O câncer configura uma das maiores causas de mortalidade no mundo, caracterizando-se como uma doença complexa orquestrada por alterações genômicas e epigenômicas capazes de alterar a expressão gênica e a identidade celular. Nova evidência obtida por meio de um estudo genômico em larga escala e cujos dados encontram-se disponíveis no banco público do TCGA sugere que um em cada dez pacientes portadores de câncer pode ser classificado com maior eficácia tendo como base a taxonomia molecular quando comparada à histologia. Dessa maneira, nós hipotetizamos que o estabelecimento de mapas genômicos exibindo a localização de sítios de ligação de fatores de transcrição combinada à identificação de regiões diferencialmente metiladas e perfis alterados de expressão gênica possa nos auxiliar a caracterizar e explorar, ao nível molecular, fenótipos associados ao câncer. Avanços tecnológicos e bancos de dados públicos a exemplo do The Cancer Genome Atlas (TCGA), The Encyclopedia of DNA Elements (ENCODE) e o NIH Roadmap Epigenomics Mapping Consortium (Roadmap) têm proporcionado um recurso inestimável para interrogar o (epi)genoma de linhagens de células tumorais em cultura, bem como de tecidos normais e tumorais em alta resolução. Todavia, a informação biológica encontra-se armazenada em diferentes formatos e não há ferramentas computacionais para integrar esses dados, evidenciando um cenário atual que requer, com urgência, o desenvolvimento de ferramentas de bioinformática e softwares capazes de direcionar a solução deste obstáculo. Nesse contexto, o objetivo principal deste estudo consiste em implementar o desenvolvimento de ferramentas de bioinformática, na linguagem de programação R que, ao final do estudo, será submetido à comunidade científica do projeto Bioconductor sob a licença de código aberto GNU GPL versão 3. Além disso, ajudaremos nossos colaboradores com o aperfeiçoamento do ELMER, um pacote R/Bioconductor que identifica elementos reguladores usando dados de expressão gênica, de metilação do DNA e análise de motivo. Nossa expectativa é que essas ferramentas possam automatizar com acurácia a pesquisa, o download e a análise dos dados (epi)genômicos que se encontram atualmente disponíveis nas bases de dados públicas dos consórcios internacionais TCGA, ENCODE e Roadmap, além de integrá-los facilmente aos dados genômicos e epigenômicos gerados por pesquisadores por meio de experimentos em larga escala. Além disso, realizaremos também o processamento e a análise manual dos dados que serão automatizados pelas ferramentas, visando validar sua capacidade em descobrir assinaturas epigenômicas que possam redefinir subtipos de câncer. Por xi fim, as usaremos para investigar as diferenças moleculares entre dois subgrupos de gliomas recentemente descobertos por nosso laboratório. / Cancer, which is one of the major causes of mortality worldwide, is a complex disease orchestrated by aberrant genomic and epigenomic changes that can modify gene regulatory circuits and cellular identity. Emerging evidence obtained through high-throughput genomic data deposited within the public TCGA international consortium suggests that one in ten cancer patients would be more accurately classified by molecular taxonomy versus histology. Therefore, we have hypothesized that the establishment of genome-wide maps of the de novo DNA binding motifs localization coupled with differentially methylated regions and gene expression changes might help to characterize and exploit cancer phenotypes at the molecular level. Technological advances and public databases like The Cancer Genome Atlas (TCGA), The Encyclopedia of DNA Elements (ENCODE), and The NIH Roadmap Epigenomics Mapping Consortium (roadmap) have provided unprecedented opportunities to interrogate the epigenome of cultured cancer cell lines as well as normal and tumor tissues with high resolution. Markedly however, biological information is stored in different formats and there is no current tool to integrate the data, highlighting an urgent need to develop bioinformatic tools and/or computational softwares to overcome this challenge. In this context, the main purpose of this study is the development of bioinformatics tools in R programming language that will be submitted to the larger open-source Bioconductor community project under the GNU GPL3 (General Public License version 3). Also, we will help our collaborators improve of the R/Bioconductor ELMER package that identifies regulatory enhancers using gene expression, DNA methylation data and motif analysis. Our expectation is that these tools can effectively automate search, retrieve, and analyze the vast (epi)genomic data currently available from TCGA, ENCODE, and Roadmap, and integrate genomics and epigenomics features with researchers own high-throughput data. Furthermore, we will also navigate through these data manually in order to validate the capacity of these tools in discovering epigenomic signatures able to redefine subtypes of cancer. Finally, we will use them to investigate the molecular differences between two subgroups of gliomas, one of the most aggressive primary brain cancer, recently discovered by our laboratory.

