Evalúa la variabilidad del medio interno de la gestante que va a ser sometida a cesárea electiva luego de infundir solución salina fisiológica, de manera rápida a un volumen de 12 mL/kg de peso corporal, en el Hospital San Bartolomé. Se seleccionaron al azar y por conveniencia a 15 gestantes a término que iban a ser sometidas a operación cesárea y, como parte del procedimiento anestésico, al inicio se le infundió 12 mL/kg de cloruro de sodio al 0,9 %. Se tomaron dos muestras venosas, la primera antes de la anestesia regional y la segunda al inicio de la extracción fetal. En ambos casos las muestras fueron analizadas con una demora máxima de 15 minutos. El equipo usado fue Rapid Lab 1265 marca SIEMENS. El pH, la cloremia y la bicarbonatemia tuvieron una variabilidad significativa (p< 0,05) no así el sodio. Se demostró la variabilidad significativa del medio interno por la rápida administración endovenosa de cloruro de sodio al 0,9 %. / Tesis

Evalúa la sinergia de la asociación de antibióticos utilizados en productos farmacéuticos de uso veterinario, los cuales contienen amoxicilina, norfloxacino, gentamicina, fosfomicina, ciprofloxacino y se analizan las asociaciones de las mismas: amoxicilina-gentamicina, ciprofloxacino-fosfomicina, amoxicilina-norfloxacino. Para determinar la concentración mínima inhibitoria (CMI) se utilizan diferentes concentraciones de las materias primas utilizadas en la fabricación de estos productos utilizando la metodología de microdilución por tablero de ajedrez. Esto se evalúa frente a aislados clínicos tales como S. aureus y E. coli. Se halla que hubo sinergismo parcial para S. aureus en las asociaciones de materias primas de amoxicilina-gentamicina con las microdiluciones 32-2 μg/mL, 16-4 μg/mL, 4-8 μg/mL, 4-4 μg/mL, 2-4 μg/ mL y 1-4 μg/mL y sinergismo en la asociación amoxicilina-norfloxacino con las microdiluciones 2-1 μg/mL, 1-1 μg/mL, 0,5-1 μg/mL, 0,25-1 μg/mL, 0,12-1 μg/mL y 0,06-1 μg/mL, así como en la asociación de ciprofloxacino-fosfomicina para la microdilución 16-4 μg/mL. En E. coli se observa sinergismo parcial en las tres asociaciones antes mencionadas. amoxicilina-gentamicina con las microdiluciones 32-0.12 μg/mL, 32-0.25 μg/mL,32-0.5 μg/mL,32-1 μg/mL y 16-2 μg/mL, amoxicilina-norfloxacino con las microdiluciones 16-0,12 μg/mL y 16-0,25 μg/mL y ciprofloxacino-fosfomicina con las microdiluciones 32-2 μg/mL, 16-4 μg/mL, 8-4 μg/mL, 4-4 μg/mL , 2-4 μg/mL. Se concluye que para S. aureus se halla sinergismo parcial en las asociaciones de amoxicilina/gentamicina y sinergismo en la asociación de amoxicilina/norfloxacino y ciprofloxacino/ fosfomicina. En E. coli se obtiene sinergia parcial en las asociaciones de amoxicilina/gentamicina, amoxicilina/norfloxacino y ciprofloxacino/ norfloxacino. / Tesis

Publicación a texto completo no autorizada por el autor / Compara la actividad antioxidante in vitro de los polisacáridos extracelulares de las cianobacterias Nostoc sphaericum y Nostoc commune recolectados en la laguna de Patococha, región Ancash; así como, la comparación de sus actividades. El tamizaje fitoquímico se realizó mediante los reactivos de Molish, antrona, ninhidrina, tricloruro férrico, gelatina, Shinoda, Fehling, Lieberman Bouchardat, Dragendorff, Mayer, Rosenheim, hidroxilamina, vainillin sulfúrico, Bertrand, Sonenheim y Bornträger. La actividad antioxidante de los polisacáridos se determinó por neutralización de los radicales: 1,1-difenil-2-picril-hidrazilo (DPPH) y ácido 2,2’-azinobis (3- etilbenzotiazolin)-6-sulfónico (ABTS). La comparación de las actividades antioxidantes de los polisacáridos extracelulares se realizó mediante análisis estadísticos ANOVA y T-student, utilizando el paquete IBM SPSS 24.0. En los extractos se evidenciaron presencia de carbohidratos, azúcares reductores, esteroides o triterpenos, alcaloides, catequinas y antocianinas, saponinas y antraquinonas en ambas cianobacterias. En la evaluación de la actividad antioxidante, los polisacáridos extracelulares de Nostoc sphaericum presentaron un IC50=2,068 mg/mL y un IC50=4,398 mg/mL en el ensayo de DPPH y ABTS, respectivamente, mientras que los polisacáridos extracelulares de Nostoc commune presentaron un IC50=2,482 mg/mL y un IC50=17,837 mg/mL en el ensayo de DPPH y ABTS, respectivamente. El análisis estadístico reveló que no existe diferencia significativa entre actividad antioxidante de polisacáridos extraceulares del Nostoc sphaericum y Nostoc commune medidos por el método de DPPH; sin embargo, sí existe diferencia significativa entre actividad antioxidante de los polisacáridos extracelulares de dichas especies medido por el método de ABTS. Se concluye que los polisacáridos extracelulares de Nostoc sphaericum presentaron una mayor actividad antioxidante que los polisacáridos extracelulares de Nostoc commune. / Tesis

El sistema nervioso consiste en una red muy compleja de billones de neuronas que se comunican entre sí. Las sinapsis químicas son primordiales para la comunicación neuronal rápida y eficiente, y están mediadas por la liberación de neurotransmisores a la hendidura sináptica para unirse a sus receptores específicos ubicados en otras células o neuronas postsinápticas. Entre los receptores de neurotransmisores se encuentran los receptores Cys-loop, que pertenecen a la superfamilia de canales pentaméricos activados por ligando (pLGIC). Son proteínas integrales de membrana que convierten la señal química en una respuesta eléctrica al permitir el paso de iones de un lado a otro de la membrana. Estos receptores se constituyen por 3 regiones fundamentales, el dominio extracelular, donde se encuentra el sitio de unión del neurotransmisor o sitio ortostérico; el dominio transmembrana, que conforma el poro del canal y contiene los sitios de unión para diferentes moduladores alostéricos; y el dominio intracelular que posee sitios de modulación y aminoácidos determinantes de la conductancia del canal. En vertebrados, esta familia de receptores está formada por los receptores nicotínicos de acetilcolina y el receptor de serotonina tipo 3 (5-HT3), los cuales son permeables a cationes, y