El carcinoma hepatocel.lular (CHC) representa un problema clínic greu i freqüent en els pacients portadors d'una hepatopatia crònica. En aquest sentit, estudis recents han demostrat que es pot establir el diagnòstic de CHC en el 5% dels malalts amb cirrosi hepàtica i en el 15% d'aquells que ingressen com a conseqüència d'una hemorràgia per varices esofàgiques. D'altra banda, la supervivència d'aquests malalts acostuma a ésser curta ja que, molt freqüentment, el tumor es detecta en estadis avançats del seu desenvolupament, quan ja no es possible aplicar una opció terapèutica radical. Així, malgrat l'aplicació dels programes de diagnòstic precoç, la majoria de malalts tan sols pot ésser tributari de mesures pal·liatives, habitualment tractament amb citostàtics, el qual ha demostrat ésser poc eficaç, estant endemés gravada per múltiples efectes secundaris. Aquesta baixa eficàcia terapèutica ha comportat el desenvolupament de noves modalitats terapèutiques entre les que sobresurt l'embolització arterial (EA).L'EA és una opció terapèutica que persegueix la necrosi isquèmica del CHC. Estudis no controlats han demostrat que l'EA posseeix un gran efecte antitumoral, tant si s'utilitza amadament com si s'associa a l'administració d'agents quimioteràpics. No obstant, en els darrers anys, tres grups occidentals han aconseguit resultats contradictoris. Així, mentre Vetler, en un estudi comparatiu no controlat, suggereix una supervivència superior en el grup tractat, Pelletier i el "Groupe Francophone d'Etude et de Traitement du Carcinome Hepatocellulaire" no han aconseguit demostrar cap milloria.La present Tesi Doctoral va voler establir exhaustivament la utilitat real de l'EA en el tractament del CHC avançat en el nostre medi. En primer lloc es va realitzar un estudi en fase 2 on s'avaluà la reproductibilitat de la tècnica, la tolerància dels malalts i l'efecte antitumoral. Així mateix, en aquest estudi es va estimar, a través de càlculs estadístics complexos, la repercussió sobre la supervivència. Els resultats obtinguts van proporcionar la base racional per a la realització d'un estudi controlat i aleatoritzat on es comparava un grup de pacients tractats mitjançant l'EA amb un altre sotmès únicament a tractament simptomàtic, i que va permetre conèixer, no tan sols la repercussió de l'EA sobre la supervivència dels malalts amb CHC. sinó també el seu efecte sobre la cinètica de creixement tumoral, l'aparició de complicacions secundàries al tumor i la qualitat de vida dels malalts. El disseny d'aquest estudi controlat no hauria estat possible sense la identificació prèvia dels factors que determinen una correcta resposta al tractament i una major supervivència després de l'EA. Paral.lelament, i donat que l'artèria hepàtica contribueix a l'increment de les resistències hepàtiques en els malalts amb cirrosi i hipertensió portal, es va investigar l'efecte que comporta l'anul.lació del seu flux sobre l'hemodinàmica esplàcnica i sistèmica. Per últim, tenint en compte la immunodepressió que presenten els malalts cirròtics portadors d'un CHC, es va estudiar la necessitat de realitzar antibioteràpia profilàctica, en el moment d'efectuar l'EA.Els resultats d'aquesta Tesi confirmen que l'EA, inclús quan no s'associa a agents quimioteràpics, posseeix un gran efecte antitumoral ja que a la majoria de casos s'observa necrosi del CHC amb marcada reducció de la mida del tumor. Així mateix, es tracta d'un procediment ben tolerat. fins al punt que. un cop resolta la síndrome postembolització, la pràctica totalitat dels malalts recuperen com a mínim el PST previ a l'EA. Per altra banda, la majoria presenten revascularització de la lesió tractada o aparició d'altres nòduls tumorals. Així, la reactivació de la malaltia neoplàstica pot contrarrestar el potencial benefici de la resposta inicial al tractament, per la qual cosa l'EA ha d'ésser considerada, ara per ara, una alternativa terapèutica amb finalitat pal.liativa. Emprant una estimació estadística s'ha observat que, malgrat el marcat efecte antitumoral, la repercussió de l'EA sobre la supervivència és discreta.Els resultats del Protocol 2 indicaren que l'EA aconseguia la màxima eficàcia enaquells malalts amb un estat general conservat (PST 0 ó 1). A més, la consecució d'un marcat efecte antitumoral s'associà a una major supervivència. Cal assenyalar que aquestes variables van facilitar l'estratificació dels malalts inclosos en l'estudi controlat que es descriu en el Protocol 5.Un altre aspecte que mereix ésser comentat és la repercussió de l'embolització de l'artèria hepàtica en l'hemodinàmica sistèmica i esplàcnica. Els resultats del Protocol 3 van demostrar que l'EA permet una disminució significativa de la pressió portal sense modificar el flux sanguini hepàtic total, probablement degut a una disminució de les resistències vasculars portals intrahepàtiques. Així, contràriament al que es creia, la vena porta pot regular el seu flux com a resposta als canvis en el flux de l'artèria hepàtica.Sigui quin sigui el mecanisme implicat, tot sembla indicar que aquest augment del flux portal podria contribuir a mantenir la funció hepàtica després de l'EA. A més, aquests resultats suggereixen que l'EA podria proporcionar un efecte beneficiós addicional en els malalts cirròtics amb hipertensió portal i CHC ja que podria prevenir l'aparició de complicacions derivades de la hipertensió portal.El Protocol 4, per la seva banda, fa referència a un estudi dirigit a establir la necessitat de realitzar profilaxi antibiòtica en els malalts que van a ésser sotmesos a EA. La base racional d'administrar antibiòtics en aquestes circumstàncies prové del fet ben conegut que els malalts cirròtics portadors d'un CHC presenten un major risc de desenvolupar infeccions bacterianes i que en algunes ocasions s'ha reportat el desenvolupament d'abscesos hepàtics com una potencial complicació infecciosa del procediment. Els seus resultats van demostrar que no és necessari efectuar profilaxi antibiòtica en els malalts cirròtics amb CHC que van a ésser sotmesos a EA. Per altra banda, es va posar de manifest que l'aparició de febre superior a 38°C després d'aquest procediment no tan sols no és indicativa de l'existència d'un infecció bacteriana, sinó que constitueix un marcador clínic de necrosi tumoral extensa i, per tant, de resposta favorable al tractament.El Protocol 5 representa el nucli central de la present Tesi Doctoral. Mitjançant aquest estudi controlat i aleatoritzat, on es comparà un grup de malalts sotmesos a EA amb un altre tractat simptomàticament, es va pretendre avaluar de manera inequívoca la utilitat d'aquest procediment. Els resultats d'aquest estudi demostraren que l'EA no aconsegueix augmentar la supervivència dels malalts amb CHC avançat. Tanmateix. l'EA alenteix la velocitat de progressió tumoral, retarda l'aparició de simptomatologia relacionada amb el tumor i prolonga el manteniment del PST. / Protocol 1 and 2 describe a phase II study aimed to assess the efficacy of transarterial embolization (TAE) in 50 patients with hepatocellular carcinoma (HCC) and to determine the parameters associated to a favourable response to treatment and/or an improved survival. TAE induces a self-Iimited postembolization syndrome that is well tolerated. A favourable response is achieved in most of the cases, and its obtainment is related to a preserved performance status (PST) and to a Iower alpha-fetoprotein concentration. The survival of the patients is better than the expected survival according to a mathematical model. The Cox regression analysis discloses that both the achievement of a favourable therapeutic response and a preserved PST are associated to a better survival. Nevertheless, since the potential benefit on survival observed in this study appears to be moderate, controlled trials to ascertain the real usefulness of TAE are mandatory.Protocol 3 demonstrates that the occlusion of the hepatic artery by TAE significantly reduces portal pressure. This beneficial effect may be due to a reduced hepatic vascular resistance to portal blood flow. In addition, total hepatic blood flow does not decrease and azygos blood flow increases, suggesting splanchnic vasodilatation with increased portal and collateral blood flow. Moreover, the indocyanine green intrinsic clearance increases, suggesting an improvement in liver microcirculation.Protocol 4 suggests that antibiotic prophylaxis is not necessary in HCC cirrhotic patients submitted to TAE and that the appearance of fever after this procedure does not indicate bacterial infection and rather represents a clinical marker of extensive tumour necrosis and thus, of a favourable response to treatment.Finally, Protocol 5 indicates that although TAE does not improves the prognosis of patients with advanced HCC, this procedure slows tumour progression rate, reduces the appearance of cancer-related symptoms and maintains the baseline PST.

