteins when the isolates were grown in the presence of the inducer, especially for the isolated IBCB 425. Most of the proteins secreted by IBCB 167 and IBCB 384 isolates were identified. Among these proteins the endo-N-acetyl--D-glucosaminidase was identified, enzyme that participates in the chitinulitic complex. Chitinases produced by the isolates were partially purified on DEAE - cellulose, yielding two peaks of chitinase activity. The purification process was continued for IBCB 384 isolated using molecular exclusion chromatographic column, yielding only one peak of chitinase activity, analyzed by electrospray. The optimal temperature for the chitinase activity from IBCB 167, IBCB 360, IBCB 384 and IBCB 425 isolates obtained in SSF, ranged from 50 ºC to 60 ºC and the optimum pH of activity was 5.0 to 5.5. All chitinases were stable at 30 ºC and 40 ºC, and wide pH range. The BaCl2 and MnCl2 salts activated the chitinases of IBCB 167 and IBCB 425 isolates. In addition, all chitinases were mercaptoethanol tolerant. The kinetic behavior of all chitinases was Michaelian with the highest affinity to the substrate observed for the chitinase of isolated IBCB 360. The in vivo and in vitro experiments showed that isolated IBCB 425 was better in pre -infection phase and the isolated IBCB 384 was better in the post infection phase. Therefore, the M. anisopliae isolates were good producers of chitinases with interesting temperature and pH stability, and other different characteristics that are probably related to the potential pathogenicity and virulence of each isolate.

A antracnose, doença causada por fungos do gênero Colletotrichum, é uma das doenças mais importantes em muitas plantas cultivadas. Nas cucurbitáceas, como pepino, chuchu, melão e melancia, a antracnose é muito freqüente e causa prejuízos bastante elevados. O agente causal é o Colletotrichum lagenarium, que apresenta como sinonímias C. orbiculare e C. gloeosporioides f. sp. cucurbitae. O presente trabalho visa caracterizar cultural, morfológica e patogenicamente, e identificar molecularmente, os isolados de C. lagenarium, obtidos de plantas da família Cucurbitaceae. Os isolados foram obtidos através de isolamento de tecidos de plantas que apresentavam sintomas de antracnose. A caracterização cultural envolveu a avaliação do crescimento micelial, esporulação, coloração da colônia, topografia da colônia, formação de setores, presença e coloração de massa conidial. A caracterização morfológica compreendeu a avaliação das formas e dimensões dos conídios e apressórios. A caracterização patogênica envolveu a avaliação da virulência de todos os isolados em inoculações cruzadas com pepino, melão, melancia, abóbora e chuchu, além da avaliação do período de incubação, do período latente e do índice de crescimento da lesão. A identificação molecular compreendeu a análise de PCR, utilizando "primer" específico para C. lagenarium, para auxílio na identificação da espécie. Quanto à caracterização cultural, os isolados apresentaram uma variabilidade muito grande quanto à cor e topografia da colônia e formação de setores, contudo, quando analisada a coloração de massa micelial, nos isolados em que esta se fez presente, a coloração não apresentou grandes variações. Apesar da grande variação encontrada nos índices de crescimento micelial diário entre os isolados, não existiu grande variação para cada isolado quando se alterou o meio de cultivo. A esporulação não apresentou correlação com o crescimento micelial, e não constituiu um bom parâmetro para caracterização, devido à variação que apresentou tanto entre os isolados, quanto entre os meios de cultivo. Os conídios apresentaram formatos cilíndrico, clavado e levemente curvo, com dimensões variando de 2,25 a 6,38µm de largura e 5,34 a 15,73µm de comprimento. Os apressórios apresentaram os formatos globoso, clavado e lobado, com dimensões variando de 5,54 a 8,68µm de largura e 6,71 a 10,75µm de comprimento. Dos 25 isolados testados nas