O Transtorno de Déficit de Atenção/Hiperatividade (TDAH) está entre as doenças psiquiátricas mais comuns na infância e adolescência, determinando prejuízo significativo na qualidade de vida dos pacientes. Os estudos moleculares nos últimos anos não foram suficientes para entender a base genética do transtorno nem esclarecer quais os genes envolvidos, devido ao pequeno efeito de cada um e da interação entre genes e destes com fatores ambientais. Estudos recentes sugerem que os sintomas de hiperatividade/impulsividade do TDAH podem ser devido à falha da inibição comportamental resultante de uma modulação inapropriada das sinalizações GABA e glutamato. É possível que os déficits de transmissão de catecolaminas presentes no TDAH sejam um efeito secundário do desbalanço excitatório/inibitório. Os estudos de variantes genéticas envolvidas na variabilidade de resposta ao tratamento com o metilfenidato, o fármaco mais utilizado para tratar o TDAH, poderiam fornecer dados que potencialmente poderiam auxiliar no aprimoramento do tratamento. Portanto o presente trabalho teve como objetivo geral investigar o papel de variantes nos genes LPHN3, GAD1, GABRA1, GABRB2 e GAT1 na suscetibilidade e na farmacogenética do TDAH. Ao longo da Tese, os resultados foram organizados em quatro artigos. No primeiro, o estudo de associação entre a LPHN3 e o TDAH avaliou 523 crianças e adolescentes com TDAH e 132 controles, o estudo farmacogenético avaliou 172 crianças através da escala de sintomas SNAP-IV no momento da prescrição, no primeiro e terceiro mês de tratamento. Os resultados sugerem o haplótipo CGC derivado dos SNPs rs6813183, rs1355368 e rs734644 como sendo de risco para o TDAH (P = 0,02; OR = 1,46; IC95%: 1.07 – 1,97). A interação desse haplótipo com o SNP rs965560, localizado no cromossomo 11q, aumenta levemente o risco ao nível nominal (P = 0,03; OR = 1,55; IC95%: 1,02 - 2,36). Pacientes homozigotos para o haplótipo CGC mostraram uma resposta mais rápida ao tratamento, com interação significante entre o haplótipo e o tratamento ao longo do tempo (P < 0,001). Homozigotos para o haplótipo GT derivado dos SNPs rs6551665 e rs1947275 mostraram uma interação nominalmente significante com o tratamento ao longo do tempo (P = 0,04). Nossos resultados replicaram estudos prévios, demonstrando que a LPHN3 confere suscetibilidade ao TDAH, interage com o cromossomo 11q e modula a resposta ao metilfenidato. No segundo trabalho, o estudo de associação de GAD1 e o TDAH avaliou 547 crianças com TDAH e seus pais biológicos, e os sintomas de hiperatividade/impulsividade foram avaliados pela escala SNAP-IV em 323 crianças. Uma amostra composta de 2.000 crianças que nasceram em Pelotas em 1993 e que foram avaliadas aos 10 e 15 anos para a escala de hiperatividade SDQ também foi analisada. Os resultados demonstram que o alelo C do SNP rs11542313 foi mais transmitido dos pais para crianças com TDAH (χ2= 5,02; P = 0,03); os haplótipos de GAD1 foram associados com escores de sintomas de hiperatividade/impulsividade (χ2= 8,98; P=0,01), sendo que o haplótipo CG derivado dos SNPs rs3749034 e rs11542313 confere os escores mais altos desses sintomas (IC95%: 0,02–0,43; P=0,03). Embora GAD1 não tenha sido associado com os sintomas de hiperatividade na amostra populacional, nossos resultados na amostra clínica sugerem que o GAD1 está associado à suscetibilidade do TDAH, contribuindo principalmente para os sintomas de hiperatividade/impulsividade. No terceiro trabalho, avaliamos SNPs nos genes GABRA1, GABRB2 e GAT1 através de análises caso-controle e baseadas em famílias. A amostra compreendeu 542 crianças com TDAH e seus pais biológicos e 132 controles. Não houve evidência de associação entre esses polimorfismos e a suscetibilidade ao TDAH (valores de P entre 0,108 e 0, 937). O quarto trabalho foi uma revisão sistemática entre os anos de 2010 e 2013 sobre os estudos farmacogenéticos do TDAH. Nós pudemos comprovar o aumento exponencial dos estudos marcados principalmente pela mudança de foco do sistema dopaminérgico para outros genes de neurotransmissão e de neurodesenvolvimento; e o aumento de estudos com novas abordagens. Contudo, a heterogeneidade metodológica ainda provavelmente determina as divergências encontradas na literatura. A presente Tese acrescenta dados de uma rota biológica pouco explorada que é o balanço excitatório/inibitório gerado por glutamato e GABA, e que pode estar envolvida na etiologia do TDAH. Mais estudos são necessários para reiterar a participação desses sistemas e aumentar a compreensão dos mecanismos moleculares na suscetibilidade