Aquesta tesi té com a principals objectius:1- Identificació de nous substrats de cdk2 en diferents models cel·lulars: cèl·lules HeLa, hepatòcits normals activats a proliferar mitjançant una hepatectomia parcial, limfòcits humans normals activats a proliferar, i la línia limfoide Namalwa.2- Localització intranuclear de proteïnes que participen en el control del cicle cel·lular en dos models de proliferació un normal i l'altre transformat: hepatòcits normals activats a proliferar mitjançant una hepatectomia parcial, i la línia cel·lular transformada d'origen humà HeLa.3- Anàlisi dels mecanismes d'activació de la cdk4 i la cdk2 durant la regeneració hepàtica.

INTRODUCCIÓNA pesar de los avances alcanzados en el manejo del trasplantado hepático, el tratamiento inmunosupresor es responsable de una importante comorbilidad en relación con una predisposición al desarrollo de infecciones, un aumento de los factores de riesgo cardiovascular y una influencia negativa en la recidiva del virus de la hepatitis C. En ese sentido, los corticoides se han relacionado de forma específica con todos estos factores, por lo que es presumible que la ausencia de tratamiento esteroideo tras el trasplante suponga un beneficio. La excelente supervivencia obtenida en todos los protocolos que utilizan como base anticalcineurínicos (ciclosporina o tacrólimus) implica que no pueda obviarse el uso de una de estas drogas. En contraposición, los corticoides pueden ser suspendidos en la gran mayoría de pacientes al tercer mes post-trasplante sin que exista rechazo ni pérdida del injerto, hecho que ya es asumido actualmente por muchos grupos de trasplante. La reciente introducción de los anticuerpos monoclonales como el basiliximab ha permitido aumentar la eficacia de los anticalcineurínicos sin aumentar su toxicidad, haciendo más prescindibles los corticoides. OBJETIVOSDeterminar si un régimen inmunosupresor sin corticoides es igual de eficaz que el mismo régimen con corticoides comparando incidencia de rechazo agudo, ductopénico y supervivencia. Determinar si un régimen inmunosupresor sin corticoides permite disminuir las complicaciones relacionadas con la inmunosupresión respecto al mismo régimen con corticoides valorando infección, diabetes, hipertensión arterial, dislipemia, y recidiva del VHC.MATERIAL Y MÉTODOSSe realizó un estudio prospectivo, multicéntrico, aleatorizado, abierto y controlado en el trasplante hepático ortotópico de cadáver. Se estratificó la muestra según la presencia del VHC. Se incluyeron a todos los pacientes sometidos a un primer trasplante hepático ortotópico de donante cadáver con una edad entre 15 y 65 años entre abril de 2001 y septiembre de 2004. Los enfermos se dividieron en dos grupos: grupo sin corticoides (ciclosporina + basiliximab) y grupo con corticoides (ciclosporina + basiliximab + corticoides). Se realizó un análisis según intención de tratamiento a los 6 meses del trasplante, evaluando la seguridad del estudio tras la retirada protocolizada de los corticoides a los 3 meses del trasplante.RESULTADOSSe incluyeron un total de 200 pacientes. La incidencia de rechazo agudo fue del 13% en el grupo con corticoides vs 18% en el grupo sin corticoides (p=0,33). En el subgrupo de pacientes VHC+ la incidencia de rechazo agudo fue del 16% en el grupo con corticoides vs 9% en el grupo sin corticoides (p=0,38). En el subgrupo de pacientes VHC- la incidencia de rechazo agudo fue del 11% en el grupo con corticoides vs 25% en el grupo sin corticoides (p=0,05). La incidencia de rechazo crónico fue de 1% en el grupo con corticoides vs 2% en el grupo sin corticoides (p=0,42). La supervivencia del grupo con corticoides fue del 89% vs el 95% en el grupo sin corticoides (p=0,15). Se halló una menor supervivencia en el grupo de VHC- que había presentado algún episodio de rechazo agudo en caso de no recibir corticoides respecto a los que recibieron (74% vs 89%, p=0,04). La incidencia global de infección fue similar, sin embargo, la incidencia de de infección bacteriana en diabéticos que recibieron corticoides fue del 54% vs 14% en los que no recibieron (p=0,01). La incidencia de HTA de novo inicial fue del 44% en el grupo con corticoides vs 25% en el grupo sin corticoides (p=0,01). Los valores de la hemoglobina glicosilada al tercer mes post-TH fueron de 5,1% en el grupo con corticoides vs 4,4% en el grupo sin corticoides (p=0,002). Los niveles de colesterol a los 3 meses del TH fueron de 5,6mg/dl en el grupo con corticoides vs 4,8mg/dl en el grupo sin corticoides (p=0,004). Los niveles de triglicéridos a los 3 meses del TH fueron de 2mg/dl en el grupo con corticoides vs 1,7mg/dl en el grupo sin corticoides (p=0,01). La incidencia de recidiva del VHC fue similar.CONCLUSIONESUn protocolo de inmunosupresión, basado en ciclosporina y basiliximab, sin corticoides no aumenta la incidencia de rechazo en los pacientes con serología VHC+ pre-TH, comparado con la misma pauta con corticoides. Sin embargo la eliminación de los corticoides en las pautas de inmunosupresión en los pacientes VHC- no parece útil, porque puede aumentar el rechazo y empeorar la supervivencia. La pauta de inmunosupresión sin corticoides se asocia a un menor índice de trastornos metabólicos post-TH. Los pacientes diabéticos pre-TH presentan una mayor incidencia de infecciones bacterianas con la pauta que incluye corticoides. / "Impact of an immunosuppressive protocol after liver transplantation without steroids: prospective multicenter and randomized study".BY: Roberto Memba IkugaLiver Transplant UnitHospital Universitario de BellvitgeTEXT:INTRODUCTIONSteroids contribute significantly to morbidity after liver transplantation. This is related to infections, development of cardiovascular risk factors and recurrence of HCV. Most liver transplant groups withdraw steroids 3 months after transplant, without any increase in the incidence of rejection. The introduction of monoclonal antibodies such as basiliximab could avoid the use of steroids. OBJECTIVESTo determine whether an immunosuppressive treatment without steroids is as effective as the same regimen with steroids, comparing incidence of rejection and survival. To determine if it is also able to reduce complications secondary to immunosuppression.MATERIAL AND METHODSWe performed a prospective, multicenter, randomized, open and controlled study. The sample was stratified according to the presence of HCV. We included all patients undergoing first cadaveric orthotopic liver transplantation with donors aged between 15 and 65 years between April 2001 and September 2004. The patients were divided into two groups: non-steroids group (basiliximab + cyclosporine) and steroids group (cyclosporine + steroids + basiliximab). RESULTSThe incidence of acute rejection was 13% in the steroids group vs 18% in the non-steroids group (p=0.33). There were no differences in HCV + patients, but in HCV - patients, the incidence of acute rejection was 11% in the steroids group vs 25% in the non-steroids group (p=0.05). There were no differences in chronic rejection or survival. However, we found a lower survival in the HCV- patients who had suffered an acute rejection episode and had not received steroids compared to those who did receive them (74% vs 89%, p=0.04). The overall incidence of infection was similar, but incidence of bacterial infection in diabetic patients who received steroids was higher compared to the non-steroids group (4% vs 14%, p=0.01). Incidence of initial "de novo" hypertension was higher in the steroids group compared to the non-steroids group (44% vs 25%, p=0.01). Glycated hemoglobin levels three months after liver transplantation were 5.1% in steroids group vs 4.4% in non-steroids group (p=0.002). Cholesterol levels after 3 months of transplant were 5.6mg/dl in the steroids group vs 4.8mg/dl in the non-steroids group (p=0.004). Triglyceride levels at 3 months of transplant were 2mg/dl in the steroids group vs 1.7mg/dl in the non-steroids group (p=0.01). Incidence of HCV recurrence was similar.CONCLUSIONSAn immunosuppressive protocol based on cyclosporine and basiliximab without steroids does not increase incidence of rejection in HCV+ patients compared to the same pattern with steroids. However, avoiding steroids in HCV- patients does not seem safe because it could produce a higher incidence of rejection and worse survival. Immunosuppression without steroids is associated with fewer metabolic complications after liver transplantation. Diabetic patients have a higher incidence of bacterial infections if they receive steroid treatment.

