O estado da cromatina influencia diretamente nos processos de expressão gênica desencadeada durante a formação de memórias. Nesse sentido sendo de grande interesse seu estudo na área biomédica. Modificações epigenéticas como a metilação do DNA e modificações pós-traducionais em histonas são reguladores cruciais do estado da cromatina e ds transcrição gênica. Uma das modificações pós-traducionais mais bem estudada é a acetilação de histonas. Quando as histonas estão acetiladas a cromatina encontra-se num estado relaxado permitindo a expressão gênica. A reação é catalisada por acetiltransferases de histonas (HATs) e é um processo reversível catalisado por histona desacetilases (HDACs). A utilização de fármacos inibidores de histona desacetilases (HDACis) tem ajudado na elucidação dos mecanismos gênicos envolvidos na formação do aprendizado e da memória. Nosso trabalho se baseia na hipótese de que a atividade de HDACs é crucial para modulação das respostas de aprendizado na tarefa de esquiva inibitória e que a acetilação de histonas é um passo essencial neste processo. Os resultados apresentados neste trabalho demonstram que a infusão intra-hipocampal de tricostatina A (TSA) ou butirato sódico (NaB) imediatamente após o treino resulta na melhora da memória de longa duração (LTM). TSA demonstrou ainda possuir duas ondas de efeitos melhoradores da LTM, uma imediatamente e outra 3h após o treino que coincidem com as ondas de ativação de vias de sinalização intracelular e de síntese de proteínas importantes para a formação da LTM. Adicionalmente, a inativação farmacológica da amigdala basolateral (BLA) antes do treino bloqueou os efeitos melhoradores do TSA administrado no hipocampo, evidenciando que a integridade da BLA é importante para este processo. Neste trabalho demonstramos também que a administração intraperitoneal de NaB imediatamente após o treino em animais velhos sem prejuízo cognitivo resulta em melhora significativa da memória. O tratamento com NaB não afetou a LTM de animais jovens saudáveis. Por fim, nossos dados demonstram que a administração de um fármaco antagonista de receptores TrkB, ANA-12, no hipocampo de animais jovens após o treino ou teste resulta no prejuízo da memória. No entanto a administração de NaB antes do treino preveniu os efeitos prejudiciais de ANA-12. Em conjunto estes resultados demonstram que a modulação epigenética através da atividade de HDACs é importante para a formação da LTM. Nossos dados fortalecem ainda a visão de que eventos epigenéticos possuem papel critico no aprendizado e memória interagindo com vias de sinalização intracelulares desencadeadas por estes processos. / The chromatin state directly impacts gene expression triggered by memory formation. Therefore, this process is of great interest to the biomedical area. Critical regulators of chromatin state and gene transcription are the epigenetic modifications such as DNA methylation and posttranslational modifications of histone proteins. One of the most studied postranslational modification of histones is histone acetylation. When histones are acetylated, chromatin is in a relaxed conformation allowing gene expression. Lysine acetylation is catalyzed by histone acetyltransferases (HATs) and is reversed by the action of histone deacetylases (HDACs). The use of histone deacetylase inhibitors (HDACis) is helping to elucidate genetic mechanisms of learning and memory. Our work is based on the hypothesis that HDACs activity is crucial for inhibitory avoidance (IA) learning responses modulation and the idea that histone acetylation is an essential step. The data presented in this work demonstrate that infusion of Trichostatin A (TSA) or Sodium Butyrate (NaB) intrahipocampally produced memory enhancement. Moreover, TSA showed two waves of memory enhancing effects when given immediately or 3 h after training coinciding with the observed waves of protein synthesis and PKA activation for memory formation. Our study also demonstrates that the enhancement of IA memory consolidation depends on the integrity of basolateral amygdala (BLA) since its functional inactivation by muscimol (MUS) completely blocked the enhancing effect of TSA infused in the rat hippocampus. Here, we also demonstrate that intraperitoneal administration of NaB immediately after training led to memory enhancement in aged rats with no cognitive deficit. Surprisingly, NaB had no effect in younger rats with normal memory retention. Finally, data presented here also demonstrate that TrkB activity in the hippocampus is crucial for long-term memory (LTM) since administration of a TrkB receptor antagonist, ANA-12, in the dorsal hippocampus immediately after training or retrieval led to memory retention impairment. Moreover, infusion of NaB before training prevented this impairing effect of TrkB antagonism. Taken together, these results show that epigenetic modulation by HDACs activity is required for memory formation. Our data also supports the idea of HDACs playing critical roles in learning and memory interacting with intracellular signaling pathways triggered by these processes.

O presente estudo comparou os efeitos da ativação e inibição do EGFR em duas linhagens de câncer de pulmão, cultivadas em monocamada ou esferoides. Os esferoides foram cultivados sem elementos de matriz extracelular. As células A549 e HK2 apresentaram, respectivamente, 3 e 6 cópias do gene ErbB1 por núcleo, embora a expressão de EGFR seja menor nas células HK2. A ativação de EGFR por EGF ou inibição por AG1478 não promoveu mudanças na proliferação celular. Entretanto, as células cultivadas em monocamada, estimuladas com EGF, exibiram alterações na disposição dos microfilamentos de actina e aumento na velocidade de migração celular. UO126 e LY294002 foram adicionados às culturas para inibir, respectivamente, as vias ERK e Akt. A linhagem A549, cultivada em monocamada, não apresentou envolvimento das vias de sinalização de ERK e Akt na migração celular induzida por EGF, mas foi observado o envolvimento dessas vias nos esferoides. Já a linhagem HK2 apresentou o envolvimento de Akt para promover a migração celular após estímulo com EGF nas duas formas de cultivo. / This study compared the effects of activation and inhibition of EGFR in two cell lines of lung cancer, grown in monolayer or spheroids. Spheroids were cultured without extracellular matrix components. HK2 and A549 cells showed, respectively, 3 and 6 ErbB1 gene copies per nucleus, while EGFR expression is lower in the HK2 cells. The activation by EGF or EGFR inhibition by AG1478 did not cause changes in cell proliferation. However, cells cultured in monolayers stimulated with EGF, showed changes in the arrangement of actin microfilaments and increased the speed of cell migration. UO126 and LY294002 were added to the cultures to inhibit, respectively, the ERK and Akt pathways. A549 cells grown in monolayer did not show involvement of ERK and Akt signaling pathways in the cell migration induced by EGF, but was observed involvement of such pathways in the spheroids. HK2 cells showed involvement of Akt to promote cell migration after EGF stimulation in monolayers and in spheroids.

