Submitted by Fabio Sobreira Campos da Costa (fabio.sobreira@ufpe.br) on 2016-04-12T12:01:04Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Tese de doutorado PDF - André Oliveira - BIBLIOTECA - FINAL.pdf: 2740688 bytes, checksum: 0e20c861826941b8e9247f2b85f35963 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-12T12:01:04Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Tese de doutorado PDF - André Oliveira - BIBLIOTECA - FINAL.pdf: 2740688 bytes, checksum: 0e20c861826941b8e9247f2b85f35963 (MD5) Previous issue date: 2015-10-29 / CAPEs / Indivíduos que são expostos a uma deficiência nutricional durante o desenvolvimento perinatal tem, uma vez atingida a idade adulta, um aumento do risco de desenvolvimento de obesidade, diabetes tipo 2 e doenças cardiovasculares, quando comparado a indivíduos da mesma idade com nutrição balanceada. Aqui nós exploramos se a restrição proteica perinatal age na capacidade de sincronização de fibroblastos de ratas e suas respectivas proles. Dietas com baixo teor de proteínas (8 g%) e normoprotéica (20 g%) foram ofertadas a ratas durante a gestação e lactação. O ritmo circadiano de consumo alimentar e glicemia dos animais controles e desnutridos durante a gestação e lactação de mães desnutridas e controles foi registrado. A cultura de fibroblastos proveniente da cauda dessas ratas e suas respectivas proles foram submetidas a um choque sérico para reinduzir as oscilações dos transcritos bmal1, per1 e per2. A expressão gênica relativa desses transcritos foi analisada por PCRq. A curva dos níveis de glicose sanguínea total das mães desnutridas durante a gestação foi significativamente menor do que o período antes da gestação, sem apresentar, porém, alterações do ritmo de consumo alimentar. Os fibroblastos das mães desnutridas exibiram diferenças significativas nos níveis de expressão de bmal1 no ZT6 e ZT18 em relação aos controles. Em contrapartida, os fibroblastos dos embriões desnutridos foram afetados pela desnutrição proteica durante o período perinatal para o per1 no ZT0 e ZT24 e para o per2 no ZT24. Além disso, foi visto que as proles não possuíam os mesmos ritmos de expressão gênica desses transcritos em relação a suas mães, tanto durante o período embrionário como também após 14 dias do desmame, exceto para o gene per2, que apresentou oscilações semelhantes entre os embriões e suas respectivas mães. Nossos resultados mostram que estas respostas perinatais e pós-natais refletem a plasticidade do desenvolvimento e as "decisões" feitas pela prole para otimizar o seu próprio desenvolvimento, mas com consequências duradouras. / Les individus qui sont exposés à une carence nutritionnelle pendant le développement périnatal, présentent à l'âge adulte, un risque plus élevé de développer de l'obésité, un diabète de type 2 et des maladies cardiovasculaires par rapport aux personnes du même âge avec une alimentation équilibrée. Ici, nous étudions si une restriction protéique périnatale agit sur la capacité de synchronisation des fibroblastes de rates et sur leur descendance. Les régimes à faible teneur en protéines (8 g%) et à teneur normale (20 g%) ont été offerts à des rats femelles pendant la grossesse et l'allaitement. Le rythme circadien de la prise alimentaire et de la glycémie des animaux témoins et en restriction protéique pendant la grossesse et la lactation malnutrition des mères correspondantes ont été enregistrés. Des fibroblastes, provenant de l'extrémité caudale de ces rates et de leur progéniture ont été établis en culture primaire et soumis à un choc de sérum pour ré-induire les oscillations de la transcription de bmal1, per1 et per2. L'expression génique relative de ces transcrits a été analysée par Réaction en Chaîne par Polymérase quantitative (sigle anglais qPCR). La courbe des taux du glucose sanguin total des mères en restriction protéique pendant la grossesse était significativement inférieur à celui d'avant la grossesse, sans montrer, cependant, des altérations dans le rythme de la prise alimentaire. Les fibroblastes de mères en restriction protéique ont montré des différences significatives dans les niveaux d'expression de bmal1 à 6 après synchronisation (ZeitGeber Time6 ; ZT6) et à ZT18 par rapport aux témoins. En revanche, les fibroblastes des embryons en restriction protéique montraient des différences significatives pour la per1 à ZT0 et ZT24 et pour per2. Il a été également constaté que les fibroblastes de la progéniture n'avaient pas les mêmes rythmes de l'expression des gènes de ces transcriptions par rapport à leurs mères, à la fois pendant la période embryonnaire ainsi que après 14 jours de sevrage, sauf pour le gène de per2, qui présentait des oscillations similaires entre les embryons et de leurs mères. Nos résultats montrent que ces réponses périnatales et postnatales reflètent la plasticité du développement et des «décisions» des descendants de première génération afin d'optimiser leur propre développement, et ce, avec des conséquences durables.