Este trabalho mostra o envolvimento do gene RECK no processo de progressão do ciclo celular. Foi verificado que a expressão endógena de RECK é modulada durante a progressão do ciclo celular. A superexpressão de RECK em fibroblastos normais de camundongo promove uma diminuição da capacidade proliferativa das células e um retardo da transição das fases G0/G1-S do ciclo celular. Além disso, os resultados sugerem que um dos possíveis mecanismos de ação de RECK, que promovem este processo, envolve a indução da expressão de um inibidor de CDK, especificamente de p21, e retardo da fosforilação de pRb. Os resultados indicam, ainda, que durante a progressão do ciclo celular a expressão do gene RECK apresenta uma correlação inversa com a expressão do proto-oncogene c-myc. Estes dados corroboram os dados da literatura que mostram RECK como um alvo para o produto de diversos oncogenes, como ras e c-myc. A caracterização da repressão de RECK por c-Myc mostrou que a mesma ocorre ao nível transcricional e que sítios Sp1, presentes no promotor de RECK, são essenciais para a ação de Myc. Dados adicionais sugerem que a repressão de RECK por c-Myc parece envolver mecanismos de desacetilação de histonas. A modulação da expressão de RECK também foi avaliada durante a progressão maligna de tumores do sistema nervoso central (especificamente, gliomas). Foi verificado que a expressão de RECK não é alterada com a progressão deste tipo de tumor. Porém, foi verificado que os pacientes que manifestaram um maior tempo de sobrevida apresentaram tumores com uma significativa maior expressão do gene RECK. Estes dados sugerem que RECK possa ser um possível marcador prognóstico. A caracterização da regulação da expressão de RECK, tanto em células normais como em diferentes tipos de tumores, assim como os alvos moleculares da sua ação, são pontos muito importantes para o entendimento dos mecanismos que controlam a proliferação celular e podem contribuir para o desenvolvimento de novas formas de terapia anti-tumoral. / This work shows, for the fIrst time, the involvement of the RECK gene in cell cycle progression. Our data shows that the RECK gene product regulates cell cycle progression by altering the G1 to S transition. Also, we show that RECK is able to induce p21 expression and, consequently, lead to hypophosphorylation of the Rb protein, revealing at least one molecular mechanism through which RECK modulates the cell cycle progression. It has been described that induction of the c-Myc transcription factor promotes cell proliferation and cell transformation by regulating several genes that are involved in cell cycle progression. Here, we show that activation of a Mycestrogen receptor fusion protein with 4-hydroxytamoxifen in mouse fibroblasts was suffIcient to repress the expression of the RECK gene, by acting at the RECK promoter region. In addition, we show that Myc-responsiveness seems to be mediated by the upstream Sp1 sites and to be dependent on cromatin remodelling mechanisms. RECK gene expression was aIso evaluated during human glioma progression. Our results indicate that RECK gene expression is not altered during glioma progresslOn, but a correlation was found between the abundance of RECK expression in gliomas and patient survival. The levels of RECK expression can be considered a good prognostic indicator for glioma patients. Better understanding of RECK gene regulation may contribute to uncover the mechanisms of cell cycle and tumor progression, and to the development of new strategies for cancer prevention and therapeutic intervention.