ao TDAH. / Attention-Deficit/Hyperactivity Disorder (ADHD) is one of the most common psychiatric disorders in children and adolescents, leading to significant impairments in the life quality of patients. At present, molecular studies still did not disclose the genetic basis of the disorder or clarified which genes are implicated in the disorder, due to the small effect of each variant and the interaction between genes and among them with environmental factors. Recent studies have suggested that ADHD hyperactive/impulsive symptoms are due to behavioral disinhibition resulting from inappropriate modulation of both glutamatergic and GABAergic signaling. It is possible that deficits in catecholaminergic transmission observed in ADHD may arise as a secondary effect of excitatory/inhibitory imbalance. Genetic variants studies involved in the variability of methylphenidate response, the most widely drug used to treat ADHD, could provide data that potentially help to improve the treatment management. The aim of the present study was to investigate the contribution of single nucleotide polymorphisms (SNPs) at LPHN3, GAD1, GABRA1, GABRB2 e GAT1 genes to ADHD susceptibility and pharmacogenetics. First, the association between LPHN3 and ADHD was evaluated in 523 children and adolescents with ADHD and 132 controls. In the pharmacogenetics study, 172 children with ADHD were investigated. The primary outcome measure was the parent-rated Swanson, Nolan, and Pelham Scale - version IV (SNAP-IV) applied at baseline, first and third months of treatment with methylphenidate. The results suggest that the CGC haplotype derived from SNPs rs6813183, rs1355368, rs734644 as an ADHD risk haplotype (P = 0.02; OR = 1.46; CI95%: 1.07 – 1.97). Its interaction with the 11q chromosome SNP rs965560 slightly increases risk, at nominal level (P = 0.03; OR = 1.55; CI95%: 1.02 – 2.36). Homozygous individuals for the CGC haplotype showed a faster response to MPH treatment as a significant interaction effect between CGC haplotype and treatment over time (P < 0.001). Homozygous individuals for the GT haplotype derived from SNPs rs6551665 and rs1947275 showed a nominally significant interaction with treatment over time (P = 0.04). Our findings replicate previous findings reporting that LPHN3 confers ADHD susceptibility, interacts with 11q region, and moderates MPH treatment response in children and adolescents with ADHD. In the second paper, the association study evaluated a clinical sample that consisted of 547 families with ADHD probands and hyperactive/impulsive symptoms which were evaluated based on SNAP-IV scores. Also, a population-based sample comprised of 2,000 individuals from the Pelotas 1993 Birth Cohort Study was evaluated for SDQ hyperactivity subscale collected at both 11 and 15 years assessments. The C allele of rs11542313 was significantly overtransmitted from parents to ADHD probands (χ2= 5.02; P = 0.03). GAD1 haplotypes were associated with higher hyperactive/impulsive scores in ADHD youths (χ2= 8.98; P=0.01). In the specific haplotype test, the GC haplotype was the one with the highest hyperactive/impulsive scores (CI 95%: 0.02–0.43; P=0.03). Even though GAD1 was not associated with ADHD symptoms in the general population sample, our results from the clinical sample suggest that the GAD1 gene is associated with ADHD susceptibility, contributing particularly to the hyperactive/impulsive symptoms domain. The SNPs at GABRA1, GABRB2 e GAT1 genes were investigated by family-based and case-control approaches. The sample comprised 542 youths with ADHD and their parents, and 132 youths without ADHD as controls. There was no evidence of association between these polymorphisms and ADHD susceptibility (P values ranging from 0.108 to 0.937). The last paper was a systematic review of the literature on ADHD pharmacogenetics between 2010 and 2013. We observed that the number of studies continues to grow with a focus shift on ADHD pharmacogenetics studies from dopaminergic genes to other neurotransmitters and neurodevelopmental genes. An increasing number of studies using new approaches were also observed. However, the heterogeneity in methodological strategies of the studies likely explains the inconsistent results. All these findings add data about an underexplored pathway which is the excitatory/inhibitory balance induced by glutamate and GABA, and may be involved in ADHD etiology. Further studies are needed to elucidate the potential role of these systems and increase the understanding of molecular mechanisms to ADHD susceptibility.