Trabajo de Investigación Requisito para optar al Título de Cirujano Dentista / ANTECEDENTES: El envejecimiento de un organismo trae consigo diversas repercusiones a nivel sistémico, entre ellas, la disminución de la capacidad reparativa de los tejidos. En el tejido conectivo sano, los fibroblastos se encuentran en estado de reposo y presentan una baja actividad mitótica y biosintética, sin embargo, al producirse una injuria son capaces de incrementar su tasa proliferativa para participar de la respuesta reparativa. En una herida aguda, los factores de crecimiento y quimioquinas liberadas por las plaquetas estimulan directamente a los fibroblastos residentes, un ejemplo de esto, es la acción mitogénica que tiene el factor de crecimiento derivado de las plaquetas sobre los fibroblastos. El suero sanguíneo contiene una gran variedad de estos factores de crecimiento capaces de inducir la proliferación, sin embargo, no se conoce el efecto del envejecimiento sobre este proceso. OBJETIVO: Cuantificar la proliferación de fibroblastos gingivales humanos jóvenes incubados con suero sanguíneo de 3 grupos: “jóvenes” (18-22 años), “mediana edad” (30-48 años) y “envejecidos” (50-65 años) mediante inmunofluorescencia para Ki-67 y citometría de flujo para síntesis de ADN. Evaluar las concentraciones de factor de crecimiento derivado de plaquetas presentes en los sueros de los distintos grupos mediante ensayo ELISA. RESULTADOS: En este trabajo logramos determinar un aumento de la proliferación de los fibroblastos gingivales al ser incubados con suero de voluntarios jóvenes, no así al ser incubados con suero de voluntarios de mediana edad o envejecidos. Esto se evaluó por medio de marcaje para Ki-67 en el núcleo y por síntesis de ADN evaluado por citometría de flujo. Además, los niveles del factor de crecimiento derivado de plaquetas fueron significativamente mayores en el suero proveniente de donante joven versus el suero proveniente de donante envejecido. CONCLUSIÓN: El suero de voluntarios de una mediana edad en adelante, produce una disminución en la proliferación de fibroblastos gingivales humanos. Tanto la proliferación en células incubadas con suero de voluntarios envejecidos como los niveles de factor de crecimiento derivado de plaquetas disminuyen con la edad. / Adscrito a Proyecto FONDECYT 111400064 "Crosstalk between gingival fibroblast and macrophages in wound healing during aging" (MC)

Memoria para optar al Título Profesional de Químico Farmacéutico / Los fibroblastos cardiacos (FC) actúan como células centinelas del corazón, ya que responden ante cualquier elemento interno o externo que afecte la homeostasis del sistema. Entre ellos, uno de los más estudiados es el lipopolisacárido bacteriano (LPS), capaz de desencadenar una respuesta inflamatoria, caracterizada por: activación de vías proinflamatorias, producción de citoquinas y factores de crecimiento, expresión de proteínas de adhesión como ICAM-1 y VCAM-1, que permiten el reclutamiento e infiltración de células del sistema inmune, entre otros, con el fin de reparar el daño. La Resolvina E1 (RvE1) es un mediador pro-resolutivo especializado (SPM), proveniente del ácido eicosapentaenoico (EPA) al que recientemente se le han atribuido propiedades antiinflamatorias, provocando el cese o inhibición del reclutamiento de células del sistema inmune, sin embargo, en FC no existe evidencia de su actividad. El objetivo de este trabajo fue identificar los efectos que la RvE1 provocaba en FC, con el fin de esclarecer si era capaz de disminuir la adhesión de células mononucleares de bazo (SMC) al disminuir los niveles de expresión de ICAM-1 y VCAM-1, inducidas por LPS; no sin antes demostrar que por sí solas no modificaban las condiciones basales del organismo. Es decir, RvE1 no presenta citotoxicidad, pero disminuye la proliferación de FC, tampoco fue capaz de proteger frente a condiciones de isquemia/reperfusión. Sin embargo, no provocó cambios en los niveles de expresión basales de ICAM-1 y VCAM-1 por sí sola, pero al pre-incubar FC con RvE1 y luego estimularlos con LPS, los niveles de expresión de ICAM-1 y VCAM-1 mostraron una marcada tendencia a disminuir, y como consecuencia de ello, se observó una significativa disminución de la adhesión de SMC a FC. Estos resultados permiten deducir que RvE1 si posee propiedades resolutivas en FC, participando activamente en el cese del reclutamiento de células del sistema inmune / Cardiac fibroblasts (CF) act as sentinel cells of the heart, as they respond to any internal or external element that affects the homeostasis of the system. Among them, one of the most studied is the bacterial lipopolysaccharide (LPS), capable of