Durante la regeneración hepática el contenido de fructosa 2,6-bisfosfato, Fru-2,6-P(2) disminuyó rápidamente (1 h) manteniéndose los niveles bajos durante las primeras 24 h. A partir de este tiempo, los niveles tendieron a recuperarse sin alcanzar los valores control a los 7 días. El contenido de glucógeno mostró un perfil similar siendo la disminución inicial menos rápida (mínimo a las 6 h) y restableciéndose el contenido a los 7 días. Los bajos niveles de Fru-2,6-P(2) después de una hepatectomía parcial correlacionan con el incremento de la gluconeogénesis y la disminución de la glucolisis descritos. Posiblemente la causa de la rápida disminución del contenido de Fru-2,6-P(2) después de una hepatectomía parcial sea la fosforilación del enzima por la proteína quinasa dependiente de cAMP como así lo sugiere la rápida disminución de la actividad PFK-2 activa (que representa la actividad quinasa de la forma no fosforilada del enzima bifuncional 6-fosfofmcto 2-quinasa/fructosa 2,6-bisfosfatasa, PFK-2/FB/Pasa-2) y del cociente de actividades PFK-2 activa/total (reflejo del grado de fosforilación del enzima bifuncional). Otros factores como la disminución del contenido de hexosas 6-fosfato y el aumento de citrato y fosfoenolpiruvato podrían también contribuir al mantenimiento de estos bajos niveles.Durante el proceso regenerativo aparece una forma del enzima bifuncional diferente a la del enzima de hígado adulto como lo indica su comportamiento cinético frente al glicerol 3-fosfato y a la incubación con la proteína quinasa dependiente de cAMP. El diferente reconocimiento de esta forma enzimática con anticuerpos específicos de la PFK-2/FBPasa-2 de hígado y con anticuerpos contra toda la proteína sugiere que tiene su extremo amino modificado. Durante todo el proceso proliferativo el ARNm que se expresa es específico de hígado por lo que la modificación del extremo amino no es debida a un alternativo "splicing" del gen sino a alguna modificación post-transcripcional aún no descrita para este enzima.Los niveles de ARNm del enzima bifuncional disminuyeron rápidamente después de una hepatectomía parcial con un mínimo a las 6 h y aumentando después de este tiempo con un máximo a las 48-60 h, y tendiendo a normalizarse después de este tiempo. Estos niveles de ARNm estuvieron regulados a nivel transcripcional, no correlacionando las variaciones del contenido de ARNm con variaciones en el contenido del enzima. La velocidad de degradación del ARNm del enzima bifuncional no se modificó durante las primeras horas después de una hepatectomía parcial sugiriendo un papel mis importante de la regulación transcripcional durante esta fase.Los niveles de ARNm de los enzimas considerados reguladores de la glucolisis/gluconeogénesis: glucoquinasa (GK), piruvato quinasa (L-PK), fructosa 1,6-bisfosfatasa (FBPasa-1) y fosfoenolpiruvato carboxiquinasa (PEPCK) fueron analizados por "Northern blot". En general, durante la fase pre-replicativa (0-12 h) se observa una disminución del contenido de ARNnl de los enzimas glucolíticos y aumento del de PEPCK. Esta correlación se rompe durante la fase replicativa (>12 h) donde se aprecia la recuperación del mensajero de GK (24 h), junto con elevados niveles de PFK-2FBPasa-2 y PEPCK. El contenido del mensajero de la LPK se recuperó a los 7 días, mientras que los niveles de FBPasa-1 no se modificaron significativamente durante todo el proceso regenerativo. El contenido de ARNm de estos enzimas también fue analizado en los animales laparotomizados y, aunque mostraron algunas modificaciones, éstas fueron mucho menos pronunciadas que en los animales hepatectomizados, normalizándose alrededor de las 24 h.La administración de glucagón intraperitonealmente (1 mg/kg) produjo sobre el sistema de la Fru-2,6-P(2) (metabolito, enzima, mensajero) una situación similar a la detectada durante las primeras horas después de una hepatectomía parcial. Así se observó una disminución del contenido de Fru-2,6-P2 en paralelo a la fosforilación del enzima. La actividad PFK-2 total y el contenido de ARNm también disminuyeron. Los niveles de ARNm estuvieron regulados a nivel transcripcional observándose una disminución de la velocidad de transcripción del gen en paralelo al contenido del ARNm. Sorprendentemente, la estabilidad del ARNm del enzima bifuncional aumentó en presencia de glucagón sugiriendo que quizás las vidas medias de losARNm estimadas mediante este procedimiento "in vitro" no reflejen las vidas medias reales "in vivo". Esta estabilización de los niveles de ARNm en presencia de glucagón también ocurrió para la L-PK y la PEPCK. La estabilización de los ARNm se modificó en presencia de cicloheximida, un inhibidor de la síntesis de proteínas, sugiriendo todos estos datos que en la estabilización de estos ARNm están involucradas proteínas con un recambio rápido y reguladas por un proceso dependiente de cAMP. / Glycogen and fmclose 2,6-bisphosphate levels in rat liver decreased quickiy after partial hepateciomy. After 7 days the glycogen level was normalyzed and fructose 2.6-bisphosphate concentration still remained low. The active (non-phosphorylaied) fonn of 6-phosphofructo-2-kinase/fructose 2,6-bisphosphatase (PFK-2/FBPase-2) varied in parallel with fructose 2.6- bisphosphate levels. The mRNA of PFK-2/FBPase-2 expressed during the hepatic regeneration is the adult liver form. The kinetic and immunological differences found for PFK-2/FBPase-2 during liver regeneration could reflect some as yet unidentified post-translational change.The mRNA levels of glucokinase (GK), L-pyruvate kinase (L-PK), PFK-2EBPase-2, fructose 1,6-bisphosphatase (FBPase-1) and phosphoenolpyurvate carboxykinase (PEFCK) were analyzed during liver regenerartion. The mRNA levels of glycolytic enzymes (GK, PFK-2/FBPase-2 and L-PK) decreased rapidly after partial hepatectomy. GK mRNA increased at 16-24 h, returning to normal values after his time. After six hours the PFK-2/FBPase-2 mRNA increased to a maximum at 48 hours, and returned to normal levels by 96 hours. L-pyruvate kinase mRNA recovered control levels al 168 h. In contrast, phosphoenolpyruvate carboxykinase mRNA increased rapidly after liver resection and remained high during the regenerative process. However, the levels of fructose 1,6-bisphosphatase mRNA, another gluconeogenic enzyme, were not modified significantly. These results correlate with reported rates and enzyme levels of increased gluconeogenesis after partial hepatectomy. The effect of stress on the mRNA levels was also studied. All enzymes showed variations in their mRNA levels following the surgical stress. The differences were more pronounced in regenerating than in sham animals, being practically normalized at 24 h. The rate of gene transcription of PEFCK, PFK-2/FBPase-2 and albumin was measured during liver regeneration. The transcription rate of albumin did not change whereas that of PEPCK was increased >12-fold at 6 hours and remained high during the regenerative process. The rate of gene transcription of PFK-2FBPase-2 decreased by 50 % at 6 hours and increased thereafter with a maximum at 72 hours, and then returned to control values at 96 hours. These results correlate with the mRNA levels and demonstrate that gene inscription of PEFCK and PFK-2FBPase-2 is specifically regulated, and that this regulation is in part responsible for the alterations in hepatic metabolism seen in regenerating liver.The administration of glucagon reproduced in fructose 2.6-bisphosphate system (meitabolite, protein, mRNA) a similar situation that we have described during the first hours after partial hepatectomy.