inoculações cruzadas, apenas 14 se apresentaram virulentos aos hospedeiros testados. Não foi encontrada correspondência entre a virulência do isolado e o hospedeiro, o local de coleta, suas características culturais ou morfológicas. Cada isolado apresentou um comportamento diferente perante os demais, quando se considerou a gama de hospedeiros a ele suscetíveis, e ao seu comportamento quanto aos períodos latente e de incubação, e ao índice de crescimento de lesão. O período de incubação variou de dois a sete dias, e período latente variou de três a nove dias. O índice de crescimento de lesão variou de 0,5 a 4,9mm/dia. Não foi observada correlação entre o período latente, o período de incubação e o índice de crescimento de lesão. Através da identificação molecular, cinco isolados puderam ser identificados pelo "primer" específico utilizado, contudo não foi encontrada correspondência entre a identificação molecular e as caracterizações cultural, morfológica e patogênica. / Anthracnose is one of the most important diseases of cucurbitaceous plants, causing severe damages to cucumber, chayote, melon, watermelon and pumpkin. The causal agent is Colletotrichum lagenarium (syn. C. orbiculare, C. gloeosporioides f. sp. cucurbitae). The objective of this work was to determine cultural, morphological and pathogenic characterization, and molecular identification of C. lagenarium, isolated from plants of the Cucurbitaceae family. The isolates used in this study were obtained through isolation from plants presenting symptoms of Anthracnose. The cultural characterization involved the evaluation of mycelial growth, sporulation, colony colour, colony topography, sectors formation, presence and colour of conidial mass. The shape and size of the conidia and apressoria were assessed to the morphological characterization. The pathogenic characterization involved the evaluation of the virulence of all isolates on cross inoculations with cucumber, melon, watermelon, pumpkin and chayote, evaluation of the incubation period, the latent period and the lesion growth. For the molecular identification PCR analysis was used, with specific "primer" for C. lagenarium, to assist the identification of the species. Colonies of all isolates presented great variability in color, topography, and sectors formation; however the color of the mycelial mass did not present great variations. Despite the great variation found in the daily micelial growth indices among the isolates, great variation for each one did not exist when the culture medium was changed. The sporulation did not present correlation with the micelial growth, showing a high variation among the isolates and the culture media. This later parameter was not useful for characterization. The conidia of the isolates were classified in the shapes cylindrical, clavate and slightly curved, with average dimensions varying from 2.25 to 6.38µm in width, and from 5.34 to 15.73µm in length. The apressoria had the shapes globose, clavate and lobed, with average dimensions varying from 5.54 to 8.68µm in width, and 6.71 to 10,75µm in length. From the 25 isolates tested in the cross inoculations, only 14 were virulent to the tested host plants. Correspondence was not found between the virulence of the isolates and de host plants origin, the local origin, and the cultural and morphological characteristics. Analyzing the variability of susceptible host plants, the inoculation and latent periods, and the lesion growth, each isolate showed a different behavior compared to the others. The incubation period varied from two to seven days, and the latent period varied from three to nine days. The lesion growth varied from 0,5 to 4,9mm/day. It was not observed correlation between the latent and incubation periods, as well as in lesion growth. Five isolates were identified to the pair of primers used, although correspondence was not found among the molecular identification and the cultural, morphological and pathogenic characterization.