por los receptores de ácido γ-aminobutírico tipo A (GABAA) y receptores de glicina, permeables a aniones. El repertorio de receptores Cys-loop en invertebrados es más variado y extenso, incluyendo entre ellos un canal aniónico activado por serotonina, denominado MOD-1. Los receptores Cys-loop son ampliamente estudiados por ser blancos moleculares terapéuticos en una extensa variedad de patologías. Es por ello por lo que ampliar el conocimiento de la función y modulación de estos receptores permitirá generar mejores estrategias farmacológicas. En esta Tesis Doctoral se realizaron estudios de la función y modulación de los receptores Cys-loop activados por serotonina humano, 5-HT3, y de Caenorhabditis elegans, MOD-1, para la búsqueda de nuevos fármacos y la generación de estrategias de reposicionamiento de medicamentos de uso clínico. En el Capítulo 1 se estudió la funcionalidad molecular del receptor 5-HT3A humano. Se logró descifrar las diferencias entre la activación ortostérica y la activación y modulación alostérica por terpenoides, utilizando la valiosa técnica de patch-clamp. Se definieron las bases mecanísticas de la activación de 5-HT3A por los agonistas ortostéricos serotonina y triptamina, y de la activación alostérica por los terpenoides timol y carvacrol. Se demostró que triptamina es un agonista de muy baja eficacia y potencia. Mediante registros de whole-cell, se demostró que los terpenoides potencian las corrientes evocadas por serotonina, pero también poseen capacidad para evocar alostéricamente respuestas macroscópicas, con mayor potencia y eficacia que triptamina, aunque de forma más lenta que serotonina. Mediante registros de canal único, se evidenció que dichos compuestos activan al receptor 5-HT3 como agonistas muy eficaces dado que generan episodios de activación más prolongados que serotonina. Nuestro estudio mostró la primera caracterización a nivel de canal único de la activación de 5-HT3A humano por ligandos alostéricos, de creciente interés como herramientas terapéuticas. En el Capítulo 2 se halló un nuevo blanco promisorio para la terapia antihelmíntica, estudiando ampliamente al receptor MOD-1 de C. elegans. Este nematodo es un buen modelo parasitario ya que comparte las características funcionales y farmacológicas con los nematodos parasitarios. Además C. elegans es sensible a la mayoría de los fármacos antiparasitarios que están dirigidos a los receptores Cys-loop de los parásitos. Dado que MOD-1 está ausente en vertebrados, se encuentra limitado al filo, y está presente en nematodos parasíticos, emerge como un blanco farmacológico promisorio. En este capítulo se revelaron las diferencias en la selectividad agonista y en los sitios ago-PAM entre MOD-1 y el receptor de serotonina humano 5-HT3. Se encontró que la triptamina, un agonista muy parcial de 5-HT3A, es un agonista eficaz de MOD-1, y se demostró además que posee una acción antihelmíntica. Por otro lado, se realizó un testeo de una variedad de compuestos en búsqueda de nuevos moduladores de MOD- 1. Se demostró, mediante estudios electrofisiológicos, que muscimol y piperazina (PZE) son antagonistas no competitivos de MOD-1. Mediante ensayos de comportamiento en gusanos se confirmó el efecto de PZE sobre MOD-1, hallando de esta manera un nuevo blanco molecular para este fármaco de uso antiparasitario. Estos estudios ampliaron el conocimiento de receptores Cys-loop de nematodos para el descubrimiento de nuevos compuestos con actividad nematicida. Por lo tanto, se concluye que, derivados de triptamina y PZE podrían ser explorados como nuevos compuestos con potencial actividad antiparasitaria. En el Capítulo 3, se comenzó a plantear estrategias para reposicionar medicamentos de uso clínico, para lograr superar las desventajas de generar un fármaco de novo, acortando los tiempos y recursos necesarios para realizar los estudios farmacológicos, famacocinéticos y de toxicidad requeridos para la producción de nuevos fármacos dirigidos a tratar patologías en las que los receptores estudiados en esta Tesis están involucrados. Con tal fin, se exploró el efecto de fármacos de uso comercial derivados de triptamina y PZE, debido a lo postulado en el capítulo 2, y se encontró que sumatriptan, un fármaco comercializado para tratar la migraña, sería un buen candidato para reposicionar para la terapia antiparasitaria. Además, PZE podría reutilizarse como modulador alostérico negativo de los receptores 5-HT3A humano abordando patologías en las que este receptor está involucrado, tales como náuseas y vómitos relacionados a la quimioterapia, radioterapia y anestesia, así como para mitigar los síntomas del síndrome de intestino irritable y para patologías del sistema nervioso como depresión, ansiedad y esquizofrenia, entre otras en las que este receptor está involucrado. En resumen, aprovechando la potencialidad que brindan los registros de canal único y de corrientes macroscópicas en el estudio de las bases moleculares del funcionamiento y modulación de estos receptores Cys-loop, se logró hallar un nuevo blanco antiparasitario, descifrar por primera vez las diferencias de activación ortostérica y alostérica del receptor 5-HT3A humano por timol y carvacrol, y generar estrategias de reposicionamiento de fármacos de uso clínico mediante la modulación alostérica de estos receptores tanto en C. elegans como en humano. Estos estudios amplían el conocimiento de la función y modulación de los receptores Cys-loop, generando una base para abordar patologías que involucran a estos receptores y para el desarrollo de nuevos y más selectivos fármacos. / The nervous system consists of a highly complex network of billions of neurons that communicate with each other. Chemical synapses are key to the rapid and efficient neuronal communication and are mediated by the release of neurotransmitters into the synaptic cleft to bind to their specific receptors located either on other cells or postsynaptic neurons. Among the neurotransmitter receptors are the Cys-loop receptors, which belong to the superfamily of ligand-gated pentameric channels (pLGIC). They are