A doença de Parkinson é a segunda enfermidade neurodegenerativa mais frequente e acomete entre 1 a 2% das pessoas acima de 65 anos. Com a expectativa de envelhecimento da população, espera-se um aumento proporcional da prevalência desta doença, o que justifica uma preocupação crescente com o manejo dessa condição. A levodopa é fundamental para o manejo farmacológico desses pacientes, uma vez que é possível um controle quase ótimo dos sintomas, pelo menos nos primeiros anos de tratamento. Entretanto, em cinco anos, cerca de metade dos pacientes apresentarão complicações pelo uso crônico desta medicação, o que determinará piora da qualidade de vida e um desafio ao médico, no sentido de controlar esses fenômenos. As principais complicações crônicas são as flutuações da resposta motora, as discinesias e as alucinações. Este trabalho tem a proposta de investigar a gênese dessas alterações em sua relação com variações genéticas específicas. Foram selecionados polimorfismos em genes com plausibilidade biológica, por estarem envolvidos na farmacocinética e farmacodinâmica da levodopa. São eles: Val158Met da COMT (catecol-orto-metiltransferase), íntron 13 da MAO-B (monoamina oxidase B), VNTR (“variable number tandem repeat”) de 40pb da região 3'UTR (“untranslated region”) do DAT (transportador de dopamina) e -839C>T da região promotora 5' do DAT. A COMT e a MAO-B são as duas rotas enzimáticas de degradação da dopamina e o DAT é um transportador présináptico de dopamina. Foram selecionados pacientes com doença de Parkinson idiopática em acompanhamento no Serviço de Neurologia do HCPA com idade de início dos sintomas após os 45 anos e que estavam em uso de levodopa há pelo menos dois anos. Esses pacientes foram submetidos a um protocolo de avaliação clínica, com obtenção de informações relevantes para a determinação da presença das complicações, aplicação de escalas padronizadas e coleta de sangue (ver anexos para o protocolo e as escalas). Após, o material biológico foi submetido à extração de DNA e os polimorfismos determinados por análise de fragmentos de enzima de restrição, no Departamento de Genética da UFRGS. Entre os polimorfismos da COMT e da MAO-B não se observou diferença para a presença ou ausência de flutuação da resposta motora, discinesia e alucinação. Entretanto, pacientes com genótipo lento da COMT (MetMet) apresentaram menos complicações da terapia (desfecho aferido pela parte IV da UPDRS, “Unified Parkinson Disease Rating Scale”, que fornece um escore cuja pontuação baixa representa menos complicações da terapia). Fazendo análise dos subítens da escala, observou-se que esse efeito se deveu à menor presença de flutuação motora. Observamos ainda que os pacientes portadores do genótipo MetMet apresentaram idade de início da doença de Parkinson menor quando comparados aos portadores dos genótipos de atividade rápida (ValMet e ValVal). A diferença aproximada foi de 4 anos, com um p=0,03. Seguindo o estudo da influência genética sobre a idade de início, observou-se que homens hemizigotos para o alelo G da MAO-B apresentavam idade de início precoce em relação aos portadores do alelo A, com diferença aproximada de 5 anos e p=0,03. Tomados em conjunto os polimorfismos da COMT e da MAO-B, o efeito do genótipo lento MetMet da COMT sobre a idade de início foi potencializado naqueles com alelo A da MAO-B (homens hemizigotos A e mulheres homozigotas AA), com diferença aproximada de oito anos e p=0,001. Em relação ao gene do DAT, observou-se que a presença do alelo T do polimorfismo da região promotora está associada à maior frequencia de alucinação visual, com OR (“odds ratio”, ou razão de chances) de 5,17 e IC (intervalo de confiança) de 95% de 1,45-18,41 com p=0,01. Ademais, encontrou-se um achado a ser melhor explorado: pacientes portadores do alelo de 9 repetições do VNTR de 40pb necessitavam de maior dose para o controle dos sintomas parkinsonianos, com uma diferença aproximada de 100mg com p=0,042. Há na literatura estudos de associação desses polimorfismos com a presença da doença de Parkinson, entretanto, poucos avaliaram o efeito dessas variantes polimórficas sobre a resposta ao uso de levodopa e sobre outros fatores clínicos. Os resultados desta dissertação trazem informações importantes para o melhor entendimento da variabilidade da resposta farmacológica e sobre a fisiopatologia da doença de Parkinson.

Resumo não disponível

A doença de Parkinson é a segunda enfermidade neurodegenerativa mais frequente e acomete entre 1 a 2% das pessoas acima de 65 anos. Com a expectativa de envelhecimento da população, espera-se um aumento proporcional da prevalência desta doença, o que justifica uma preocupação crescente com o manejo dessa condição. A levodopa é fundamental para o manejo farmacológico desses pacientes, uma vez que é possível um controle quase ótimo dos sintomas, pelo menos nos primeiros anos de tratamento. Entretanto, em cinco anos, cerca de metade dos pacientes apresentarão complicações pelo uso crônico desta medicação, o que determinará piora da qualidade de vida e um desafio ao médico, no sentido de controlar esses fenômenos. As principais complicações crônicas são as flutuações da resposta motora, as discinesias e as alucinações. Este trabalho tem a proposta de investigar a gênese dessas alterações em sua relação com variações genéticas específicas. Foram selecionados polimorfismos em genes com plausibilidade biológica, por estarem envolvidos na farmacocinética e farmacodinâmica da levodopa. São eles: Val158Met da COMT (catecol-orto-metiltransferase), íntron 13 da MAO-B (monoamina oxidase B), VNTR (“variable number tandem repeat”) de 40pb da região 3'UTR (“untranslated region”) do DAT (transportador de dopamina) e -839C>T da região promotora 5' do DAT. A COMT e a MAO-B são as duas rotas enzimáticas de degradação da dopamina e o DAT é um transportador présináptico de dopamina. Foram selecionados pacientes com doença de Parkinson idiopática em acompanhamento no Serviço de Neurologia do HCPA com idade de início dos sintomas após os 45 anos e que estavam em uso de levodopa há pelo menos dois anos. Esses pacientes foram submetidos a um protocolo de avaliação clínica, com obtenção de informações relevantes para a determinação da presença das complicações, aplicação de escalas padronizadas e coleta de sangue (ver anexos para o protocolo e as escalas). Após, o material biológico foi submetido à extração