La producció de glucosa hepàtica està sotmesa a un estricte control hormonal i de substrats. En individus diabètics, l'increment de la gluconeogènesi hepàtica, secundària a la resistència a insulina o a la manca de secreció de la hormona, repercuteix de forma directa sobre l'homeòstasi de la glucosa. A més, s'ha observat una relació directa entre la sobreexpressió de PEPCK-C, l'increment de la producció hepàtica de glucosa i el desenvolupament d'hiperglucèmia en models animals. Malgrat aquest conjunt d'evidències, la validació de PEPCK-C com a diana terapèutica per a disminuir la producció hepàtica de glucosa en la diabetis no ha estat investigada en profunditat fins al moment.No obstant, una gran controvèrsia ha esdevingut en els últims anys sobre la preponderància de la gluconeogènesi hepàtica en el control de la glucèmia. Els estudis amb ratolins genosuprimits per PEPCK-C hepàtica han demostrat que la supressió de l'enzim de manera específica al fetge, aboleix la gluconeogènesi sense afectar al control de la glucèmia en repòs, i han demostrat la rellevància de l'activitat PEPCK-C en el metabolisme energètic a través del manteniment del flux del cicle de Krebs. Resulta essencial el fet que, tant el context fisiopatològic com l'abast de la supressió de l'activitat PEPCK-C al fetge divergeixen entre aquest model de ratolí genosuprimit i el model de diabetis experimental o genètica estudiats en el nostre laboratori. Amb aquests precedents, ens vàrem interessar per estudiar els efectes aguts sobre l'homeòstasi energètica i de la glucosa derivats la modulació de l'activitat PEPCK-C hepàtica a fi de validar aquest enzim com a una possible diana per a una estratègia terapèutica per a controlar la hiperglucèmia diabètica. Per a assolir aquest objectiu general, s'ha aplicat tècniques de RNA d'interferència sobre diferents models animals de la patologia diabètica.Per això ens vam plantejar estudiar: a) les implicacions de la silenciació de PEPCK-C sobre l'homeòstasi de la glucosa i la resistència a la insulina en el marc de la patofisiologia de la diabetis b) la rellevància de la magnitud de la silenciació de PEPCK-C en fetge envers dels efectes sobre la cataplerosi i la funció mitocondrial, i c) les alteracions del metabolisme energètic resultants de la reducció de la gluconeogènesi hepàtica en el context de la resistència a la insulina.Aquests estudis ens han permès extreure importants conclusions sobre la implicació de PEPCK-C en el control de la gluconeogènesi i la glucèmia, validant idoneïtat de la PEPCK-C hepàtica com a diana una terapèutica plausible per la diabetis.

Antecedents: La síndrome de la hipertensió portal és la més greu complicació de les malalties cròniques del fetge. Estudis anteriors del nostre grup en models experimentals de hipertensió portal van demostrar l’existència d’un procés actiu d’angiogènesi estimulada per VEGF a nivell del territori esplàncnic, i la implicació d´aquesta neovascularització en la formació de vasos col•laterals portosistèmics i en l’establiment de la circulació hiperdinàmica esplàncnica. Objectiu: Determinar els mecanismes reguladors de l´angiogènesi en la hipertensió portal, i avaluar experimentalment noves estratègies terapèutiques per el tractament d´aquesta malaltia. Metodologia: Estudi 1: Es realitza el bloqueig de les vies de senyalització de VEGF i PDGF, per separat o de manera combinada, en rates amb hipertensió portal, i se’n determina l’efecte sobre les alteracions en la circulació esplàncnica. Estudi 2: Es busca aprofundir en el coneixement dels efectes dels agents antiangiogènics en les alteracions associades a la hipertensió portal, determinant l’efecte de Sorafenib, un inhibidor multikinasa amb efectes antiangiogènics, en rates amb hipertensió portal i cirrosi. Estudi 3: Es prova de determinar, que a més de la congestió, hi hauria altres mecanismes implicats en l’esplenomegàlia associada a la hipertensió portal, i que el bloqueig de la via de mTOR, mitjançant Rapamicina, seria efectiu per reduir l’esplenomegàlia. Resultats: Estudi 1: S’assoleix una reversió dels canvis en la circulació esplàncnica més important quan bloquegem les vies de VEGF i PDGF alhora que amb el bloqueig de cadascuna d’elles per separat. Estudi 2: El tractament amb Sorafenib produeix una millora en l’hemodinàmica dels animals amb hipertensió portal, no només a nivell esplàncnic, sinó també hepàtic i intestinal, reduint la inflamació i la fibrosi. Estudi 3: Els resultats posen en relleu la participació de l’angiogènesi, la fibrogènesi o la inflamació en l’esplenomegàlia associada a la hipertensió portal i la reducció de la mida de la melsa mitjançant la inhibició de mTOR.

Objectiu: Avaluar l'efecte del precondicionament isquèmic (PI) sobre la seqüència isquèmia-inflamació-regeneració en el fetge normal en rates.Introducció : El PI consisteix en la aplicació d'un breu període d' isquèmia i de reperfusió abans de que l'òrgan sigui sotmès a una I/R (isquèmia/reperfusió) perllongada. Material i mètodes: Rates mascle de la soca Sprague-Dawley van ser sotmeses a una hepatectomia del 70% aplicant prèviament a la resecció hepàtica algun tipus d' oclusió vascular. Es van realitzar 4 grups d' animals atenent al tipus de control vascular: Resecció hepàtica sense oclusió hiliar-RH (Grup 1), Resecció hepàtica amb oclusió hiliar-RHPR (15') (Grup 2), Precondicionament isquèmic (PI) (10'+10') i posterior resecció hepàtica amb oclusió hiliar (15') (Grup 3) i Isquèmia curta (10'+10') i posterior resecció hepàtica sense control vascular (IC) (Grup 4) . En cada grup, es van establir 4 subgrups depenent del moment del sacrifici de l'animal, a les 6h, 24 h, 3 i 7 dies. La lesió hepàtica va ser avaluada utilitzant els nivells sèrics de transaminases (AST i ALT). Es van analitzar també marcadors d'estrès oxidatiu (MPO i MDA), de reserva energètica (ATP i càrrega energètica), citosines (IL-6, IL-10 y TNF-α), així com paràmetres de regeneració hepàtica (HGF, TGF-β i PCNA). Resultats: L'aplicació del PI produeix una menor lesió hepàtica mesurada pels nivells d'AST i ALT que tenen un valors significativament més baixos en el grup d'animals sotmesos a PI. I per a altra banda, el PI afavoreix la regeneració hepàtica mesurada pels nivells d'HGF i PCNA que tenen uns valors significativament més alts en el grup d'animals als quals es va aplicar el PI. Conclusions: Aquests resultats suggereixen que el PI millora la lesió hepàtica associada a la lesió per I/R i promou la regeneració hepàtica. / Objectives: To evaluate the effects of ischemic preconditioning (IPC) on the ischemia-inflammation-regeneration sequence in normal rat livers. Introduction: IPC consists of the application during a brief period of time of ischemia and reperfusion befote a prolongad periodo f /I/R (ischemia/reperfusion) is performed on the organ. Previous studies in rodents suggest that IPC is a modality that protects against a I/R lesion in the liver. Material and methods: A 70% hepatectomy was performed in male Sprague-Dawley rats alter some type of vascular occlusion was applied. There were 4 groups of animals depending on the type of vascular control: Hepatic resection without hiliar occlusion-RH (Group 1), hepatic resection with hiliar occlusion- RHPR (15') (Group 2), ischemic preconditioning - PI (10'+10') and subsequent hepatic resection with hiliar occlusion (15') (Group 3) and short ischemia-IC (10'+10') and subsequent hepatic resection without vascular control (Group 4). An each group, 4 subgroups were established depending on the moment of sacrifice of the animal, at 6 hours, 24 hrs, 3 and 7 days. The hepatic lesion was evaluated using serum levels of hepatic enzymes (AST and ALT). Serum markers of oxidative stress (MPO, MDA), energetic reserve (ATP and energy charge) and citokynes (IL-6, IL-10 and TNF-α) were also measured, as well as markers of hepatic regeneration (TGF-β, HGF and PCNA). Results: The application of IPC produced less hepatic lesion measured by AST and ALT, which showed significantly lower levels in IPC animals. Furthermore, IPC improves hepatic regeneration measured by HGF and PCNA, which showed significantly higher levels in IPC animals. Conclusions: These results suggest that IPC improves hepatic lesion associated with I/R injury and promotes hepatic regeneration.

