A leishmaniose é uma doença causada por parasitos do gênero Leishmania e transmitida por insetos flebotomíneos. O objetivo deste trabalho foi comparar o perfil da infecção por L. amazonenses em BALB/c, BALB/c nude e C57BL/6, e avaliar a expressão das proteínas CP, LACK, LRR17, metacaspase, PDI e STI, em amastigotas isolados de BALB/c e BALB/c nude. Observamos em 13 semanas o aumento mais precoce da espessura da pata em BALB/c do que em BALB/c nude. A carga parasitária nos animais nude foi superior à dos demais. Por outro lado, animais C57BL/6 controlaram a infecção a partir da sexta semana. A análise da expressão gênica nas lesões mostrou um padrão misto Th1/Th2 em todos os animais, e maior expressão de IFN-g, IL-4, IL1b e iNOS em BALB/c. Em baço e linfonodo observamos baixa expressão de CD3e e elevada expressão de iNOS em BALB/c nude. A análise por FACs mostrou em baço e linfonodo a esperada baixa porcentagem de células TCD4 e T CD8 em BALB/c nude, no entanto com capacidade de produzir IFN-g e IL-4. A LACK e a metacaspase estão aumentadas nos parasitas isolados de BALB/c nude. A metacaspase apresentou maior atividade também em nude. Não observamos diferença na expressão da LACK e metacaspase em amastigotas isolados de macrófagos infectados na presença de IFN-g e IL-4. / Leishmaniasis is caused by parasites of Leishmania genus, transmitted by phlebotomine sandflies. The aim of this study was to compare the profile of the infection by L. amazonenses in BALB/c, BALB/c nude and C57BL/6 and to analyze the expression of CP, LACK, LRR17, metacaspase, PDI and STI proteins, in amastigotes isolated from BALB/c and BALB/c nude lesions. We observed during 13 weeks an early increase in footpad thickness in BALB/c compared to BALB/c nude. Parasite loads in nude mice were higher than the others. C57BL/6 mice controlled infection since the sixth week. Gene expression analysis of the lesions indicated a mixed Th1/Th2 pattern in all mice, and higher expression of IFN-g, IL-4, IL1b and iNOS in BALB/c. In spleens and lymph nodes we observed lower expression of CD3e and high expression of iNOS in BALB/c nude. FACs analysis of spleens and lymph nodes showed low percentages of TCD4 and T CD8 cells in BALB/c nude, but producing IFN-g and IL-4. LACK and metacaspase are increased in parasites isolated from BALB/c nude, and metacaspase had higher enzymatic activity in amastigotes from nude. No differences in LACK or metacaspase in amastigotes isolated from macrophages infected in the presence of IFN-g and IL-4 were observed.

A cárie dental, uma doença multifatorial de caracter bacteriana associada à dieta alimentar, que danifica a estrutura dos dentes, se mantém como um problema de saúde pública mundial. A produção de ácidos por bactérias acidogênicas, como o Streptococcus mutans é considerada um importante fator etiológico no desenvolvimento de cáries. Este microorganismo está sempre presente no biofilme dental potencialmente cariogênico. Além disso, há uma clara e forte evidência que a produção de glucanas é essencial para a expressão da virulência de S. mutans, contribuindo para a aderência efetiva da bactéria à superfície dental, pela exposição à sacarose. Neste trabalho, estudamos a ação do extrato bruto hidroetanólico das folhas (EF), do óleo-resina (OR) e de suas frações, a fração volátil (FV) e a fração resinosa (FR), de Copaíba sobre fatores de virulência de S. mutans. O efeito inibitório na produção de ácido foi monitorado pelo registro potenciométrico de pH da suspensão bacteriana em função do tempo de incubação, tratadas com concentrações seriadas dos produtos naturais de copaíba. Para o ensaio da atividade antibacteriana, a concentração inibitória mínima (CIM) e a bactericida mínima (CBM) foram determinadas e comparadas. Glucanas sintetizadas a partir da sacarose por glucosiltransferases isoladas de S. mutans (GTFs) em presença dos produtos de copaíba foi quantificada pelo método do fenol-sulfúrico. Os valores de de CI50 estabelecidos nos ensaios de potencial acidogênico foram iguais a 0,36 mg/mL (EF), e 0,06 mg/mL (FV). Enquanto a CIM foi estabelecida em 1 mg/mL (EF) e 0,2 mg/mL (FV). No entanto, tanto o EF quanto a F não apresentaram nenhum efeito bactericida nas concentrações testadas, sugerindo que eles exercem um efeito bacteriostático. Por outro lado, o OR exibiu um efeito bacteriostático em baixa concentração (CIM = 0,4 mg/mL) e um efeito bactericida em concentrações maiores (0,8 mg/mL). O OR também apresentou um maior efeito inibitório sobre a produção de ácidos bacterianos quando comparado ao EF, em concentrações menores ou igual a 2,0 mg/mL, porém em concentrações maiores este efeito inibitório foi equivalente. OR inibiu a síntese de glucanas insolúveis em um perfil dose-dependente e suprimiu a atividade das GTFs-AC e GTFs-EC em 70% e 50%, respectivamente, na concentração de 20 ?g/mL. Igualmente o OR suprimiu a síntese de glucanas solúveis pelas GTFs-EC (60%) na mesma concentração. Por outro lado, o EF não apresentou efeito acentuado sobre a atividade de GTFs-AC e GTFs-EC. / Dental caries, a diet-bacterial disease which damages the structure of teeth, continues to be a major public health problem worldwide. Acid production by acidogenic bacteria, such as Streptococcus mutans, which are embedded in a biofilm termed ?dental plaque? is a key aspect of the pathogenesis of dental caries. In addition, there is clear and unequivocal evidence that glucan production is essential for the expression of virulence by mutans streptococci and contribute for the effective adherence of bacteria on dental surfaces formed when exposed to sucrose. In this work, we have evaluated the effect of the hidroethanolic crude extract from the leaves of copaiba (EF), as well as, the wood oil resin from copaiba (OR) and its volatile fraction (FV) upon virulence factors of Streptococcus mutans. The inhibitory effect on bacteria acid production was evaluated through the potentiometric measurement of pH from bacterial suspensions treated with serial concentrations of natural products. For the antibacterial activity assay, the minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal concentrations (MBC) were determined and compared. Glucans synthesized from sucrose by streptococci glucosiltransferases (GTFs), in the presence of Copaiba natural products, were quantified by phenol-sulphuric method. The