Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2012-07-16T21:26:49Z No. of bitstreams: 1 Elsio Augusto Wunder Júnior Patogênese da leptospirose...pdf: 2609622 bytes, checksum: aa34c959355bc105a6e849e74258cf78 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-07-16T21:26:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Elsio Augusto Wunder Júnior Patogênese da leptospirose...pdf: 2609622 bytes, checksum: aa34c959355bc105a6e849e74258cf78 (MD5) Previous issue date: 2010 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, Bahia, Brasil / A leptospirose é uma zoonose de importância global e um importante problema de saúde pública principalmente em países em desenvolvimento. É causada por bactérias do gênero Leptospira, uma espiroqueta móvel e de alta morbidade capaz de se disseminar nos tecidos e causar doença crônica em animais hospedeiros. Uma barreira importante para o controle e prevenção da doença tem sido o pouco conhecimento da patogênese do agente, em parte pela falta de ferramentas disponíveis e eficazes de manipulação genética. Um dos objetivos desse estudo foi caracterizar duas cepas mutantes de Leptospira interrogans. A interrupção do gene lipl32, que codifica para a proteína LipL32, a mais abundante proteína no gênero Leptospira e expressa somente na superfície das leptospiras patogênicas, foi realizada através da inserção do transposon Himar1 no sorovar Manilae. A cepa mutante não apresentou nenhuma diferença de crescimento ou de aderência em componentes da matriz celular, comparada com a cepa parental. O mutante foi capaz de produzir doença aguda no modelo animal de hamster e causar colonização crônica no modelo animal de rato, mostrando que LipL32 não possui um papel nestes modelos de infecção. A interrupção do gene ligB foi realizada com a utilização, pela primeira vez em leptospiras patogênicas, da técnica de recombinação homóloga por mutagênese dirigida, onde o gene que codifica para a proteína LigB teve uma parte substituída por um cassete de resistência de espectinomicina (Spcr). Essa proteína, identificada como um possível fator de virulência, reconhecida pelo soro de pacientes infectados e importante para a aderência em componentes da matriz celular, mostrou não ser importante para a infecção aguda ou crônica, quando testada frente aos modelos animais, além de não ser necessária para a aderência em cultura de células. Outro objetivo desse trabalho foi estudar a cinética de disseminação da Leptospira interrogans no modelo animal de hamster, utilizando uma dose alta (108 leptospiras) e baixa (250 leptospiras) de inóculo, além de diferentes rotas de infecção. Nossos resultados demonstraram que leptospiras se disseminam rapidamente em todos os tecidos 01 hora após a infecção com uma alta dose de inóculo e que possivelmente a carga do agente nos tecidos é mais importante para a patogênese do que a sua habilidade para a disseminação. Também demonstramos que a motilidade não é essencial para disseminação, mas pode ser essencial para a carga nos tecidos e letalidade. / Leptospirosis is a worldwide zoonosis and a major public health problem especially important in developing countries. Caused by bacteria of Leptospira genus, a motile lifethreatening spirochete which is able to disseminate to tissues and causes chronic carriage in animal hosts. A significant barrier to the control and prevention of leptospirosis has been the limited understanding of its pathogenesis, due in part to the lack of tools available for the genetic manipulation of this pathogen. One of the purposes of this study was to characterize two mutant strains of Leptospira interrogans. Interruption of lipL32 gene, encoding LipL32, the most abundant protein of pathogenic leptospires and its major outermembrane lipoprotein, was achieved in serovar Manilae using transposon mutagenesis with Himar1. The mutant had normal morphology and growth rate compared to the wild type and was equally adherent to extracellular matrix. The mutant was able to cause acute severe disease manifestations in the hamster model and chronic colonization in the rat model, showing that LipL32 doesn’t play a role in neither of those models of infection. Interruption of ligB gene was achieved using the homologous recombination by target mutagenesis for the first time in pathogenic leptospires and a spectinomycin resistance (Spcr) gene replaced a portion of the ligB coding sequence. This Lig protein, previously identified as a putative virulence factor, recognized by the sera of infected patients and important for the adherence in extracellular matrix components, showed not to be important for acute or chronic infection when tested with animal models and it’s not required to mediate bacterial adherence to cultured cells. Another purpose of this study was to determine and analyze the kinetics of dissemination of Leptospira interrogans in the hamster model, using a high (108 leptospires) and low (250 leptospires) dose of inoculum and different routes of infection. Our results demonstrated that leptospires can rapidly disseminate through all tissues after 1 hour post-challenge with a high inoculum dose and that perhaps the load of the agent in target tissues is more important for pathogenesis than its ability for dissemination. We also demonstrate that motility is not essential for dissemination but can be essential for tissue load and lethality.