Fatores de transcrição (FT) são proteínas que se ligam em sequências específicas e bem conservadas de nucleotídeos no DNA, denominadas sítios de ligação dos fatores de transcrição (SLFT), localizadas em regiões de regulação gênica conhecidas como módulos cis-reguladores (CRM). Ao reconhecer o SLFT, o fator de transcrição se liga naquele sítio e influencia a transcrição gênica positiva ou negativamente. Existem técnicas experimentais para a identificação dos locais dos SLFTs em um genoma, como footprinting, ChIP-chip ou ChIP-seq. Entretanto, a execução de tais técnicas implica em custos e tempo elevados. Alternativamente, pode-se utilizar as sequências de SLFTs já conhecidas para um determinado fator de transcrição e aplicar técnicas de aprendizado computacional supervisionado para criar um modelo computacional para tal sítio e então realizar a predição computacional no genoma. Entretanto, a maioria das ferramentas computacionais existentes para esse fim considera independência entre as posições entre os nucleotídeos de um sítio - como as baseadas em PWMs (position weight matrix) - o que não é necessariamente verdade. Este projeto teve como objetivo avaliar a utilização de gramáticas regulares estocásticas (GRE) como técnica alternativa às PWMs neste problema, uma vez que GREs são capazes de caracterizar dependências entre posições consecutivas dos sítios. Embora as diferenças de desempenho tenham sido sutis, GREs parecem mesmo ser mais adequadas do que PWMs na presença de valores mais altos de dependência de bases, e PWMs nos demais casos. Por fim, uma ferramenta de predição computacional de SLFTs foi criada baseada tanto em GREs quanto em PWMs. / Transcription factors (FT) are proteins that bind to specific and well-conserved sequences of nucleotides in the DNA, called transcription factor binding sites (TFBS), contained in regions of gene regulation known as cis-regulatory modules (CRM). By recognizing TFBA, the transcription factor binds to that site and positively or negatively influence the gene transcription. There are experimental procedures for the identification of TFBS in a genome such as footprinting, ChIP-chip or ChIP-Seq. However, the implementation of these techniques involves high costs and time. Alternatively, one may utilize the TFBS sequences already known for a particular transcription factor and applying computational supervised learning techniques to create a computational model for that site and then perform the computational prediction in the genome. However, most existing software tools for this purpose considers independence between nucleotide positions in the site - such as those based on PWMs (position weight matrix) - which is not necessarily true. This project aimed to evaluate the use of stochastic regular grammars (SRG) as an alternative technique to PWMs in this problem, since SRGs are able to characterize dependencies between consecutive positions in the sites. Although differences in performance have been subtle, SRGs appear to be more suitable than PWMs in the presence of higher base dependency values, and PWMs in other cases. Finally, a computational TFBS prediction tool was created based on both SRGs and PWMs.