integral membrane proteins that convert the chemical signal into an electrical response by allowing ions to pass from one side of the membrane to the other. These receptors are made up of 3 fundamental regions: the extracellular domain, where the neurotransmitter binding site or orthosteric site is located; the transmembrane domain, which forms the channel pore and contains the binding sites for different allosteric modulators; and the intracellular domain which contains modulation sites and amino acids that determine channel conductance. In vertebrates, this family of receptors consists of the nicotinic acetylcholine receptors and the serotonin receptor type 3 (5- HT3), both of which are permeable to cations, and the receptors for γ-aminobutyric acid type A (GABAA) and glycine receptors, permeable to anions. The repertoire of Cys-loop receptors in invertebrates is more varied and extensive, including among them, a serotonin-activated anion channel called MOD-1. Cys-loop receptors have been extensively studied as they are therapeutic molecular targets in a wide variety of pathologies. Expanding our knowledge on the function and modulation of these receptors will therefore contribute to generating better pharmacological strategies for the treatment of these disorders. In this Ph. D. thesis studies were carried out on the function and modulation of the Cys-loop receptors activated by human serotonin, 5-HT3, and of Caenorhabditis elegans, MOD-1, for the search for new drugs and the generation of repositioning strategies for drugs for clinical use. In Chapter 1 the molecular functionality of the human 5-HT3A receptor was studied. It was possible to decipher the differences between orthosteric activation and allosteric activation and modulation by terpenoids, using the valuable patch-clamp technique. The mechanistic bases of 5-HT3A activation by the orthosteric agonists serotonin and tryptamine, and allosteric activation by the terpenoids thymol and carvacrol, were defined. It is revealed that tryptamine is an agonist with very low efficacy and potency. Using whole-cell recordings, they show that terpenoids not only potentiate the currents evoked by serotonin but also have the ability to allosterically evoke macroscopic responses, with greater power and efficiency than tryptamine, although more slowly than serotonin. Using single channel recordings, these compounds were shown to activate the 5-HT3A receptor as highly effective agonists, since they generate longer episodes of activation than serotonin. Our study showed the first characterization at the single channel level of the activation of human 5-HT3A by allosteric ligands, of increasing interest as therapeutic tools. In Chapter 2, a promising new target for anthelmintic therapy was found by extensively studying the MOD-1 receptor of C. elegans. This nematode is a good parasitic model since it shares functional and pharmacological characteristics with parasitic nematodes. In addition, C. elegans is sensitive to most antiparasitic drugs that are directed at the Cys-loop receptors of the parasites. Since MOD-1 is absent in vertebrates, limited to the phylum, and present in parasitic nematodes, it emerges as a promising drug target. In this chapter we revealed the differences in agonist selectivity and ago-PAM sites between MOD-1 and the human serotonin 5-HT3 receptor. Tryptamine, a very partial agonist of 5-HT3A, was found to be an effective agonist of MOD-1, and was further shown to have an anthelmintic action. On the other hand, we carried out a test of a variety of compounds in search of new modulators of MOD-1. We demonstrated by means of electrophysiological studies that muscimol and piperazine (PZE) are non- competitive antagonists of MOD-1. Also, through behavioral tests in worms, we confirmed the effect of PZE on MOD-1, thus finding a new molecular target for this drug for antiparasitic use. These studies have considerably expanded the knowledge of nematode Cys-loop receptors for the discovery of new compounds with nematicidal activity. We conclude that tryptamine and PZE derivatives could be explored as new compounds with potential antiparasitic activity. In Chapter 3, we began to propose strategies to reposition drugs for clinical use in order to overcome the disadvantages of generating a new drug, shortening the time and resources necessary to perform the pharmacological, pharmacokinetic, and toxicity studies required for the production of new drugs aimed at treating pathologies in which the receptors studied in this Ph. D. thesis are involved. To this end, the effect of drugs in commercial use derived from tryptamine and PZE was explored based on the results collected in Chapter 2. It was found that sumatriptan, a drug marketed to treat migraine, appears to be a good candidate to reposition for antiparasitic therapy. In addition, PZE could be reused as a negative allosteric modulator of human 5-HT3A receptors, addressing pathologies in which this receptor is involved, such as nausea and vomiting related to chemotherapy, radiotherapy, and anesthesia, as well as to alleviate the symptoms of irritable bowel syndrome and for pathologies of the nervous system, such as depression, anxiety and schizophrenia, among others in which this receptor is involved. Summing up, taking advantage of the potential offered by single channel recordings and macroscopic currents in the study of the molecular bases of the functioning and modulation of the Cys-loop receptors explored in this Ph. D. thesis, it was possible to: i) find a new antiparasitic target, ii) to decipher for the first time the differences of orthosteric and allosteric activation of the human 5-HT3A receptor by thymol and carvacrol, and iii) to generate drug repositioning strategies for clinical use through allosteric modulation of these receptors in both C. elegans and humans. These studies broaden the knowledge of the function and modulation of Cys- loop receptors, generating a basis for addressing pathologies that involve these receptors as well as for developing new and more selective drugs.