de DNA e os polimorfismos determinados por análise de fragmentos de enzima de restrição, no Departamento de Genética da UFRGS. Entre os polimorfismos da COMT e da MAO-B não se observou diferença para a presença ou ausência de flutuação da resposta motora, discinesia e alucinação. Entretanto, pacientes com genótipo lento da COMT (MetMet) apresentaram menos complicações da terapia (desfecho aferido pela parte IV da UPDRS, “Unified Parkinson Disease Rating Scale”, que fornece um escore cuja pontuação baixa representa menos complicações da terapia). Fazendo análise dos subítens da escala, observou-se que esse efeito se deveu à menor presença de flutuação motora. Observamos ainda que os pacientes portadores do genótipo MetMet apresentaram idade de início da doença de Parkinson menor quando comparados aos portadores dos genótipos de atividade rápida (ValMet e ValVal). A diferença aproximada foi de 4 anos, com um p=0,03. Seguindo o estudo da influência genética sobre a idade de início, observou-se que homens hemizigotos para o alelo G da MAO-B apresentavam idade de início precoce em relação aos portadores do alelo A, com diferença aproximada de 5 anos e p=0,03. Tomados em conjunto os polimorfismos da COMT e da MAO-B, o efeito do genótipo lento MetMet da COMT sobre a idade de início foi potencializado naqueles com alelo A da MAO-B (homens hemizigotos A e mulheres homozigotas AA), com diferença aproximada de oito anos e p=0,001. Em relação ao gene do DAT, observou-se que a presença do alelo T do polimorfismo da região promotora está associada à maior frequencia de alucinação visual, com OR (“odds ratio”, ou razão de chances) de 5,17 e IC (intervalo de confiança) de 95% de 1,45-18,41 com p=0,01. Ademais, encontrou-se um achado a ser melhor explorado: pacientes portadores do alelo de 9 repetições do VNTR de 40pb necessitavam de maior dose para o controle dos sintomas parkinsonianos, com uma diferença aproximada de 100mg com p=0,042. Há na literatura estudos de associação desses polimorfismos com a presença da doença de Parkinson, entretanto, poucos avaliaram o efeito dessas variantes polimórficas sobre a resposta ao uso de levodopa e sobre outros fatores clínicos. Os resultados desta dissertação trazem informações importantes para o melhor entendimento da variabilidade da resposta farmacológica e sobre a fisiopatologia da doença de Parkinson.

Submitted by Marcelo Andrade Silva (marcelo.andradesilva@ufpe.br) on 2015-03-09T13:36:55Z No. of bitstreams: 2 DISSERTAÇÃO Suedja Priscila Serafim Silva.PDF: 1335149 bytes, checksum: cce4b3e438b259fd4a0857f6a1ee4c2b (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-09T13:36:55Z (GMT). No. of bitstreams: 2 DISSERTAÇÃO Suedja Priscila Serafim Silva.PDF: 1335149 bytes, checksum: cce4b3e438b259fd4a0857f6a1ee4c2b (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2013 / FACEPE e CNPq / A Terapia Antirretroviral Altamente Ativa (HAART) é a única alternativa terapêutica eficaz para indivíduos que vivem com o vírus da imunodeficiência humana (HIV). Contudo, as reações adversas têm sido a maior limitação deste tratamento. A Farmacogenética investiga porque indivíduos diferentes respondem de forma desigual aos mesmos tratamentos. Assim, polimorfismos genéticos podem possuir papel importante no surgimento de reações adversas em pacientes em HAART. O objetivo do presente estudo foi investigar se a presença de polimorfismos genéticos estava envolvida com o desenvolvimento de reações adversas aos medicamentos anti-HIV. Foram selecionados 250 pacientes em tratamento em Recife-PE para um estudo caso-controle, cujas reações adversas mais frequentes foram: resistência à insulina, dislipidemia, erupção cutânea e neurotoxicidade. Foram levados em consideração oito polimorfismos em seis genes (RETN, APOB, APOA5, CCHCR1, NR1I2 e NR1I3), além de variáveis clínicas: idade, massa corporal, sexo e etnia. O alelo A do polimorfismo rs2307424 (G>A) no NR1I3 foi associado com menor susceptibilidade à neurotoxicidade (OR= 0,93 [0,54-1,6] e p= 0,01) do gene NR1I3. O genótipo G/G está associado com risco de neurotoxicidade (p=0,04). Não houve evidências de que polimorfismos nos genes RETN, APOB, APOA5, CCHCR1 e NR1I2 estejam associados com o desenvolvimento de reações adversas à HAART.

Submitted by Andre Moraes Queiroz (andre.moraesqueiroz@ufpe.br) on 2015-04-14T14:12:05Z No. of bitstreams: 2 Dissertação Antonio Coelho.pdf: 871850 bytes, checksum: 65f954df216fcb2b29d2b8b7f7072e49 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-14T14:12:05Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação Antonio Coelho.pdf: 871850 bytes, checksum: 65f954df216fcb2b29d2b8b7f7072e49 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2013 / FACEPE; CNPq / A infecção pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV) pode promover a síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS). Os antirretrovirais reduziram as mortes relacionadas a AIDS. Os antirretrovirais são absorvidos e metabolizados em diversas células. Existe variabilidade na resposta a esses medicamentos. Portanto, polimorfismos genéticos em vias farmacocinéticas podem afetar o resultado terapêutico. O objetivo do presente estudo foi avaliar se diferentes perfis genéticos estão relacionados com a falha virológica de antirretrovirais de primeira linha, definida como presença de carga viral detectável no sangue apesar de um ano de terapia. Foram recrutados 187 pacientes em tratamento na região metropolitana de Recife – PE para um estudo de caso controle (160 sucessos e 27 falhas). Foram analisadas variáveis clínicas e epidemiológicas, como sexo, idade e massa corporal, medicamentos prescritos, carga viral e contagem de células T CD4+. Sete polimorfismos em cinco genes (ABCB1, ABCC1, CYP2B6, SLC22A1 e SLCO3A1) foram genotipados. Não foram observadas associações entre os polimorfismos dos genes CYP2B6, SLC22A1 e SLCO3A1 com a falha virológica. Análises por regressão logística indicaram que polimorfismos nos genes ABCB1 (rs1045642) e ABCC1 (rs212091) estiveram significativamente associados com a ocorrência de falha de esquemas contendo inibidores de protease (OR=5,01, p=0,045 e OR=6,50, p=0,02, respectivamente). Os resultados poderão contribuir para o entendimento da variabilidade na resposta ao tratamento anti-HIV e ajudar a identificar pacientes em risco de falha, auxiliando na orientação da escolha do primeiro esquema terapêutico.