INTRODUÇÃO: O polimorfismo dentro do gene TCF7L2, rs7903146, é, até o momento, o marcador genético mais significantemente associado ao risco de diabetes mellitus tipo 2, sendo também associado à doença arterial coronariana. Contudo, pouco ainda se conhece sobre o papel funcional desse polimorfismo na patologia dessas doenças. O objetivo desse projeto foi investigar esse papel funcional, no fenótipo de células vasculares de músculo liso de 92 indivíduos, usando abordagens de comparação de níveis de expressão gênica e de comparação de correlações de expressão gênica, de modo que tais comparações fossem representadas visualmente como redes de interação gênica. MÉTODOS: Inicialmente, foram comparados os níveis de expressão de 41 genes (genes que possuem ou estão perto de variantes genéticas associadas ao diabetes mellitus tipo 2 e outros genes relacionados às vias de sinalização de diabetes mellitus tipo 2 ou às vias de proliferação celular) entre indivíduos com o alelo associado ao risco de diabetes mellitus tipo 2 (CT e TT) e indivíduos sem o alelo de risco (CC) do rs7903146. Com a finalidade de se observar se os genes estavam se relacionando de modo diferente entre os grupos genotípicos, foram comparados os padrões de correlação de expressão dos 41 genes. RESULTADOS: Quanto às comparações de níveis de expressão entre os grupos, cinco formas de splicing do gene TCF7L2 e os genes CDKAL1, IGF2BP2, JAZF1, CDKN2B, CAMK1D, JUN, CDK4, ATP2A2, e FKBP1A apresentaram níveis de expressão significativamente diferentes. Quanto às comparações de correlação de expressão entre os grupos, os genes RXR?, CALM1, CALR e IGF2BP2 foram os que mostraram os mais diferentes padrões de correlação com os outros genes. CONCLUSÃO: Deste modo, o alelo de risco analisado é apontado como tendo influência em cis na regulação da expressão de determinadas formas de splicing do gene TCF7L2 em células vasculares de músculo liso; além de parecer influenciar nas expressões e nas interações de genes relacionados à homeostase glicolítica e/ou proliferação celular. Sendo assim, através de nossas análises identificaram-se possíveis candidatos-alvos no tratamento de redução do risco em indivíduos com alto risco de desenvolvimento de diabetes mellitus tipo 2 e de doença arterial coronariana, especialmente os indivíduos que possuem os genótipos de risco analisados do gene TCF7L2 / INTRODUCTION: The SNP within the TCF7L2 gene, rs7903146, is, to date, the most significant genetic marker associated with type 2 diabetes mellitus risk, well as being associated with coronary artery disease. Nonetheless, its functional role in these diseases pathology is poorly understood. The aim of the present study was to investigate this role, in vascular smooth muscle cells from 92 patients undergoing aortocoronary bypass surgery, using expression levels and expression correlation comparison approaches, which were visually represented as gene interaction networks. METHODS: Initially, the expression levels of 41 genes (seven TCF7L2 splice forms and other 40 relevant genes) were compared between rs7903146 wild-type (CC) and type 2 diabetes mellitus risk (CT + TT) genotype groups. Next, the expression correlation patterns of the 41 genes were compared between genotypic groups in order to observe if the relationships between genes were different. RESULTS: Five TCF7L2 splice forms and CDKAL1, IGF2BP2, JAZF1, CDKN2B, CAMK1D, JUN, CDK4, ATP2A2 and FKBP1A genes showed significant expression differences between groups. RXR?, CALM1, CALR and IGF2BP2 genes were pinpointed as showing the most different expression correlation pattern with other genes. CONCLUSION: Therefore, type 2 diabetes mellitus risk alleles appear to be influencing TCF7L2 splice form\'s expression in vascular smooth muscle cells; besides it can be influencing expression and interactions of genes related to glucose homeostasis and/or cellular proliferation. Thereby, through our analysis were identified possible treatment target candidates for risk reduction in individuals with high-risk of developing type 2 diabetes mellitus and coronary artery disease, especially individuals harboring TCF7L2 risk genotypes