El presente trabajo de Tesis tuvo por objetivo el estudio de la reacción de oxidación catalítica selectiva del grupo tioéter (-S-) presente en los fármacos benzimidazólicos llamados albendazol, fenbendazol y triclabendazol para obtener las moléculas farmacológicamente activas conocidas como albendazol sulfóxido, fenbendazol sulfóxido y triclabendazol sulfóxido. Para tal fin se prepararon varios catalizadores heterogéneos a base de molibdeno soportado en nanoestructuras de carbono. La incorporación de la fase activa (Mo) se realizó mediante impregnación húmeda, con posterior calcinación durante 4 horas a la temperatura de 400°C. En la preparación de dichos catalizadores heterogéneos se utilizó ácido molibdatofosfórico (Mo20O3·P2O5·51H2O) como fuente de molibdeno y nanoestructuras de carbono, a base de nanotubos de carbono de múltiple capa, como soporte catalítico. De esta manera se prepararon tres tipos de catalizadores con diferente área superficial y diámetro promedio de poro: CAT1 (699 m2/g, 33nm), CAT2 (342 m2/g, 100nm) y CAT3 (755 m2/g, 35nm). En la reacción de oxidación catalítica se utilizó urea peróxido de hidrógeno (H2NCONH2·H2O2) como agente oxidante y metanol como medio de reacción (CH3OH). Las pruebas cualitativas se efectuaron a 48 y 72 horas de reacción. Los estudios cinéticos y de estabilidad se llevaron a cabo en intervalos de tiempo desde el minuto inicial hasta completar los 60 minutos de reacción. La caracterización físico química de las nanopartículas de carbono y de los catalizadores preparados se realizó utilizando las técnicas de adsorción-desorción de N2 (BET) y microscopía electrónica de barrido (SEM). La identificación y cuantificación de los productos de reacción catalítica se realizó mediante espectroscopia infrarroja con transformada de Fourier (FTIR) y cromatografía líquida de alta performance (HPLC). Los resultados del presente estudio indicaron que la reacción de oxidación catalítica sólo fue efectiva en albendazol, obteniéndose albendazol sulfóxido con un rendimiento, selectividad y conversión mayores al 90% después de 60 minutos de reacción. Sin embargo, después de utilizar los mismos catalizadores en una segunda reacción de oxidación de 60 minutos de duración, los estudios de estabilidad de los catalizadores estudiados reportaron hasta 50% y 60% de conversión y selectividad, respectivamente. Finalmente, en relación con la eficiencia de los catalizadores ensayados se estableció el siguiente orden descendente: CAT1 > CAT3 > CAT2 / Tesis

Residencia para optar al Título de Profesional Especialista en Farmacia Clínica y Atención Farmacéutica / En Chile, los adultos mayores (AM) tienen una mayor prevalencia de enfermedades crónicas no transmisibles, más episodios de enfermedades agudas y se hospitalizan en una proporción de 2,6 veces más que la población general. Durante la hospitalización están expuestos a medicamentos que podrían ser potencialmente inapropiados (MPI), así como también, a desarrollar problemas relacionados con medicamentos (PRM). El objetivo del estudio fue optimizar las terapias farmacológicas de los adultos mayores ≥65 años hospitalizados en una Unidad Geriátrica de Agudos (UGA). A través de un estudio de seguimiento farmacoterapéutico prospectivo e intensivo se desarrollaron intervenciones farmacéuticas a los pacientes AM ≥65 años hospitalizados en la UGA del Hospital Clínico de la Universidad de Chile (HCUCH), que las necesitaran y que cumplieran los criterios de selección. Se registró la información desde fichas clínicas, entrevistas y visitas médicas. La presencia de MPI fue evaluada con los Criterios de Beers 2003 y los PRM clasificados de acuerdo a la categorización de Cipolle, Strand y Morley. Los datos fueron analizados con estadística descriptiva y comparativa utilizando STATA 10.1®. De los 84 pacientes evaluados durante el período en estudio 70(83,3%) cumplieron los criterios de selección. A 26 (37,1%) pacientes se les administró al menos un MPI, principalmente ácido acetil salicílico en uso concomitante con terapia anticoagulante oral (35,5%), amiodarona (19,4%) y analgésicos antiinflamatorios no esteroidales en uso concomitante con terapia anticoagulante oral (19,4%). La severidad de los MPI encontrados fue alta para el 90,3% de los casos. El número promedio de medicamentos para los pacientes con MPI fue significativamente superior al de los pacientes sin MPI, 11,7 ± 5,0 y 8,6 ± 3,7, respectivamente (p<0,01). El 95,7%(67) de los pacientes presentó a lo menos un PRM. De los 568 PRM encontrados, 353(62,1%) fueron problemas en el cumplimiento de la terapia. Se realizaron intervenciones a los profesionales y personal de apoyo dirigidas a resolver PRM, obteniéndose un promedio de 4,2 ± 3,3 intervenciones/paciente. El 96,3%(284) de las intervenciones fueron aceptadas. Entre las intervenciones realizadas destacan la suspensión de medicamentos en 42(14,2%) casos, el ajuste de dosis en 30(10,2%) y el ajuste de los horarios de administración en 30(10,2%). Las intervenciones farmacéuticas permitieron resolver y prevenir problemas relacionados con medicamentos y disminuir la tasa de prescripción