O presente estudo comparou os efeitos da ativação e inibição do EGFR em duas linhagens de câncer de pulmão, cultivadas em monocamada ou esferoides. Os esferoides foram cultivados sem elementos de matriz extracelular. As células A549 e HK2 apresentaram, respectivamente, 3 e 6 cópias do gene ErbB1 por núcleo, embora a expressão de EGFR seja menor nas células HK2. A ativação de EGFR por EGF ou inibição por AG1478 não promoveu mudanças na proliferação celular. Entretanto, as células cultivadas em monocamada, estimuladas com EGF, exibiram alterações na disposição dos microfilamentos de actina e aumento na velocidade de migração celular. UO126 e LY294002 foram adicionados às culturas para inibir, respectivamente, as vias ERK e Akt. A linhagem A549, cultivada em monocamada, não apresentou envolvimento das vias de sinalização de ERK e Akt na migração celular induzida por EGF, mas foi observado o envolvimento dessas vias nos esferoides. Já a linhagem HK2 apresentou o envolvimento de Akt para promover a migração celular após estímulo com EGF nas duas formas de cultivo. / This study compared the effects of activation and inhibition of EGFR in two cell lines of lung cancer, grown in monolayer or spheroids. Spheroids were cultured without extracellular matrix components. HK2 and A549 cells showed, respectively, 3 and 6 ErbB1 gene copies per nucleus, while EGFR expression is lower in the HK2 cells. The activation by EGF or EGFR inhibition by AG1478 did not cause changes in cell proliferation. However, cells cultured in monolayers stimulated with EGF, showed changes in the arrangement of actin microfilaments and increased the speed of cell migration. UO126 and LY294002 were added to the cultures to inhibit, respectively, the ERK and Akt pathways. A549 cells grown in monolayer did not show involvement of ERK and Akt signaling pathways in the cell migration induced by EGF, but was observed involvement of such pathways in the spheroids. HK2 cells showed involvement of Akt to promote cell migration after EGF stimulation in monolayers and in spheroids.

INTRODUÇÃO: O câncer do pâncreas apresenta taxas anuais de mortalidade e incidência muito semelhantes, sendo uma das principais causas de morte por câncer no mundo. A agressividade do tumor e o retardo no seu diagnóstico são considerados responsáveis pela sua alta letalidade. O tratamento adjuvante convencional aumenta pouco a sobrevida a longo prazo e a terapia-alvo pode ser uma alternativa ao tratamento deste tipo de tumor. OBJETIVO: O objetivo do presente estudo é avaliar a expressão do receptor do fator de crescimento epitelial e seu eventual valor prognóstico em pacientes portadores de adenocarcinoma pancreático submetidos à ressecção cirúrgica. MÉTODO: Foram estudados retrospectivamente 88 pacientes portadores de adenocarcinoma pancreático operados no Serviço de Cirurgia de Vias Biliares e Pâncreas do HC-FMUSP e no Departamento de Cirurgia Abdominal Hospital A.C. Camargo no período de 1990 a 2006. RESULTADOS: Quarenta e sete (53,4%) pacientes do sexo feminino e 41 (46,6%) do masculino com idade mediana de 60 anos. As cirurgias realizadas foram duodenopancreatectomia com preservação do piloro (55,1%), gastroduodenopancreatectomia (34,8%), pancreatectomia corpo-caudal (6,8%) e gastroduodenopancreatectomia total (2,3%). A ressecção venosa portal foi realizada em 12 pacientes (13,5%). O tamanho tumoral médio foi de 3,75cm. Invasão vascular esteve presente em 31% dos casos e neural em 88,5%. A margem de ressecção estava comprometida em 33 pacientes (37,5%). Cinco (5,7%) pacientes eram do estádio IA, 15(17%) do IB, 19(21,6%) do IIA, 47(53,4) do IIB e dois (2,3%) do III.Observou-se diferença na expressão de EGFR na membrana celular entre o tecido tumoral e o tecido não tumoral (p=0,004); entre o tecido metastático linfonodal e o tecido não tumoral (p=0,02) mas não houve diferença quanto à sua expressão quando comparamos o tecido tumoral e o tecido metastático linfonodal (p=0,28). Dentre as variáveis clínicas e patológicas estudadas, observou-se diferença de expressão do EGFR entre os gêneros feminino e masculino (p=0,03), não havendo diferenças entre as outras variáveis. A sobrevida mediana global foi de 22,9 meses. A sobrevida cumulativa global em 1 ano, 3 anos e 5 anos foi de 48%, 20% e 18%, respectivamente. As sobrevidas cumulativas em 1 ano, 3 anos e 5 anos foram 77%, 30% e 8% no grupo sem expressão do EGFR na membrana tumoral versus 46%, 8% e 0% respectivamente no grupo com expressão do EGFR na membrana celular do tumor. Na análise univariada, as seguintes variáveis estiveram associadas a menor sobrevida: sexo masculino, ressecção venosa portal, invasão peri-neural, e vascular, invasão do tecido peri-pancreático, acometimento da margem de ressecção pancreática e expressão positiva de EGFR no tecido tumoral. Na análise multivariada, os fatores associados à sobrevida menor foram: gênero masculino, ressecção venosa portal, invasão vascular e invasão peri-neural. CONCLUSÃO: A expressão do EGFR na membrana celular é significativamente maior no tecido tumoral que no tecido pancreático não tumoral. A expressão do EGFR na membrana celular do tecido tumoral está associada a pior prognóstico (menor sobrevida). / INTRODUCTION: Pancreatic cancer is one of the main cancer related deaths in the world and its incidence is similar to its mortality. Biological aggressiveness and delayed diagnosis are a major concern. Adjuvant treatment has little impact on survival and the expression of potential target molecules has been undertaken in order to increase survival. OBJECTIVE: The aim of the present study is to study the expression of EGFR and its potential prognostic role in tumor, non-tumor and metastatic lymph node tissues of patient with pancreatic adenocarcinoma treated with surgical resection. MATHERIAL AND METHODS: Eighty eight patients with pancreatic adenocarcinoma operated at Serviço de Cirurgia de Vias Biliares e Pâncreas do HC-FMUSP and Departamento de Cirurgia Abdominal do Hospital A.C.Camargo were retrospectively studied between 1990 and 2003. RESULTS: Forty seven females (53,4%) and 41 males (46,6%) with