Os craniofaringiomas são os tumores mais frequentes da região hipotálamohipofisária na faixa etária pediátrica. Apesar de serem histologicamente benignos, sua tendência infiltrativa e seu comportamento agressivo resultam em significante morbimortalidade. Histologicamente podem ser divididos em dois subtipos: adamantinomatosos e papilíferos. A patogênese dos craniofaringiomas é pouco compreendida. Mutações no gene CTNNB1, que codifica a proteína beta-catenina, são a única alteração molecular conhecida até o momento implicada na tumorigênese dos craniofaringiomas adamantinomatosos. Tais mutações afetam o sítio de degradação da beta-catenina, que passa a se acumular no citoplasma e no núcleo, ativando excessivamente a via de sinalização WNT, através da ligação aos fatores de transcrição da família LEF/TCF, levando a tumorigênese. Recentemente foi descoberto um novo mecanismo de determinação da linhagem celular hipofisária regulado pela beta-catenina, através do qual ela interage diretamente com o PROP1 para determinar a diferenciação celular hipofisária. De acordo com esse modelo, o complexo protéico PROP1/beta- catenina atua simultaneamente como repressor do HESX1 e ativador do PIT1, dependendo dos co-fatores associados. Pacientes com mutações germinativas inativadoras no PROP1 desenvolvem hipopituitarismo e podem apresentar aumento hipofisário com imagens de ressonância nuclear magnética (RNM) da região selar muitas vezes semelhantes àquelas dos craniofaringiomas, com hiperssinal em T1. Por outro lado, camundongos com expressão persistente do Prop1 exibem defeitos na regulação da proliferação celular hipofisária, incluindo cistos da bolsa de Rathke, hiperplasia adenomatosa e tumores, sugerindo que mutações com ganho de função no PROP1 também poderiam contribuir para a patogênese de tumores hipofisários em seres humanos. A semelhança entre as imagens de RNM dos pacientes com craniofaringiomas e daqueles com aumento hipofisário devido a mutações inativadoras no PROP1, e o fato de que camundongos transgênicos com expressão persistente do Prop1 apresentam aumento da susceptibilidade a tumores hipofisários, deram base a nossa hipótese de que uma desregulação na expressão do PROP1 em humanos poderia estar envolvida na patogênese dos craniofaringiomas adamantinomatosos. Esse trabalho teve como objetivo avaliar a presença de mutação somática no exon 3 do CTNNB1 e avaliar a expressão desse gene e do gene PROP1 em craniofaringiomas adamantinomatosos. Foram obtidas 14 amostras desse tipo de tumor por meio da ressecção terapêutica. As amostras foram submetidas à extração do RNA e posterior transcrição reversa para obtenção de cDNA. A partir do cDNA foi realizada PCR e sequenciamento do exon 3 do CTNNB1 em todas as amostras. Porém, a avaliação por PCR em tempo real foi realizada apenas em 12 amostras, devido à qualidade inadequada de 2 amostras para submissão a essa metodologia. Foram encontradas mutações missense, em heterozigose em 9 das 14 amostras, sendo 5 previamente descritas e 2 ainda não descritas em craniofaringiomas adamantinomatosos. Hiperexpressão do CTNNB1 foi encontrada em 7 amostras, sendo 5 com mutação e 2 sem mutação no CTNNB1.A hiperexpressão variou de 2,5 a 6,2 vezes maior que o pool de hipófise normal. Contudo, a expressão do PROP1 foi indetectável em todas as amostras. Concluímos que o aumento da expressão do CTNNB1 presente em 58% das amostras sugere o envolvimento também da hiperexpressão desse gene na etiopatogenia do craniofaringioma adamantinomatoso, enquanto a ausência de expressão do PROP1 afasta a participação desse gene na etiopatogenia do craniofaringioma adamantinomatoso / Craniopharyngiomas are the the commonest tumors to involve the hypothalamo-pituitary regions in childhood population. Histologically they are benign, and can be divided in two primary subtypes: the adamantinomatous and the papillary. Although histologically benign, their infiltrative tendency and aggressive behavior can result in great morbidity. The pathogenesis of craniopharyngiomas is poorly understood. To date, beta-catenin gene (CTNNB1) mutations have been identified only in the adamantinomatous subtype. These mutations affect the degradation target box of beta-catenin that accumulates in the cytoplasm and the nucleus increasing the transcriptional activity of WNT pathway through interaction with the transcription factors of LEF/TCF family, leading to tumorigenesis. Recently, an interaction between beta-catenin and PROP1 was described as