IC50 values established for the acidogenic potential assay were 0.36 mg/mL (EF) and 0.06 mg/mL (FV), while the MIC values were 1.0 mg/mL (EF) and 0.2 mg/mL (FV). However, both EF and FV did not display any bactericidal effect at the tested concentration range, suggesting that they exert a bacteriostact, rather than a bactericidal effect. On the other hand, OR exerted a bacteriostact effect at low concentrations (MIC = 0.4 mg/mL) and a bactericidal effect at higher concentration (MBC = 0.8 mg/mL). OR also displayed a higher inhibitory activity on bacterial acid production when compared to EF, at concentrations less than or equal to 2.0 mg/mL, but at higher concentrations their inhibitory effects were equivalent. OR inhibited insoluble glucan synthesis in a dose-dependent profile and suppressed GTFs-AC and GTFs-EC activities by 70% and 50%, respectively, at a concentration of 20 ?g/mL. Similary, OR suppressed soluble glucans synthesis by GTFs-EC (60%), at the same concentration. On the other hand, the EF did not affect significantly the activity of the GTFs-AC and GTFs-EC.

O fitopatógeno Xanthomonas axonopodis pv citri (XAC) é o agente causal do cancro em citros. O desenvolvimento da infecção depende do sucesso de XAC na colonização do hospedeiro. Para isso, além do sistema de secreção tipo III, que injeta efetores de virulência dentro da célula do hospedeiro, Xanthomonas também conta com o processo de quorum-sensing. O aumento da densidade celular em XCC (Xanthomonas campestris pv campestris) promove o acúmulo da molécula sinalizadora difusível (DSF) produzida por RpfF, que ativa o sistema de dois componentes formado pelas proteínas RpfC e RpfG, as quais transduzem o sinal de ativação para o fator de transcrição Clp (CAP Like Protein - homóloga da proteína CAP de E. coli). A proteína RpfG contém um domínio de fosfodiesterase conservado (HD-GYP) que regula a concentração de diGMP cíclico (c-diGMP), um segundo mensageiro bacteriano. Dessa forma o domínio HD-GYP atua contrapondo-se à atividade dos domínios diguanilato ciclases (GGDEF). No caso de XCC, foi demonstrado que a ativação do domínio HD-GYP de RpfG reduz a concentração de c-diGMP na célula e promove a ligação e ação positiva de Clp no promotor do gene de engXCA. Com intuito de estudar a via Rpf em XAC, produzimos mutantes não-polares de rpfF, rpfC, rpfG, dos genes que codificam os domínios GGDEF que interagiram com RpfG (Andrade et al. 2006), clp, fliC, pilT, gumD e também geramos mutantes dos operons xcs e xps, que codificam sistemas de secreção do tipo 2 em XAC. Análise por HPLC-MS/MS mostrou que a deleção de rpfG, mas não clp, promoveu um aumento de aproximadamente 4 vezes dos níveis celulares de c-diGMP. Também foi demonstrado por EMSA que c-diGMP inibe a ligação de Clp ao promotor do operon xcs. Os mutantes ΔrpfF-C-G e Δclp mostraram um comprometimento da mobilidade, redução da biossíntese de exopolissacarídeos e na produção de fatores de virulência. Em adição, observamos uma diminuição significativa no crescimento dos mutantes ΔrpfG e Δclp dentro do hospedeiro. Além disso, identificamos também novos fatores envolvidos no metabolismo do c-diGMP e (p)ppGpp em XAC. Além do c-diGMP, outro segundo mensageiro o (p)ppGpp, cuja concentração na célula é regulada pelas proteínas SpoT e RelA, pode afetar a expressão de maneira dependente da subunidade ω da RNA polimerase em XAC. Finalmente, propusemos um modelo onde a concentração de c-diGMP sob controle da via do quorum-sensing e a sinalização por (p)ppGpp podem convergir para alguns efetores que regulam a mobilidade e a patogenicidade em XAC. / In Xanthomonas, the cell-cell signaling mediated by diffusible molecules is known to play an important role in regulating physiological process, including the formation and dispersal of biofilms and virulence. It has been shown that the ability of Xanthomonas species to incite disease depends on several factors, including adhesins, synthesis of extracellular enzymes, type III secretion system (T3SS) effectors and the exopolysaccharide (EPS) xanthan. The rpf genes act to positively regulate the synthesis of extracellular enzymes, EPS and pathogenicity. The rpfF, rpfC and rpfG genes are implicated in a regulatory system involving a diffusible signal factor (DSF) whose synthesis of DSF depends on RpfF. DSF perception and signal transduction are mediated by the two-component system comprising RpfC and RpfG. High cell densities are thought to lead to the phosphorylation of RpfG by RpfC which in turn activates the RpfG HD-GYP phosphodiestarase domain whose substrate has been shown to be the important second messenger cyclic diGMP (c-diGMP) (Ryan et al., 2006). This work was prompted to by the observation that the HD-GYP domain of RpfG interacts with a subset of diguanylate cyclase (GGDEF) proteins (Andrade et al., 2006), responsible for c-diGMP synthesis in Xanthomonas axonopodis pv citri (XAC). In order to study rpf signaling in XAC, we produced non-polar knockouts of rpfF, rpfC, rpfG, all genes coding the GGDEF domains shown to interact with RpfG, CAP-like protein (clp), fliC, pilT, gumD and polar insertions in the operons of both type 2 secretion systems coded by the XAC genome. HPLC-MS/MS analysis showed that the deletion of rpfG, but not clp, promoted an approximate 4-fold increase in cellular c-diGMP levels. We Also demonstrated that c-diGMP inhibits the binding of Clp to the promoter of the XAC0694 gene, the first gene in the operon coding the type 2 secretion system. The rpf genes and clp knockouts have impaired motility, reduction in exopolissacarides and extracellular enzyme production. Furthermore, we observe a significant decrease in the growth of rpfG and clp mutants in host tissues. Our results demonstrate that RpfF-RpfC-RpfG-Clp signaling in XAC is associated with cellular c-diGMP levels and is important for XAC virulence, motility, and EPS production. In addition, we have identified new factors involved to metabolism of c-diGMP and (p)ppGpp in XAC. The (p)ppGpp synthesis and degradation is under control of the proteins SpoT and RelA; However the effect of (p)ppGpp on gene expression seems to depend of the ω subunit of RNA polimerase in XAC. Finally, we propose the model where c-diGMP levels controlled by quorum-sensing and the (p)ppGpp signalization may converge to regulate the motility and pathogenicity of XAC.