median age of 60 years were studied. Pylorus preserving duodenopancreatectomy was performed in 55%, classical duodenopancreatectomy in 34,8%, distal pancreatectomy in 6,8% and total pancreatectomy in 2,3%. Portal vein resection was performed in 12 patients (13,5%). Mean tumor size was 3,75cm. Vascular and neural invasion were present in 31% and 88,5%, respectively. Positive surgical margin was present in 33 (37,5%) patients. Five (5,7%) patients were stage IA, 15(17%) stages IB, 19(21,6%) stages IIA, 47(53,4%) stages IIB and two (2,3%) stages III. There were difference in the membrane expression of EGFR between tumor and non tumor pancreatic tissue (p=0,004); between metastatic lymph node and non tumor pancreatic tissue (p=0,02); but there were no difference between tumor and metastatic lymph node tissue (p=0,28). Median survival time was 22,9 months. Cumulative one, three and five years survival were 48%, 20% and 18%. Cumulative survival at 1, 3 and 5 years were 77%, 30% and 8% in patients with negative expression of EGFR in tumor membrane and 46%, 8% and 0%, respectively in patients with positive EGFR expression in tumoral membrane. Univariate analysis showed that male gender, portal vein resection, neural, vascular and peri-pancreatic invasion invasion, positive surgical margin and positive membrane EGFR expression in tumoral tissue were correlated with poor survival. Multivariate analysis showed that male gender, portal vein resection, vascular invasion and peri-neural invasion are associated with lower survival after resection. CONCLUSION: EGFR membrane expression is different between tumor tissue and non tumor pancreatic tissue. EGFR membrane expression in tumoral tissue was associated with worst survival.

OBJETIVOS: Analisar a expressão de EGFR, proteínas da via de sinalização ou relacionadas aos seus efeitos em carcinoma hepatocelular (CHC) primários, metastáticos e em tecido hepático não tumoral em autópsias. Correlacionar os achados a dados clínico-patológicos e marcadores de classes moleculares. Avaliar a heterogeneidade de expressão em CHC metastáticos e fatores de disseminação extra-hepática. MÉTODOS: Oitenta autópsias de pacientes com CHC ao exame foram incluídas em estudo retrospectivo transversal. Foram analisados sexo, idade, raça, etilismo, infecção por vírus da hepatite B (VHB) e C (VHC), infecção pelo HIV, tratamento prévio, causas básica e imediata de óbito, peso do fígado, cirrose, número e tamanho dos nódulos, padrão macroscópico, grau histológico, variantes histológicas, padrão arquitetural, invasão de grandes veias e metástases extra-hepáticas. Imuno-histoquímica foi realizada em micromatrizes teciduais para pesquisa de EGFR, pEGFR(Tyr 1173), HER2, ERK1/2, MAPKAPK-2, pMAPK, Ag Ki67, caspase 3, citoqueratina 19 (CK19), mTOR, ciclina D1, Met, vimentina, p53 e beta-catenina. A expressão de EGFR foi avaliada em intensidade (0-3+) e distribuição (0-100%) em um sistema de escores de 0 a 300. Hiperexpressão foi definida para escores >= 200. Amostras de fígado normal foram incluídas como controles. Amostras de CHC primário foram pareadas às suas metástases e consideradas concordantes quando na mesma categoria de expressão. No tecido não tumoral foram semi-quantificadas a reação ductular expressando CK19 e a densidade da população de células estromais perissinusoidais pela vimentina. Estatística foi realizada através dos testes do qui-quadrado ou exato de Fisher ao nível de significância de 0,05. Para as correlações de escores e variáveis categóricas foi utilizado o coeficiente de Spearman. RESULTADOS: Foram incluídos 62 casos do sexo masculino e 18 do sexo feminino (58,1 ± 10,9 anos). Infecção pelo VHC foi a principal causa em 49% (39/80), seguida por etilismo em 30% (24/80) e infecção por VHB em 19% (15/80). Cirrose foi identificada em 90% (72/80) dos casos. Os tumores mostraram-se avançados em 95% (76/80). Invasão de grandes veias foi detectada em 19% (15/80) e metástases extra-hepáticas em 38% (30/80). MAPKAPK2, pEGFR (Tyr1173) e HER2 tiveram expressão fraca ou ausente. A expressão de EGFR foi mais frequente no fígado não neoplásico (26/26) (P < 0,05) - e nos controles normais (8/8) do que nas amostras tumorais primárias (60/75) e nas metástases (12/17). Nenhuma amostra dos controles apresentou hiperexpressão de EGFR, a qual foi mais frequente na cirrose (65% - 17/26) do que nos tumores avançados (36% - 26/72) (P < 0,05). EGFR hiperexpresso foi mais frequente nos tumores de grau 1/2 (P < 0,01) e nos casos com menos de quatro nódulos hepáticos (P = 0,014). A expressão de EGFR correlacionou-se à expressão de caspase 3 (P < 0,01). A expressão das quinases ERK1 e ERK2 foi correlacionada à proliferação celular pelo Ag Ki67 (P < 0,01), porém não ao escore de expressão de EGFR. CK19, p53 e beta-catenina nuclear foram correlacionaram-se às lesões de maior grau e a maiores taxas de proliferação celular (P<0,01). Met, EGFR e caspase 3 foram correlacionados a lesões mais diferenciadas. Vimentina teve forte correlação com CK19 (P < 0,01). A concordância de expressão entre tumores hepáticos e respectivas metástases variou de 50 a 85%. Para o EGFR foi de 61%. A expressão endotelial 2-3+ de pMAPK foi mais frequente nas metástases (P = 0,09). A disseminação extra-hepática foi mais frequente nos casos com baixa densidade de células perissinusoidais positivas para vimentina (P = 0,054) e nos casos sem reação ductular no tecido não neoplásico (P = 0,095). CONCLUSÕES: O EGFR tem papel relevante nas etapas iniciais e intermediárias do CHC, sendo sua expressão reduzida nas formas avançadas. Diferentes classes de CHC podem estar associadas a ativação da via do EGFR. A presente análise imuno-histoquímica ampla parece validar pelo menos dois grupos de CHC que nesta série de autópsias parecem ter sido separados pelo grau histológico. Confirma-se a hiperexpressão das quinases como evento importante na progressão tumoral, porém não necessariamente associada à hiperexpressão de EGFR. A heterogeneidade de expressão entre o CHC primário e suas metástases variou de 15 a 45% / OBJECTIVES: To analyze the expression of EGFR and proteins