a new mecanism for beta-catenindependent regulation of pituitary cell-lineage determination. According to this novel model, the PROP1/beta-catenin proteic complex would act as a binary switch to simultaneously repress the transcription factor HESX1 and to activate expression of transcription factor PIT1, depending on the associated cofactors. Patients with loss-of-function mutations in PROP1 present combined pituitary hormonal deficiency generally associated with pituitary enlargement and the magnetic resonance imaging (MRI) of the sellar region in these patients sometimes resembles that of the craniopharyngiomas, with T1 hyperintense signal. On the other hand, transgenic mice with persistent Prop1 expression exhibit defects consistent with misregulation of pituitary cell proliferation, including adenomatous hyperplasia with formation of Rathke\'s cleft cysts and tumors suggesting that misregulation of PROP1 expression in human could contribute to pathogenesis of pituitary tumors. The similarity between the MRI images of craniopharyngiomas patients and that of patients with loss-of-function mutations in PROP1, associated with the fact that transgenic mice with persistent Prop1 expression exhibit increased susceptibility to pituitary tumors gave rise to our hypothesis that a misregulation of PROP1 expression could be involved in the pathogenesis of adamantinomatous craniopharyngiomas. The aim of this study was to analyze the presence of somatic mutations in exon 3 of CTNNB1 and the expression pattern of this gene and the PROP1 gene in adamantinomatous craniopharyngiomas. Fourteen samples were obtained from therapeutic surgery and submitted to RNA extraction and reverse transcription in order to produce the cDNA. The cDNA was used as a template to CTNNB1 exon 3 PCR reaction followed by direct sequencing of all samples. However, the real-time RT-PCR analysis was realized only in 12 samples, since 2 of them had an insufficient quality for this method. Missence, heterozygous mutations were found in 9 out of 14 samples; five were previously described and 2 not yet described in adamantinomatous craniopharyngiomas. Overexpression of CTNNB1 was found in 7 samples, which them 5 with CTNNB1 mutation 2 whitout. The overexpression ranged from 2.5 to 6.2 fold more than pituitary normal pool. However, the PROP1 expression was undetectable in all the samples. We could conclude that the amount of 58% CTNNB1 overexpressed samples suggest also a role of this overexpression in the pathogenesis of adamantinomatous craniopharingiomas, while the undetectable levels of PROP1 exclude a role of this gene in the pathogenesis of adamantinomatous craniopharingiomas

Este trabalho mostra o envolvimento do gene RECK no processo de progressão do ciclo celular. Foi verificado que a expressão endógena de RECK é modulada durante a progressão do ciclo celular. A superexpressão de RECK em fibroblastos normais de camundongo promove uma diminuição da capacidade proliferativa das células e um retardo da transição das fases G0/G1-S do ciclo celular. Além disso, os resultados sugerem que um dos possíveis mecanismos de ação de RECK, que promovem este processo, envolve a indução da expressão de um inibidor de CDK, especificamente de p21, e retardo da fosforilação de pRb. Os resultados indicam, ainda, que durante a progressão do ciclo celular a expressão do gene RECK apresenta uma correlação inversa com a expressão do proto-oncogene c-myc. Estes dados corroboram os dados da literatura que mostram RECK como um alvo para o produto de diversos oncogenes, como ras e c-myc. A caracterização da repressão de RECK por c-Myc mostrou que a mesma ocorre ao nível transcricional e que sítios Sp1, presentes no promotor de RECK, são essenciais para a ação de Myc. Dados adicionais sugerem que a repressão de RECK por c-Myc parece envolver mecanismos de desacetilação de histonas. A modulação da expressão de RECK também foi avaliada durante a progressão maligna de tumores do sistema nervoso central (especificamente, gliomas). Foi verificado que a expressão de RECK não é alterada com a progressão deste tipo de tumor. Porém, foi verificado que os pacientes que manifestaram um maior tempo de sobrevida apresentaram tumores com uma significativa maior expressão do gene RECK. Estes dados sugerem que RECK possa ser um possível marcador