triggering an inflammatory response, characterized by: activation of proinflammatory pathways, production of cytokines and growth factors, expression of adhesion proteins such as ICAM-1 and VCAM -1, which allow the recruitment and infiltration of cells of the immune system, among others, in order to repair the damage. Resolvin E1 (RvE1) is a specialized pro-resolutive mediator (SPM), derived from eicosapentaenoic acid (EPA), which has recently been attributed anti-inflammatory properties, causing the cessation or inhibition of the recruitment of cells of the immune system, however, in FC not there is evidence of its activity. The objective of this work was to identify the effects that the RvE1 caused in FC, in order to clarify if it was able to decrease the adhesion of spleen mononuclear cells (SMC) by decreasing the expression levels of ICAM-1 and VCAM-1, induced by LPS; not without first demonstrating that by themselves they did not modify the basal conditions of the organism. In other words, RvE1 does not present cytotoxicity, but decreases the proliferation of FC, nor was it able to protect against ischemia / reperfusion conditions. However, it did not cause changes in the basal expression levels of ICAM-1 and VCAM-1 by themselves, but by pre-incubating FC with RvE1 and then stimulating them with LPS, the expression levels of ICAM-1 and VCAM-1 showed a marked tendency to decrease, and as a consequence, a significant decrease in the adhesion of SMC to FC was observed. These results allow to deduce that RvE1 does have resolutive properties in FC, participating actively in the cessation of the recruitment of cells of the immune system / FONDECYT N° 1130300 y 1170425

Memoria para optar al Título Profesional de Químico Farmacéutico / El fibroblasto cardíaco (FC) es la célula encargada de la homeostasis de la matriz extracelular (MEC), cumpliendo un rol estructural en el tejido cardíaco. Además, participan en el proceso inflamatorio aportando con citoquinas y quimioquinas; y también de esta forma participan en la homeostasis. El FC es capaz de expresar moléculas de adhesión celular como por ejemplo ICAM-1 y VCAM-1 lo que favorece la respuesta inflamatoria y el reclutamiento de leucocitos. Se conoce que Angiotensina II (ANG II) es un fuerte inductor de respuestas inflamatorias, pero se desconoce si en FC aumenta ICAM-1 y VCAM-1. La Resolvina E1 (RvE1) es un mediador lipídico que participa activamente en la resolución de la inflamación, y se desconoce si la RvE1 modula las respuestas inflamatorias inducidas por ANG II. El objetivo de este trabajo fue estudiar las vías transduccionales que son activadas por un estímulo proinflamatorio como la ANG II y un estímulo proresolutivo como la RvE1, determinando además su rol como moduladores de la expresión de proteínas de adhesión en el FC. Se demostró que tanto ANG II como RvE1 activan la vía transduccional ERK1/2 y que RvE1 modula la actividad de ésta frente al estímulo de ANG II. Igualmente se evidenció que ANG II aumentó la expresión de ICAM-1 y que el pretratamiento con RvE1 disminuye este efecto de ANG II sobre el FC, lo cual se tradujo en la disminución de la adhesión de monocitos derivados del bazo (SMC) a FC inducida por ANG II. Los resultados de este trabajo sugieren que ANG II induce la adhesión de SMC a FC a través de ICAM-1, lo cual fue prevenido por RvE1 mediante la modulación de la actividad enzimática de ERK1/2 / RESOLVINA-E1 PREVENTS THE INCREASE OF ICAM-1 INDUCED BY ANGIOTENSIN II IN CARDIAC FIBROBLASTS Cardiac fibroblast (FC) is the cell responsible for the homeostasis of the extracellular matrix (ECM), fulfilling a structural role in cardiac tissue. In addition, they participate in the inflammatory process contributing with cytokines and chemokines; and also in this way they participate in homeostasis. FC is capable of expressing cell adhesion molecules such as ICAM-1 and VCAM-1, which favors the inflammatory response and leukocyte recruitment. It is well known that Angiotensin II (ANG II) is a strong inducer of inflammatory responses, but it is unknown if in FC increases ICAM-1 and VCAM-1. Resolvin E1 (RvE1) is a lipid mediator that actively participates in the resolution of inflammation, and it is unknown whether RvE1 modulates the inflammatory responses induced by ANG II. The objective of this work was to study the transduction signalling pathways that are activated by a proinflammatory stimulus such as ANG II and by a proresolutive stimulus such as RvE1, also determining its role as modulators of the expression of cell adhesion protein in the FC. We show that both ANG II and RvE1 activate the transduction pathway ERK1/2 and that RvE1 modulates its activity against the stimulation of ANG II. We also shows that ANG II increased the expression of ICAM-1 and that pretreatment with RvE1 decreased this effect of ANG II on FC, which translated into a decrease in the adhesion of monocytes cells derived from the spleen (SMC) to FC induced by ANG II. The results of this work suggest that ANG II induces the adhesion of SMC to FC through ICAM-1, and RvE1 prevented this effect by modifying the enzymatic activity of ERK1/2