related to its signaling pathway or to its effects in hepatocellular carcinoma (HCC), metastases and surrounding liver tissue in a series of autopsies. To correlate expression patterns to clinicopathological data and other markers of molecular classification. To assess the heterogeneity of expression in metastatic HCC and factors related to extrahepatic spread. METHODS: Eighty autopsies of patients with HCC were included in a cross-sectional retrospective study. We analyzed gender, age, race, alcohol intake, infection with hepatitis B (HBV) and C virus (HCV), HIV infection, prior treatment, basic and immediate causes of death, the weight of the liver, cirrhosis, number and size of nodules, gross pattern, histological grade, histological variants, architectural pattern, invasion of large veins and extrahepatic metastases. Immunohistochemistry was performed on tissue microarrays to survey EGFR, pEGFR(Tyr 1173), HER2, ERK1/2, MAPKAPK-2, pMAPK, Ag Ki67, caspase 3, cytokeratin 19 (CK19), mTOR, cyclin D1, Met, vimentin, p53 and beta-catenin. EGFR expression was evaluated in intensity (0-3+) and distribution of membrane staining (0-100%) in a 0 - 300 score. Overexpression was defined for scores >= 200. Normal liver samples were included as controls. Intra-hepatic HCC samples were matched to their respective metastases and expression was considered concordant when they were assigned to the same category. Ductular reaction expressing CK19 and the density of perisinusoidal vimentin positive stromal cells were semi-quantified in non-tumor tissue. Statistics was performed using the chi- square or Fisher exact test at a significance level of 0.05. For the correlations of scores and categorical data we used the Spearman coefficient. RESULTS: Sixty-two males and eighteen females were included (age 58.1 ± 10.9). HCV was the major cause in 49% (39/80), followed by alcoholism in 30% (24/80) and HBV infection in 19% (15/80). Cirrhosis was identified in 90% (72/80) and advanced tumors in 95% (76/80). Large vein invasion was detected in 19% (15/80) and extra-hepatic metastases in 38% (30/80). MAPKAPK2, pEGFR (Tyr1173) and HER2 expression were weak or absent. The EGFR expression was more frequent in non-tumoral liver (26/26) (P <.05) and in normal controls (8/8) than in primary HCC tumor samples (60/75) and in metastatic HCC (12/17). No samples taken from the controls showed overexpression of EGFR, which was more common in cirrhotic tissue (65% - 17/26) than in advanced tumors (36% - 26/72) (P <0.05). EGFR overexpression was more frequent in grade 1/2 tumors (P <0.01) and in cases with less than four hepatic nodules (P = 0.014). EGFR expression was correlated to the expression of caspase 3 (P <0.01). The expression of the kinases ERK1 and ERK2 was correlated to Ag Ki67 cell proliferation index (P <0.01), but not to the EGFR expression score. CK19, p53 and nuclear beta- catenin were correlated to high grade lesions and to higher rates of cell proliferation (P <0.01). Met, EGFR and caspase 3 were correlated with more differentiated lesions. Vimentin was strongly correlated with CK19 (P <0.01). The concordance of expression between liver tumors and their metastases ranged from 50 to 85% (61% for EGFR). The 2-3+ expression of pMAPK in tumor endothelial cells was more common in metastases (P = 0.09). Extrahepatic dissemination was more frequent in cases with low density of vimentin positive perisinusoidal cells (P = 0.054) and in cases with no detectable ductular reaction in non-neoplastic tissue (P = 0.095). CONCLUSIONS: EGFR plays an important role in the early and intermediate stages of HCC progression, with lower expression in advanced tumors. Different classes of HCC may be associated with activation of EGFR. The present comprehensive immunohistochemical approach seems to validate at least two molecular classes of HCC, and histological grade seems to be able to discriminate these groups. We herein confirmed overexpression of kinases as a key event in tumor progression, but not necessarily associated with overexpression of EGFR. The heterogeneity of expression between primary HCC and its metastases ranged from 15 to 45%

OBJETIVOS: Analisar a expressão de EGFR, proteínas da via de sinalização ou relacionadas aos seus efeitos em carcinoma hepatocelular (CHC) primários, metastáticos e em tecido hepático não tumoral em autópsias. Correlacionar os achados a dados clínico-patológicos e marcadores de classes moleculares. Avaliar a heterogeneidade de expressão em CHC metastáticos e fatores de disseminação extra-hepática. MÉTODOS: Oitenta autópsias de pacientes com CHC ao exame foram incluídas em estudo retrospectivo transversal. Foram analisados sexo, idade, raça, etilismo, infecção por vírus da hepatite B (VHB) e C (VHC), infecção pelo HIV, tratamento prévio, causas básica e imediata de óbito, peso do fígado, cirrose, número e tamanho dos nódulos, padrão macroscópico, grau histológico, variantes histológicas, padrão arquitetural, invasão de grandes veias e metástases extra-hepáticas. Imuno-histoquímica foi realizada em micromatrizes teciduais para pesquisa de EGFR, pEGFR(Tyr 1173), HER2, ERK1/2, MAPKAPK-2, pMAPK, Ag Ki67, caspase 3, citoqueratina 19 (CK19), mTOR, ciclina D1, Met, vimentina, p53 e beta-catenina. A expressão de EGFR foi avaliada em intensidade (0-3+) e distribuição (0-100%) em um sistema de escores de 0 a 300. Hiperexpressão foi definida para escores >= 200. Amostras de fígado normal foram incluídas como controles. Amostras de CHC primário foram pareadas às suas metástases e consideradas concordantes quando na mesma categoria de expressão. No tecido não tumoral foram semi-quantificadas a reação ductular expressando CK19 e a densidade da população de células estromais perissinusoidais pela vimentina. Estatística foi realizada através dos testes do qui-quadrado ou exato de Fisher ao nível de significância de 0,05. Para as correlações de escores e variáveis categóricas foi utilizado o coeficiente de Spearman. RESULTADOS: Foram incluídos 62 casos do sexo masculino e 18 do sexo feminino (58,1 ± 10,9 anos). Infecção pelo VHC foi a principal causa em 