L'estudi realitzat ha estat la identificació i caracterització de proteïnes de la matriu nuclear, concretament d'una proteïna de 55 KD (p55) associada a la fase replicativa de l'ADN durant la proliferació cel.lular.La matriu nuclear és una estructura obtinguda després d'una extracció de cromatina i components solubles de nuclis amats. Durant els últims anys s'ha implicat a la matriu nuclear en importants funcions com són: l'organització i replicació de l'ADN, la transcripció i l'acció hormonal (1, 2, 3, 4, 5, 6). Nombroses evidències desvetllen la importància dels components de la matriu nuclear en la regulació de la síntesi de l'ADN i la proliferació cel.lular, com l'increment d'expressió de molts oncogens, que codifiquen proteïnes nuclears les quals s'associen a l'activació proliferativa de diversos tipus cel.lulars normals (7, 8, 9, 10). També s'ha descrit l'increment de moltes altres proteïnes, incloent la calmodulina, proteïnes acceptores de calmodulina (11) i distins enzims replicatius com l'ADN polimerasa a, l'ADN primasa, la 3'-5'-exonucleasa, l'ARNasa H i l'ADN metilasa, les quals s'associen a la matriu nuclear dels hepatòcits durant la fase replicativa de la regeneració (12).Totes aquestes dades suggereixen que la síntesi de certes proteïnes i la seva associació amb la matriu nuclear pot ésser un procés important per a la regulació de la replicació de l'ADN i la proliferació cel.lular en general.El treball desenvolupat s'ha centrat en la identificació d'una proteïna de 55 KDa (p55) associada a la matriu nuclear, que incrementa paral.lelament a l'inici de la síntesi d'ADN durant la regeneració hepàtica després d'una hepatectomia parcial (13). L'hepatectomia parcial ha estat el model emprat per l'estudi dels canvis proteics associats a la matriu nuclear dependents de les distintes fases dels cicle ceLlular.El fet de que la p55 incrementes paral.lelament a la síntesi d'ADN suggería que fos una proteïna relacionada directament amb la replicació de l'ADN.A causa de l'interès que representa l'estudi dels processos i factors que intervenen en el desenvolupament de la síntesi d'ADN i posterior divisió cel.lular, i atès que es desconeixen les proteïnes que forment part o intervenen en l'estructura interna de la matriu nuclear, l'objectiu d'aquest estudi ha estat la caracterització de la p55. Per tal propòsit s'ha purificat i s'han produït anticossos policlonals contra la p55, amb els quals s'han realitzat estudis immunocitoquímics que han desvetllat la localització nuclear d'aquesta proteïna en el teixit hepàtic regenerant.A partir de la seqüència parcial d'aminoàcids, s'ha obtingut que la p55 presenta una granhomologia amb les queratines, concretament amb la queratina núm. 8.Atès que les queratines són proteïnes de la família de filaments intermedis, descrits comconstituents dels citoesquelet cel.lular i per tant la seva localització és citoplasmàtica i no nuclear, com en el cas de la p55, es plantejaren estudis paral.lels emprant anticossos contra la p55 i contra les queratines.Els estudis realitzats a nivell bioquímic, en teixit hepàtic, semblen indicar que la p55 detectada en la matriu nuclear es tracta de la queratina 8. Ja que el patró de les dues proteïnes és el mateix tant a nivell d'electroforesi bidimensional, com a nivell de fosforil.laciò in vitro i mitjançant immunotransferències emprant els anticossos esmentats anteriorment.Com a conclusió d'aquests resultats es podria afirmar, tal com hem indicat, que les duesproteïnes són la mateixa, si no fos pels resultats obtinguts en els estudis immunocitoquímics emprant l'anticossos anti-p55 i anti-queratines, en els quals s'ha comprovat que la queratina presenta distribució citoplasmàtica i la p55 nuclear.Posteriorment, s'inicià l'estudi de la p55 en distintes línies cel.lulars en cultiu, per poder generalitzar i comprovar els resultats obtinguts en el teixit hepàtic regenerant.S'ha utilitzat la línia cel.lular NRK 44F (cèl.lules normals no epitelials de ronyó de rata).Aquestes cèl.lules resultaven un model d'estudi interessant i comparable amb el de la regeneració hepàtica post-hepatectomia parcial, ja que presenten la capacitat d'ésser activades i sincronitzades en les distintes fases del cicle cel.lular.S'ha analitzat, mitjançant tècniques immunocitoquímiques, la presència de la p55 en aquestes cèl.lules en diferents fases del cicle cel.lular i s'ha observat que, al igual que en el fetge, la p55 es detecta exclusivament en el nucli de les cèl.lules NRK en fase S. L'ànalisi bioquímica ens indica que el patró electroforètic bidimensional de la proteïna detectada en les cèl.lules NRK, és similar al de la p55 de les cèl.lules hepàtiques. Presenta una forma majoritària i distintes isoformes d'igual pes molecular, degudes a diferents graus de fosforil.lació. En canvi, el pes molecular de la proteïna detectada per l'anticòs anti-p55 en aquestes cèl.lules no és de 55 KOa, si no de 62 KOa.Pel que fa a la correlació que hi ha entre la p55 i la citoqueratina 8 en les cèl.lules hepàtiques, és interessant indicar que les cèl.lules NRK 44F no són cèl.lules d'origen epitelial (tipus cel.lular que presenta típicament queratines com a components dels filaments intermedis), són fibroblasts, i aquests presenten vimentina com a component dels filaments intermedis.S'ha comprovat, mitjançant estudis immunocitoquímics i per immunotransferència la composició dels filaments intermedis de les cèl.lules NRK, emprant els anticossos antiqueratina i anti-vimentina. Ja que és conegut que alguns tipus cel.lulars que contenen un únic tipus de filament intermedi, a l'adaptar-se a les condicions de cultiu o degut a factors tumorals (en el cas de línies tumorals), expressen nous tipus de filaments intermedis que coexisteixen amb els originals.Els resultats obtinguts han estat els esperats. Les cèl.lules NRK no presenten queratines, únicament presenten vimentina.També s'ha caracteritzat la p55 en altres tipus cel.lulars com són: les cèl.lules HeLa (cèl.lules d'adenocarcinoma humà), MOCK (cèl.lules epitelials de ronyó de gos), BRL (cèl.lules d'hepatocarcinoma de rata) i cèl.lules 3T3 NIH (fibroblasts de ratolí). En totes aquestes cèl.lules, l'anticòs anti-p55 presenta localització exclusivament nuclear. En canvi s'han observat diferències respecte a la proteïna detectada. En les cèl.lules HeLa i MDCK l'anticòs anti-p55 detecta específicament una proteïna de 55 KOa, igual que en les cèl.lules hepàtiques. Una altra característica comú entre aquestes cèl.lules i les del fetge és que presenten queratines i concretament la queratina 8, com component dels filaments intermedis.En les cèl.lules 3T3 NIH, l'anticòs anti-p55 detecta una proteïna de 60-62 KOa. Aquest resultat coincideix amb l'obtingut en les cèl.lules NRK. Cal destacar que ambdós tipus de cèl.lules són fibroblasts i presenten vimentina com component dels filaments intermedis.Així doncs podem indicar que l'anticòs anti-p55 detecta una proteïna de localització nuclear independentment del tipus cel.lular que es tracti. En canvi en les cèl.lules d'origen epitelial o que contenen queratina 8, la proteïna detectada per l'anticòs presenta 55 KOa de pes molecular i en els fibroblasts o cèl.lules que no contenen queratina la proteïna detectada presenta entre 60-62 KOa.S'ha intentat esbrinar si la proteïna de 62 KOa detectada en els fibroblasts presenta alguna correlació amb la vimentina, com és el cas de la p55 i la queratina 8 en el fetge. Però, a més de presentar distint pes molecular, ja que la vimentina té un pes molecular de 57 KOa, presenten diferent patró electroforètic, així com tampoc s'ha observat que l'anticòs antivimentina reconegui la p55, ni l'anticòs anti-p55 la vimentina, contràriament al que s'observava amb la p55 i la queratina 8 en el fetge.CONCLUSIONS:Com a conclusió final podem dir que la proteïna detectada per l'anticòs anti-p55, encara que no presenti sempre una correlació amb el tipus de filament intermedi típic del tipus cel.lular en estudi, té relació amb els filaments intermedis degut a la seqüència d'aminoàcids que presenta. La proteïna identificada es pot considerar una proteïna estructural de la matriu nuclear implicada en la segregació dels cromosomes durant la divisió cel.lular, ja que els estudis immunocitoquímics realitzats en cèl.lules en mitosi, emprant l'anticòs anti-p55, ens mostren una reacció associada als cromosomes i a vegades seguint el mateix patró que el fus mitòtic.BIBLIOGRAFIA:1- Nelson, W.G.; K.J. Barrack and O.S. Cotfey. 