Resumo O laser operando em baixa intensidade tem sido utilizado em tratamentos odontológicos visando melhorar a regeneração e cicatrização de tecidos. Com o objetivo de analisar o efeito desse laser na proliferação de fibroblastos gengivais “in vitro", desenvolvemos uma linhagem primária a partir de fragmentos de gengiva. Trabalhamos em um modelo de estudo “in vitro" no qual cultivamos os fibroblastos em condição de déficit nutricional parcial (meio de cultivo DME com 5% de soro fetal bovino), simulando uma situação de estresse celular. Foram feitos 3 experimentos distintos, para todos utilizamos um diodo-laser de 664 nm. Para o experimento 1, células LMF foram plaqueadas em placas de Petri e após 24 horas as placas foram divididas em 4 grupos, irradiados com potência fixa de 56 mW, mas variando a fluência: 2 J/cm2, 5 J/cm2, 10 J/cm2 e 15 J/cm2. Para o experimento 2, células LMF foram plaqueadas em placas de Petri e após 24 horas as placas foram divididas em 2 grupos, irradiados com fluência fixa de 2 J/cm2, mas variando a potência: 28 mW e 56 mW. Para o experimento 3, células LMF foram plaqueadas em placas de Petri e após 24 horas as placas foram divididas em 5 grupos, irradiados com potência fixa de 56 mW, fluência fixa de 2 J/cm2, mas variando o tipo de emissão: contínua, ou intermitente com freqüências de: 10 Hz, 60 Hz, 120 Hz e 180 Hz. Foram feitas 4 irradiações, a cada 12 horas. Células que estavam em concentração de 5% de SFB e irradiadas mostraram crescimento mais acelerado em todos os grupos estudados. No experimento 1 obtivemos: células irradiadas com diferentes doses apresentaram proliferação semelhante; sendo melhores resultados para os grupos irradiados com fluência de 2 J/cm2. No experimento 2: células irradiadas com irradiância diferentes apresentaram melhores resultados para potências maiores. No experimento 3: células irradiadas com emissão contínua apresentaram maior proliferação que aquelas irradiadas com laser intermitente, sendo que quanto maior a freqüência, maior a proliferação celular. Menores doses de laser aumentaram mais a proliferação de fibroblastos; menor tempo de exposição resultou em mais alta proliferação celular; o laser emitido no modo contínuo apresentou melhores resultados em termos de proliferação que o laser intermitente, sendo que para o laser pulsado, quanto maior a freqüência, melhores resultados que freqüências menores. / Abstract The low level laser therapy (LLLT) has been used to improve wound healing. In order to verify the effect of LLLT on the in vitro proliferation of gingival fibroblasts we worked with primary culture of human gingival fibroblasts. The cell line used was LMF which grown in Dulbecco’s Modified Eagle’s medium (DME) with 5% (nutritional deficit) of fetal bovine serum (fbs) in order to simulate a cellular stress condition. Laser irradiation was carried out with diode laser with wavelength at 664 nm in three conditions. At first, we kept the output power stable at 56 mW, and set the total energy applied at 2, 5, 10 and 15 Joules. Then, the energy was set at 2 Joules and we worked with power output at 56 mW and 28 mW. At last, with the energy set at 2 Joules and the power output at 56 mW, we worked with the laser emitting in CW and pulsed modes (setting the frequencies at 10, 60, 120 and 180 Hz). We found that in the first part of the experiment (stable output power and different energy applied), the best results were achieved for the total deposited energy of 2 Joules. The conclusion for the second part (energy set at 2 Joules and different output power) was that the best results were achieved when using the highest output power. The conclusion for the last part (energy set at 2 Joules, output power set at 56mW and CW or Pulsed modes at different frequencies) was that CW mode presented the best results, and for the Pulsed mode, the highest frequency presented the best results. A lower energy rate improves in vitro fibroblasts proliferation, a lower laser exposure time results in higher proliferation and laser emitting on CW mode present best results in terms of proliferation than pulsed laser, and when pulsed lasers are being used high frequencies are better than low frequencies.