A região espaçadora ITS rDNA tem sido utilizada como uma importante ferramenta molecular para a identificação de fungos. Neste estudo a região ITS1 - 5.8S - ITS2 foi analisada em diferentes espécies do fungo entomopatogênico Metarhizium incluindo M. anisopliae, M. album e M. flavoviride com o objetivo de se construir primers específicos para a detecção e identificação do fungo no interior de larvas infectadas de Diatraea saccharalis. A amplificação desta região produziu um fragmento único de aproximadamente 540 pb para as linhagens E9, B/Vi e C, e de 600 pb para a linhagem 14 de M. anisopliae var. anisopliae; de 650 bp para M. album e 600 pb para M. flavoviride. Os produtos de PCR obtidos foram digeridos com diferentes enzimas de restrição Afa I, Alu I, Dde I, Hae III, Hpa II e Sau 3A I; e os perfis de PCR-RFLP mostraram nítidas diferenças entre as espécies analisadas. O sequenciamento da região ITS1 - 5.8S - ITS2 permitiu o desenho de primers específicos para as linhagens de M.a. var. anisopliae do Brasil e da Austrália. A amplificação não ocorreu em linhagens de M. álbum, M. flavoviride e Beauveria bassiana. Os DNAs extraídos de larvas infectadas pelas linhagens E9, B/Vi e C do Brasil e linhagem 14, da Austrália, foram testados utilizando-se os primers desenvolvidos. Em todos os experimentos o fungo M.a. var. anisopliae foi detectado 48 horas após a inoculação. A técnica molecular empregada neste estudo permite a rápida e segura detecção e identificação de M.a. var. anisopliae em bioensaios de laboratório e de campo, programas de manejo de pragas e estudos de epizootiologia. / The ITS rDNA have been used as an important molecular tool for fungi identification. In this study the ITS1 - 5.8S - ITS2 rDNA regions were analyzed in different species of the entomopathogenic fungus Metarhizium including M. anisopliae, M. album and M. flavoviride, in order to construct specific primers for their detection and identification within infected Diatraea saccharalis larvae. The amplification of this region yielded a unique fragment of approximately 540 bp for E9, B/Vi and C, and 600 bp for strain 14 of M. anisopliae var. anisopliae; of 650 bp for M. album and 600 bp for M. flavoviride. The PCR products were digested with the different restriction endonucleases Afa I, Alu I, Dde I, Hae III, Hpa II and Sau 3A I; and the PCR-RFLP profiles showed clear differences amongst the species. The sequencing of the ITS-5.8S rDNA regions allowed for the design of specific primers for M. anisopliae var. anisopliae. The amplification was not observed with M. album, M flavoviride and Beauveria bassiana strains. DNAs extracted from infected larvae by E9 and C strains from Brazil and the strain 14 from Australia in individual bioassays were tested using previously designed specific primers. In all experiments, the fungus was detected after 48 hours of post-inoculation. This molecular technique allows a fast and secure detection and identification of the entomopathogen in bioassays, in pest management programs and epizootiology.

A região espaçadora ITS rDNA tem sido utilizada como uma importante ferramenta molecular para a identificação de fungos. Neste estudo a região ITS1 - 5.8S - ITS2 foi analisada em diferentes espécies do fungo entomopatogênico Metarhizium incluindo M. anisopliae, M. album e M. flavoviride com o objetivo de se construir primers específicos para a detecção e identificação do fungo no interior de larvas infectadas de Diatraea saccharalis. A amplificação desta região produziu um fragmento único de aproximadamente 540 pb para as linhagens E9, B/Vi e C, e de 600 pb para a linhagem 14 de M. anisopliae var. anisopliae; de 650 bp para M. album e 600 pb para M. flavoviride. Os produtos de PCR obtidos foram digeridos com diferentes enzimas de restrição Afa I, Alu I, Dde I, Hae III, Hpa II e Sau 3A I; e os perfis de PCR-RFLP mostraram nítidas diferenças entre as espécies analisadas. O sequenciamento da região ITS1 – 5.8S – ITS2 permitiu o desenho de primers específicos para as linhagens de M.a. var. anisopliae do Brasil e da Austrália. A amplificação não ocorreu em linhagens de M. álbum, M. flavoviride e Beauveria bassiana. Os DNAs extraídos de larvas infectadas pelas linhagens E9, B/Vi e C do Brasil e linhagem 14, da Austrália, foram testados utilizando-se os primers desenvolvidos. Em todos os experimentos o fungo M.a. var. anisopliae foi detectado 48 horas após a inoculação. A técnica molecular empregada neste estudo permite a rápida e segura detecção e identificação de M.a. var. anisopliae em bioensaios de laboratório e de campo, programas de manejo de pragas e estudos de epizootiologia. / The ITS rDNA have been used as an important molecular tool for fungi identification. In this study the ITS1 - 5.8S – ITS2 rDNA regions were analyzed in different species of the entomopathogenic fungus Metarhizium including M. anisopliae, M. album and M. flavoviride, in order to construct specific primers for their detection and identification within infected Diatraea saccharalis larvae. The amplification of this region yielded a unique fragment of approximately 540 bp for E9, B/Vi and C, and 600 bp for strain 14 of M. anisopliae var. anisopliae; of 650 bp for M. album and 600 bp for M. flavoviride. The PCR products were digested with the different restriction endonucleases Afa I, Alu I, Dde I, Hae III, Hpa II and Sau 3A I; and the PCR-RFLP profiles showed clear differences amongst the species. The sequencing of the ITS-5.8S rDNA regions allowed for the design of specific primers for M. anisopliae var. anisopliae. The amplification was not observed with M. album, M flavoviride and Beauveria bassiana strains. DNAs extracted from infected larvae by E9 and C strains from Brazil and the strain 14 from Australia in individual bioassays were tested using previously designed specific primers. In all experiments, the fungus was detected after 48 hours of post-inoculation. This molecular technique allows a fast and secure detection and identification of the entomopathogen in bioassays, in pest management programs and epizootiology.