Submitted by Ana Cláudia Moro Lima dos Santos (anna.moro@hotmail.com) on 2018-05-07T20:15:18Z No. of bitstreams: 1 Dissertaçãofinal.pdf: 1989003 bytes, checksum: c02493762a88023038e4fc08eea12f1c (MD5) / Approved for entry into archive by Sulamita Selma C Colnago null (sulamita@btu.unesp.br) on 2018-05-09T16:37:26Z (GMT) No. of bitstreams: 1 santos_acml_me_bot.pdf: 1989003 bytes, checksum: c02493762a88023038e4fc08eea12f1c (MD5) / Made available in DSpace on 2018-05-09T16:37:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 santos_acml_me_bot.pdf: 1989003 bytes, checksum: c02493762a88023038e4fc08eea12f1c (MD5) Previous issue date: 2018-02-26 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Peritonite por bacilos Gram-negativos não fermentadores (BGNNF) é complicação importante da diálise peritoneal (DP), com curso clínico grave e elevada taxa de falência do método. Fatores associados à virulência, resistência antimicrobiana, formação de biofilme, entre outros, têm sido relatados, mas o limitado conjunto de evidências não permite concluir sobre os fatores responsáveis pelo pior curso clínico dessas infecções. O objetivo deste trabalho foi avaliar a influência das características microbiológicas, das condições clínicas do paciente e do tratamento na evolução de peritonites por BGNNF, ocorridas num único centro, em período de 18 anos. A sensibilidade in vitro aos antimicrobianos, produção de biofilme, além da análise do perfil clonal das bactérias pela técnica de eletroforese em gel de campo pulsado foram realizadas em todos os isolados bacterianos. Foram pesquisados genotipicamente, em isolados de Pseudomonas aeruginosa, a presença de marcadores de virulência (alginato, exoenzima S, fosfolipases C, exotoxina A, protesase alcalina, elastase e ramnolipídeos). Associações entre as características microbiológicas do paciente e tratamento com a taxa de resolução da peritonite foram estudadas. A espécie mais frequente foi Pseudomonas aeruginosa (45,59%), seguida por isolados do complexo Acinetobacter baumannii (17,65%). O estudo dos fatores de virulência da Pseudomonas aeruginosa revelou a presença de fatores de virulência em 100% dos casos, exceto exoenzima S (58,33%) e fosfolipase C não hemolítica (87,5%). Houve elevada proporção de BGNNF resistentes aos antimicrobianos testados, em particular à amicacina (36,73%) e à ciprofloxacina (44,9%), sendo que a sensibilidade aos betalactâmicos esteve acima de 70%. Observou-se elevada proporção de isolados produtores de biofilme (73,08%). Os resultados da tipagem por PFGE revelaram um perfil policlonal para a maioria dos isolados, entretanto para isolados do complexo Acinetobacter baumannii a análise revelou um cluster, entre 2000-2008, com perfil de multiresistência aos antimicrobianos, sugerindo fonte hospitalar. A evolução dos episódios mostrou reduzida taxa de cura (35,29%). A sensibilidade à amicacina e cefepime, se associaram de modo independente à maior chance de cura, enquanto a presença concomitante de infecção do óstio de saída do cateter de DP foi preditor independente de não resolução do episódio. Não se observaram associações entre fatores de virulência, produção de biofilme e características do paciente e tratamento com o desfecho dos episódios. Em conclusão, peritonites em DP, por BGNNF, são infecções com reduzida taxa de cura; a resistência bacteriana é fator associado à menor chance de resolução e peritonite por bactérias do gênero Acinetobacter spp. podem representar infecção grave, potencialmente de origem hospitalar, o que deve fazer redobrar os cuidados quanto ao seu manejo clínico. / Peritonitis due to non-fermentative Gram-negative bacilli (NFGNB) is a serious complication of peritoneal dialysis (PD), with a severe clinical course and high technique failure rate. Factors as bacterial virulence, antimicrobial resistance, biofilm formation, among others, have been reported, but the limited amount of evidence does not allow to conclude on the factors responsible for the worst clinical course of these infections. The objective of this study was to evaluate the influence of the microbiological characteristics, patients conditions, and treatment on evolution of peritonitis episodes at a single center in an 18 - year period. In vitro susceptibility, biofilm production, and clonal profile analysis of bacteria by pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) were performed in all isolates. The presence of virulence markers (alginate, exoenzyme S, phospholipases C, exotoxin A, alkaline protease, elastase, and ramnolipids) was genotyped in bacterial isolates of Pseudomonas aeruginosa. From the data referring to the patient and causal agent, associations between the microbiological, patient characteristics, and treatment on the resolution rate of peritonitis were analyzed. The most frequent species was Pseudomonas aeruginosa (45.59%), followed by Acinetobacter baumannii complex (17.65%). The study of the virulence factors of Pseudomonas aeruginosa revealed the presence of virulence factors in 100% of the cases, except for exonzyme S (58.33%) and hemolytic phospholipase C (87.5%). There was a high proportion of antimicrobial resistant, in particular to amikacin (36.73%) and ciprofloxacin (44.9%), with sensitivity to betalactam above 70%. A high (73.08%) proportion of biofilm producing isolates was observed. The results of the PFGE typing revealed a polyclonal profile for most of the isolates; however, for the Acinetobacter baumannii complex species the analysis revealed a cluster at interval from 2000 to 2008, with antimicrobial multi resistance profile, suggest that peritonitis by this agent had a hospital source. The evolution of the episodes showed a reduced resolution rate (35.29%). The susceptibility to amikacin and to cefepime were independently associated with a higher odds of resolution, while the concomitant presence of PD catheter exit site infection was an independent predictor of non-resolution. In conclusion, peritonitis due to NFGNB in PD are infections with reduced resolution rate; bacterial resistance is an independent predictor of lower odds of resolution. Peritonitis by Acinetobacter spp. can represent serious / 64736017.2.0000.5411

A capacidade de sobrevivência da Leishmânia no interior de células especializadas na destruição de patógenos deve-se à capacidade do parasito de burlar a propriedade microbicida pela produção de moléculas denominadas fatores de virulência. Dentre as proteínas diferencialmente expressas em um estudo prévio de nosso laboratório, encontramos isoformas da OPB, uma serino peptidase e da CPX, proteína antioxidante. De fato, promastigotas de L. (L.) major deficientes em OPB apresentaram significante redução na infecção e sobrevivência em macrófagos in vitro e lesões de evolução mais lenta no modelo murino de infecção na pata. De forma análoga, promastigotas de L. (L.) donovani superexpressoras de CPX apresentaram maior carga parasitária em macrófagos in vitro. Considerando essas informações e a importância da L. (L.) amazonensis na epidemiologia da leishmaniose no Brasil, nosso objetivo é analisar a importância da OPB e CPX na virulência desta espécie utilizando parasitas superexpressores e proteínas solúveis em modelos murinos de infecção in vitro e in vivo. / The survivability of Leishmania within specialized cells in the destruction of pathogens due to the parasite\'s ability to circumvent the microbicidal property for the production of molecules called virulence factors. Among the proteins differentially expressed in a previous study from our laboratory, we found isoforms of OPB, a peptidase serine and CPX, antioxidant protein. Indeed, promastigotes of L. (L.) Major disabled in OPB showed a significant reduction in infection and survival in macrophages in vitro and slower evolution of lesions in a murine model of infection in the leg. Similarly, promastigotes of L. (L.) Donovani overexpressors CPX showed higher parasite load in macrophages in vitro. Given this information and the importance of L. (L.) amazonensis in the epidemiology of leishmaniasis in Brazil, our goal is to analyze the importance of OPB and CPX virulence of this species using overexpressors parasites and soluble proteins in murine models of infection in vitro and in alive.