Introdução: Patógenos emergentes são isolados nas vias respiratórias de pacientes com fibrose cística (FC), entre eles a Burkholderia cepacia. Atualmente, é conhecida como um conjunto de nove espécies relacionadas (\"genomovares\"), referidas coletivamente como complexo B. cepacia. A identificação fenotípica do complexo B. cepacia é difícil, e métodos de análise do genoma bacteriano, como a reação em cadeia da polimerase, que exploram diferenças no gene recA, têm mostrado grande eficácia na caracterização dos genomovares. Alguns Centros de tratamento de FC demonstraram infecções cruzadas entre os pacientes e marcadores de virulência foram identificados com freqüência em alguns deles. Métodos baseados em biologia molecular são capazes de realizar a genotipagem das cepas e têm sido utilizados na avaliação epidemiológica. Objetivos: Identificar o genomovar e a presença de marcadores de virulência entre as cepas do complexo Burkholderia cepacia isoladas de pacientes com fibrose cística atendidos no ICr e analisar as cepas do complexo Burkholderia cepacia através de genotipagem pela técnica de RAPD. Métodos: Foram coletadas 672 amostras de escarro e esfregaço de orofaringe de 140 pacientes com fibrose cística (6 meses a 19 anos) atendidos na nossa Unidade nos períodos de set/2000 a abr/2001 e jun/2003 a jun/2004. As amostras foram cultivadas em meios seletivos, incluindo meio para B. cepacia, e a identificação realizada por sistema automatizado (1º período) e por testes fenotípicos clássicos (2º período). Após a extração do DNA, as cepas foram submetidas a uma série de reações de PCR para a determinação dos genomovares (I a VII), utilizando primers direcionados à amplificação de diferentes trechos da seqüência do gene recA, sendo, em seguida, submetidas ao seqüenciamento do DNA deste gene. Os genes de virulência pesquisados foram o cblA (que codifica o pili) e o esmR (marcador de uma cepa epidêmica). A genotipagem foi realizada pela técnica do RAPD, que analisa todo o genoma bacteriano. Resultados: Foram isoladas 41 cepas do complexo B. cepacia, obtidas de 21 pacientes com fibrose cística. O método de PCR identificou o genomovar de 32/41 (78%) das cepas e todos os resultados foram confirmados através do seqüenciamento do DNA. B. cenocepacia foi o genomovar mais prevalente (n = 17), seguido da B. multivorans (n = 12), B. vietnamiensis (n = 2) e B. cepacia (n = 1). As nove cepas não caracterizadas foram submetidas ao seqüenciamento, tendo sido encontradas 5 cepas de B. gladioli, 2 cepas de X. campestris e 2 cepas permaneceram sem identificação. O gene cblA não foi identificado em nenhuma cepa, mas o gene esmR foi encontrado em 2 amostras (pacientes não relacionados). A genotipagem detectou 23 padrões distintos, sem identificar padrões idênticos entre pacientes diferentes. Conclusões: O método de PCR baseado na amplificação do gene recA mostrou ser eficaz para a determinação do genomovar. B. cenocepacia e B. multivorans foram as espécies mais prevalentes entre nossos pacientes. A prevalência de marcadores de virulência foi baixa entre as cepas isoladas. Infecção cruzada pelo complexo B. cepacia não parece ter ocorrido na nossa Unidade durante os períodos estudados. / Introduction: Emerging pathogens are found in the respiratory tract of the cystic fibrosis (CF) patients, including the bacterium Burkholderia cepacia. At the present moment, it is recognized as a group of nine related species (\"genomovars\"), collectively referred as B. cepacia complex. Phenotypical identification of B. cepacia complex is difficult, and molecular based methods such as PCR, exploring differences in recA gene sequence, showed high efficacy for genomovar determination. B. cepacia complex cross infections among CF patients were previously described in some CF treatment Centers, and virulence markers were identified in a high frequency in some of them. Molecular based methods are suitable for strain genotyping and have been used for epidemiological evaluation. Aims: To identify genomovar status and virulence markers among Burkholderia cepacia complex isolates obtained from cystic fibrosis patients attending in the ICr, and to analyze the isolates through genotyping by RAPD. Methods: 672 sputum or oropharyngeal samples were obtained from 140 cystic fibrosis patients (6 months to 19 years) attending our Unit from sep/2000 to apr/2001 and jun/2003 to jun/2004. The samples were cultivated in selective media, including B. cepacia medium, and bacterial identification obtained by automated system (first period) and by classical phenotypic tests (second period). After DNA extraction, B. cepacia complex strains were submitted to sequential PCR reactions targeting recA gene in order to determine genomovar status (I to VII), and after that, submitted to automated DNA sequencing of this gene. Virulence genes screened were cblA (cable pilus) and esmR (epidemic strain marker). Genotyping was performed by whole bacterial genome fingerprinting using RAPD. Results: 41 isolates of B. cepacia complex were obtained from 21 cystic fibrosis patients. The PCR method identified genomovar status of 32/41 (78%) isolates and all results were confirmed by DNA sequencing. B. cenocepacia was the main genomovar (n=17), followed by B. multivorans (n = 12), B. vietnamiensis (n = 2) and B. cepacia (n = 1). The nine isolates uncharacterized were submitted to sequencing and we found 5 isolates as B. gladioli, 2 isolates as X. campestris and 2 isolates remained unidentified. The cblA gene was not identified in all isolates, but esmR gene was found on 2 strains (unrelated patients). Genotyping depicted 23 patterns, without identical patterns among different patients. Conclusions: The PCR method targeting recA gene showed to be a valuable tool for determination of genomovar status. B. cenocepacia and B. multivorans were the most prevalent specie among our patients. The prevalence of virulence markers was low among the isolates. Cross infection by B. cepacia complex does not seem to have occurred in our Unit during the two studied periods.

Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2018-03-14T10:52:27Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Andressa Santana Santos - 2018.pdf: 1959070 bytes, checksum: d90ba29af15d78161810fe1b557cd44c (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2018-03-14T10:53:11Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Andressa Santana Santos - 2018.pdf: 1959070 bytes, checksum: d90ba29af15d78161810fe1b557cd44c (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2018-03-14T10:53:11Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Andressa Santana Santos - 2018.pdf: 1959070 bytes, checksum: d90ba29af15d78161810fe1b557cd44c (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2018-02-28 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / Introduction:Vulvovaginal candidiasis (VVC) is characterized as the second most common infection among infections affecting this region. Candida yeasts, such as C. albicans, C. parapsilosis, C. topicalis, C. glabrata, C. krusei and C. guilliermondii, are the main causes of this pathology and can be identified by phenotypic and molecular methods. Objectives:This study determines the predictive value (PPV) of the clinical diagnosis of VVC in comparison to the culture, characterizes Candida species isolated from the vaginal mucosa through phenotypic and molecular methods, and verifies the production of hydrolytic enzymes and the susceptibility profile in vitro to antifungal agents used in VVC therapy. Methods: the phenotypic methods used were based on morphological and biochemical aspects, while molecular tests were performed using the polymerase chain reaction with primes specific for each species. In order to verify the activity of the enzymes protease, phospholipase and hemolysin, yeast growth was carried out in media containing bovine albumin, egg yolk and blood, and the reading was determined by the precipitation zone (PZ). Adherence of Candida to epithelial cells was determined by light microscopy by counting the number of cells adhered to 100 epithelial cells. In vitro susceptibility of Candida isolates to fluconazole, itraconazole, voriconazole, nystatin, and amphotericin B was performed using the broth dilution assay to determine the minimum inhibitory concentration (MIC) of the antifungal. Results: the VPP of clinical diagnosis against the gold standard of 61.8% (34/55). Among the 55 samples collected, 36 isolates identified as C. albicans(27), C. glabrata (5) and C. topicalis (4) were obtained. All isolates were enzyme producers with average adherence to 100 oral epithelial cells for the C. albicans, C. glabrata and C. tropicalis species were respectively 402.5, 236.2 and 58. High resistance to fluconazole (38.8%), high susceptibility to amphotericin B (94.4%) and low MIC values for nystatin (8 μg / mL at > 16 μg/mL) were observed for the isolates. Conclusions: the culture is essential for the diagnosis of CVV and confirm that C. albicans continues the predominant species as CVV agent. All species presented a high pathogenic power. Hydrolytic enzymes were produced by all the isolates. This study allow suggest to the clinician that the in vitro susceptibility tests prior to antifungal prescription would bring higher therapeutic success. / Introdução: a candidíase vulvovaginal (CVV) é caracterizada como a segunda infecção mais comum entre as infecções que acometem esta região. As leveduras do gênero Candida, como C. albicans, C. parapsilosis, C. topicalis, C. glabrata, C. krusei e C. guilliermondii são as principais causadoras desta patologia, podendo ser identificadas por métodos fenotípicos e moleculares. Objetivos: determinar o valor preditivo (VPP), do diagnóstico clínico de CVV em comparação à cultura, realiza a caracterização das espécies de Candida isoladas da mucosa vaginal através de métodos fenotípicos e moleculares, verifica a produção de enzimas hidrolíticas e o perfil de suscetibilidade in vitro aos antifúngicos usados na terapia da CVV. Metódos: Os métodos fenotípicos usados foram baseados em aspectos morfológicos e bioquímicos, enquanto os testes moleculares foram realizados usando–se a reação em cadeia da polimerase com oligonucleotídeos específicos para cada espécie. Para a verificação da atividade das enzimas proteinase, fosfolipase e hemolisina, foi realizado respectivamente, o crescimento das leveduras em meios contendo albumina bovina, gema de ovo e sangue, sendo a leitura determinada pela zona de precipitação (PZ). A aderência de Candida às células epiteliais foi determinada por microscopia óptica pela contagem do número de células aderidas a 100 células epiteliais. A suscetibilidade in vitro dos isolados de Candida para fluconazol, itraconazol, voriconazol, nistatina e anfotericina B foi realizada usando-se o teste de diluição em caldo visando á determinação da concentração inibitória mínima (CIM) do antifúngico. Resultados: o VPP do diagnóstico clínico frente ao padrão-ouro de 61,8% (34/55). Dentre as 55 amostras coletadas foram obtidos 36 isolados identificados como C. albicans (27), C. glabrata (5) e C. tropicalis (4). Todos os isolados foram produtores de enzimas, a média de aderência à 100 células epiteliais bucais para as espécies de C. albicans, C. glabrata e C. tropicalis foi respectivamente de 402,5, 236,2 e 58. Alta resistência ao fluconazol (38,8%), elevada suscetibilidade a anfotericina B (94,4%) e baixos valores de MIC para nistatina (8 μg/mL a > 16 μg/mL) foram observados para os isolados.Conclusões: a cultura é fundamental para o diagnóstico de CVV e confirmam que C. albicans continua a espécie predominante como agente de CVV. Todas as espécies apresentam um alto poder patogênico visto a liberação de enzimas por todos os isolados. Este estudo permite sugerir ao clínico que a realização de testes de suscetibilidade in vitro anterior a prescrição do antifúngico traria maior êxito terapêutico.