49% (39/80), seguida por etilismo em 30% (24/80) e infecção por VHB em 19% (15/80). Cirrose foi identificada em 90% (72/80) dos casos. Os tumores mostraram-se avançados em 95% (76/80). Invasão de grandes veias foi detectada em 19% (15/80) e metástases extra-hepáticas em 38% (30/80). MAPKAPK2, pEGFR (Tyr1173) e HER2 tiveram expressão fraca ou ausente. A expressão de EGFR foi mais frequente no fígado não neoplásico (26/26) (P < 0,05) - e nos controles normais (8/8) do que nas amostras tumorais primárias (60/75) e nas metástases (12/17). Nenhuma amostra dos controles apresentou hiperexpressão de EGFR, a qual foi mais frequente na cirrose (65% - 17/26) do que nos tumores avançados (36% - 26/72) (P < 0,05). EGFR hiperexpresso foi mais frequente nos tumores de grau 1/2 (P < 0,01) e nos casos com menos de quatro nódulos hepáticos (P = 0,014). A expressão de EGFR correlacionou-se à expressão de caspase 3 (P < 0,01). A expressão das quinases ERK1 e ERK2 foi correlacionada à proliferação celular pelo Ag Ki67 (P < 0,01), porém não ao escore de expressão de EGFR. CK19, p53 e beta-catenina nuclear foram correlacionaram-se às lesões de maior grau e a maiores taxas de proliferação celular (P<0,01). Met, EGFR e caspase 3 foram correlacionados a lesões mais diferenciadas. Vimentina teve forte correlação com CK19 (P < 0,01). A concordância de expressão entre tumores hepáticos e respectivas metástases variou de 50 a 85%. Para o EGFR foi de 61%. A expressão endotelial 2-3+ de pMAPK foi mais frequente nas metástases (P = 0,09). A disseminação extra-hepática foi mais frequente nos casos com baixa densidade de células perissinusoidais positivas para vimentina (P = 0,054) e nos casos sem reação ductular no tecido não neoplásico (P = 0,095). CONCLUSÕES: O EGFR tem papel relevante nas etapas iniciais e intermediárias do CHC, sendo sua expressão reduzida nas formas avançadas. Diferentes classes de CHC podem estar associadas a ativação da via do EGFR. A presente análise imuno-histoquímica ampla parece validar pelo menos dois grupos de CHC que nesta série de autópsias parecem ter sido separados pelo grau histológico. Confirma-se a hiperexpressão das quinases como evento importante na progressão tumoral, porém não necessariamente associada à hiperexpressão de EGFR. A heterogeneidade de expressão entre o CHC primário e suas metástases variou de 15 a 45% / OBJECTIVES: To analyze the expression of EGFR and proteins related to its signaling pathway or to its effects in hepatocellular carcinoma (HCC), metastases and surrounding liver tissue in a series of autopsies. To correlate expression patterns to clinicopathological data and other markers of molecular classification. To assess the heterogeneity of expression in metastatic HCC and factors related to extrahepatic spread. METHODS: Eighty autopsies of patients with HCC were included in a cross-sectional retrospective study. We analyzed gender, age, race, alcohol intake, infection with hepatitis B (HBV) and C virus (HCV), HIV infection, prior treatment, basic and immediate causes of death, the weight of the liver, cirrhosis, number and size of nodules, gross pattern, histological grade, histological variants, architectural pattern, invasion of large veins and extrahepatic metastases. Immunohistochemistry was performed on tissue microarrays to survey EGFR, pEGFR(Tyr 1173), HER2, ERK1/2, MAPKAPK-2, pMAPK, Ag Ki67, caspase 3, cytokeratin 19 (CK19), mTOR, cyclin D1, Met, vimentin, p53 and beta-catenin. EGFR expression was evaluated in intensity (0-3+) and distribution of membrane staining (0-100%) in a 0 - 300 score. Overexpression was defined for scores >= 200. Normal liver samples were included as controls. Intra-hepatic HCC samples were matched to their respective metastases and expression was considered concordant when they were assigned to the same category. Ductular reaction expressing CK19 and the density of perisinusoidal vimentin positive stromal cells were semi-quantified in non-tumor tissue. Statistics was performed using the chi- square or Fisher exact test at a significance level of 0.05. For the correlations of scores and categorical data we used the Spearman coefficient. RESULTS: Sixty-two males and eighteen females were included (age 58.1 ± 10.9). HCV was the major cause in 49% (39/80), followed by alcoholism in 30% (24/80) and HBV infection in 19% (15/80). Cirrhosis was identified in 90% (72/80) and advanced tumors in 95% (76/80). Large vein invasion was detected in 19% (15/80) and extra-hepatic metastases in 38% (30/80). MAPKAPK2, pEGFR (Tyr1173) and HER2 expression were weak or absent. The EGFR expression was more frequent in non-tumoral liver (26/26) (P <.05) and in normal controls (8/8) than in primary HCC tumor samples (60/75) and in metastatic HCC (12/17). No samples taken from the controls showed overexpression of EGFR, which was more common in cirrhotic tissue (65% - 17/26) than in advanced tumors (36% - 26/72) (P <0.05). EGFR overexpression was more frequent in grade 1/2 tumors (P <0.01) and in cases with less than four hepatic nodules (P = 0.014). EGFR expression was correlated to the expression of caspase 3 (P <0.01). The expression of the kinases ERK1 and ERK2 was correlated to Ag Ki67 cell proliferation index (P <0.01), but not to the EGFR expression score. CK19, p53 and nuclear beta- catenin were correlated to high grade lesions and to higher rates of cell proliferation (P <0.01). Met, EGFR and caspase 3 were correlated with more differentiated lesions. Vimentin was strongly correlated with CK19 (P <0.01). The concordance of expression between liver tumors and their metastases ranged from 50 to 85% (61% for EGFR). The 2-3+ expression of pMAPK in tumor endothelial cells was more common in metastases (P = 0.09). Extrahepatic dissemination was more frequent in cases with low density of vimentin positive perisinusoidal cells (P = 0.054) and in cases with no detectable ductular reaction in non-neoplastic tissue (P = 0.095). CONCLUSIONS: EGFR plays an important role in the early and intermediate stages of HCC progression, with lower expression in advanced tumors. Different classes of HCC may be associated with activation of EGFR. The present comprehensive immunohistochemical approach seems to validate at least two molecular classes of HCC, and histological grade seems to be able to discriminate these groups. We herein confirmed overexpression of kinases as a key event in tumor progression, but not necessarily associated with overexpression of EGFR. The heterogeneity of expression between primary HCC and its metastases ranged from 15 to 45%