O fitopatógeno Xanthomonas axonopodis pv citri (XAC) é o agente causal do cancro em citros. O desenvolvimento da infecção depende do sucesso de XAC na colonização do hospedeiro. Para isso, além do sistema de secreção tipo III, que injeta efetores de virulência dentro da célula do hospedeiro, Xanthomonas também conta com o processo de quorum-sensing. O aumento da densidade celular em XCC (Xanthomonas campestris pv campestris) promove o acúmulo da molécula sinalizadora difusível (DSF) produzida por RpfF, que ativa o sistema de dois componentes formado pelas proteínas RpfC e RpfG, as quais transduzem o sinal de ativação para o fator de transcrição Clp (CAP Like Protein - homóloga da proteína CAP de E. coli). A proteína RpfG contém um domínio de fosfodiesterase conservado (HD-GYP) que regula a concentração de diGMP cíclico (c-diGMP), um segundo mensageiro bacteriano. Dessa forma o domínio HD-GYP atua contrapondo-se à atividade dos domínios diguanilato ciclases (GGDEF). No caso de XCC, foi demonstrado que a ativação do domínio HD-GYP de RpfG reduz a concentração de c-diGMP na célula e promove a ligação e ação positiva de Clp no promotor do gene de engXCA. Com intuito de estudar a via Rpf em XAC, produzimos mutantes não-polares de rpfF, rpfC, rpfG, dos genes que codificam os domínios GGDEF que interagiram com RpfG (Andrade et al. 2006), clp, fliC, pilT, gumD e também geramos mutantes dos operons xcs e xps, que codificam sistemas de secreção do tipo 2 em XAC. Análise por HPLC-MS/MS mostrou que a deleção de rpfG, mas não clp, promoveu um aumento de aproximadamente 4 vezes dos níveis celulares de c-diGMP. Também foi demonstrado por EMSA que c-diGMP inibe a ligação de Clp ao promotor do operon xcs. Os mutantes ΔrpfF-C-G e Δclp mostraram um comprometimento da mobilidade, redução da biossíntese de exopolissacarídeos e na produção de fatores de virulência. Em adição, observamos uma diminuição significativa no crescimento dos mutantes ΔrpfG e Δclp dentro do hospedeiro. Além disso, identificamos também novos fatores envolvidos no metabolismo do c-diGMP e (p)ppGpp em XAC. Além do c-diGMP, outro segundo mensageiro o (p)ppGpp, cuja concentração na célula é regulada pelas proteínas SpoT e RelA, pode afetar a expressão de maneira dependente da subunidade ω da RNA polimerase em XAC. Finalmente, propusemos um modelo onde a concentração de c-diGMP sob controle da via do quorum-sensing e a sinalização por (p)ppGpp podem convergir para alguns efetores que regulam a mobilidade e a patogenicidade em XAC. / In Xanthomonas, the cell-cell signaling mediated by diffusible molecules is known to play an important role in regulating physiological process, including the formation and dispersal of biofilms and virulence. It has been shown that the ability of Xanthomonas species to incite disease depends on several factors, including adhesins, synthesis of extracellular enzymes, type III secretion system (T3SS) effectors and the exopolysaccharide (EPS) xanthan. The rpf genes act to positively regulate the synthesis of extracellular enzymes, EPS and pathogenicity. The rpfF, rpfC and rpfG genes are implicated in a regulatory system involving a diffusible signal factor (DSF) whose synthesis of DSF depends on RpfF. DSF perception and signal transduction are mediated by the two-component system comprising RpfC and RpfG. High cell densities are thought to lead to the phosphorylation of RpfG by RpfC which in turn activates the RpfG HD-GYP phosphodiestarase domain whose substrate has been shown to be the important second messenger cyclic diGMP (c-diGMP) (Ryan et al., 2006). This work was prompted to by the observation that the HD-GYP domain of RpfG interacts with a subset of diguanylate cyclase (GGDEF) proteins (Andrade et al., 2006), responsible for c-diGMP synthesis in Xanthomonas axonopodis pv citri (XAC). In order to study rpf signaling in XAC, we produced non-polar knockouts of rpfF, rpfC, rpfG, all genes coding the GGDEF domains shown to interact with RpfG, CAP-like protein (clp), fliC, pilT, gumD and polar insertions in the operons of both type 2 secretion systems coded by the XAC genome. HPLC-MS/MS analysis showed that the deletion of rpfG, but not clp, promoted an approximate 4-fold increase in cellular c-diGMP levels. We Also demonstrated that c-diGMP inhibits the binding of Clp to the promoter of the XAC0694 gene, the first gene in the operon coding the type 2 secretion system. The rpf genes and clp knockouts have impaired motility, reduction in exopolissacarides and extracellular enzyme production. Furthermore, we observe a significant decrease in the growth of rpfG and clp mutants in host tissues. Our results demonstrate that RpfF-RpfC-RpfG-Clp signaling in XAC is associated with cellular c-diGMP levels and is important for XAC virulence, motility, and EPS production. In addition, we have identified new factors involved to metabolism of c-diGMP and (p)ppGpp in XAC. The (p)ppGpp synthesis and degradation is under control of the proteins SpoT and RelA; However the effect of (p)ppGpp on gene expression seems to depend of the ω subunit of RNA polimerase in XAC. Finally, we propose the model where c-diGMP levels controlled by quorum-sensing and the (p)ppGpp signalization may converge to regulate the motility and pathogenicity of XAC.