de medicamentos potencialmente inapropiados en AM hospitalizados. Sería conveniente evaluar las consecuencias clínicas, económicas y humanísticas de dichas intervenciones a través de estudios posteriores / In Chile elderly people has a higher prevalence of non transmissible chronic disease, more episodes of acute diseases, and us are hospitalized 2.6 more times than general population. During the hospitalization they as a higher risk for receiving potential inappropriate medications (PIM), as well to develop drug related problems (DRP). The aim of this study was to optimize pharmacotherapy use in inpatients elderly people ≥65 years old in an Acute Geriatric Unit (AGU). An intensive follow-up and prospective study was carried out developing pharmaceutical interventions in a hospitalized elderly people aged ≥65 years an AGU of Hospital Clínico de la Universidad de Chile, who met selection criteria. PIM was identified using Beers¢ Criteria 2003 and DRP classified by Minnesota Project. Data analyses were performed using STATA 10.1®. Of a total of 84 patients, 70 (83.3%) met selection criteria. At least one PIM was prescribed in 26 (37.1%) patients, mainly acetyl salicylic acid and non steroidal anti-inflammatory analgesics concomitantly with oral anticoagulant therapy (35,5% and 19,4% respectively), and also amiodarone (19,4%). High severity of PIM was found in 90.3% of cases. Mean number of medication/patient with PIM (11.7±5.0) and was significantly higher (p<0.01) than patient without PIM (8.6±3.7). Sixty seven (95.7%) patient had at least one DRP. Of 568 DRP detected, 353(62.1%) were problems associated to compliance. Pharmaceutical intervention were done to professionals and health care team to resolved DRP, founding a men of 4.2±3.3 interventions/patient. Thes intervention were accepted in 96.3% (284) of cases and included stop therapy (14.2%), change of doses (10,2%) and change of time administration (10,2%). Pharmaceutical interventions can help to resolve and prevent DRP as well as to reduce rate of prescription of potential inappropriate medication in hospitalized elderly. Future studies should be conducted to assess the impact of pharmacist interventions on clinical, economic and humanistic outcomes

Publicación a texto completo no autorizada por el autor / Determina la incidencia de E. coli formadora de biopelículas y resistente a antibióticos aisladas del Hospital Cayetano Heredia, se lleva a cabo un estudio observacional, descriptivo, prospectivo y serie de casos donde se recolectaron 100 cepas de E.coli aisladas de muestras de orina de pacientes con ITU del Hospital de biopelículas por microtitulación con tinción de CV, durante noviembre a diciembre del 2017, se verifican sus características fenotípicas en agar MacConkey y la prueba bioquímica IMVIC, además se realiza el ensayo caracterización molecular por PCR convencional para el gen usp, y Multiplex PCR para los genes fim H, hly A, agn 43, electroforesis y antibiograma mediante difusión de discos. / Tesis

El tratamiento de la anticoagulación oral con AVK es complicado debido a que las propiedades farmacodinámicas, farmacocinéticas y su estrecho margen terapéutico, nos llevan a una respuesta variable e impredecible. La variabilidad interindividual al tratamiento con acenocumarol depende de factores no genéticos como la edad, peso, alcohol, tabaquismo, ingesta de vitamina K, interacciones farmacológicas, comorbilidad y factores genéticos siendo las variantes alélicas de los genes CYP2C9 y VKORC1 las más estudiadas en cuanto a la influencia que tienen sobre la respuesta al acenocumarol. Otras variantes alélicas en otros genes tales como Apoliporoteina E (ApoE), α-1 glicoproteina ácida (ORM1-2), Calumenina y Proteina C (PROC) pueden mostrar influencia en la respuesta anticoagulante con acenocumarol. El objetivo de nuestro estudio fue valorar la utilidad de un suplemento de vitamina K en pacientes con fibrilación auricular no valvular y enfermedad tromboembólica venosa, que empezaban tratamiento con acenocumarol, con el fin de optimizar el tiempo de anticoagulación en rango terapéutico (INR 2.0-3.0) tanto en la fase aguda como crónica de la anticoagulación. Además se evaluó la asociación entre los polimorfismos genéticos CYP2C9 (rs1799853, rs1057910), VKORC1 (rs 9923231), ApoE (rs429358, rs7412), ORM1-2 (rs1687390, rs3762055), Calumenina (rs2290228), PROC (rs2069919) tanto con el tiempo como con la dosis necesaria de acenocumarol para alcanzar y mantener el INR en rango terapéutico, permitiéndonos mejorar la eficacia del tratamiento, así como disminuir el número de visitas de control y la aparición de episodios de hemorragia severa consiguiéndose una monitorización más coste-efectiva. Estos objetivos se quisieron confirmar con la realización de un ensayo clínico, en el Hospital General Universitario Santa Lucia, aprobado por el Cómité Ético de Investigación Clínica de dicho hospital y por la Agencia Española del Medicamento y Productos Sanitarios (AEMPS), la cual también permitió que se realizara en el Servicio de Farmacia la solución de vitamina K (100μg/ml) y placebo que se les