Base teórica: O processo de implantação do embrião no ser humano é extremamente complexo e, ao mesmo tempo, essencial para que a mulher possa engravidar. Neste processo, em que o endométrio precisa sofrer uma série de mudanças para tornar-se receptivo, a adequada expressão de MFG-E8 (milk fat globule epidermal growth factor 8), seu receptor a integrina αvβ3 e LIF (leukemia inhibitory factor) parecem ter um papel importante. Além do mais, mulheres com infertilidade e endometriose podem apresentar a falha de implantação como uma grande barreira para obter seu sucesso terapêutico. Objetivos: Avaliar o papel de MFG-E8 e do seu receptor integrina αvβ3 em um modelo de implantação in vitro com uma linhagem celular trofoblástica e outra de epitélio endometrial. Comparar a expressão de MFG-E8, de integrina αvβ3 e de LIF no endométrio de pacientes férteis e inférteis com endometriose durante a janela de implantação. Métodos: No primeiro ensaio, utilizando-se uma linhagem celular bem diferenciada de adenocarcinoma de endométrio (células Ishikawa) e uma linhagem de coriocarcinoma de trofoblasto, o modelo in vitro de implantação humana foi estabelecido. Para investigação do impacto do bloqueio de MFG-E8 e integrina αvβ3, ambas linhagens celulares foram pré-tratadas com anticorpos contra estas proteínas em diferente concentrações antes do ensaio de adesão. No ensaio subsequente, para comparar a expressão de MFG-E8, de integrina αvβ3 e de LIF no endométrio humano, foram realizadas biópsias no período da janela de implantação (LH+7 a LH+10) com cateter de Pipelle. As amostras foram submetidas a imunohistoquímica, e analisadas através do HSCORE. Resultados: Na avaliação in vitro observamos que as células Ishikawa pré-tratadas com anticorpo anti-MFG-E8 causaram diminuição da adesão das esferas Jar dose-dependente. Por outro lado, o pré-tratamento das esferas Jar não resultou em diminuição significativa da adesão. Pré-tratamento com anticorpos anti-integrina αvβ3, tanto de células Ishikawa como de esferas Jar, causaram inibição significativa, dose-dependente, da adesão das esferas. A análise imunohistoquímica das biópsias realizadas durante a janela de implantação mostrou uma expressão aumentada de MFG-E8 em pacientes com endometriose e infertilidade. Além do mais, houve expressão diminuída de LIF no grupo em estudo. Contudo, não houve diferença estatisticamente significativa na expressão de integrina αvβ3 entre os grupos em estudo. Conclusão: Este estudo demonstrou que, quando se bloqueia MFG-E8 ou seu receptor integrina αvβ3 em células Ishikawa em um modelo in vitro, ocorre uma diminuição de adesão das células Jar. Além do mais, bloqueando-se a integrina αvβ3 nas esferas Jar, também ocorre uma diminuição da adesão destas nas células Ishikawa. No entanto, quando estudamos o endométrio in vivo de pacientes com endometriose e infertilidade, encontramos a expressão aumentada de MFG-E8 e diminuída de LIF durante a janela de implantação no endométrio. / Background: The human implantation process is very complex and, at the same time, it is essential for women to achieve pregnancy. In this process, where the human endometrium must go through a lot of changes in order to become receptive, an adequate expression of MFG-E8 (milk fat globule epidermal growth factor 8), integrin αvβ3 and LIF (leukemia inhibitory factor) appear to play an important role. Furthermore, women with endometriosis and infertility may have in their implantation process the key to achieve pregnancy. Objectives: To investigate the role of MFG-E8 and its receptor integrin αvβ3 in the attachment of trophoblast cells to the endometrial epithelium, in an in vitro model. To compare endometrial expression of MFG-E8, integrin αvβ3 and LIF between fertile patients and patients with endometriosis and infertility during the window of implantation. Methods: In our first assay, by using a well-differentiated endometrial adenocarcinoma cell line (Ishikawa cells) and choriocarcinoma human trophoblast cells (Jar cells), an in vitro model mimicking human implantation was established. To investigate the impact of blocking MFG-E8 and integrin αvβ3, the cell lines were pretreated with antibodies against those proteins at different concentrations before the attachment assay. Moreover, to compare endometrial expression of MFG-E8, integrin αvβ3 and LIF, endometrial biopsies were performed during the window of implantation (LH+7 to LH+10) with the Pipelle catheter. The samples were submitted immunochemistry, and analyzed with HSCORE. Results: Pretreatment of Ishikawa cells with anti-MFG-E8 antibody caused a dosedependent and significant inhibition of attachment is our in vitro assay. On the other hand, pretreatment of Jar spheroids did not result in a significant effect on the attachment rate. Pretreatment of Ishikawa cells as well as Jar spheroids with anti-integrin avb3 antibodies resulted in a dose-dependent, significant inhibition of attachment. The immunochemistry analysis of the endometrial biopsies performed during the window of implantation showed increased MFG-E8 expression in patients with endometriosis and infertility. Moreover, there was lower LIF expression in the study group. Conclusion: This study showed that blocking MFG-E8 and its receptor integrin αvβ3 in Ishikawa cells diminishes Jar spheroid attachment in an in vitro model. Moreover, blocking integrin αvβ3 in the trophoblastic cells also diminished their attachment to the Ishikawa monolayer. Nevertheless, when we studied the endometrium of patients with endometriosis and infertility, we saw an increased expression of MFG-E8 and decreased expression of LIF during the window of implantation.