Orientador: Reginaldo Bruno Gonçalves / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-08T12:34:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Kamiya_RegianneUmeko_D.pdf: 1901318 bytes, checksum: 6b54c1e6cbe9e4b6b6fb94ea27db2ec2 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: Esta tese, apresentada na forma de 3 artigos, teve por objetivos: (1) analisar a freqüência dos genes de produção de mutacinas I, II, III e IV, em genótipos de S. mutans isolados de indivíduos cárie-ativos e livres de cárie, (2) analisar a freqüência dos genes de produção das mutacinas I, II, III, IV, N, B-Ny 266, 1140 e genes homólogos às bacteriocinas, identificadas em outras espécies bacterianas, em cepas de S. mutans isolados de crianças, bem como detectar a expressão diferencial dos genes identificados, em células de S. mutans crescidas na condição planctônica e séssil, (3) analisar a expressão dos genes de produção das mutacinas I, II e proteínas kinases CiaH, Dgk e ComD, em diferentes fases do crescimento planctônico e séssil. O rastreamento e a freqüência dos genes estruturais de diferentes mutacinas em isolados de S. mutans, foram realizados pela técnica de PCR e a análise da expressão gênica, pela técnica de RT-PCR semi-quantitativa. Os estudos, apresentados nesta tese, demonstraram o papel das mutacinas como um fator de virulência, altamente diversificado entre a espécie S. mutans, e relacionado com o risco de cárie. Este fator de virulência, pode ser regulado por mecanismos quorum-sensing, sendo assim, dependente da condição de crescimento planctônica ou séssil. A regulação da produção de mutacinas, por mecanismos quorum-sensing, pode representar uma vantagem seletiva à espécie produtora, principalmente em ambiente complexo, como o biofilme dental e lesões de cárie. Futuramente, mais estudos serão necessários para identificar novos determinantes genéticos, necessários para a síntese de substâncias semelhantes às mutacinas, bem como, identificar os mecanismos e componentes, que modulam a expressão deste importante fatorde virulência em S. mutans / Abstract: This thesis, comprised of 3 manuscripts was designed (1) to analyse the frequency of biosynthesis genes of the mutacins types I, II, III and IV, in S. mutans isolated from caries-affected and caries-free individuals, (2) to analyse the frequency of biosynthesis genes of the mutacins types I, II, III, IV, N, B-Ny 266, 1140 and genes homologues to bacteriocins identified in other bacterial species, in S. mutans isolated from children, in addition, to detect the differential expression of these genes, in S. mutans cells grown in planktonic and sessil conditions, (3) and to analyse the expression of the mutacins I and II production genes and kinase proteins genes (ciaH, dgk e comD), in different phases of the planktonic and sessile growth. The screening and frequency of the mutacins structural genes in S. mutans isolates were realized by PCR technique and the analysis of genetic expression, by RT-PCR semiquantitative method. The studies, presented in this thesis, demonstrate the role of mutacins as a virulence factor, highly diverse among S. mutans, and related to risk of dental caries. The mutacins production may be regulated by quorum-sensing mechanisms and is dependent on planktonic and sessile conditions. The modulation by quorum-sensing mechanisms may represent a selective advantage for producer S. mutans strain, mainly in complex environments as the dental biofilm and caries. Hereafter, more studies will be necessary to identify new genetic determinants for synthesis of mutacin-like substances and elucidate the mechanisms and components that modulate the genetic expression of this important virulence factor in S. mutans / Doutorado / Microbiologia e Imunologia / Doutor em Biologia Buco-Dental

EPECa tem sido identificada como o principal agente de diarreia aguda em crianças de países em desenvolvimento. Biofilmes são estruturas bacterianas envoltas por uma matriz de exopolissacarídeos. O objetivo deste estudo foi verificar a influência de diferentes condições de cultivo na formação de biofilme por EPECa isoladas de crianças com diarreia e pesquisar a presença de genes relacionados com a formação de biofilme. As sequências genéticas dos genes csgA, crl, fimH e bcsA foram pesquisadas através da PCR e verificadas em 6 (26%), 23 (100%), 22 (95,6%) e 23 (100%) das amostras respectivamente. A formação de biofilme em placas de MTP por EPECa foi melhor evidenciada em meio LB sem sal a 26 °C e em caldo E. coli a 37 °C, tanto em número de amostras quanto em intensidade da formação de biofilme. As microscopias confocal e de varredura propiciaram uma análise qualitativa de microcolônias e pilares, além de EPS respectivamente. As condições de cultivo devem ser usadas com precaução para realmente aferir a capacidade de formação de biofilme por amostras de EPECa. / aEPEC has been identified as the main agent of acute diarrhea in children in developing countries. Biofilms are bacterial structures which are surrounded by a matrix of exopolysaccharides. The aim of this study was investigate the influence of different culture conditions on biofilm formation by 23 aEPEC strains isolated from children with diarrhea and search for the presence of genes related to biofilm formation. The genetic sequences of the csgA, crl, fimH and bcsA genes were screened by PCR and were found in 6 (26%), 23 (100%) 22 (95.6%) and 23 (100%) of the strains respectively. Biofilm formation in MTP plates for aEPEC strains was better evidenced in LB medium without NaCl at 26 ° C and in E. coli broth at 37 ° C, both in number and intensity of biofilm formation. The confocal and scanning electron microscopy provided a qualitative analysis of structures such as microcolonies and pillars, and respectively EPS. The growing conditions should be used with caution to measure the real ability of biofilm formation by strains of aEPEC.

Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2016-04-20T12:49:28Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Alex Jesus de Carvalho - 2014.pdf: 1685689 bytes, checksum: 5b4f38809e4a3fe6252bba20b25d949b (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2016-04-20T12:58:32Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Alex Jesus de Carvalho - 2014.pdf: 1685689 bytes, checksum: 5b4f38809e4a3fe6252bba20b25d949b (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-20T12:58:33Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Alex Jesus de Carvalho - 2014.pdf: 1685689 bytes, checksum: 5b4f38809e4a3fe6252bba20b25d949b (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2014-06-09 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The Gram-positive bacterium Staphylococcus saprophyticus, one of the coagulasenegative staphylococci, is the second most common causative agent of urinary tract infection, affecting mainly sexually active women. Staphylococcus saprophyticus can cause acute diseases as pyelonephritis, sepsis, nephrolithiasis, endocarditis, urethritis, epididymitis and prostatitis. This work aims to identify Staphylococcus saprophyticus surface proteins by using a proteolytic shaving approach, a methodology that was established to identify surface-exposed protein domains by tripsinization of intact cells. The peptides obtained were treated by trypsin, reduced, alkylated and identified by nano-chromatography using a nanoACQUITY UPLCTM system (Waters) coupled to a SYNAPT Q-TOF mass spectrometer (Waters). The homology analysis was performed using the software ProteinLynx 2.3 (Waters). Through the shaving, it was possible to identify 219 proteins, many of them, described as virulence factors. Of total, 01 is cell wall protein, 09 are extracelular proteins, 19 are membrane proteins and 190 are citoplasmatic proteins. Besides of the lysis process, the presence of cytoplasmic proteins on cell surface can be due to the activity of export pathways not yet identified and many of these proteins can be proteins with moonlighting function, in other words, proteins that plays more of one function, it can, in this case, plays functions on S. saprophyticus cell surface related to bacterial virulence. The main proteins with moonlighting function include metabolic enzymes of the glycolytic pathway; enzymes of other metabolic pathways, such as, glyoxalate cycle; chaperones and proteins related with the proteic folding. The prediction of cellular localization was performed through LocateP database. The results of this research help to elucidate the strategies and machineries used by proteins during the adhesion, infection and proliferation, leading us to understand the interaction between the pathogenic bacteria S. saprophyticus and the human host. The knowledge about the proteins present on the cell surface is of extreme importance, because many of these proteins represent targets to new drugs, therapeutic antibodies or vaccines, since the pathogen cell surface is the first to contact with the host cells during the infection process. / A bactéria Gram-positiva Staphylococcus saprophyticus, uma das bactérias estafilococos coagulase negativa, é o segundo agente mais comum causador de infecções do trato urinário, afetando principalmente mulheres sexualmente ativas. S. saprophyticus pode causar doenças agudas como pielonefrite, sepse, nefrolitíase, endocardite, uretrite, epididimite e prostatite. Este trabalho teve como objetivo identificar proteínas de superfície de S. saprophyticus pela abordagem de shaving proteolítico, uma metodologia que foi estabelecida para identificar proteínas que possuem domínios proteicos na superfície celular utilizando a tripsinização de células intactas. Posteriormente, os peptídeos obtidos foram tripsinizados, reduzidos, alquilados e identificados através de nano-cromatografia utilizando um sistema nanoACQUITY UPLCTM (Waters) acoplado a um espectrômetro de massas SYNAPT Q-TOF (Waters). Com isso foi possível identificar 219 proteínas, muitas delas descritas como fatores de virulência. Do total, 01 proteína é de parede celular, 09 extracelulares, 19 de membrana e 190 citoplasmáticas. Além do processo de lise, a presença de proteínas citoplasmáticas na superfície celular pode ser devida à atividade de vias de exportação ainda não identificadas e muitas dessas proteínas podem ser proteínas com função moonlighting, ou seja, proteínas que desempenham mais de uma função, podendo, neste caso, desempenhar funções na superfície de S. saprophyticus relacionadas à virulência bacteriana. As principais proteínas com função moonlighting incluem enzimas metabólicas da via glicolítica; enzimas de outras vias metabólicas, tais como, ciclo do glioxalato; chaperonas e proteínas relacionadas com o dobramento proteico. A predição de localização celular foi realizada com o banco de dados LocateP. Os resultados desta pesquisa contribuíram na elucidação das estratégias e maquinarias utilizadas pelas proteínas durante a adesão, infecção e proliferação, levando-nos a compreender a interação entre a bactéria patogênica S. saprophyticus e o hospedeiro humano. O conhecimento acerca das proteínas presentes na superfície celular é de extrema importância, visto que muitas dessas proteínas representam alvos para novas drogas, anticorpos terapêuticos ou vacinas, uma vez que a superfície celular do patógeno é a primeira a entrar em contato com as células do hospedeiro durante o processo de infecção.