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O bagaço de cana-de-açúcar, um dos resíduos gerados durante a produção de açúcar, é composto basicamente por celulose (41 44 %), hemicelulose (25 27 %) e lignina (20 22 %); cerca de dois terços da energia existente na cana-de-açúcar está contida no bagaço e na palha. Diversos processos utilizam o bagaço excedente, mas principalmente para produção de energia. No entanto, devido à grande quantidade de bagaço e palha que ainda sobram no processo estes materiais podem ser utilizados como fonte de celulose para obtenção de etanol. Para tanto, se faz necessária a hidrólise do bagaço e da palha a fim de se obter um hidrolisado que possa ser fermentado por leveduras industriais. A hidrólise do bagaço pode ocorrer por explosão a vapor, hidrólise química com ácidos ou álcalis ou hidrólise enzimática entre outros processos; a hidrólise química pode gerar compostos que são inibidores do processo fermentativo enquanto a hidrólise enzimática é um processo bastante oneroso visto não existir no Brasil a produção de enzimas para este fim. Por outro lado, se a hidrólise for efetuada somente com o próprio fungo, o processo pode ser lento. Neste contexto, este trabalho visou utilizar bagaço de cana-de-açúcar, pré-tratado por explosão a vapor e pré-tratado com ácido como substrato para selecionar fungos capazes de hidrolisar o bagaço a açúcares potencialmente fermentáveis por leveduras industriais. Foram realizados experimentos em uma etapa preliminar para selecionar dentre seis linhagens de fungos o(s) mais apto(s) para produção de açúcares redutores. E, experimentos fatoriais 22 para otimização das condições de hidrólise para os fungos selecionados na etapa anterior. Os fungos Trichoderma reesei e Phanerochaete chrysosporium foram selecionados para hidrolisar bagaço moído pré-tratado por ácido em cinco dias de incubação. A análise de variância (ANOVA) possibilitou gerar modelos validados e, superfícies de resposta para liberação de açúcares redutores e hexoses na hidrólise pelos fungos selecionados. As superfícies de resposta indicaram faixas ótimas de temperatura e concentração de ácido (32,19°C/1,09%) para liberação de açúcares redutores por T. reesei e, (32,6°C/1,06%) para P. chrysosporium. / The bagasse from sugar cane, a waste generated during the production of sugar, is composed primarily of cellulose (41 - 44%), hemicellulose (25 - 27%) and lignin (20 - 22%), about two thirds of energy in existing sugar cane is contained in the bagasse and straw. Several processes using bagasse surplus, but mainly for energy production. However, due to the large amount of bagasse and straw still left in these materials can be used as a source of cellulose to obtain ethanol. Thus, it is necessary to hydrolysis of bagasse and straw in order to obtain a hydrolyzate that can be fermented by yeast industry. Hydrolysis of bagasse can occur for a steam explosion, hydrolysis with acid or alkali chemical or enzymatic hydrolysis and other processes, the hydrolysis may generate chemical compounds that are inhibitors of the fermentation process while the enzymatic hydrolysis process is very costly as there is in Brazil the production of enzymes for this purpose. Furthermore, if the hydrolysis is carried out only with the fungus itself, the process can be slow. In this context, this work aimed to use crushed sugar cane, pre-treated by steam explosion and pre-treated with acid as a substrate to select fungi able to hydrolyze the bagasse potentially fermentable sugars for the yeast industry. Experiments were carried out in a preliminary step to select among six strains of fungi as suitable for production of reducing sugars. And, 2² factorial experiments to optimize the conditions of hydrolysis for selected fungi in the previous step. The fungi Trichoderma reesei and Phanerochaete chrysosporium were selected to hydrolyze milled bagasse pre-treated by acid in five days of incubation. The analysis of variance (ANOVA) allowed generate validated models and response surfaces for the release of reducing sugars and hexose hydrolysis by the selected fungi. The areas of response indicated bands optimum temperature and concentration of acid (32.19°C/1.09%) for release of reducing sugars by T. reesei, and (32.6°C/1.06%) for P. chrysosporium.