Justificativa: A recidiva do Carcinoma Hepatocelular (CHC) é um fator limitante da sobrevida nos indivíduos submetidos a transplante hepático (TxH). Além do número e tamanho do tumor, invasão vascular e grau de diferenciação, compreender a biologia tumoral e os biomarcadores relacionados é um passo importante para prever a recidiva e estabelecer estratégias terapêuticas. Objetivos: Analisar a expressão e valor prognóstico do receptor do Fator de Crescimento Epidérmico (EGFr) e sua relação com outros fatores implicados na recidiva no CHC. Pacientes e métodos: Foram analisados retrospectivamente os dados de 59 pacientes cirróticos submetidos a TxH no nosso centro com diagnóstico histopatológico confirmado de CHC no período de 2001 a 2006. Resultados: Foi registrada uma sobrevida global e em 1, 3 e 5 anos de 89,3%, 74,9% e 72,4% respectivamente e uma sobrevida livre de doença em 1, 3 e 5 anos de 84,8%, 69,6% e 69,6% respectivamente. A taxa de recidiva foi de 22,03%. O EGFr foi expresso em 93,2% dos tumores, mas não apresentou relação estatisticamente significatica com risco de recidiva (p=0,147) ou outros fatores de risco. Somente a invasão vascular (p=0,046) e o tamanho > 5 cm (p=0,046) foram capazes de predizer o risco de recidiva. Conclusão: O tamanho tumoral e a invasão vascular foram os principais fatores de risco relacionados à recidiva tumoral, enquanto a expressão do EGFr, embora bastante alta, não tem relação com este risco. / Background: Recurrent Hepatocellular Carcinoma (HCC) is a significant cause of death after liver transplantation (LT). Understanding tumor biology and correlate biomarkers is an important step to predict recurrence and establish new therapies. Purpose: Analyze the expression and prognostic significance of Epidermal Growth Factor receptor (EGFr) on HCC and its relationship with other prognostic factors. Patients and methods: Data from 59 cirrhotic patients who underwent LT between 2001 and 2006 with pathological confirmation of HCC were analyzed retrospectively. Results: The overall survival at 1, 3 e 5 years was 89.3%, 74.9%, 72.4% while recurrence-free was 84.8%, 69.6, 69.6% respectively with a recurrence rate of 22%. EGFr was expressed in 93.2% of tumors, but no statistical relationship with HCC recurrence (p=0.147) were found. Only vascular invasion (p=0.046) and tumor size > 5 cm (p=0.046) predicted tumor recurrence. Conclusion: EGFr was widely expressed on our series of tumors, and, as so, has a poor prognostic value, with no significance among groups (negative, weak and strong expression) considering HCC recurrence. Only tumor size and vascular invasion were significant predictors of tumor recurrence.

Base teórica: O processo de implantação do embrião no ser humano é extremamente complexo e, ao mesmo tempo, essencial para que a mulher possa engravidar. Neste processo, em que o endométrio precisa sofrer uma série de mudanças para tornar-se receptivo, a adequada expressão de MFG-E8 (milk fat globule epidermal growth factor 8), seu receptor a integrina αvβ3 e LIF (leukemia inhibitory factor) parecem ter um papel importante. Além do mais, mulheres com infertilidade e endometriose podem apresentar a falha de implantação como uma grande barreira para obter seu sucesso terapêutico. Objetivos: Avaliar o papel de MFG-E8 e do seu receptor integrina αvβ3 em um modelo de implantação in vitro com uma linhagem celular trofoblástica e outra de epitélio endometrial. Comparar a expressão de MFG-E8, de integrina αvβ3 e de LIF no endométrio de pacientes férteis e inférteis com endometriose durante a janela de implantação. Métodos: No primeiro ensaio, utilizando-se uma linhagem celular bem diferenciada de adenocarcinoma de endométrio (células Ishikawa) e uma linhagem de coriocarcinoma de trofoblasto, o modelo in vitro de implantação humana foi estabelecido. Para investigação do impacto do bloqueio de MFG-E8 e integrina αvβ3, ambas linhagens celulares foram pré-tratadas com anticorpos contra estas proteínas em diferente concentrações antes do ensaio de adesão. No ensaio subsequente, para comparar a expressão de MFG-E8, de integrina αvβ3 e de LIF no endométrio humano, foram realizadas biópsias no período da janela de implantação (LH+7 a LH+10) com cateter de Pipelle. As amostras foram submetidas a imunohistoquímica, e analisadas através do HSCORE. Resultados: Na avaliação in vitro observamos que as células Ishikawa pré-tratadas com anticorpo anti-MFG-E8 causaram diminuição da adesão das esferas Jar dose-dependente. Por outro lado, o pré-tratamento das esferas Jar não resultou em diminuição significativa da adesão. Pré-tratamento com anticorpos anti-integrina αvβ3, tanto de células Ishikawa como de esferas Jar, causaram inibição significativa, dose-dependente, da adesão das esferas. A análise imunohistoquímica das biópsias realizadas durante a janela de implantação mostrou uma expressão aumentada de MFG-E8 em pacientes com endometriose e infertilidade. Além do mais, houve expressão diminuída de LIF no grupo em estudo. Contudo, não houve diferença estatisticamente significativa na expressão de integrina αvβ3 entre os grupos em estudo. Conclusão: Este estudo demonstrou que, quando se bloqueia MFG-E8 ou seu receptor integrina αvβ3 em células Ishikawa em um modelo in vitro, ocorre uma diminuição de adesão das células Jar. Além do mais, bloqueando-se a integrina αvβ3 nas esferas Jar, também ocorre uma diminuição da adesão destas nas células Ishikawa. No entanto, quando estudamos o endométrio in vivo de pacientes com