Resumo O laser operando em baixa intensidade tem sido utilizado em tratamentos odontológicos visando melhorar a regeneração e cicatrização de tecidos. Com o objetivo de analisar o efeito desse laser na proliferação de fibroblastos gengivais “in vitro”, desenvolvemos uma linhagem primária a partir de fragmentos de gengiva. Trabalhamos em um modelo de estudo “in vitro” no qual cultivamos os fibroblastos em condição de déficit nutricional parcial (meio de cultivo DME com 5% de soro fetal bovino), simulando uma situação de estresse celular. Foram feitos 3 experimentos distintos, para todos utilizamos um diodo-laser de 664 nm. Para o experimento 1, células LMF foram plaqueadas em placas de Petri e após 24 horas as placas foram divididas em 4 grupos, irradiados com potência fixa de 56 mW, mas variando a fluência: 2 J/cm2, 5 J/cm2, 10 J/cm2 e 15 J/cm2. Para o experimento 2, células LMF foram plaqueadas em placas de Petri e após 24 horas as placas foram divididas em 2 grupos, irradiados com fluência fixa de 2 J/cm2, mas variando a potência: 28 mW e 56 mW. Para o experimento 3, células LMF foram plaqueadas em placas de Petri e após 24 horas as placas foram divididas em 5 grupos, irradiados com potência fixa de 56 mW, fluência fixa de 2 J/cm2, mas variando o tipo de emissão: contínua, ou intermitente com freqüências de: 10 Hz, 60 Hz, 120 Hz e 180 Hz. Foram feitas 4 irradiações, a cada 12 horas. Células que estavam em concentração de 5% de SFB e irradiadas mostraram crescimento mais acelerado em todos os grupos estudados. No experimento 1 obtivemos: células irradiadas com diferentes doses apresentaram proliferação semelhante; sendo melhores resultados para os grupos irradiados com fluência de 2 J/cm2. No experimento 2: células irradiadas com irradiância diferentes apresentaram melhores resultados para potências maiores. No experimento 3: células irradiadas com emissão contínua apresentaram maior proliferação que aquelas irradiadas com laser intermitente, sendo que quanto maior a freqüência, maior a proliferação celular. Menores doses de laser aumentaram mais a proliferação de fibroblastos; menor tempo de exposição resultou em mais alta proliferação celular; o laser emitido no modo contínuo apresentou melhores resultados em termos de proliferação que o laser intermitente, sendo que para o laser pulsado, quanto maior a freqüência, melhores resultados que freqüências menores. / Abstract The low level laser therapy (LLLT) has been used to improve wound healing. In order to verify the effect of LLLT on the in vitro proliferation of gingival fibroblasts we worked with primary culture of human gingival fibroblasts. The cell line used was LMF which grown in Dulbecco’s Modified Eagle’s medium (DME) with 5% (nutritional deficit) of fetal bovine serum (fbs) in order to simulate a cellular stress condition. Laser irradiation was carried out with diode laser with wavelength at 664 nm in three conditions. At first, we kept the output power stable at 56 mW, and set the total energy applied at 2, 5, 10 and 15 Joules. Then, the energy was set at 2 Joules and we worked with power output at 56 mW and 28 mW. At last, with the energy set at 2 Joules and the power output at 56 mW, we worked with the laser emitting in CW and pulsed modes (setting the frequencies at 10, 60, 120 and 180 Hz). We found that in the first part of the experiment (stable output power and different energy applied), the best results were achieved for the total deposited energy of 2 Joules. The conclusion for the second part (energy set at 2 Joules and different output power) was that the best results were achieved when using the highest output power. The conclusion for the last part (energy set at 2 Joules, output power set at 56mW and CW or Pulsed modes at different frequencies) was that CW mode presented the best results, and for the Pulsed mode, the highest frequency presented the best results. A lower energy rate improves in vitro fibroblasts proliferation, a lower laser exposure time results in higher proliferation and laser emitting on CW mode present best results in terms of proliferation than pulsed laser, and when pulsed lasers are being used high frequencies are better than low frequencies.

Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico / El daño ocasionado por la ocurrencia de un infarto cardiaco es complejo, generando la pérdida de viabilidad de las células cardiacas entre otros efectos deletéreos ocurridos tanto en el periodo isquémico de falta de oxígeno y nutrientes, así como también en la posterior reperfusión sanguínea. Frente a esta condición patológica los fibroblastos cardiacos (FC) son capaces de reaccionar, secretando y renovando la matriz extracelular; lo que los convierte en elementos celulares claves en la cicatrización y remodelamiento del tejido cardiaco dañado post-infarto al miocardio. Esto hace necesario el intentar regular la viabilidad de estas células para una correcta cicatrización y mantención de la función cardiaca. En relación a esto se ha reportado el efecto cardioprotector ejercido por el empleo de LPS en condiciones de daño celular causado por isquemia/reperfusión (I/R). Sin embargo, dicho efecto ha sido descrito principalmente en