Insetos como formigas cortadeiras, cupins e alguns besouros têm sido descritos como agricultores de fungos mutualistas. No entanto, apenas recentemente esse fenômeno foi descrito em abelhas. O objetivo desse trabalho foi estudar os micro-­organismos associados à abelha sem ferrão Scaptotrigona depilis, a primeira abelha agricultora descrita. Foram isolados 149 micro-­organismos a partir de diferentes materiais coletados da colônia, e destes, 28% apresentaram atividade antimicrobiana frente a patógenos humanos. Os micro-­organismos Bacillus sp. SDLI1, Candida sp. SDCP2, Zygosaccharomyces sp. SDBC30G1 e Monascus ruber SDCP1, isolados do favo de cria de S. depilis, foram selecionados para estudo químico e biológico. Foi demonstrado que o fungo-­alimento de S. depilis é Zygosaccharomyces sp., que produz grande quantidade de adipossomos. Os lipídeos e esteroides estocados nessas organelas citoplasmáticas podem ajudar na nutrição larval, uma vez que Zygosaccharomyces sp. é requerido para o desenvolvimento das larvas de S. depilis. Em culturas in vitro de ovos dessa abelha, verificou-­se que ergosterol depempenha papel semelhante ao de Zygosaccharomyces sp. para a metamorfose de S. depilis, indicando que esse mutualista serve como fonte de esteroides para as larvas. Verificou-­se que compostos voláteis produzidos por Candida sp. SDCP2 estimulam o crescimento de Zygosaccharomyces sp. SDBC30G1. Análises revelaram que os compostos voláteis majoritários produzidos por Candida sp. SDCP2 foram etanol (C1) e álcool isoamílico (C2), e essas substâncias também foram encontradas nas células de cria dessa abelha. Já o fungo M. ruber SDCP1 produz lovastatina (M6), um produto natural reconhecido pela inibição da enzima HMG-­CoA redutase, essencial para biossíntese de esteroides, e M6 pode modular o desenvolvimento de Zygosaccharomyces sp. SDBC30G1. Candida sp. SDCP2 estimula a produção de monascinol (M2) e monascina (M3) pelo fungo M. ruber SDCP1 em co-­cultura. Monascina (M3) é ativa frente Candida sp. SDCP2, podendo controlar o crescimento dessa levedura, sendo a produção de M3 aumentada em 57 vezes após sete dias de cocultivo. A investigação química de Bacillus sp. SDLI1 revelou que essa bactéria produz sete surfactinas (B1-­B7) e bacillomicina D (B8), que apresentam atividade antifúngica. O cromossomo circular de Bacillus sp. SDLI1 possui oito clursters biossintéticos para a produção de diferentes classes de antimicrobianos. Bacillus sp. SDLI1 também produz o fago SDLI1-­1, ativo contra Paenibacillus larvae, patógeno causador da cria pútrida americana em Apis mellifera. Cultivos de larvas in vitro revelaram que S. depilis apresenta resistência contra os entomopatógenos Beauveria bassiana e Metarhizium anisopliae, sendo que Bacillus sp. SDLI1 pode desempenhar um papel protetivo para as larvas de S. depilis contra o patógeno P. larvae. Os resultados sugerem que o ambiente encontrado nas colônias de S. depilis favorece o desenvolvimento de uma microbiota especializada. Esses micro-­ organismos interagem e beneficiam a abelha hospedeira, estabelecendo relações de simbiose que devem ser preservadas para a sobrevivência desse polinizador / Some ants, termites and beetles have established mutualistic relationship with fungi that they culture for food. However, just recently a fungus agricultural behavior has been described for bees. The main goal of this study was to investigate the microbiota associated with the stingless bee Scaptotrigona depilis, the first fungus-­ farming bee described. Different materials from S. depilis colony were used to isolate 149 microbial strains, and among these microorganisms, 28% showed antimicrobial activity against human pathogens. The microorganisms Bacillus sp. SDLI1, Candida sp. SDCP2, Zygosaccharomyces sp. SDBC30G1 and Monascus ruber SDCP1, isolated from brood cells of S. depilis, were selected for further studies. Using different approaches, it was confirmed that Zygosaccharomyces sp. SDBC30G1 is the fungus required for S. depilis