Orientador: Heitor Moreno Junior / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-12T13:57:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lacchini_Riccardo_M.pdf: 3791091 bytes, checksum: 8936fbea9ef58bfd48f550316c33f122 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: Introdução: Hipertensão Refratária se caracteriza por quadro de hipertensão concomitante ao uso de 3 classes diferentes de anti-hipertensivos, sendo, pelo menos um destes, diurético. Existem fatores genéticos que influenciam mecanismos de controle da pressão arterial, podendo ter papel importante na hipertensão refratária. O sistema Renina-Angiotensina-Aldosterona desempenha um papel central na gênese da hipertensão. Isto torna interessante o estudo das influências genéticas sobre sistemas envolvidos com a produção e transporte da aldosterona. Este trabalho apresenta o estudo de um polimorfismo na região promotora do gene CYP11b2 (troca de timina por citosina na posição -344 do gene), que codifica a aldosterona sintase, enzima responsável pelo último passo na síntese de aldosterona pelas glândulas supra-renais. Secundariamente, o trabalho apresenta o estudo de um polimorfismo no exon 26 do gene da p-glicoproteína (troca de citosina por timina na posição 3435 do gene). Esta proteína está envolvida com resistência a diversos medicamentos na terapêutica (o gene é chamado Muliple Drug Resistance-1, MDR-1), e recentemente foi associada a alterações na excreção e captação tecidual de aldosterona. Objetivos: O estudo visa determinar se existe associação entre o alelo T do polimorfismo -344C/T no gene CYP11b2 e a resistência ao tratamento anti-hipertensivo. Secundariamente, é avaliada, de maneira preliminar, a participação do alelo C do gene MDR-1 no fenótipo de hipertensão refratária. Materiais e Métodos: Foram avaliados 340 indivíduos, dos quais 88 eram portadores de HAR que preencheram os requisitos de inclusão no estudo, 142 indivíduos eram hipertensos moderados e responsivos a tratamento farmacológico (HT). Os demais indivíduos (n = 110) constituíram o grupo controle. Foram coletadas amostras de sangue para exames laboratoriais (dentre eles, quantificação de aldosterona, cortisol, renina) e extração de DNA. Foi medida a espessura da íntima média de carótida (EIM) dos pacientes através de ultra-som. Foi estimada a Velocidade de Onda de Pulso carótida-femural (VOP) dos pacientes. O DNA foi extraído pelo método de Salting Out. O polimorfismo do gene CYP11b2 foi genotipado por PCR(Polymerase Chain Reaction) seguido por digestão enzimática com a enzima Hae-III. O polimorfismo do gene MDR-1 foigenotipado através de PCR alelo específico. Resultados: Foi encontrada associação do alelo T do gene CYP11b2 com Hipertensão (p<0,05), porém não houve diferença entre os grupos hipertensos responsivos e hipertensos resistentes. Não houve diferença estatística nas concentrações plasmáticas de aldosterona, cortisol e renina; EIM e VOP nos grupos de alelos C e T. Não foi encontrada relação entre a distribuição alélica do gene MDR-1 e hipertensão tratada ou resistente. Foi detectada associação significativa entre alelo C do gene MDR-1 e pressão arterial diastólica (PAD) aumentada em hipertensos refratários. Conclusões: há associação entre o alelo T do gene CYP11b2 e hipertensão, mas não há associação com resistência farmacológica aos anti-hipertensivos. Não houve influência do alelo T sobre parâmetros clínicos e de remodelamento vascular. O alelo C do gene MDR-1 parece estar associado a uma maior PAD no grupo de hipertensos refratários. / Abstract: Introduction: Resistant hypertension is characterized by elevated blood pressure concurrent with the use of 3 different anti-hypertensive drugs, being one of them a diuretic. There are genetic factors that interfere in the arterial pressure control system and may have a significant role in resistant hypertension. Renin-Angiotensin-Aldosterone System plays a major role in hypertension genesis, therefore the systems that control the production and transport of aldosterone are interesting targets for genetic association studies. This work presents the study of a polymorphism (-344 C/T) in CYP11b2 gene. This gene translates aldosterone synthase, an enzyme responsible for endogenous synthesis of aldosterone on adrenal glands. A secondary study on a polymorphism (3435C/T) in MDR-1 gene was performed. This gene translates p-glicoprotein, an efflux-pump related to several drug resistance phenotypes. Recently it was reported that tissue uptake and excretion of aldosterone is mediated by p-glicoprotein. Objectives: The study aims to evaluate the association between allele T of CYP11b2 and resistance to anti-hypertension treatment. As a second objective it has been performed an initial evaluation of the influence of C allele of MDR-1 on resistant hypertension phenotype. Materials and Methods: In this study, 340 subjects were evaluated: 88 patients presented Refractory Arterial Hypertension (RAH), 142 were responsive to anti-hypertension treatment (RT), and the remaining was the control group (n=110). Blood samples were collected for laboratory examinations (plasmatic aldosterone, cortisol, renin) and DNA extraction. It was examined the carotid intima-media thickness (IMT) using ultra-sound, and carotid-femoral pulse wave velocity (PWV). DNA was extracted using the salting out method. CYP11b2 genotyping was performed through restriction fragment length polymorphism (polymerase chain reaction (PCR) followed by endonuclease digestion). PCR products were digested with Hae III enzyme. MDR-1 genotyping was