cardiomiocitos, por lo que su efecto en FC es aún desconocido. Nuestro trabajo estudió la capacidad cito-protectora ejercida por LPS sobre FC de ratas neonatas sometidos a un modelo de I/R in vitro e indagó las vías transduccionales implicadas en este efecto. El tratamiento de los FC con LPS (1 μg/mL) durante la isquemia y reperfusión previno la pérdida de viabilidad inducida por I/R. Sin embargo, en el pre-condicionamiento con LPS durante 24 o 16 h, y en el tratamiento con LPS durante la isquemia o reperfusión, no se observó el efecto cito-protector. En esta misma línea, demostramos que el efecto cito-protector ejercido por LPS es mediado a través del receptor TLR4 vía PI3K/Akt y ERK1/2, ya que el empleo de TAK-242, Ly29002 y PD98059, inhibidores del receptor y de las vías transduccionales respectivamente, bloquearon completamente el efecto cito-protector. La activación de TLR4 por LPS previno, además, el procesamiento de la procaspasa 8 y 3 inducido por I/R. Conjuntamente, demostramos que las vías PI3K/Akt y ERK1/2 participaban en la prevención del procesamiento de la procaspasa 8 ejercido por LPS, pero no tuvieron efecto en la activación de la caspasa 3. Nuestros resultados dan cuenta del efecto cito-protector y antiapoptótico ejercido por LPS a través de TLR4 vía PI3K/Akt y ERK1/2 frente a la muerte de FC inducida por I/R / The damage caused by a myocardial infarct is complex, causing cardiac cell viability loss, among other deleterious effects that occur during the ischemia period, such as lack of oxygen and nutrients; as well as the posterior reperfusion with blood. In this situation, cardiac fibroblasts react by secreting proteins and renewing the extracellular matrix. These properties make them a key element in the scar and remodeling process of the injured cardiac tissue. Thus, the viability of these cells are required to preserve the correct functioning of the heart. In this regard, the use of LPS as a cytoprotector agent in cardiac Ischemia/reperfusion (I/R) has been reported. However such effect has been described mostly in cardiomyocytes cells, whereas its role in cardiac fibroblasts remains unknown. Our work studied the LPS cytoprotector effect in neonate cardiac fibroblast exposed to an in vitro model of I/R, and transductional pathways involved in this process were explored. Incubation with LPS (1μg/mL) during both ischemia and reperfusion periods prevented the I/R-induced cell loss. However, LPS used only during preconditioning, ischemia or reperfusion did not induced cytoprotection. Furthermore we demonstrated that the LPS-dependent protective effects were completely abolished when TLR4 receptor (TAK-242), and PI3K/Akt and ERK1/2 (Ly29002 and PD98059, respectively) inhibitors were used. These data suggest that LPS-dependent cytoprotector effects are mediated through TLR4 receptor activation and PI3K/Akt and ERK1/2 signalling pathways. Additionally the activation of TLR4 by LPS prevented the cleave of procaspases 3 and 8 induced by I/R. Both PI3K/Akt and ERK1/2 were necessary for the prevention of the caspase 8 activation, but not of caspase 3. Our results conclude that LPS protects cardiac fibroblasts from I/R apoptosis by the activation of TLR4 and both PI3K/Akt and ERK1/2 signalling pathways / FONDECYT

Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico / Los fibroblastos cardíacos (FC) son células capaces de mantener la homeostasis de la matriz extracelular (MEC), regulando la estructura tisular, así como también participan de la señalización química y eléctrica del tejido cardiaco. Además, los FC están en estrecha relación con el proceso inflamatorio, manteniendo un rol clave en la homeostasis del tejido posterior a una injuria o daño tisular. En el proceso inflamatorio, producido por daño celular o por invasión microbiana, las células del sistema inmune son atraídas desde la circulación sanguínea al sitio de injuria, siendo los neutrófilos la primera línea de defensa del organismo. La llegada de neutrófilos al sitio de daño genera gradientes quimiotáxicos que atraen células del sistema inmune, gatillando el reclutamiento leucocitario, el cual es dependiente de las proteínas de adhesión molecular VCAM-1 e ICAM-1, generando una respuesta inflamatoria sostenida. En ese contexto, evidencias sugieren que un nuevo tipo de mediador lipídico, la Resolvina D1 (RvD1), ha demostrado moderar la respuesta inflamatoria, promoviendo el cese de la infiltración leucocitaria, además de mejorar la fagocitosis en macrófagos para así permitir la remoción de células y tejido apoptótico en la zona de injuria, finalizando así el proceso de inflamación. Hasta la fecha, la RvD1 no ha sido utilizada en modelos cardíacos, y por lo mismo, se desconoce su utilidad como agente antiinflamatorio en el corazón, específicamente en el FC. El objetivo de este trabajo fue caracterizar los efectos de RvD1 en la viabilidad y proliferación celular de FC neonatos (FCN), para así estudiar el efecto de RvD1 sobre FCN bajo un contexto inflamatorio, inducido por estímulo con LPS, midiendo los niveles de expresión de proteínas de adhesión VCAM-1 e ICAM-1, y consecuentemente, la adhesión de leucocitos a FCN. Además, se estudió si la RvD1 es capaz