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:25:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 CarolinaRodriguesCosta-2009.pdf: 705821 bytes, checksum: 53ed28c3e9fdc5770d04b7c412384968 (MD5) Previous issue date: 2009-06-02 / Adhesion to host tissues, production of hydrolytic enzymes, the resistance to antifungals and ability to production hyphal interfere in the infectious process caused by Candida. Resistance to azole antifungal agents, used to treatment of candidiasis, has been observed to immunocompromised patients. Molecular typing based on RAPD-PCR has been used to discriminate between susceptible and resistant isolates to antifungal agents. In this work, were evaluated the virulence factors and molecular characteristics of Candida isolates obtained of samples from blood, catheter of nosocomial patients and from oral cavity of HIV positive patients. The isolates were identified as: Candida albicans (59) Candida parapsilosis (22), Candida tropicalis (14) Candida guilliermondii (07), Candida. famata (05), Candida krusei (03), Candid. lusitaniae (01) and Candida kefyr (01). The proteinase and phospholipase production and the adherence ability were determined for these yeasts. The effect of fluconazole and itraconazole antifungal agents on hyphal formation were studied to 5 isolates previously classified as either susceptible or resistant. The characterization genotypic of resistant and susceptible isolates to fluconazole was carried out for 13 isolates of C. albicans by RAPD-PCR method. The results showed that proteinase activity was detected in 88.1% of C. albicans isolates and in 69.8% of non C. albicans, while phospholipase was produced in 55.9% of C. albicans isolates and in 37.7% of non C. albicans. Isolates of blood were more proteolitic than catheter and oral cavity, while for phospholipase, there was more production of this enzyme in the oral cavity. The ability of adherence to buccal epithelial cell was higher in C. albicans than non C. albicans, however there was not behavior difference between the isolates from different sources studied. The hyphal formation was higher in resistant isolates than susceptible isolates when used the both drugs. In RAPD-PCR method the formation of two different groups was verified for susceptible and resistant isolates being that only one resistant isolate was clustered in the susceptible group. Thus, in this work, it was verified that the exoenzymes activity and adherence ability depend not only of the specie of Candida, but too of the source from host; the resistant isolates produced more hyphal than susceptible isolates under the antifungal action and the molecular characteristics of the resistant isolates did not suggest unique DNA fingerprints did not predicting their susceptibility to fluconazole / A capacidade de aderência ao tecido do hospedeiro, a produção de exoenzimas, a resistência aos antifúngicos e a formação de hifas são fatores que podem interferir no processo infeccioso causado por Candida. Resistência aos derivados azólicos utilizados no tratamento de candidíase, tem sido observada em pacientes imunocomprometidos. Tipagem molecular como o RAPD-PCR tem sido utilizada para discriminação entre isolados de Candida spp suscetíveis e resistentes aos antifúngicos. Neste trabalho foram avaliados fatores de virulência e características moleculares de leveduras do gênero Candida isoladas de amostras do sangue, de cateter de pacientes nosocomiais e da cavidade bucal de pacientes HIV positivos. Os isolados utilizados foram identificados como: Candida albicans (59) Candida parapsilosis (22), Candida tropicalis (14) Candida guilliermondii (07), Candida famata (05), Candida krusei (03), Candida lusitaniae (01) e Candida kefyr (01). Estas leveduras foram avaliadas quanto à atividade de proteinase, fosfolipase e à sua capacidade de aderência. A ação do fluconazol e itraconazol sobre a formação hifal, foi avaliada em 5 isolados previamente classificados como suscetíveis e resistentes ao fluconazol e ao itraconazol. A caracterização genotípica de 13 isolados de C albicans resistentes e suscetíveis ao fluconazol foi realizada por meio de RAPD-PCR. Os resultados mostraram que a atividade de proteinase foi detectada em 88,1% de isolados de C. albicans e em 69,8% de Candida não albicans, enquanto que a fosfolipase foi detectada em 55,9% de isolados de C. albicans e em 37,7% de Candida não albicans. Isolados do sangue foram mais proteolíticos do que os do cateter e os da cavidade bucal, enquanto para a fosfolipase foi observado maior produção desta enzima em isolados da cavidade bucal. A capacidade de aderência à célula epitelial foi maior em C. albicans que Candida não albicans, no entanto não houve diferença de comportamento entre isolados obtidos dos diferentes locais estudados. A formação de hifas foi maior nos isolados resistentes do que nos isolados suscetíveis quando sob a ação de qualquer um dos dois fármacos. Na análise do RAPD-PCR foi verificada a formação de dois grupos distintos para os isolados suscetíveis e resistentes ao fluconazol, sendo que apenas um isolado resistente foi agrupado com os suscetíveis. Neste trabalho, foi verificado que a atividade de exoenzimas e a habilidade de aderência dependem além da espécie de Candida como também do local onde foi isolada no hospedeiro, que isolados resistentes formaram mais hifas do que os suscetíveis sob a ação de antifúngico e que as características moleculares dos isolados resistentes em mais de um padrão fingerprinting não permitiram predizer a sua suscetibilidade ao fluconazol