prognóstico. A caracterização da regulação da expressão de RECK, tanto em células normais como em diferentes tipos de tumores, assim como os alvos moleculares da sua ação, são pontos muito importantes para o entendimento dos mecanismos que controlam a proliferação celular e podem contribuir para o desenvolvimento de novas formas de terapia anti-tumoral. / This work shows, for the fIrst time, the involvement of the RECK gene in cell cycle progression. Our data shows that the RECK gene product regulates cell cycle progression by altering the G1 to S transition. Also, we show that RECK is able to induce p21 expression and, consequently, lead to hypophosphorylation of the Rb protein, revealing at least one molecular mechanism through which RECK modulates the cell cycle progression. It has been described that induction of the c-Myc transcription factor promotes cell proliferation and cell transformation by regulating several genes that are involved in cell cycle progression. Here, we show that activation of a Mycestrogen receptor fusion protein with 4-hydroxytamoxifen in mouse fibroblasts was suffIcient to repress the expression of the RECK gene, by acting at the RECK promoter region. In addition, we show that Myc-responsiveness seems to be mediated by the upstream Sp1 sites and to be dependent on cromatin remodelling mechanisms. RECK gene expression was aIso evaluated during human glioma progression. Our results indicate that RECK gene expression is not altered during glioma progresslOn, but a correlation was found between the abundance of RECK expression in gliomas and patient survival. The levels of RECK expression can be considered a good prognostic indicator for glioma patients. Better understanding of RECK gene regulation may contribute to uncover the mechanisms of cell cycle and tumor progression, and to the development of new strategies for cancer prevention and therapeutic intervention.

O diabetes mellitus tipo 2 (DM2) é caracterizado pela presença de resistência à insulina, a qual pode ser modulada pelo estrógeno, tanto em fêmeas como em machos. Nesse processo, o transportador de glicose GLUT4 (gene Slc2a4, solute carrier family 2 member 4) desempenha papel importante, pois aumento da expressão do GLUT4 melhora o controle glicêmico. Estradiol (E2) regula a expressão do Slc2a4 por meio do balanço dos efeitos contrários de seus receptores (ERs): ER-alfa estimula e ER-beta inibe a expressão. Efeitos transcricionais dos ERs envolvem a participação de co-reguladores, destacadamente o SP1 (transcription factor Sp1), potente estimulador do Slc2a4. Entretanto, o papel do SP1 na regulação do Slc2a4 mediada pelos ERs é desconhecido; e este foi o objetivo do presente estudo. Investigou-se adipócitos maduros 3T3-L1, tratados por 24 horas com E2, agonista de ER-alfa (PPT) ou agonista de ER-beta (DPN). Avaliou-se: a expressão gênica (RT-qPCR) de Slc2a4 e Sp1; o conteúdo (Western blotting) total de GLUT4 e o nuclear de ER-alfa/beta e SP1; a atividade de ligação do SP1 no Slc2a4 (ensaio de mobilidade eletroforética); e a formação de complexos SP1/ER-alfa (imunoprecipitação). Os resultados confirmaram que E2 aumenta a expressão de Slc2a4/GLUT4 pela ação preponderante do ER-alfa. O agonista PPT aumentou: o conteúdo nuclear de SP1, a interação SP1/ER-alfa e a atividade de ligação do SP1 no Slc2a4. O agonista DPN indicou que a ação repressora do ER-beta não envolve o SP1. Conclui-se que o efeito estimulador do ER-alfa na expressão do Slc2a4 envolve mecanismo de transativação gênica via SP1. Essas observações colocam a cooperação ER-alfa/SP1 como um novo alvo para o desenvolvimento de medidas terapêuticas para resistência à insulina e diabetes mellitus tipo 2 / Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is characterized by insulin resistance, which can be modulated by estrogen in both females and males. In this process, the glucose transporter GLUT4 (solute carrier family 2 member 4 gene - Slc2a4) plays an important role, since increasing GLUT4 expression improves glycemic control. Estradiol (E2) regulates the expression of Slc2a4, by a mechanism in which estrogen receptors (ERs) play opposite effects: ER-alpha stimulates, whereas ER-beta inhibits the expression. Transcriptional effects of ERs involve co-regulators, notably the transcription factor SP1, a powerful enhancer