de mostrar un efecto citoprotector frente al daño provocado por un estímulo de isquemia/reperfusión simulada (I/Rs). Los resultados mostraron que en FCN la presencia de RvD1 no afecta la proliferación ni viabilidad de éstos; sin embargo, no previnieron la muerte celular inducida por I/Rs. Se demostró además que el pre-tratamiento de FCN con RvD1 y posteriormente tratados por LPS, disminuyó la expresión de VCAM-1 e ICAM-1, y como consecuencia de ello, previno la adhesión de SMC a FCN. De esta forma, la RvD1 se transforma en una potencial y valiosa herramienta terapéutica capaz de disminuir la respuesta inflamatoria luego de algún evento de injuria cardiaca como lo puede ser una miocarditis, o bien, un infarto al miocardio / Cardiac fibroblasts (FC) are cells capable of maintaining the homeostasis of the extracellular matrix (ECM), regulating tissue structure, as well as participating in the chemical and electrical signaling of cardiac tissue. In addition, FCs are closely related to the inflammatory process, maintaining a key role in tissue homeostasis following injury or tissue damage. In the inflammatory process, presented by cellular damage or by microbial invasion, the cells of the immune system are attracted from the blood circulation to the site of the lesion, with neutrophils being the first line of defense of the organism. The arrival of neutrophils to the site of damage to genomes chemotactic gradients that attract cells of the immune system, triggering the leukocyte recruitment, which is dependent on molecular adhesion proteins VCAM-1 and ICAM-1, generating a sustained inflammatory response. In this context, evidence suggesting a new type of lipid mediator, Resolvin D1 (RvD1), has shown that the inflammatory response, the growth of leukocyte infiltration, in addition to improving phagocytosis in macrophages to allow a separation of cells and tissue apoptotic in the area of injury, thus ending the process of inflammation. To date, RvD1 has not been used in cardiac models, and therefore, is unknown as the anti-inflammatory agent in the heart, specifically in the FC. The objective of this work was to characterize the effects of RvD1 on the viability and cellular proliferation of neonatal FC (FCN), in order to study the effect of RvD1 on FCN under an inflammatory context, induced by stimulation with LPS, measuring the levels of expression of adhesion proteins VCAM-1 and ICAM-1, and consequently, the adhesion of leukocytes to FCN. In addition, we studied whether RvD1 is able to show a cytoprotective effect against damage caused by a simulated ischemia / reperfusion stimulus (I / Rs). The results show that in FCN the presence of RvD1 does not affect the proliferation or viability thereof; however, they did not prevent cell death induced by I/Rs. It was also demonstrated the previous treatment of FCN with RvD1 and subsequently treated by LPS, decreased the expression of VCAM-1 and ICAM-1, and as a consequence, prevented the adhesion of SMC to FCN. In this way, RvD1 becomes a potential and valuable therapeutic tool capable of decreasing the inflammatory response after some event of cardiac injury such as myocarditis or myocardial infarction / FONDECYT N° 1130300 y 1170425

O ligamento periodontal e o tecido gengival são formados por tecido conjuntivo frouxo, sendo constituídos por diversas células, dentre as quais os fibroblastos são as mais numerosas. Ao serem submetidas a agressões diversas, estas células respondem com a liberação de substâncias, tais como citocinas e quimiocinas, que participam de maneira ativa no processo inflamatório, e com a produção de componentes da matriz extracelular fundamentais para o reparo, como por exemplo, o colágeno. Assim sendo, este trabalho teve como objetivo: Avaliar e comparar a expressão e a produção de prócolágeno tipo I, IL6, MIP1 e SDF1 por fibroblastos humanos, cultivados de ligamento periodontal e de tecido gengival, estimulados por lipopolissacarídeo (LPS) de Porphyromonas gingivalis. Foram coletados ligamentos periodontais de terceiros molares não irrompidos e biópsias de gengiva de um mesmo indivíduo (n=3). Estes tecidos foram picotados e mantidos em meio de cultura adequado para fibroblastos, que foram utilizados na quarta passagem. Após adesão dos fibroblastos a placas de 24 poços, o meio de cultura contendo 0,1 10 g/mL de LPS de P. gingivalis foi adicionado às placas em duplicata. O sobrenadante e as células foram coletados após 1, 6 e 24 horas e analisados por ELISA e PCR em tempo real, respectivamente. A análise estatística foi realizada por meio do programa GraphPad Prism, aplicandose o teste ANOVA a 1 critério com nível de significância de 5%. A expressão de prócolágeno tipo I mostrouse - ligeiramente diferente entre fibroblastos de ligamento periodontal e de gengiva. A produção de IL6, MIP1 e SDF1 foi significativamente maior em fibroblastos gengivais. A citocina IL6 foi produzida de maneira tempodependente com LPS de P gingivalis, principalmente por fibroblastos gengivais. Para MIP1, os fibroblastos gengivais mostraram maior produção com a menor concentração de estímulo (0,1g/ml). Para SDF1, foi detectada produção constitutiva que foi inibida com o aumento da concentração