endometriose e infertilidade, encontramos a expressão aumentada de MFG-E8 e diminuída de LIF durante a janela de implantação no endométrio. / Background: The human implantation process is very complex and, at the same time, it is essential for women to achieve pregnancy. In this process, where the human endometrium must go through a lot of changes in order to become receptive, an adequate expression of MFG-E8 (milk fat globule epidermal growth factor 8), integrin αvβ3 and LIF (leukemia inhibitory factor) appear to play an important role. Furthermore, women with endometriosis and infertility may have in their implantation process the key to achieve pregnancy. Objectives: To investigate the role of MFG-E8 and its receptor integrin αvβ3 in the attachment of trophoblast cells to the endometrial epithelium, in an in vitro model. To compare endometrial expression of MFG-E8, integrin αvβ3 and LIF between fertile patients and patients with endometriosis and infertility during the window of implantation. Methods: In our first assay, by using a well-differentiated endometrial adenocarcinoma cell line (Ishikawa cells) and choriocarcinoma human trophoblast cells (Jar cells), an in vitro model mimicking human implantation was established. To investigate the impact of blocking MFG-E8 and integrin αvβ3, the cell lines were pretreated with antibodies against those proteins at different concentrations before the attachment assay. Moreover, to compare endometrial expression of MFG-E8, integrin αvβ3 and LIF, endometrial biopsies were performed during the window of implantation (LH+7 to LH+10) with the Pipelle catheter. The samples were submitted immunochemistry, and analyzed with HSCORE. Results: Pretreatment of Ishikawa cells with anti-MFG-E8 antibody caused a dosedependent and significant inhibition of attachment is our in vitro assay. On the other hand, pretreatment of Jar spheroids did not result in a significant effect on the attachment rate. Pretreatment of Ishikawa cells as well as Jar spheroids with anti-integrin avb3 antibodies resulted in a dose-dependent, significant inhibition of attachment. The immunochemistry analysis of the endometrial biopsies performed during the window of implantation showed increased MFG-E8 expression in patients with endometriosis and infertility. Moreover, there was lower LIF expression in the study group. Conclusion: This study showed that blocking MFG-E8 and its receptor integrin αvβ3 in Ishikawa cells diminishes Jar spheroid attachment in an in vitro model. Moreover, blocking integrin αvβ3 in the trophoblastic cells also diminished their attachment to the Ishikawa monolayer. Nevertheless, when we studied the endometrium of patients with endometriosis and infertility, we saw an increased expression of MFG-E8 and decreased expression of LIF during the window of implantation.

Justificativa: A recidiva do Carcinoma Hepatocelular (CHC) é um fator limitante da sobrevida nos indivíduos submetidos a transplante hepático (TxH). Além do número e tamanho do tumor, invasão vascular e grau de diferenciação, compreender a biologia tumoral e os biomarcadores relacionados é um passo importante para prever a recidiva e estabelecer estratégias terapêuticas. Objetivos: Analisar a expressão e valor prognóstico do receptor do Fator de Crescimento Epidérmico (EGFr) e sua relação com outros fatores implicados na recidiva no CHC. Pacientes e métodos: Foram analisados retrospectivamente os dados de 59 pacientes cirróticos submetidos a TxH no nosso centro com diagnóstico histopatológico confirmado de CHC no período de 2001 a 2006. Resultados: Foi registrada uma sobrevida global e em 1, 3 e 5 anos de 89,3%, 74,9% e 72,4% respectivamente e uma sobrevida livre de doença em 1, 3 e 5 anos de 84,8%, 69,6% e 69,6% respectivamente. A taxa de recidiva foi de 22,03%. O EGFr foi expresso em 93,2% dos tumores, mas não apresentou relação estatisticamente significatica com risco de recidiva (p=0,147) ou outros fatores de risco. Somente a invasão vascular (p=0,046) e o tamanho > 5 cm (p=0,046) foram capazes de predizer o risco de recidiva. Conclusão: O tamanho tumoral e a invasão vascular foram os principais fatores de risco relacionados à recidiva tumoral, enquanto a expressão do EGFr, embora bastante alta, não tem relação com este risco. / Background: Recurrent Hepatocellular Carcinoma (HCC) is a significant cause of death after liver transplantation (LT). Understanding tumor biology and correlate biomarkers is an important step to predict recurrence and establish new therapies. Purpose: Analyze the expression and prognostic significance of Epidermal Growth Factor receptor (EGFr) on HCC and its relationship with other prognostic factors. Patients and methods: Data from 59 cirrhotic patients who underwent LT between 2001 and 2006 with pathological confirmation of HCC were analyzed retrospectively. Results: The overall survival at 1, 3 e 5 years was 89.3%, 74.9%, 72.4% while recurrence-free was 84.8%, 69.6, 69.6% respectively with a recurrence rate of 22%. EGFr was expressed in 93.2% of tumors, but no statistical relationship with HCC recurrence (p=0.147) were found. Only vascular invasion (p=0.046) and tumor size > 5 cm (p=0.046) predicted tumor recurrence. Conclusion: EGFr was widely expressed on our series of tumors, and, as so, has a poor prognostic value, with no significance among groups (negative, weak and strong expression) considering HCC recurrence. Only tumor size and vascular invasion were significant predictors of tumor recurrence.