1986. Ann. Rev. Biophys. Chem. 15: 457475.2- Pardoll, O.M.; B. Volgestein and O.S. Coffey. 1980. Cell 19: 527-536.3- Smith, H.C. and R. Berezney. 1982. Biochemestry 21: 6751-6761.4- Smith, H.C. and R. Berezney. 1983. Biochemestry 22: 3042-3046.5- Jackson, O.A. and P.R. Cook. 1986. EMBO J. 5: 1403-1410.6- Berezney, R. and O.S. Cotfey. 1975. Science 189: 291-293.7- Kelly, K.; B.H. Cochram, Ch.O. Stiles and P.Leder. 1983. Cell 35: 603-610.8- Thompson, C.B.; P.B. Challoner, P.E. Neiman and M. Groudine. 1986. Nature 319: 374380.9- Greenberg, M.E. and E.B. Ziff. 1984. Nature 311: 433-438.10- Thompson, N.L.; J.E. Mead, lo Braun. M. Goyette, P.R. Shank and N. Fausto. 1986.Caneer. Res. 46: 3111-3117.11- Serratosa, J.; M.J. Pujol, O. Baehs and E. Carafoli. 1988. 8ioehem. 8iophys. Res.Commun. 150: 1162-1169.12- Tubo, R.A. and R. Berezney. 1987. J. 8iol. Chem. 262: 1148-1154.13- Higgins, G.M. and R.M. Anderson. 1931. Mreh. Pathol. 12: 186-202. / We have identified a protein (p55) with a molecular weight of 55 KDa and pI of 6.2, which was strongly increased in the nuclear matrix of rat liver cells during proliferative activation. This protein is highly insoluble since it could not be solubilized either by detergents or by alkaline extraction. We have obtained three partial amino acid sequences which revealed that p55 has a high homology with cytoqueratins. Polyclonal antibodies raised against p55 were used to carry out Western blot and immunocytochemical studies which indicated that p55 was localized only in the nuclei, specifically in the nuclear matrix. Autoradiographic experiments revealed that not all the cells presenting an increase in p55 incorporated (3H)thymidine, indicating that this protein is not related to DNA replication. Immunocytochemical studies also revealed that during mitosis p55 is localized surrounding the chromosomes and associated with the mitotic apparatus, suggesting that p55 is involved in the separation of chromosomes during cell division.In order to identify the presence of p55 in different cells types, we have also analyzed the antibody against the p55 in NRK (normal rat kidney) cells.Immunocytochemical studies in synchronic NRK cells revealed that the antibody is located specifically in the nuclei of replicative NRK cells. Western blot analysis of NRK cells showed that the protein detected in NRK cells has 62 KDa and 5.2-5.4 pi value. By western blot studies, we have also found that the protein (p62) is present at the same level in different phases of cell cycle, suggesting that the specific reaction detected by imunocytochemistry in replicative cells is due to increase of antigen accessibility or a change of protein conformation.Immunocytochemical studies in others culture cells, HeLa (human cervical adenocarcinome), NIH 3T3 fibroblasts, MDCK (Madin-Darby canine kidney) cells and BRL (rat hepatocarcinome), confirm the nuclear reaction of the antibody.We also show that the protein detected by the antibody from nuclear matrix liver cells is located in the nuclear matrix in all tested cells after extraction of "in vitro" nuclear matrix fraction.Thus, the NRK cells are fibroblasts and their do not have cytokeratins, we can conclude that the antibody against the nuclear matrix from rat liver cells detect a specific protein of nuclear matrix and from all the results we can also suggest that the protein detected would be related with intermediate filaments proteins.

En este trabajo se han realizado estudios sobre el transporte de aminoácidos en vesículas de membrana plasmática de hígado de rata, intentando correlacionar las alteraciones observadas en la captación hepática de aminoácidos "in vivo" con cambios estables en las propiedades cinéticas de los sistemas de transporte estudiadas "in vitro". Se han estudiado tres situaciones experimentales diferentes: ayuno, gestación y lactancia. Posteriormente se han realizado estudios sobre el posible efecto a corto plazo de diversas hormonas (Glucagón, Insulina y Factor de Crecimiento Epidermal "EGF") sobre el transporte de aminoácidos en vesículas de membrana plasmática de hígado de rata.En los resultados expuestos en esta memoria sobre la modulación "in vivo" e "in vitro" de la captación de L-alanina por vesículas de membrana plasmática de hígado de rata, se han observado los siguientes puntos:1. - En la rata, la privación de alimento produce un aumento de la afinidad (Km) y un descenso de la capacidad (Vmax) de los sistemas de transporte de L-alanina. Estos cambios en los parámetros cinéticos están altamente correlacionados con un descenso gradual en la asequibilidad portal de alanina.2. - Durante el ayuno, se producen cambios importantes en la inhibición de la función transportadora por otros aminoácidos naturales. La estrategia utilizada para discernir entre la proporción relativa de los sistemas de transporte en la captación de L-alanina, mediante pruebas con MeAIB y Litio, revelan que estos cambios no parecen ser atribuibles a una modificación en la participación de los sistemas A y ASC en el transporte total de alanina.3. - La fuerte correlación existente entre los cambios de Km y las K(1/2) del efecto inhibidor sobre el transporte de agentes modificadores de grupos -SH, como el NEM o el PCMBS, revelan cambios conformacionales en la(s) molécula(s) transportadora(s). Esta posibilidad es compatible con la presencia de grupos -SH en el centro activo de la proteína o, alternativamente, en dominios muy directamente implicados con la función transportadora.4. - En la gestación y la lactancia, situaciones fisiológicas caracterizadas por un aumento en la captación hepática de aminoácidos "in vivo", se comprueba que los índices de captación de L-a1anina calculados a partir de las medidas de transporte en preparaciones de vesículas de membrana plasmática de hígado, están incrementados en el rango de concentraciones fisiológicas de substrato. No obstante, las adaptaciones realizadas mediante cambios en los parámetros cinéticos en ambas situaciones fisiológicas son diferentes; mientras que en la gestación se detecta un incremento de Vmax, durante la lactancia se observa un descenso de Km, que creemos atribuible a un cambio en la participación relativa de los sistemas A y ASC en el transporte total de este aminoácido a nivel hepático. 5. - El glucagón y el factor de crecimiento epidermal (EGF) ejercen acciones inhibidoras, a muy corto plazo, sobre el transporte de aminoácidos en vesículas de membrana plasmática de hígado de rata. Su acción parece ser específica sobre aquellos transportadores que utilizan al ión sodio como co-substrato del aminoácido, puesto que no se detecta ningún efecto al estudiarse el transporte de L-leucina. El efecto inhibidor de estos péptidos parece realizarse acelerando la disipación del gradiente de sodio a través del "antiporter" Na(+)-H(+), ya que dicho efecto se revierte al ser estudiado en presencia de HMA, un derivado de la amilorida que actúa como inhibidor específico del "antiporter".6. - Dado que en las preparaciones vesiculares utilizadas no existe actividad Na-K ATPasa funcional, podemos concluir que los efectos hormonales observados en nuestras vesículas de membrana plasmática son compatibles con la hipótesis que sugiere que los efectos estimuladores de glucagón y EGF sobre el transporte dependiente de sodio de aminoácidos a nivel hepático, se realizarían mediante la hiperpolarización de la membrana.Debido a los anteriores resultados los factores que determinarían las tasas de captación hepática de aminoácidos "in vivo" serían producto de, al menos, las siguientes adaptaciones: En primer lugar, cambios en los parámetros cinéticos de sistemas transportadores. Estos cambios pueden implicar tanto modificaciones de capacidad total (Vmax) como de afinidad (Km). En este último caso, parece que esta adaptación pueda llevarse a cabo, tanto modificándose la proporción relativa de transporte de los sistemas implicados en la captación de L-alanina, como induciéndose, de forma todavía no conocida, la presencia de formas