Introdução: Patógenos emergentes são isolados nas vias respiratórias de pacientes com fibrose cística (FC), entre eles a Burkholderia cepacia. Atualmente, é conhecida como um conjunto de nove espécies relacionadas (\"genomovares\"), referidas coletivamente como complexo B. cepacia. A identificação fenotípica do complexo B. cepacia é difícil, e métodos de análise do genoma bacteriano, como a reação em cadeia da polimerase, que exploram diferenças no gene recA, têm mostrado grande eficácia na caracterização dos genomovares. Alguns Centros de tratamento de FC demonstraram infecções cruzadas entre os pacientes e marcadores de virulência foram identificados com freqüência em alguns deles. Métodos baseados em biologia molecular são capazes de realizar a genotipagem das cepas e têm sido utilizados na avaliação epidemiológica. Objetivos: Identificar o genomovar e a presença de marcadores de virulência entre as cepas do complexo Burkholderia cepacia isoladas de pacientes com fibrose cística atendidos no ICr e analisar as cepas do complexo Burkholderia cepacia através de genotipagem pela técnica de RAPD. Métodos: Foram coletadas 672 amostras de escarro e esfregaço de orofaringe de 140 pacientes com fibrose cística (6 meses a 19 anos) atendidos na nossa Unidade nos períodos de set/2000 a abr/2001 e jun/2003 a jun/2004. As amostras foram cultivadas em meios seletivos, incluindo meio para B. cepacia, e a identificação realizada por sistema automatizado (1º período) e por testes fenotípicos clássicos (2º período). Após a extração do DNA, as cepas foram submetidas a uma série de reações de PCR para a determinação dos genomovares (I a VII), utilizando primers direcionados à amplificação de diferentes trechos da seqüência do gene recA, sendo, em seguida, submetidas ao seqüenciamento do DNA deste gene. Os genes de virulência pesquisados foram o cblA (que codifica o pili) e o esmR (marcador de uma cepa epidêmica). A genotipagem foi realizada pela técnica do RAPD, que analisa todo o genoma bacteriano. Resultados: Foram isoladas 41 cepas do complexo B. cepacia, obtidas de 21 pacientes com fibrose cística. O método de PCR identificou o genomovar de 32/41 (78%) das cepas e todos os resultados foram confirmados através do seqüenciamento do DNA. B. cenocepacia foi o genomovar mais prevalente (n = 17), seguido da B. multivorans (n = 12), B. vietnamiensis (n = 2) e B. cepacia (n = 1). As nove cepas não caracterizadas foram submetidas ao seqüenciamento, tendo sido encontradas 5 cepas de B. gladioli, 2 cepas de X. campestris e 2 cepas permaneceram sem identificação. O gene cblA não foi identificado em nenhuma cepa, mas o gene esmR foi encontrado em 2 amostras (pacientes não relacionados). A genotipagem detectou 23 padrões distintos, sem identificar padrões idênticos entre pacientes diferentes. Conclusões: O método de PCR baseado na amplificação do gene recA mostrou ser eficaz para a determinação do genomovar. B. cenocepacia e B. multivorans foram as espécies mais prevalentes entre nossos pacientes. A prevalência de marcadores de virulência foi baixa entre as cepas isoladas. Infecção cruzada pelo complexo B. cepacia não parece ter ocorrido na nossa Unidade durante os períodos estudados. / Introduction: Emerging pathogens are found in the respiratory tract of the cystic fibrosis (CF) patients, including the bacterium Burkholderia cepacia. At the present moment, it is recognized as a group of nine related species (\"genomovars\"), collectively referred as B. cepacia complex. Phenotypical identification of B. cepacia complex is difficult, and molecular based methods such as PCR, exploring differences in recA gene sequence, showed high efficacy for genomovar determination. B. cepacia complex cross infections among CF patients were previously described in some CF treatment Centers, and virulence markers were identified in a high frequency in some of them. Molecular based methods are suitable for strain genotyping and have been used for epidemiological evaluation. Aims: To identify genomovar status and virulence markers among Burkholderia cepacia complex isolates obtained from cystic fibrosis patients attending in the ICr, and to analyze the isolates through genotyping by RAPD. Methods: 672 sputum or oropharyngeal samples were obtained from 140 cystic fibrosis patients (6 months to 19 years) attending our Unit from sep/2000 to apr/2001 and jun/2003 to jun/2004. The samples were cultivated in selective media, including B. cepacia medium, and bacterial identification obtained by automated system (first period) and by classical phenotypic tests (second period). After DNA extraction, B. cepacia complex strains were submitted to sequential PCR reactions targeting recA gene in order to determine genomovar status (I to VII), and after that, submitted to automated DNA sequencing of this gene. Virulence genes screened were cblA (cable pilus) and esmR (epidemic strain marker). Genotyping was performed by whole bacterial genome fingerprinting using RAPD. Results: 41 isolates of B. cepacia complex were obtained from 21 cystic fibrosis patients. The PCR method identified genomovar status of 32/41 (78%) isolates and all results were confirmed by DNA sequencing. B. cenocepacia was the main genomovar (n=17), followed by B. multivorans (n = 12), B. vietnamiensis (n = 2) and B. cepacia (n = 1). The nine isolates uncharacterized were submitted to sequencing and we found 5 isolates as B. gladioli, 2 isolates as X. campestris and 2 isolates remained unidentified. The cblA gene was not identified in all isolates, but esmR gene was found on 2 strains (unrelated patients). Genotyping depicted 23 patterns, without identical patterns among different patients. Conclusions: The PCR method targeting recA gene showed to be a valuable tool for determination of genomovar status. B. cenocepacia and B. multivorans were the most prevalent specie among our patients. The prevalence of virulence markers was low among the isolates. Cross infection by B. cepacia complex does not seem to have occurred in our Unit during the two studied periods.