dispensaba a los pacientes participantes en el ensayo tomándose diariamente junto con su dosis de acenocumarol. A todos los pacientes del ensayo se les controló la ingesta de vitamina K en la dieta y se realizó un seguimiento farmacoterapéutico para evitar posibles interacciones y la aparición de efectos adversos. La dosis de inicio de acenocumarol fue 2mg ó ≥3mg y los pacientes que empezaron con una dosis ≥3mg y llevaron solución de vitamina K alcanzaron más rápido el INR terapéutico (2.0-3.0). También se confirmó que los pacientes con un aporte de vitamina K necesitaron más dosis de acenocumarol. Con respecto a los polimorfismos, destacar CYP2C9 (*2 y*3) que alcanzaron en menos tiempo el INR terapéutico, y sobre todo pacientes con el genotipo CA en CYP2C9*3. No se observó asociación entre el TRT y los diferentes polimorfismos estudiados. En cuanto al polimorfismo rs2069919 en PROC destaca el genotipo AA que se asocia con menos mg de acenocumarol semanal necesarios para mantener el INR en rango terapéutico y el genotipo AG con una tendencia a necesitar menos mg de acenocumarol al inicio del tratamiento. Con respecto al estudio de los polimorfismos de los genes Calumenina, ApoE y ORM1-2 nos ofrecen cierta información sobre su relación con el acenocumarol. No se presentó durante el ensayo ningún acontecimiento adverso, ni de hemorragias, ni de sobrecoagulación por lo que no podemos asociar ningún polimorfismo como valor predictivo. Serían necesarios más estudios para clarificar el papel de la vitamina K y la influencia de los polimorfismos en la estabilidad de la anticoagulación con acenocumarol con el fin de mejorar la eficacia y seguridad. / Treatment of oral anticoagulation with VKA is complicated because of the pharmacodynamic properties, pharmacokinetics and its narrow therapeutic margin, leading us to a variable and unpredictable response. The interindividual variability in acenocoumarol depends on non-genetic factors such as age, weight, alcohol, smoking, intake of vitamin K, drug interactions, comorbidities and genetic factors being allelic variants of the CYP2C9 and VKORC1 genes the most studied in terms of influence in the response to acenocoumarol. Other allelic variants in other genes such as Apolipoprotein E (ApoE), α -1 -Acid glycoprotein (ORM1-2), Calumenin and Protein C (PROC) can show influence in the anticoagulant response to acenocoumarol. The aim of our study was to assess the usefulness of vitamin K supplement in patients with non -valvular atrial fibrillation and venous thromboembolism, who began treatment with acenocoumarol, in order to optimize the time in therapeutic range of anticoagulation (INR 2.0-3.0) in both acute and chronic anticoagulation. Also the association was evaluated between CYP2C9 genetic polymorphisms ( rs1799853 , rs1057910 ) , VKORC1 (rs 9923231 ) , ApoE ( rs429358 , rs7412) , ORM1-2 ( rs1687390 , rs3762055 ) Calumenin ( rs2290228 ) , PROC ( rs2069919 )with both the time and the necessary dose of acenocoumarol to achieve and maintain the INR within the therapeutic range , allowing us to improve treatment efficacy and reduce the number of monitoring visits and the appearance of episodes of severe bleeding achieving a more cost - effective monitoring. The confirmation of these goals was intended by a clinical trial carried out at the University General Hospital Santa Lucia, approved by the Clinical Research Ethics Committee of the hospital and the Spanish Agency for Medicines and Health Products (AEMPS), which also allowed the production of vitamin K solution (100µg / ml) and placebo in the Pharmacy Service that were served to patients participating in the trial, taken daily along with the dose of acenocoumarol. The intake of vitamin K was controlled in all the patients in the trial and drugs treatments were followed to avoid possible interactions and the occurrence of adverse effects. The staring dose was 2 mg or ≥3mg of acenocoumarol with patients who had started with a dose ≥3mg of vitamin K solution reaching faster therapeutic INR`s (2.0-3.0). It was also confirmed that patients with vitamin K supplements needed more doses of acenocoumarol. Regarding polymorphisms, CYP2C9 (* 2 and * 3) reached the therapeutic INR in less time especially in patients with CA CYP2C9 * 3 genotype. None of the gene variables analyzed was associated with TRT. T As for the rs2069919 polymorphism in PROC it highlights the AA genotype that is associated with fewer weekly mg of acenocoumarol necessary to maintain the INR within the therapeutic range and genotype AG with a tendency to need less mg of acenocoumarol at baseline. Regarding the study of polymorphisms of Calumenin, and ApoE genes ORM1-2 it offers us specific information about the relationship with acenocoumarol. No adverse event was presented during the trial, neither bleeding, or excessive coagulation so we cannot associate any polymorphism as a predictive value. Further studies would be needed to clarify the role of vitamin K and the influence of polymorphisms in the stability of anticoagulation with acenocoumarol in order to improve the efficiency and safety.