moleculares que, si bien obedecen a las características bioquímicas descritas para sistemas ya conocidos, actúan con una afinidad distinta hacia el substrato.Por otra parte, en los casos en que se detectan cambios de afinidad hacia el substrato, es esperable y así se comprueba que existan modificaciones en la eficacia inhibidora del transporte dependiente de sodio de L-alanina por parte de otros aminoácidos naturales. Si a este hecho le añadimos la evidencia de que en cada situación fisiológica el patrón de concentraciones de aminoácidos en la vena porta varía, es fácil imaginar que ambos factores, cambio de concentración y de eficacia inhibidora, jugarán un papel importante a la hora de determinar la captación neta "in vivo".Finalmente el contexto hormonal existente en la vena porta juega un papel decisivo en la modulación de la captación neta de aminoácidos "in vivo". Obviamente, este factor no está presente en las preparaciones vesiculares y debe considerarse a la hora de determinar hasta que punto los cambios observados, en los balances hepáticos de aminoácidos "in vivo", pueden ser explicados por modificaciones estables de la cinética de los sistemas responsables de su transporte. / It has been studied the alanine transport in plasma membrane vesicles from rat livers. The studies have been focused on to correlate the changes in hepatic amino acid metabolism "in vivo" with the changes in kinetic values "in vitro". It has been chosen three experimental models: food deprivation, pregnancy and 1actation. Starvation induced a decrease in Km (2.32, 1.60, 1.10 mM) and Vmax (1.86, 1.69, 1.10 pmol Ala/l0s per microgr. protein) for control, fasted 24h and 48h respectively. The Km va1ues have a good relation with the decrease in hepatic availability and with a decrease in the K(l/2) values from sensitivity to sulfhydryl specific reagents such as NEM and PCMBS. Studies with Li and MeAIB show that the proportion of A and ASC systems not change during starvation. This results suggest that it can exist changes in conformational status of transport proteins. In the studies with late pregnant rats, it has been found a light increase in Vmax values (1.7 vs 2.0 pmol Ala/l0s per microg. protein) without changes in Km (2.3 vs 1.8 mM) for virgin and pregnant rats respective1y. The alanine utilization rates, as calculated from plasma membrane enzyme marker recoveries, were enhanced in the physiological range of alanine concentration in blood.Kinetic parameters of alanine transport were measured in plasma membrane vesicles from livers of 15 days lactating rats. Lactation induced 10w Vmax and Km va1ues of the sodium dependent alanine component of transport (1.8 vs 1.3 pmol A1a/10s per microgr. protein and 2.3 vs 1.2 mM, respectively). At the same way than late pregnant rats the alanine utilization rates were enhanced. The decrease of Km values seen to be atributable to a greater contribution of system A to the total Na+-dependent alanine transport as deduced from less tolerance to lithium substitution instead Na, a greater inhibition of alanine transport by saturating amounts of MeAIB y proline, and higher sensitivity to NEM and PCMBS. Finally, it has been studied the hormonal short-term effects of glucagon and EGF on sodium dependent alanine transport in plasma membrane vesicles from rat liver. The resu1ts suggest that the hormone action on Na+ dependent amino acid transport is modifying the sodium electrochemical flux through the Na+-H+ antiporter. This hipothesis is based from studies on selective inhibition of antiporter activity.

El trasplante hepático es el tratamiento de elección en pacientes con hepatopatías en fase terminal. En la actualidad puede ofrecerse con esta terapéutica una supervivencia a los tres años que oscila entre el 60 y el 80%. Una vez superados los problemas de técnica quirúrgica y reanimación, los factores que pueden limitar el éxito del trasplante hepático son la presencia de rechazo y la aparición de infecciones. Se han buscado métodos para diagnosticar con prontitud el rechazo y se han tratado de encontrar factores que pudieran servir de predicción del rechazo. La gran variabilidad de los resultados y en otros casos la sofisticación de las técnicas o de la infraestructura necesaria para aplicarlas ha hecho que no se hayan adoptado de manera sistemática para diagnosticar el rechazo, Por otra parte la similitud que desde el punto de vista semiológico y bioquímico, presentan otras situaciones clínicas distintas del rechazo, hace que sea necesario asegurar el diagnóstico. Esto es particularmente importante, porque el aumento de los niveles de inmunosupresión puede aumentar el riesgo o la susceptibilidad de los pacientes frente a los agentes infecciosos, fundamentalmente víricos. La rapidez con que se inicia la administración de dosis crecientes de fármacos inmunosupresores puede ser vital a la hora de controlar el rechazo, pero también puede aumentar innecesariamente el riesgo de infección si en realidad el problema que presenta el paciente es otro. Estos precedentes, han acentuado la necesidad de obtener una biopsia hepática antes de iniciar el tratamiento. Sin embargo en situaciones especiales el tiempo que puede tardarse en "leer" la biopsia puede significar perder un tiempo precioso durante el cual el rechazo puede progresar. Con estas premisas se ha realizado una hipótesis de trabajo que pretende conocer si hay algunas alteraciones en los parámetros bioquímicos de función hepática o en otras variables que sean un índice seguro de rechazo, y asimismo conocer si existen datos en el donante o en el receptor que sirvan de predicción del rechazo. Esta tesis pretende a su vez concretar en una ecuación matemática la posibilidad de que una disfunción hepática sea un rechazo y establecer grupos de riesgo de presentar un rechazo a lo largo del tiempo. El estudio se realizó en los 100 primeros trasplantes realizados en el Hospital Clínic de Barcelona, entre junio de 1988 y Octubre de 1990. El seguimiento medio era de 11±8 meses, con un máximo de 30 meses y un mínimo de 3 meses. El 50% de los pacientes había superado los 10 meses de seguimiento. El estudio analiza el primer episodio de disfunción hepática tras el trasplante. Para el diagnóstico de rechazo se utilizaron criterios clínicos bioquímicos e histológicos. La biopsia fue considerada como el único criterio determinante para el diagnóstico de rechazo, e imprescindible para que el caso fuera incluido en el estudio. De esta manera quedaron configurados dos grandes grupos. El primero constituido por aquellos trasplantes en los que la biopsia mostró la existencia de un rechazo, y el segundo por los que la biopsia no demostró la presencia de un rechazo. A partir de este dato se recogió de cada trasplante una serie de variables obtenidas antes, durante o después del trasplante que fueron agrupados en las denominadas Variables Relacionadas con el donante, Variables Relacionadas con el Receptor, Variables relacionadas con el episodio de Rechazo y Variables que correlacionan Donante y Receptor. En total se han analizado en cada trasplante 33 variables. El estudio estadístico se realizó mediante un análisis bivariante con la variable dependiente Rechazo y las otras variables del donante y del receptor, seguidas de una regresión logística para identificar los parámetros con significación pronóstica independiente. Asimismo se analizó la probabilidad de presentar un rechazo a Jo largo del tiempo mediante la comparación de curvas de supervivencia mediante los test de Brelow y Mantel-Cox. Los resultados obtenidos permitieron contestar a modo de conclusión las preguntas planteadas en la hipótesis de trabajo: 1.