A capacidade de sobrevivência da Leishmânia no interior de células especializadas na destruição de patógenos deve-se à capacidade do parasito de burlar a propriedade microbicida pela produção de moléculas denominadas fatores de virulência. Dentre as proteínas diferencialmente expressas em um estudo prévio de nosso laboratório, encontramos isoformas da OPB, uma serino peptidase e da CPX, proteína antioxidante. De fato, promastigotas de L. (L.) major deficientes em OPB apresentaram significante redução na infecção e sobrevivência em macrófagos in vitro e lesões de evolução mais lenta no modelo murino de infecção na pata. De forma análoga, promastigotas de L. (L.) donovani superexpressoras de CPX apresentaram maior carga parasitária em macrófagos in vitro. Considerando essas informações e a importância da L. (L.) amazonensis na epidemiologia da leishmaniose no Brasil, nosso objetivo é analisar a importância da OPB e CPX na virulência desta espécie utilizando parasitas superexpressores e proteínas solúveis em modelos murinos de infecção in vitro e in vivo. / The survivability of Leishmania within specialized cells in the destruction of pathogens due to the parasite\'s ability to circumvent the microbicidal property for the production of molecules called virulence factors. Among the proteins differentially expressed in a previous study from our laboratory, we found isoforms of OPB, a peptidase serine and CPX, antioxidant protein. Indeed, promastigotes of L. (L.) Major disabled in OPB showed a significant reduction in infection and survival in macrophages in vitro and slower evolution of lesions in a murine model of infection in the leg. Similarly, promastigotes of L. (L.) Donovani overexpressors CPX showed higher parasite load in macrophages in vitro. Given this information and the importance of L. (L.) amazonensis in the epidemiology of leishmaniasis in Brazil, our goal is to analyze the importance of OPB and CPX virulence of this species using overexpressors parasites and soluble proteins in murine models of infection in vitro and in alive.

Orientador: Pasqual Barretti / Resumo: Peritonite por bacilos Gram-negativos não fermentadores (BGNNF) é complicação importante da diálise peritoneal (DP), com curso clínico grave e elevada taxa de falência do método. Fatores associados à virulência, resistência antimicrobiana, formação de biofilme, entre outros, têm sido relatados, mas o limitado conjunto de evidências não permite concluir sobre os fatores responsáveis pelo pior curso clínico dessas infecções. O objetivo deste trabalho foi avaliar a influência das características microbiológicas, das condições clínicas do paciente e do tratamento na evolução de peritonites por BGNNF, ocorridas num único centro, em período de 18 anos. A sensibilidade in vitro aos antimicrobianos, produção de biofilme, além da análise do perfil clonal das bactérias pela técnica de eletroforese em gel de campo pulsado foram realizadas em todos os isolados bacterianos. Foram pesquisados genotipicamente, em isolados de Pseudomonas aeruginosa, a presença de marcadores de virulência (alginato, exoenzima S, fosfolipases C, exotoxina A, protesase alcalina, elastase e ramnolipídeos). Associações entre as características microbiológicas do paciente e tratamento com a taxa de resolução da peritonite foram estudadas. A espécie mais frequente foi Pseudomonas aeruginosa (45,59%), seguida por isolados do complexo Acinetobacter baumannii (17,65%). O estudo dos fatores de virulência da Pseudomonas aeruginosa revelou a presença de fatores de virulência em 100% dos casos, exceto exoenzima S (58,33%)... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Peritonitis due to non-fermentative Gram-negative bacilli (NFGNB) is a serious complication of peritoneal dialysis (PD), with a severe clinical course and high technique failure rate. Factors as bacterial virulence, antimicrobial resistance, biofilm formation, among others, have been reported, but the limited amount of evidence does not allow to conclude on the factors responsible for the worst clinical course of these infections. The objective of this study was to evaluate the influence of the microbiological characteristics, patients conditions, and treatment on evolution of peritonitis episodes at a single center in an 18 - year period. In vitro susceptibility, biofilm production, and clonal profile analysis of bacteria by pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) were performed in all isolates. The presence of virulence markers (alginate, exoenzyme S, phospholipases C, exotoxin A, alkaline protease, elastase, and ramnolipids) was genotyped in bacterial isolates of Pseudomonas aeruginosa. From the data referring to the patient and causal agent, associations between the microbiological, patient characteristics, and treatment on the resolution rate of peritonitis were analyzed. The most frequent species was Pseudomonas aeruginosa (45.59%), followed by Acinetobacter baumannii complex (17.65%). The study of the virulence factors of Pseudomonas aeruginosa revealed the presence of virulence factors in 100% of the cases, except for exonzyme S (58.33%) and hemolytic phospholipase C ... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Submitted by Fernanda Freire null (fernanda.freire@fosjc.unesp.br) on 2017-12-13T19:59:30Z No. of bitstreams: 1 Tese - Fernanda Freire.pdf: 1272262 bytes, checksum: 11df7d222fe968088750e08ceb6fa488 (MD5) / Submitted by Fernanda Freire null (fernanda.freire@fosjc.unesp.br) on 2017-12-14T11:25:01Z No. of bitstreams: 1 Tese - Fernanda Freire.pdf: 1272262 bytes, checksum: 11df7d222fe968088750e08ceb6fa488 (MD5) / Submitted by Fernanda Freire null (fernanda.freire@fosjc.unesp.br) on 2017-12-14T13:50:30Z No. of bitstreams: 1 Tese - Fernanda Freire.pdf: 1272262 bytes, checksum: 11df7d222fe968088750e08ceb6fa488 (MD5) / Approved for entry into archive by Silvana Alvarez null (silvana@ict.unesp.br) on 2017-12-14T18:37:35Z (GMT) No. of bitstreams: 1 freire_f_dr_sjc.pdf: 1272262 bytes, checksum: 11df7d222fe968088750e08ceb6fa488 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-12-14T18:37:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 freire_f_dr_sjc.pdf: 1272262 bytes, checksum: 11df7d222fe968088750e08ceb6fa488 (MD5) Previous issue date: 2017-11-30 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Os micro-organismos estão se tornando cada vez mais resistentes aos antimicrobianos e cepas de Candida albicans resistentes aos antifúngicos tem sido isoladas, assim, torna-se importante e necessário a realização de pesquisas que avaliem os efeitos de novos métodos terapêuticos, como a inativação fotodinâmica antimicrobiana (aPDI). Assim, o objetivo deste estudo foi verificar os efeitos da inativação fotodinâmica sobre biofilmes de Candida albicans, avaliando seus efeitos sobre a expressão dos genes TEC1 (fator de transcrição), HWP1 (proteína de parede celular das hifas), EFG1 (regulador transcricional relacionado com a morfogênese), BCR1 (regulador da formação de biofilme e da parede celular), CPH1 (regulador transcricional envolvido na morfogênese) e ALS3 (adesina) de C. albicans. Foram avaliadas 30 amostras isoladas de pacientes portadores de HIV e 30 amostras de pacientes com estomatite protética, quanto a produção de biofilme, peso seco e filamentação. Destas, foram selecionadas as amostras mais virulentas de cada grupo que apresentaram melhor capacidade de formação de biofilme e filamentação. Assim, foi utilizada uma amostra clínica de C. albicans isolada de paciente portador de HIV, uma amostra clínica de C. albicans isolada de paciente com estomatite protética e uma cepa padrão ATCC 18804. A quantificação da expressão dos genes foi relacionada à produção desses genes nas amostras clínicas e na cepa de referência utilizando-se ensaio de PCR em tempo real. Para a aPDI, foram utilizados os fotossensibilizadores azul de metileno a 300 μM e eritrosina a 400 μM sensibilizados com laser de Índio-Gálio-Alumínio-Fósforo de baixa potência (vermelho visível, 660 nm) e LED verde (532 ± 10 nm), respectivamente. Foram avaliados quatro grupos experimentais para a aPDI: a) F+L+: sensibilização com o corante e irradiação com luz; b) F+L-: somente tratamento com o fotossensibilizador; c) F-L+: somente irradiação com luz e d) F-L-: sem sensibilização com o corante e ausência de luz. Os resultados foram analisados por t-test, com um nível de significância de 5%. Após a análise fenotípica, as amostras Ca30 e 39S foram selecionadas para a realização da aPDI. Como esperado, apenas para o grupo F+L+, quando comparado com o grupo F-L-, todos os genes analisados foram sub expressos após a aPDI. O fold-decrease para os genes ALS3, HWP1, BCR1, TEC1, CPH1 e EFG1 foram 0,73; 0,39; 0,77; 0,71; 0,67 e 0,60; para laser, respectivamente, e 0,66; 0,61; 0,50; 0,43; 0,54 e 0,66; para LED, respectivamente. Pode-se concluir que a aPDI mostrou uma redução na expressão dos genes de C. albicans, sugerindo a diminuição de sua virulência. / Micro-organisms are becoming increasingly resistant to antimicrobial agents and Candida albicans resistant strains to antifungal has been isolated, so it is important and necessary to carry out studies that evaluates the effects of new therapeutic methods, such as antimicrobial photodynamic inactivation (aPDI). The objective of this study was verify the effects of aPDI on C. albicans biofilms, evaluating its effects on genes expression: TEC1 (transcription factor), HWP1 (cell wall protein hyphae), EFG1 (transcriptional regulator related to morphogenesis), BCR1 (regulator of biofilm formation and cell wall), CPH1 (transcriptional regulator involved in morphogenesis) and ALS3 (adhesin) of C. albicans. Were evaluated 30 samples isolated from patients with HIV and 30 samples from patients with denture stomatitis, as the production of biofilm, dry weight and filamentation. Of these, the most virulent strains of each group that presented better biofilm formation capacity and filamentation were selected. Therefore, were used a clinical sample of C. albicans isolated from HIV positive patient, a clinical sample of C. albicans isolated from patient with denture stomatitis and a standard strain ATCC 18804. The quantification of gene expression was related to the production of these genes in clinical samples and in the reference strain using PCR assay in real time. For aPDI, were used the photosensitizer methylene blue at 300 uM and erythrosine at 400 uM, sensitized with low power laser Indium-Gallium-AluminumPhosphorus (visible red, 660 nm) and green LED (532 ± 10 nm), respectively. Were evaluated four groups for aPDI: a) P+L+: sensitization with the photosensitizer and irradiation with light; b) P+L-: only treatment with the photosensitizer; c) P-L+: only irradiation with light and d) P-L-: without sensitization with the dye and absence of light. The results were analyzed by t-test, with a significance level of 5%. After the phenotypic analysis, the samples Ca30 and 39 S were selected for aPDI . As expected, only in the group P+L+ when compared with the group P-L-, all analyzed genes were downregulated after aPDI. The fold-decrease for the genes ALS3, HWP1, BCR1, TEC1, CPH1 and EFG1, were 0.73, 0.39, 0.77, 0.71, 0.67 and 0.60, for laser, respectively, and 0.66, 0.61, .050, 0.43, 0.54 and 0.66, for LED, respectively. It could be concluded that aPDI showed a reduction in the expression of C. albicans genes, suggesting its virulence decrease. / 2013/22897-2