A cárie dental, uma doença multifatorial de caracter bacteriana associada à dieta alimentar, que danifica a estrutura dos dentes, se mantém como um problema de saúde pública mundial. A produção de ácidos por bactérias acidogênicas, como o Streptococcus mutans é considerada um importante fator etiológico no desenvolvimento de cáries. Este microorganismo está sempre presente no biofilme dental potencialmente cariogênico. Além disso, há uma clara e forte evidência que a produção de glucanas é essencial para a expressão da virulência de S. mutans, contribuindo para a aderência efetiva da bactéria à superfície dental, pela exposição à sacarose. Neste trabalho, estudamos a ação do extrato bruto hidroetanólico das folhas (EF), do óleo-resina (OR) e de suas frações, a fração volátil (FV) e a fração resinosa (FR), de Copaíba sobre fatores de virulência de S. mutans. O efeito inibitório na produção de ácido foi monitorado pelo registro potenciométrico de pH da suspensão bacteriana em função do tempo de incubação, tratadas com concentrações seriadas dos produtos naturais de copaíba. Para o ensaio da atividade antibacteriana, a concentração inibitória mínima (CIM) e a bactericida mínima (CBM) foram determinadas e comparadas. Glucanas sintetizadas a partir da sacarose por glucosiltransferases isoladas de S. mutans (GTFs) em presença dos produtos de copaíba foi quantificada pelo método do fenol-sulfúrico. Os valores de de CI50 estabelecidos nos ensaios de potencial acidogênico foram iguais a 0,36 mg/mL (EF), e 0,06 mg/mL (FV). Enquanto a CIM foi estabelecida em 1 mg/mL (EF) e 0,2 mg/mL (FV). No entanto, tanto o EF quanto a F não apresentaram nenhum efeito bactericida nas concentrações testadas, sugerindo que eles exercem um efeito bacteriostático. Por outro lado, o OR exibiu um efeito bacteriostático em baixa concentração (CIM = 0,4 mg/mL) e um efeito bactericida em concentrações maiores (0,8 mg/mL). O OR também apresentou um maior efeito inibitório sobre a produção de ácidos bacterianos quando comparado ao EF, em concentrações menores ou igual a 2,0 mg/mL, porém em concentrações maiores este efeito inibitório foi equivalente. OR inibiu a síntese de glucanas insolúveis em um perfil dose-dependente e suprimiu a atividade das GTFs-AC e GTFs-EC em 70% e 50%, respectivamente, na concentração de 20 ?g/mL. Igualmente o OR suprimiu a síntese de glucanas solúveis pelas GTFs-EC (60%) na mesma concentração. Por outro lado, o EF não apresentou efeito acentuado sobre a atividade de GTFs-AC e GTFs-EC. / Dental caries, a diet-bacterial disease which damages the structure of teeth, continues to be a major public health problem worldwide. Acid production by acidogenic bacteria, such as Streptococcus mutans, which are embedded in a biofilm termed ?dental plaque? is a key aspect of the pathogenesis of dental caries. In addition, there is clear and unequivocal evidence that glucan production is essential for the expression of virulence by mutans streptococci and contribute for the effective adherence of bacteria on dental surfaces formed when exposed to sucrose. In this work, we have evaluated the effect of the hidroethanolic crude extract from the leaves of copaiba (EF), as well as, the wood oil resin from copaiba (OR) and its volatile fraction (FV) upon virulence factors of Streptococcus mutans. The inhibitory effect on bacteria acid production was evaluated through the potentiometric measurement of pH from bacterial suspensions treated with serial concentrations of natural products. For the antibacterial activity assay, the minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal concentrations (MBC) were determined and compared. Glucans synthesized from sucrose by streptococci glucosiltransferases (GTFs), in the presence of Copaiba natural products, were quantified by phenol-sulphuric method. The IC50 values established for the acidogenic potential assay were 0.36 mg/mL (EF) and 0.06 mg/mL (FV), while the MIC values were 1.0 mg/mL (EF) and 0.2 mg/mL (FV). However, both EF and FV did not display any bactericidal effect at the tested concentration range, suggesting that they exert a bacteriostact, rather than a bactericidal effect. On the other hand, OR exerted a bacteriostact effect at low concentrations (MIC = 0.4 mg/mL) and a bactericidal effect at higher concentration (MBC = 0.8 mg/mL). OR also displayed a higher inhibitory activity on bacterial acid production when compared to EF, at concentrations less than or equal to 2.0 mg/mL, but at higher concentrations their inhibitory effects were equivalent. OR inhibited insoluble glucan synthesis in a dose-dependent profile and suppressed GTFs-AC and GTFs-EC activities by 70% and 50%, respectively, at a concentration of 20 ?g/mL. Similary, OR suppressed soluble glucans synthesis by GTFs-EC (60%), at the same concentration. On the other hand, the EF did not affect significantly the activity of the GTFs-AC and GTFs-EC.