- ¿Existen algunas alteraciones en los parámetros bioquímicos de función hepática o en otras "aria bies que se desprenden del estudio del donante y del receptor que sean un índice seguro de diagnóstico de rechazo? Sí. El estudio realizado permitió separar dos tipos de pacientes en función de la presencia o no de rechazo. El análisis entre los dos grupos demostró que existían algunas diferencias entre ellos que eran significativas desde el punto de vista estadístico. Después de realizar el estudio bivariable se han determinado unos puntos de corte de cada variable que con el estudio estadístico ofrecen una sensibilidad y especificidad alta con una probabilidad de diagnosticar correctamente entre el 81% y el 87% de los pacientes. Tras este estudio se realizó un estudio multivariable en el que se introdujeron las variables que habían resultado significativas en el estudio univariable y otras que razonablemente podían estar implicadas desde el punto de vista médico. En el modelo final resultaron ser significativas cuatro variables, tres de ellas cuantitativas como son el valor de bilirrubina, el valor de Gammaglutamiltranspeptidasa y la edad del receptor y una cualitativa que fue la compatibilidad entre donante y receptor a nivel del "locus" B del Complejo Mayor de Histocompatibilidad. 2.- ¿Existen algunos datos obtenidos del estudio del receptor que puedan servir de predicción de la aparición de un rechazo a lo largo del tiempo? Sí. El interés de esta tesis se centraba no sólo en el análisis del rechazo a partir del momento de su aparición sino también en considerar si existían factores que sirvieran de predicción de la aparición del rechazo. Estos factores se han definido en este estudio tras la realización de curvas de supervivencia. El único factor dependiente del receptor que tienen capacidad de predicción de la aparición del rechazo en nuestros trasplantes es el Diagnóstico por el que se indica el Trasplante. A través del estudio estadístico realizado se pudo establecer una gradación de mayor a menor rechazo en función del diagnóstico. Los pacientes con un trasplante realizado por una Insuficiencia Hepática Aguda, tienen una mayor incidencia de rechazo agudo. Este hecho no es dependiente de la compatibilidad ABO. La necesidad acuciante de un órgano hace que en estos pacientes no se respete la compatibilidad sanguínea. Por esta razón se podía suponer que este grupo de pacientes el rechazo agudo era una consecuencia de la trasgresión de la compatibilidad ABO. Esto no es así porque el número de pacientes con ABO incompatible es insignificante. Por otra parte se ha podido observar que los pacientes con Cirrosis de etiología alcohólica tienen una menor probabilidad de presentar un rechazo a lo largo del tiempo, significativamente menor que el que presentan los pacientes con Cirrosis de etiología no alcohólica como son las criptogenéticas o las post-hepáticas. 3.- ¿Existen algunos dalos obtenidos del estudio del donante que puedan servir de predicción de la aparición de un rechazo a lo largo del tiempo? Sí. Al igual que en la pregunta anterior de la hipótesis se han calculado curvas de supervivencia de cada parámetro hasta el momento en que los pacientes han presentado un rechazo. Se han encontrado dos parámetros dependientes del estudio del donante que podrían servir de predicción de la aparición de un rechazo, y que son el sexo del donante y también el tipo de Solución de Preservación utilizado. Los trasplantes realizados con donantes de sexo femenino tienen un tiempo libre de rechazo significativamente mayor que los de sexo masculino. Del mismo modo, los órganos preservados con el método que hemos denominado combinado tienen un mayor tiempo libre de rechazo que los preservados con Solución de Eurocollins o Solución de Wisconsin aisladas. 4.- ¿Podría concretarse en una ecuación matemática la probabilidad de que una determinada disfunción hepática, en un determinado receptor al que se le ha trasplantado un determinado hígado fuera un rechazo? Sí. Para contestar a esta pregunta planteada en la hipótesis hemos utilizado las variables que demostraren capacidad pronostica independiente para diagnosticar el rechazo. Los resultados se han concretado en la siguiente ecuación en la cual se tienen en cuenta estas variables en función de los puntos de corte y de los coeficientes de regresión: e(2.9971+edadx(-0.19868)+ MMBx2.7666 +Bix4.5203+GPTx5.6646) PROB= ----------------------------------------------------------------------------------------------- 1+e(2.9971+edadx(-0.19868)+MMBx2.7666+Bix4.5203+GPTx5.6646) Esta ecuación ofrece según el cálculo de probabilidades un valor global de alrededor del 90%. Se ha validado en un grupo de enfermos pertenecientes a la misma Unidad distintos de la serie inicial de 100 Trasplantes. Se han considerado tanto los primeros episodios como los segundos o terceros episodios de disfunción hepática. Los resultados obtenidos tras la validación demuestran que con esta ecuación es posible diagnosticar correctamente las tres cuartas partes de los episodios de disfunción hepática que aparecen tras el trasplante. 5.- ¿Sería posible establecer distintos grupos de riesgo de presentar un rechazo a lo largo del tiempo, en función de parámetros obtenidos del estudio del donante y del receptor? Sí. El estudio multivariable que se realizó con todos los factores significativos demostró que existía como único factor pronóstico independiente, el diagnóstico con el que se había realizado la indicación del trasplante. Existía una clara gradación en el sentido de que los pacientes con trasplante por Insuficiencia Hepática Aguda tienen un mayor probabilidad de presentar un rechazo o sea tienen un menor tiempo libre de rechazo. A continuación el grupo de las Enfermedades de predominio Colestásico constituidas en su mayor parte por Cirrosis Biliares Primarias. En tercer lugar se situaron los pacientes con Enfermedades de predominio hepatocelular en el que estaban incluidos los pacientes con cirrosis de variada etiología. Por último, como grupo en el que existe un mayor tiempo libre de rechazo están los pacientes con una hepatopatía alcohólica. Este hecho es un punto que debe unirse a las consideraciones éticas que se han invocado para que el grupo de los pacientes alcohólicos no sea discriminado a la hora de indicar un trasplante hepático. / Rejection is one of the most important problems alter liver transplantation (OLT).The aim of the present study was to evaluate the possibility of diagnosis of rejection only by biochemical parameters. Besides to study different preoperative and postoperative factors that may influence in the incidence of rejection episodes. MATERIAL AND METHODS: From June 1988 to October 1990, 82 OLT were performed. 66p were male and 16 female. Triple therapy immunosuppresive regimen was used (Cyclosporine, Azathioprine and Prednisone). During the follow-up period, 89 fine-needle aspiration biopsies were performed due to liver graft dysfunction episodes. Variables considered were: Liver Function tests, donor and recipient age, sex, CMV status, ABO compatibility, HLA mismatch, Crossmatch, preservation solution, and indication for OLT (hepatocellular, cholestatic, fulminant hepatic failure , and retransplantation, Statistical Analysis: Univariate and Multivariate Methods (proportional hazard model with co-variates) were used. Only the first liver dysfunction episode was considered. According to histologic findings the samples were divided in Group 1: rejection present (60), Group 2: No signs of rejection (22). Median follow up was of 10 months (range from 3 to 28). RESULTS: Patients with rejection episodes significantly differed in the value of: Bilirrubín >2.5 mg%, AST>701.U, age (inverse related) and mismatch B. Regression model was used and applied in a formula where the above variables were considered. Overall diagnosis sensibility and specificity was around 75%. Incidence of rejection was equally distributed with respect to donor age (26.3 vs. 25.3) and recipient age (44.9 vs. 48.6) Patients without sex mismatch rejected in 54.7%, while patients with sex mismatch rejected in 45.2%. Donor/recipient CMV+/- did not influence on rejection. A total of 6 positive crossmatch were detected, only one in the group of no rejection episodes. With respect to HLA mismatch, most of our patients had 5 or 6 MM (55). Finally patients with alcoholic cirrhosis had a low incidence of rejection (5 out of 14). Multivariate analysis confirmed the predictive value of the type of cirrhosis on the incidence of rejection (X2=7.7, p<0.005). CONCLUSION: Using the formula here in proposed the possibility to diagnose rejection episodes over 75%. Out of the preoperative risk factors studied we have found that only patients with alcoholic cirrhosis have demonstrated a low risk for rejection.