larval development. This fungus accumulates cytoplasmic lipid droplets that can be a source of sterols and lipids to the larvae. Using in vitro eggs culturing, it was verified that ergosterol, the major sterol produced by Zygosaccharomyces sp. SDBC30G1, can stimulates larval metamorphosis, confirming this yeast as an important sterol source. Co-­cultures provided information about Candida sp. SDCP2 volatile organic compounds (VOCs) production, which stimulates Zygosaccharomyces sp. SDBC30G1 growth. The majoritarian VOCs produced by Candida sp. SDCP2 were ethanol (C1) and isoamyl alcohol (C2), which were also detected in S. depilis brood cells. The fungus M. ruber SDCP1 produces lovastatin (M6), an inhibitor of HMG-­CoA reductase, which can modulate Zygosaccharomyces sp. SDBC30G1 pellicle formation and lipids accumulation. Candida sp. SDCP2 stimulates the production of monascinol (M2) and monascin (M3) by M. ruber SDCP1 in co-­culture. Monascin (M3) is active against Candida sp. SDCP2 and can control the growth of this yeast, once M3 biosynthesis increased ~ 57 folds after seven days of co-­culturing. Bacillus sp. SDLI1 produces seven surfactins (B1-­B7) and bacillomycin D (B8) that presented antifungal activity against pathogenic fungi. This bacterium had its whole-­genome sequenced and the circular chromosome harbors biosynthetic gene clusters to produce eight classes of antimicrobial compounds. The phage SDLI1-­1, which presented activity against Paenibacillus larvae, a pathogen causative of American Foulbrood Disease, was also produced by Bacillus sp. SDLI1. S. depilis larvae were resistant against Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae infections, and Bacillus sp. SDLI1 was capable to increase larval survival during in vitro culturing with P. larvae. The results suggest that the environmental conditions found in S. depilis colonies favor the development of a specialized microbiota. These microorganisms interact and produce beneficial factors to its host. These stablished symbiotic relationships contribute with the homeostasis inside the colony and they must be preserved to safeguard S. depilis survival

O interesse na obtenção de novos fármacos a partir de micro-organismos endofíticos vem crescendo, uma vez que esta é uma fonte ainda pouco explorada. Além disso, o estudo das interações entre plantas e micro-organismos tem sido amplamente discutido ao longo dos últimos anos. No presente trabalho, o fungo endofítico Drechslera ravenelii (SS33), isolado das folhas de Smallanthus sonchifolius (yacon), foi cultivado sob diferentes condições fermentativas, objetivando a determinação das melhores condições para produzir metabólitos secundários com atividades antimicrobiana e/ou citotóxica. Para tal avaliaram-se dois parâmetros: meio fermentativo e tempo de incubação. Os meios fermentativos líquidos utilizados foram Czapek e caldo de batata (PDB), sob agitação (120 RPM), cultivados por 216 e 480 horas. Também foi desenvolvida cultura por fermentação em substrato sólido, meio de arroz-aveia, durante 720 horas. Todos os cultivos foram realizados em temperatura de 30 ºC e precedidos por pré-fermentação. Dos cultivos em meio líquido foram obtidas frações em diclorometano e em acetato de etila. Já dos cultivos provenientes do meio fermentativo sólido foram obtidas frações em n-hexano, diclorometano, acetato de etila e n-butanol. Dessa forma, obtiveram-se 12 frações que foram concentradas em rotaevaporador até a secura, pesadas e identificadas. As frações tiveram sua atividade antimicrobiana avaliada através de duas técnicas: técnica da bioautografia e técnica da microdiluição em microplaca (determinação da Concentração Inibitória Mínima), utilizando-se como indicadores biológicos as cepas Kocuria rhizophila, Staphylococcus aureus, Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa. A avaliação da atividade citotóxica foi realizada pela técnica do MTT, utilizando-se três linhagens de células tumorais MB435 (melanoma humano), HCT-8 (cólon humano) e SF-295 (glioblastoma humano). As frações tiveram também seus perfis químicos avaliados por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência. Após observação dos resultados obtidos, concluiu-se que a fração diclorometânica, proveniente do meio fermentativo sólido, foi a que apresentou maior rendimento, manejo mais simples e perfil cromatográfico mais interessante, quando comparada às outras frações obtidas dos meios sólido e líquido. Desse modo, foi realizada ampliação da escala fermentativa em meio sólido e a fração diclorometânica obtida foi submetida a processos cromatográficos visando o isolamento das substâncias majoritárias. Assim, foram isoladas a substância 1 (não identificada) e a substância 2, identificada como terpestacina, um sesterpeno incomum com conhecida atividade na inibição da formação de sincícios pelo vírus HIV. A terpestacina foi isolada pela primeira vez do fungo Drechslera ravenelii no presente estudo. A substância 2 não apresentou atividade antimicrobiana quando submetida ao ensaio da microdiluição em microplaca e apresentou atividade citotóxica discreta, frente a três linhagens de células cancerígenas humanas. / The interest in obtaining new drugs from endophytic microorganisms is growing, since this is a source still little exploited. In addition, the study of the interactions between plants and microorganisms has been widely discussed over the past few years. In this work, the endophytic fungus Drechslera ravenelii (SS33), isolated from the leaves of Smallanthus sonchifolius (yacon), was grown under different conditions, targeting the determination of the best conditions to produce secondary metabolites with antimicrobial and/or cytotoxic activities. For that, two parameters were evaluated: culture medium type and incubation time. The liquid media used were Czapek and Potato Dextrose Broth (PDB), swirling (120 RPM), cultivated for 216 and 480 hours, respectively. The fungus has also been culture by fermentation in solid substrate, rice-oats medium, during 720 hours. All crops were conducted in temperature of 30 °C and preceded by pre-fermentation. The obtained liquid mediums were submitted to liquid partition to furnish dichloromethane and ethyl acetate fractions. The solid medium was submitted to extraction to furnish the fractions in n-hexane, dichloromethane, ethyl acetate and n-butanol, in sequence. |Then, the 12 fractions obtained were dried, cumbersome and identified. The antimicrobial activity of the fractions was evaluated through two techniques: bioautography and Microdiluition method (Minimum Inhibitory Concentration-MIC), and for that, the biological indicators used were Kocuria rhizophila, Staphylococcus aureus, Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa. The cytotoxic activity evaluation was performed by MTT test, using three tumor cell lines: MB435 (human melanoma), HCT-8 (human colon) and SF-295 (human glioblastoma). The chromatographic profiles of the fractions were evaluated by High Performance Liquid Chromatography. Analysis of the results allowed to conclude that the dichloromethane fraction from the solid medium gave greater yield, was easier to manager and more displayed an interesting chromatographic profile when compared to other fractions obtained from both solid and liquid media. Thus, the fungus was cultivated in a larger scale in solid medium and the dichloromethane fraction obtained was subjected to chromatographic processes aiming the isolation of the major compounds. Thus, two compounds were isolated the substance 1 (unidentified) and the substance 2, witch was identified as terpestacin, an uncommon sesterpene, which inhibits the formation of syncytia in the course of HIV infection. The terpestacin was isolated for the first time from the fungus Drechslera ravenelii in this study. The compound 2 did not presented antimicrobial activity when subjected to the microdilution test and it displayed discreet cytotoxic activity in three human cancer cell lines.