Orientador: Brenda Paula Figueiredo de Almeida Gomes / Tese (Doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-21T23:48:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Endo_MarcosSergio_D.pdf: 3037856 bytes, checksum: a21ebec8d8ad677c201694383adabc1c (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Introdução: Microrganismos resistentes à terapia endodôntica ou que invadiram o sistema de canais radiculares após os procedimentos clínicos de desinfecção são considerados as principais causas do insucesso endodôntico. Objetivos: 1) investigar a prevalência de Enterococcus faecalis nos casos de retratamento endodôntico e lesão periapical utilizando a técnica de cultura, PCR tradicional e nested PCR, e avaliar a suscetibilidade antimicrobiana e os fatores de virulência dos E. faecalis isolados dos canais radiculares investigados (Capítulo 1); 2) quantificar bactérias viáveis e endotoxinas em dentes com infecções endodônticas secundárias e correlacionar seus níveis com aspectos clínicos e radiográficos, e também avaliar o efeito do preparo químico-mecânico (PQM) com clorexidina 2% gel + EDTA 17% na redução de bactérias e endotoxinas. Também visou investigar determinadas espécies bacterianas Gram-negativas por meio da técnica de PCR (Capítulo 2). Métodos: Amostras microbiológicas foram coletadas de 30 canais radiculares de dentes com tratamento endodôntico prévio e lesão periapical após a remoção da guta-percha (C1) e após o PQM (C2). Técnicas de cultura microbiana, PCR (16S rDNA) e nested PCR foram empregadas para investigação de E. faecalis. Determinadas espécies bacterianas Gram-negativas foram investigadas por meio da técnica de PCR. Níveis de endotoxinas e unidades formadoras de colônias (UFCs) foram monitorados em C1 e C2, utilizando o método LAL e cultura, respectivamente. Cepas clínicas de E. faecalis foram testadas quanto sua suscetibilidade antimicrobiana frente a 12 tipos de antibióticos por meio do E-test. Fatores de virulência (efaA, ace, asa, asa373, gelE, esp e cylA) dos E. faecalis isolados foram investigados pela técnica de PCR. Resultados: E. faecalis foi encontrado pela técnica de cultura (7/30), PCR tradicional (13/30) e nested PCR (23/30). PCR tradicional e nested PCR revelaram maior sensibilidade do que a cultura na detecção de E. faecalis (p<0,05, teste McNemar). P. nigrescens (4/15), P. intermedia (2/15), F. nucleatum (1/15), T. denticola (1/15), T. socranskii (1/15) e T. forsythia (2/15) foram detectadas nos canais radiculares. Endotoxinas foram detectados em todos os casos (C1 e C2). Correlação positiva entre níveis de endotoxinas e destruição óssea periapical foi observada (p<0,05). E. faecalis apresentou-se suscetível frente à Amoxicilina, Amoxicilina + ácido clavulânico, Benzilpenicilina, Moxifloxacina e Vancomicina, entretanto algumas cepas mostraram resistência contra Eritromicina (3/12), Azitromicina (8/12), Rifampicina (4/12), Tetraciclina (2/12) e Doxiciclina (1/12). Foram encontrados os seguintes fatores de virulência nos E. faecalis isolados: ace e efaA (100%), gelE (91,6%), asa (83,3%), esp (25%) e cylA (16,6%). Conclusão: 1) A percentagem de E. faecalis encontrada variou dependendo da técnica empregada. Todos os E. faecalis isolados apresentaram fatores de virulência relacionados à aderência (genes ace e efa). Foi observada resistência frente a alguns antibióticos comumente utilizados na Odontologia (Capítulo 1); 2) Foram encontrados microrganismos e endotoxinas em todos os canais radiculares, antes e após o PQM. Os níveis de endotoxinas presentes inicialmente nos canais apresentaram associação com o tamanho da lesão periapical. O PQM com clorexidina 2% gel + EDTA 17% foi efetivo na redução da carga bacteriana e dos níveis de endotoxinas nos casos de infecção endodôntica secundária. (Capítulo 2) / Abstract: Introduction: Microorganisms resistant to the endodontic therapy or that invaded the root canal system after clinical disinfection procedures are considered the main causes of endodontic failure. Aims: 1) to investigate the prevalence of E. faecalis in cases of endodontic retreatment with periapical lesions using culture technique, traditional PCR and nested PCR; and also to evaluate the antimicrobial susceptibility and virulence factors of E. faecalis isolates (Chapter 1); 2) to quantify cultivable bacteria and endotoxin in root canals with secondary endodontic infection correlating their levels with the presence of clinical features; and also to evaluate the effect of chemomechanical preparation (CMP) with 2% chlorhexidine-gel + 17% EDTA on bacterial and endotoxin removal. Moreover, it was also aimed to investigate the presence of target strict Gram-negative anaerobic bacteria by PCR/ nested PCR (Chapter 2). Methods: Microbial samples were collected from 30 root-filled canals of teeth with secondary endodontic infection after removal of gutta-percha (S1) and after CMP (S2). Microbial culture techniques, PCR (16S rDNA) and nested PCR were used to investigate the presence of E. faecalis. Target Gram-negative bacteria species were investigated by PCR. Levels of endotoxin and CFU were monitored in S1 and S2, using the LAL assay and culture, respectively. Clinical strains of E. faecalis were tested for their antimicrobial susceptibility to 12 types of antibiotics by E-test. The virulence factors (efaA, ace, asa, asa373, gelE, esp and cylA) of E. faecalis isolates were investigated by PCR technique. Results: E. faecalis was found by culture technique (7/30), traditional PCR (13/30) and nested PCR (23/30). The traditional PCR and nested PCR technique revealed higher sensitivity for detection of E. faecalis than culture (p<0.05, McNemar's test). P. nigrescens (4/15), P. intermedia (2/15), F. nucleatum (1/15) T. denticola (1/15) T. socranskii (1/15) and T. forsythia (2/15) were detected in the root canals investigated. Endotoxins were detected in all cases (S1 and S2). Positive correlation between endotoxin levels and periapical bone destruction was observed (p <0.05). All