El propósito de esta Tesis Doctoral ha sido profundizar y ampliar los conocimientos sobre la distribución, biosíntesis y metabolismo de las furanocumarinas e isoflavonas en B. bituminosa. La importancia y el interés por estos metabolitos secundarios reside en su aplicabilidad en biomedicina, ya que al ser irradiadas con luz UV, establecen uniones covalentes con el ADN y con proteínas, modulando, la regulación génica o la actividad de determinados enzimas. Ha demostrado ser efectivo contra distintas enfermedades autoinmunes y diversos tipos de cáncer. Por otro lado, las isoflavonas, son consideradas moduladores selectivos del receptor de estrógenos (SERM´s), pudiendo estar implicadas tanto en el crecimiento como en la muerte celular. Uno de nuestros objetivos, ha sido la de encontrar un material vegetal, con una producción lo suficientemente alta como para establecerse como materia prima para la producción comercial de estos compuestos, y B. bituminosa ha mostrando uno de los mayores niveles de FC´s e isoflavonas de todos los materiales vegetales analizados. Durante el presente trabajo, se ha optimizado un método analítico, rápido, preciso y eficaz, y se han analizado los niveles de FC´s e isoflavonas, de distintas variedades y poblaciones de B. bituminosa, por toda la cuenca mediterránea e Islas Canarias. Seleccionando aquellas, que presentaban una biosíntesis mayoritaria de FC´s lineales y por otro lado, individuos con una biosíntesis mayoritaria de FC´s angulares. Se establecieron plantaciones experimentales, de las cuales surgieron dos clones de B. bituminosa, clon Psoraleno (96% de FC´s lineales) y B. bituminosa, clon Angelicina (75% de FC´s angulares). Se estudió tanto la evolución en la acumulación de FC´s como su distribución en planta, así como la modulación de su ruta biosíntética. Observándose un patrón de distribución característico, donde las FC´s se localizan predominantemente en la parte aérea de la planta, mientras que las isoflavonas, se localizan en la parte radicular, siendo inducidas ambas moléculas, por determinados precursores, como el ácido cinámico o umbeliferona, por metales como el Mg2+ o el Cu2+ y por algunos efectores hormonales como el MeJa. Además se ha identificado, purificado y caracterizado bioquímica y molecularmente una enzima, implicada directamente en el metabolismo de las FC´s, como es una ß-glucosidasa específica de furanocumarinas glicosiladas, (BbFCbG), la cual, pertenece a la familia 1 de las glicosil hidrolasas. Esta enzima, presenta una alta especificidad por las FC´s conjugadas, debido a la sustitución de un residuo de ácido glutámico, en el centro activo, por uno de glutamina. Este hecho ocurre con sustratos que tienen una reactividad lo suficientemente alta como para no necesitar catálisis ácida, y en el caso de las furanocumarinas, la catálisis básica recaería sobre el grupo hidroxilo del grupo carboxilo presente en el anillo lactona de la propia furanocumarina, lo que podría ser la razón de la elevada especificidad de esta enzima por las furanocumarinas. Esta enzima además, está implicada en la respuesta defensiva frente a heridas, mostrando una inducción de su transcripción al realizar heridas en la planta o al tratarla con MeJa. Por último, se llevó a cabo un estudio del metabolismo de FC´s durante el proceso germinativo y se analizó cómo varían los niveles de BbFCbG durante dicha etapa del desarrollo vegetal, mostrando una hidrólisis de FC´s conjugadas en los cotiledones, así como un aumento en la expresión de esta enzima en ese órgano. Además, en la activación de BbFCbG están implicadas fitohormonas como el GA3 y el MeJa y en menor medida la 6-BA. Para el desarrollo de estos objetivos se han utilizado numerosas técnicas de instrumentación científica (HPLC, MS/MS, TOF, RMN), así como técnicas bioquímicas y moleculares, las cuales, nos han permitido avanzar en el conocimiento del metabolismo de estos compuestos. / SUMMARY The aim of this PhD Thesis has been deepen and broaden the knowledge about the distribution, biosynthesis and metabolism of furanocoumarins (FC´s) and isoflavones in B. bituminosa. The importance and interest of these secondary metabolites is its aplicability in biomedicine, such to be able to, when they are irradiated with UV light, to establish covalents unions with both DNA and proteins, modulating gene regulation or activity of certain enzymes, which has been demostrated to be effective agains various autoinmune diseases and cancers. Furthermore, isoflavones are considered selective estrogen receptor modulators (SERM´s) and they may be involved in both cell growth and cell death. One of our goals in this report, has been to find a plant material, with a high enough production of these metabolites in order to establish itself as raw material for commercial production of these compunds and so B. bituminosa has been shown one of the highest amounts of FC´s and isoflavones content in the analyzed plant kingdom. In this work, it has been optimized an analytical, fast, accurate and efficient method for quantification of differents FC´s and isoflavones, previously identified in B. bituminosa. In addition, It has done a prospecting, analyzing FC´s and