of Slc2a4. However, the role of SP1 in the ERs-mediated regulation of Slc2a4 is unknown; and that was the aim of the present study. Differentiated adipocytes 3T3-L1 were treated (24 hours) with E2, ER-alpha agonist (PPT) or ER-beta agonist (DPN). It was analyzed: gene expression (RT-qPCR) of Slc2a4 and Sp1; total content o GLUT4 and nuclear content of ER-alpha/beta and SP1 (Western blotting); binding activity of SP1 into Slc2a4 promoter (electrophoretic mobility shift assay); and content of nuclear SP1/ER-alpha complexes (immunoprecipitation). Results confirmed that E2 increases the expression of Slc2a4/GLUT4, by the dominant effect of ER-alpha. The ER-alpha agonist PPT increased the nuclear content of SP1, the interaction of SP1/ER-alpha, and the binding activity of SP1 into the Slc2a4. The agonist DPN evinced that ER-beta activity does not involve the SP1. In conclusion, the enhancer effect of ER-alpha upon Slc2a4 gene expression involves a transactivation mechanism via SP1. This observation point outs the cooperation of ER-alpha/SP1 as a new target for the development of approaches to treat insulin resistance and T2DM

Fatores de transcrição (FT) são proteínas que se ligam em sequências específicas e bem conservadas de nucleotídeos no DNA, denominadas sítios de ligação dos fatores de transcrição (SLFT), localizadas em regiões de regulação gênica conhecidas como módulos cis-reguladores (CRM). Ao reconhecer o SLFT, o fator de transcrição se liga naquele sítio e influencia a transcrição gênica positiva ou negativamente. Existem técnicas experimentais para a identificação dos locais dos SLFTs em um genoma, como footprinting, ChIP-chip ou ChIP-seq. Entretanto, a execução de tais técnicas implica em custos e tempo elevados. Alternativamente, pode-se utilizar as sequências de SLFTs já conhecidas para um determinado fator de transcrição e aplicar técnicas de aprendizado computacional supervisionado para criar um modelo computacional para tal sítio e então realizar a predição computacional no genoma. Entretanto, a maioria das ferramentas computacionais existentes para esse fim considera independência entre as posições entre os nucleotídeos de um sítio - como as baseadas em PWMs (position weight matrix) - o que não é necessariamente verdade. Este projeto teve como objetivo avaliar a utilização de gramáticas regulares estocásticas (GRE) como técnica alternativa às PWMs neste problema, uma vez que GREs são capazes de caracterizar dependências entre posições consecutivas dos sítios. Embora as diferenças de desempenho tenham sido sutis, GREs parecem mesmo ser mais adequadas do que PWMs na presença de valores mais altos de dependência de bases, e PWMs nos demais casos. Por fim, uma ferramenta de predição computacional de SLFTs foi criada baseada tanto em GREs quanto em PWMs. / Transcription factors (FT) are proteins that bind to specific and well-conserved sequences of nucleotides in the DNA, called transcription factor binding sites (TFBS), contained in regions of gene regulation known as cis-regulatory modules (CRM). By recognizing TFBA, the transcription factor binds to that site and positively or negatively influence the gene transcription. There are experimental procedures for the identification of TFBS in a genome such as footprinting, ChIP-chip or ChIP-Seq. However, the implementation of these techniques involves high costs and time. Alternatively, one may utilize the TFBS sequences already known for a particular transcription factor and applying computational supervised learning techniques to create a computational model for that site and then perform the computational prediction in the genome. However, most existing software tools for this purpose considers independence between nucleotide positions in the site - such as those based on PWMs (position weight matrix) - which is not necessarily true. This project aimed to evaluate the use of stochastic regular grammars (SRG) as an alternative technique to PWMs in this problem, since SRGs are able to characterize dependencies between consecutive positions in the sites. Although differences in performance have been subtle, SRGs appear to be more suitable than PWMs in the presence of higher base dependency values, and PWMs in other cases. Finally, a computational TFBS prediction tool was created based on both SRGs and PWMs.