E. faecalis strains were susceptible to Amoxicillin, Amoxicillin + clavulanic acid, Benzylpenicillin, Vancomycin and Moxifloxacin, however some strains showed resistant to Erythromycin (3/12), Azithromycin (8/12), Rifampicin (4/12), Tetracycline (2/12) and Doxycycline (1/12). The virulence factors of the E. faecalis strains were ace and efaA (100%), gelE (91.6%), asa (83.3%), esp (25%) and cylA (16.6%). Conclusion: 1) The percentage of E. faecalis found varied according to the technique employed. All E. faecalis isolated showed virulence factors related to adherence (genes ace and efa). They also showed resistance to some antibiotics commonly used in dentistry (Chapter 1); 2) Microorganisms and endotoxins were found in all root canals investigated, before and after CMP. The endotoxin levels initially found in the infected root canals were associated with a larger size of periapical radiolucent area. CMP with 2% chlorhexidine-gel + 17% EDTA was effective in reducing both bacterial load and endotoxin contents in the post-treatment apical periodontitis (Chapter 2) / Doutorado / Endodontia / Doutor em Clínica Odontológica

Made available in DSpace on 2014-08-20T13:32:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_mariana_almeida_iglesias.pdf: 683600 bytes, checksum: 7c2d99601551e443f9b19dd649609f3f (MD5) Previous issue date: 2014-03-06 / Listeria monocytogenes is a foodborne pathogen that can cause listeriosis, both in humans and in animals. The contamination by this microorganism is difficult to control, given its wide dissemination and physiological adaptability, which allow its development under conditions which are usually unfavorable to other pathogenic bacteria. Therefore, this pathogen has become of concern to the food industry as well as consumers, since it is highly pathogenic, especially in relation to risk group and may be fatal in 30% of cases of listeriosis. Although any isolate of L. monocytogenes can be considered potentially pathogenic for humans, several studies suggest that this micro-organism has a heterogeneous pathogenicity of the strains, which makes it essential to know the gene expression of the pathogen can be understood that the differences in their virulence mechanisms, and how different potential pathogenicity. The present study aimed to verify the occurrence of. L. monocytogenes in slaughterhouses in southern Rio Grande do Sul, and through the isolates, assess their sensitivity to antibiotics, and perform a genotypic characterization by verifying the presence of virulence genes. L. monocytogenes occured in 6% of the samples, detected after bleeding at the point where the collect was held in the leather of the animal, and point 4 (pre-cooling after washing).Twelve isolates were obtained, which were evaluated for sensibility to 15 antimicrobials, of which 100% were susceptible to most antibiotics tested. Resistance to gentamycin (8%), ampicilin (8%), kanamycin (8%) and sulfonamide (83%) were observed in some isolated of L. monocytogenes. Intermediate susceptibility to clindamycin (60%) and erythromycin (8%) was observed, and multidrug-resistant strains were also observed. Proceeded to evaluate the presence of virulence genes (hlyA, plcA, inlA, inlB, inlC, inlJ, plcB, iap, actA, mpl and PrfA) and, through the results of PCR, it was observed that all isolates possessed the evaluated genes, also confirmed the expression of the gene of internalin A by RT-PCR, showing the potential pathogenic strains of L. monocytogenes isolated from food in southern Brazil. / Listeria monocytogenes é um patógeno de origem alimentar capaz de causar listeriose, tanto em humanos como em animais. A contaminação por este micro-organismo é de difícil controle, tendo em vista sua ampla disseminação e capacidade fisiológica de adaptação, as quais permitem seu desenvolvimento sob condições que usualmente são desfavoráveis a outras bactérias patogênicas. Assim sendo, esse patógeno tornou-se motivo de preocupação para a indústria de alimentos bem como para os consumidores, uma vez que é altamente patogênica, principalmente em relação ao grupo de risco, podendo ser fatal em até 30% dos casos de listeriose. Embora qualquer isolado de L. monocytogenes possa ser considerado potencialmente patogênico para humanos, vários estudos sugerem que este micro-organismo apresenta patogenicidade heterogênea, o que torna essencial a caracterização molecular de cada isolado, bem como o conhecimento de sua expressão gênica, para que possam ser entendidas as diferenças nos seus mecanismos de patogenicidade.. Em vista do exposto, o presente estudo objetivou verificar a ocorrência de L. monocytogenes em carcaças bovinas abatidas em dois frigoríficos-matadouros do sul do Rio Grande do Sul e, a partir dos isolados, avaliar sua sensibilidade a antimicrobianos, e realizar a caracterização genotípica, através da verificação da presença de genes de virulência e da expressão da internalina A. A ocorrência de L. monocytogenes nas carcaças foi de 6%, a qual foi detectada no Ponto 1 (após a sangria) e no Ponto 4 (após a lavagem pré-resfriamento). Foram obtidos 12 isolados, os quais foram avaliados quanto a sensibilidade a 15 antimicrobianos, dos quais 100% mostraram-se sensíveis a maioria dos antibióticos testados. Resistência à gentamicina (8%), ampicilina (8%), canamicina (8%) e a sulfonamida (83%) foram observadas em parte dos isolados. Suscetibilidade intermediária foi observada para clindamicina (60%) e eritromicina (8%). Quanto aos isolados multirresistentes, dois deles apresentaram resistência a mais de um agente antimicrobiano. Procedeu-se à avaliação da presença de genes de virulência (prfA, plcA, plcB, hlya, iap, actA, mpl, inlA, inlC e inlJ) e, através dos resultados da PCR, foi possível observar que todos os isolados possuíam os genes avaliados, sendo também confirmada a expressão do gene da internalina A através da técnica de RT-PCR, evidenciando o potencial patogênico das cepas de L. monocytogenes isoladas de alimentos no sul do Brasil.