isoflavones levels of several varieties and populations of B. bituminosa throughout the mediterranean basin and Canary Islands, selecting all of them, that met with our requirements: a majority biosynthesis of linear FC´s, or angular FC´s. We have been established two experimental plantations with selected plants, in which, we selected two plants to be candidates, one of them, called Psoralen clone (96% linear FC´s content) and other one, called, Angelicin clone (75% angular FC´s content). It has been studied the evolution in FC´s accumulation, their distribution in plants and the modulation of the biosynthetic pathway. We observed a characteristic pattern of distribution, where FC´s are located predominantly in the aerial parts of the plants while isoflavones are located in the root part of the plant, being both molecules induced by certain precursors, such as cinnamic acid and umbelliferone, by metals, such as Mg2+ or Cu2+ and some hormonal effectors as MeJa. Otherwise, it has been identified, purified and characterized an enzyme directly involved in the metabolism of the FC´s, as specific ß-glucosidase of furanocoumarins (BbFCbG), which belongs to family 1 of glycosyl hidrolases. This enzyme has a high specifity againts conjugate FC´s, due to the sustitution of a glutamic acid residue, located at the active site of the enzyme, by a glutamine one. This fact occurs with substrates that have a reactivity high enough to not require acid catalysis, and with furanocoumarins, base catalysis would be carried out by the hydroxyl group, content in the carboxyl group of lactone ring in FC´s. These could be the reason of the highest specifity of this enzyme on furanocoumarins. This reaction mechanism, is the first time that it is purposed, as well as, the identification and characterization of an furanocoumarin conjugated specific ß-glucosidase. Also, this enzyme is involved in the defense response to wounds, showing an induction of its transcription when made tissue damage or by treatment with MeJa. Finally, we studied about the FC´s metabolism during the germination process and was analyzed the variation of expression levels of BbFCbG during this stage of plant development, showing a FC´s conjugates hydrolysis in cotyledons during development and an increase of the transcription levels of BbFCbG in this organ. Also, in the activation of BbFCbG are implicated some phytohormones as GA3 and MeJa, and to a lesser extent 6-BA. For accomplish these objectives, we have been used numerous scientific instrumentation techniques (HPLC, MS/MS, TOF, RMN), biochemical and molecular techniques, which have allowed us to advance our knowledge of the metabolism of these compounds.

INTRODUCCION: La osteonecrosis mandibular es un efecto secundario que puede aparecer en aquellos pacientes que reciben tratamiento con bifosfonatos. Puede aparecer de manera espontánea o, en la mayoría de los casos, tras un procedimiento quirúrgico bucal (extracción dentaria). La melatonina es una hormona que presenta múltiples funciones entre las cuales presenta características antioxidantes y antiinflamatorias. El objetivo de este estudio es analizar “in vitro” el efecto citoprotector de la melatonina frente al ácido zolendrónico (Zometa®) en células madre procedentes de ligamento periodontal (PDLSCs) y médula ósea (BMMSCs). MATERIALES Y MÉTODOS: PDLSCs y BMMSCs fueron cultivadas en presencia de Zometa® (ZA), melatonina y ZA más melatonina durante 72h. La proliferación celular fue determinada mediante MTT. RESULTADOS: Nuestros resultados confirman que las PDLSCs fueron más sensibles al ZA que las BMMSCs. El efecto citoprotector de la melatonina se comprobó en ambas líneas celulares (PDLSCs y BMMSCs) tratadas con ZA. CONCLUSIÓN: Estos resultados revelan que la melatonina tiene un efecto citoprotector frente al ácido zolendrónico en células madre procedentes de ligamento periodontal (PDLSCs) y médula ósea (BMMSCs). De tal modo, agentes citoprotectores como la melatonina podrían ser usados para evitar efectos indeseables de los bifosfonatos como es la osteonecrosis mandibular. / INTRODUCTION: Osteonecrosis of the jaw is a side effect that can occur in patients treated with bisphosphonates. It may occur spontaneously or, in most cases, after oral surgical procedure (tooth extraction). Melatonin is a hormone that has multiple functions among which has antioxidant and anti-inflammatory properties. This study aims to evaluate the cytoprotective effects of melatonin on Zometa®-treated human mesenchymal stem cells from periodontal ligament (PDLSCs) and bone marrow (BMMSCs). METHODS: PDLSCs and BMMSCs were exposed to Zometa® (ZA), melatonin or ZA+melatonin for 72h. Cell Proliferation was measured by MTT. RESULTS: Our results confirm that PDLSCs were more sensitive to the ZA than BMMSCs. The cytoprotective effect of melatonin was checked in both cell lines (PDLSCs and BMMSCs) treated with ZA. CONCLUSION: These results reveal that melatonin has a cytoprotective effect of ZA-treated PDLSCs and BMMSCs. Thus, cytoprotective agents such as melatonin could be used as preventive medication in order to avoid undesirable effects of bisphosphonates such as osteonecrosis of the jaw.