performed through allele specific PCR. Results: It was found association between allele T of CYP11b2 and hypertension (p<0,005), but no difference has been detected between RT and RAH groups. No statistical difference was detected in plasmatic aldosterone, cortisol and renin concentrations, neither in PWV nor in IMT when compared C and T allele groups. It was found no relationship between alleleC of MDR-1 and hypertension, treated or resistant, although there was a significant association between allele C of this gene and elevated diastolic blood pressure in the RAH group. Conclusions: There is association between allele T of CYP11b2 gene and hypertension, but there is no relationship with pharmacological resistance to antihypertensive treatment. No influence was detected of allele T regarding clinical parameters or remodeling indicators. Allele C of MDR-1 gene seems to be associated with an elevated diastolic blood pressure in resistant hypertensive subjects. / Mestrado / Mestre em Farmacologia

Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico / En la práctica clínica se han observado grandes variaciones interindividuales, tanto en la respuesta como en la toxicidad asociadas con las terapias anticancerígenas. El presente trabajo tiene por objetivo estudiar la asociación entre polimorfismos genéticos en enzimas de biotransformación y la toxicidad del esquema cisplatino-etopósido-bleomicina (PEB) en pacientes con cáncer testicular y evaluar la influencia del polimorfismo genético en GSTM1 en la farmacocinética de cisplatino. Para el cumplimiento de los objetivos se realizó la genotipificación de los polimorfismos CYP3A4*1B, GSTM1 nulo, GSTT1nulo y BLMH (A1450G) realizadas mediante PCR-RFLP a partir del ADN genómico total obtenido de sangre periférica de sesenta y tres (63) pacientes con cáncer testicular. Adicionalmente, a ocho (8) pacientes reclutados se les realizó un estudio farmacocinético en donde recibieron una infusión intravenosa por 2 horas de cisplatino (100 mg/m2). Los niveles plasmáticos de cisplatino fueron medidos por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). Los resultados muestran que los pacientes con el genotipo GSTM1 presente experimentan más leucopenia grado 3-4 (OR=0,2058; 95% IC 0,0405-1,0459, p=0,041chi2, p=0,052 Fisher). Linfocitopenia severa fue más frecuente en pacientes con el genotipo GSTT1 nulo (OR=29, 95% IC 1,29-650,0, p=0,002chi2, p=0,095 Fisher). Los pacientes con el genotipo BLMH A/G experimentaron más toxicidad hematológica grado 3-4 (OR=7,67, 95% IC 2,14-27,35-, p=0,001chi2, p=0,002 Fisher) y leucopenia grado 3-4 (OR=29, 95% IC 1,2938-650,015, p=0,002chi2, p=0,095 Fisher). Los datos farmacocinéticos se ajustaron a un modelo de dos compartimentos, el promedio poblacional estimado para el aclaramiento (CL) fue de 9,97 L/hr y el volumen de distribución en el compartimento central (V1) fue 6,48 L. Ninguna covariable mejoró la variabilidad intersujeto asociada con los parámetros farmacocinéticos. No se observó ninguna asociación significativa entre la farmacocinética y GSTM1. En conclusión, los polimorfismos GSTM1 nulo, GSTT1 nulo y BMLH (A1450G) están relacionados con la toxicidad luego del esquema de quimioterapia en pacientes con cáncer testicular. En el estudio farmacocinético preliminar de cisplatino, ningún parámetro se ve influenciado por el genotipo GSTM1 / In the clinical practice were observed large interindividual variations both the response and the toxicity in the anticancer therapy. The present work aimed to study the association among the genetics polymorphisms in the biotransformation enzymes and toxicity in cisplatin-etoposide-bleomycin (PEB) chemotherapy in testicular cancer patients and to evaluate the influence of genetic polymorphism in GSTM1 on the pharmacokinetics of cisplatin. Genotyping of CYP3A4*1B, GSTM1 null, GSTT1 null and BLMH (A1450G) polymorphisms was performed by PCR – RFLP of genomic DNA obtained from the peripheral blood of sixty three (63) testicular cancer patients. Additionally, the eight (8) patients recruited to the pharmacokinetics study received a 2 hours intravenous infusion of cisplatin (100 mg/m2). Plasma levels of cisplatin were measured by high-performance liquid chromatography (HPLC). Results showed that the patients GSTM1 present genotype experienced more grade 3-4 leucopenia (OR=0,2058; 95% CI 0,0405-1,0459, p=0,041chi2, p=0,052 fisher). Severe linfocitopenia was more frequent in patients GSTT1 null genotype (OR=29, 95% CI 1,2938-650,015, p=0,002chi2, p=0,095 fisher). Patients BLMH A/G genotype experienced more grade 3-4 hematological toxicity (OR=7,67, 95% CI 2,14-27,35-, p=0,001chi2, p=0,002 fisher) and grade 3-4 leucopenia (OR=29, 95% CI 1,2938-650,015, p=0,002chi2, p=0,095 fisher). Dates pharmacokinetics were adjusted to a linear two-compartment model, the mean population estimates for clearence (CL) were 9,97 L/hr and central distribution volume (V1) were 6,48 L. No covariate improved the intersubject variability associated with pharmacokinetics parameters. No association among pharmacokinetics parameters and GSTM1 genotype were significant. In conclusion, GSTM1 null, GSTT1 null and BLMH A1450G polymorphisms were related with toxicity from chemotherapy testicular cancer. In the pharmacokinetics preliminary study of cisplatin, no parameters were influenced for GSTM1 genotype. Key words: Pharmacogenetics, polymorphisms, testicular cancer

A doença de Parkinson (DP) é a segunda doença neurodegenerativa mais frequente na espécie humana. A etiologia da DP é multifatorial, com muitos fatores ambientais e genéticos atuando em conjunto para sua determinação. Ao nível patológico ela caracteriza-se pela destruição seletiva de neurônios dopaminérgicos da substantia nigra pars compacta e pelo acúmulo de corpos de Lewy no cérebro. Em aproximadamente 90% dos casos da DP, a suscetibilidade parece ser determinada por variantes comuns no genoma que podem interagir com o ambiente. Dentre os fatores ambientais que modulam o risco para a DP estão: uso de pesticidas, exposição ocupacional a tóxicos, consumo de café e cigarro. A variabilidade na resposta à principal medicação da DP, a levodopa, parece também estar relacionada à genética do indivíduo. Dessa forma, o presente trabalho teve como objetivo a melhor compreensão dos fatores genéticos e suas interações com o ambiente envolvidos na suscetibilidade à DP e no tratamento com levodopa. Pacientes com DP e seus controles foram recrutados no ambulatório de distúrbios do movimento e no ambulatório de medicina interna do Hospital de Clínicas de Porto Alegre e da Universidade Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre, respectivamente. Os resultados obtidos foram organizados em cinco artigos. No primeiro estudo, foram considerados oito polimorfismos previamente associados à DP. Na nossa população, os indivíduos que possuíam sete ou mais alelos de risco desses polimorfismos apresentaram um odds ratio de 2,54 quando comparados a quem possuía seis alelos ou menos (95% IC 1,66-3,89; P = 1,80E−05). Esse ponto de corte foi escolhido porque o número médio de alelos de risco na amostra foi 7. No segundo artigo, portadores do genótipo TT do polimorfismo rs1021463 e dos genótipos TT ou GT do polimorfismo rs30196 do gene SV2C apresentaram um maior risco a DP quando expostos ocupacionalmente a tóxicos, quando comparado a não-expostos (respectivamente, OR 2,53; 95% IC 1,33-4,69; Pinteração = 0,008 e OR 2,30; 95% IC 1,21-4,36; Pinteração = 0,033). O terceiro artigo mostra uma associação em que fumantes com o haplótipo T- não G -T do transportador ABCB1 apresentaram menor risco a DP quando comparados a portadores do 9 haplótipo C-G-C (OR 0,34, 95% IC 0,15-0,72; Pinteração = 0,012). No quarto trabalho, foi constatada uma interação entre o gene NOS1 e a cafeína modulando o risco da DP (OR 0,24; 95% IC 0,10-0,54; Pinteração = 0,0002). O último artigo trata da farmacogenética da levodopa, em que foi proposto um modelo com variáveis genéticas, biológicas e farmacológicas que explicou 23% da variabilidade na dose (F = 11,54; P < 0,000001). Observou-se uma redução da média de dose em aproximadamente 76 mg/dia por cada alelo C nos genótipos do polimorfismo rs30196 do gene SV2C. Estes trabalhos enriqueceram o conhecimento da variabilidade da DP tanto em aspectos de suscetibilidade quanto farmacogenética. Os dados obtidos serão importantes na continuação das pesquisas para identificar biomarcadores para prevenção e tratamento da DP. / Parkinson’s disease (PD) is the second most common neurodegenerative disease in humans. PD etiology is multifactorial, due to several environmental and genetic factors. Pathologically, it is characterized by a selective destruction of dopaminergic neurons in substantia nigra pars compacta and by the accumulation of Lewy bodies in brain. In approximately 90% of PD cases, susceptibility seems to be driven by common variants in the genome that might interact with the environment. Among environmental factors that modulate PD risk, pesticides, occupational exposure to toxics, smoking and coffee consumption were identified. The variability in patients’ response to the main medication of PD, levodopa, seems also to be related to genetics. Therefore, the present work had the objective to understand the genetic factors and their interaction with the environment involved in PD susceptibility and in the treatment with levodopa. Patients and controls were recruited at the movement disorders ambulatory and at the internal medicine ambulatory at the Hospital de Clínicas de Porto Alegre and at Universidade Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre respectively. The main results obtained were organized in five manuscripts. In the first, eight polymorphisms previously associated with PD were considered. In our population, individuals with 7 or more risk alleles presented an odds ratio of 2.54 for PD when compared to those with 6 or less alleles (95% CI 1.66-3.89; P = 1.80E−05). This cut off was chosen because the average number of risk alleles in the sample was 7. In the second manuscript, SV2C rs10214163 TT genotype carriers and SV2C rs30196 TT/GT genotypes carriers showed a higher PD risk in subjects exposed to environmental toxics compared to those not exposed (respectively, OR 2.53; 95% CI 1.33-4.69; Pinteraction = 0.008 and OR 2.30; 95% CI 1.21-4.36; Pinteraction = 0.033). The third manuscript shows the association between ABCB1 T-non G-T haplotype and smoking (OR 0.34, 95% CI 0.15-0.72; Pinteraction = 0.012). In the fourth manuscript, an interaction between NOS1 gene and caffeine, modulating PD risk, was observed (OR 0.24; 95% CI 0.10-0.54; Pinteraction = 0.0002). The last manuscript reports a 11 model with genetic, biological and pharmacological variants in response to levodopa. This model explained 23% of dose variability (F = 11.54; P < 0.000001). The presence of each rs30196 C allele reduced the average dose in approximately 76 mg/day. All these work enriched the knowledge of the variability of PD in both susceptibility and pharmacogenetic areas. The data obtained will be important to identify biomarkers for disease prediction and treatment.

As enzimas CYP450 são as principais enzimas metabolizadoras de fármacos. Elas são codificadas por genes que apresentam polimorfismos gênicos que lhes confere características fenotípicas diversas. Estes fenótipos são: Metabolizadores Lentos ou PM, Metabolizadores Normais ou EM, Metabolizadores Intermediários ou IM e Metabolizadores Ultra-rápidos ou UM. A Farmacogenética é a ciência que estuda estas variações gênicas e sua relação com a resposta terapêutica no organismo. Entre as enzimas CYP450 se encontram as enzimas CYP2D6, que são responsáveis pelo metabolismo de 25% dos fármacos clinicamente prescritos. O objetivo principal deste estudo foi a identificação dos polimorfismos mais importantes deste gene: CYP2D6*1, CYP2D6*2, CYP2D6*3, CYP2D6*4, CYP2D6*5, CYP2D6*6, CYP2D6*10, CYP2D6*17 e CYP2D6*41 pelos métodos de Genotipagem (PCR Tetra Primer e Seqüenciamento) e Fenotipagem (analisado pelo Índice Metabólico) em 75 voluntários sadios da região de Campinas. Para a caracterização da Fenotipagem foi usada a substância teste Dextrometorfano (DM). Esta foi monitorada por espectrometria de massa mediante a determinação da concentração do seu principal metabólito o Dextrorfano (DX), que foi extraída das amostras de urina. Os resultados foram comparados entre estas duas metodologias e apresentaram alta correlação. Os resultados obtidos são a identificação das freqüências dos alelos *1, *3 e *4 pelo método PCR Tetra Primer (30.66%, 1.3% e 14%, respectivamente). O método de seqüenciamento detectou também outros alelos que não foram detectados pela PCR Tetra Primer. A avaliação do número de cópias do gene CYP2D6 também foi avaliada, detectando em um voluntário 3 cópias do gene CYP2D6, característica de metabolizadores Ultra-rápidos. Podemos afirmar que os métodos usados forneceram perfis dos polimorfismos de maneira rápida e prática. / The CYP450 enzymes are the major drug metabolizing enzymes. They are encoded by genes that show genetic polymorphisms which gives them several phenotypic characteristics. These phenotypes are Poor Metabolizers or PM, or Extensive Metabolizers or EM, Intermediate Metabolizers or IM, and finally, Ultra-rapid Metabolizers or UM. Pharmacogenetics is the science that studies these genetic variations and its relationship to therapeutic response in the body. One of CYP450 enzymes is CYP2D6 enzyme, which are responsible for the metabolism of 25% of clinically prescribed drugs. The main objective of this study was to identify the most important polymorphisms of this gene: CYP2D6 * 1, CYP2D6 * 2, CYP2D6 * 3, CYP2D6 * 4, CYP2D6 * 5, CYP2D6 * 6, CYP2D6 * 10, CYP2D6 * 17 and CYP2D6 * 41 by genotyping methods (PCR Tetra Primer and Sequencing) and phenotyping (by metabolic rate monitoring) in 75 healthy volunteers in Campinas region.To characterize the phenotyping was used to test substance Dextromethorphan (DM). This was monitored by mass spectrometry by determining the concentration of its major metabolite the Dextrorphan (DX), which was extracted from urine samples. The results were compared between these two methods and showed high correlation. We can obtain the identification of allelic frequencies of alleles * 1, * 3 and * 4 by Tetra Primer PCR (30.66%, 1.3% and 14% respectively). The sequencing method has also detected other alleles that were not detected by PCR Tetra Primer. The assessment of the number of copies of the CYP2D6 gene was also assessed. This method detected a volunteer which carrying three copies of CYP2D6 gene, characteristic of Ultra-rapid metabolizers. We can say that the methods used in this study provide polymorphism profiles quickly and conveniently.