de LPS ao longo do tempo nestas mesmas células. Já para fibroblastos de ligamento periodontal, não foi observado um padrão homogêneo e linear, apesar de a produção basal de SDF1 também existir, porém em níveis bem mais discretos, como aquele observado para a produção de MIP1. A capacidade dos fibroblastos modificarem o padrão de produção dessas citocinas frente ao estímulo com LPS de P. gingivalis reforça a importância dessas células no contexto da resposta imune do indivíduo frente à doença periodontal. / The fibroblast is considered an important cell in periodontitis because it is the predominant cell type in the periodontal connective tissue. When challenged by different agents, fibroblasts respond through the release of substances, such as cytokines and chemokines that participate in an active way in the inflammatory process as well as the production of basic components of the extracellular matrix for repair, like collagen. The aim of this study was to: to evaluate and to compare the expression and production of type I procollagen, IL6, MIP1 and SDF1 by cultured human periodontal ligament and gingival fibroblasts challenged with lipopolyssacharide from Porphyromonas gingivalis. Human periodontal ligament and gingival fibroblasts were cultured from biopsies of the same donor and were used on the fourth passage. After confluence in 24well plates, the culture medium alone (control) or with 0,1 10 ug/mL of LPS from P. gingivalis were added and after 1, 6 and 24 hours, the supernatant and the cells were collected and analysed by ELISA and Real time PCR, respectively. Data were analysed by GraphPad Prism Program (1 way ANOVA test) and a significance level of 5% was adopted. Procollagen type I expression by Real Time PCR differ between periodontal ligament and gingival fibroblasts. In vitro experiments revealed that IL6, MIP 1 and SDF1 production were significantly greater in gingival fibroblasts when compared to periodontal ligament. In addition, IL6 was upregulated in a timedependent manner, mainly by the gingival fibroblasts. On one hand, MIP1 was stimulated with a low concentration (0,1ugml) of LPS by gingival fibroblasts. On the other hand, SDF1 was constitutively secreted by the same cells but its production was inhibited when challenged by a higher concentration of LPS from P gingivalis. In general, periodontal ligament fibroblasts did not show a pattern of production of these cytokines under the challenge with LPS, despite of the basal production of SDF1 in lower levels than gingival cells and the low production of MIP1 over time. The differential ability of the gingival and periodontal ligament fibroblasts to secrete these cytokines emphasizes their crucial role in the inflammatory microenvironment and in the host immune response to periodontal disease.

Fibroblastos são as células mais numerosas encontradas nos tecidos orais como gengiva, ligamento periodontal e polpa dental. Além de exercerem função estrutural, estas células também desempenham papel importante na resposta imune destes tecidos através do reconhecimento de antígenos e produção de mediadores inflamatórios e citocinas. Evidências apontam ainda para o fato de que fibroblastos não constituem um grupo único de células. Sendo assim, os objetivos deste estudo foram: (I) avaliar a produção diferencial de fibroblastos de gengiva, ligamento periodontal e polpa dental de dentes permanentes e decíduos quanto à produção das quimiocinas CCL3 e CXCL12; (II) avaliar a produção de pró-colágeno I pelas células de polpa e (III) avaliar a expressão diferencial dos fibroblastos quanto a microRNAs. Dentes recentemente extraídos (terceiros molares hígidos) e fragmentos de gengivas saudáveis de três pacientes adultos foram obtidos no Laboratório de Farmacologia e Fisiologia Clínica da Faculdade de Odontologia de Bauru. Caninos decíduos de dois pacientes com indicação para extração por motivos ortodônticos foram obtidos na Clínica de Odontopediatria da mesma unidade. Culturas primárias de fibroblastos de gengiva (n=3), ligamento periodontal (n=3) e polpa de dente permanente (n=3) e polpa dental de dente decíduo (n=2) foram estabelecidas a partir de tecidos humanos por meio de técnica de explant. Após a quarta passagem, a produção de CCL3 e de CXCL12 foi avaliada após estímulo com concentrações crescentes (0 10 µg/mL) de ácido lipoteicóico de Enterococcus faecalis (EfLTA), lipopolissacarídeo de Porphyromonas gingivalis (PgLPS) ou LPS de Escherichia coli (EcLPS) por ELISA após 1, 6 e 24 h. O RNAm para as quimiocinas no grupo estimulado com EcLPS por 24 h foi avaliado por transcrição reversa seguida de reação em cadeia da polimerase quantitativa. A produção de pró-colágeno I por células de polpa estimuladas com EfLTA e PgLPS foi avaliada por imunofluorescência. O perfil de expressão de microRNAs foi investigado por ensaio de microarranjo. A produção de CCL3 foi aumentada (p< 0,05) pelos antígenos empregados, porém de maneira mais evidente para EcLPS em células de gengiva. A quimiocina CXCL12 foi detectada em níveis basais em todos os grupos de células, porém em maiores quantidades em fibroblastos de gengiva seguidos pelos de ligamento periodontal. A adição dos antígenos diminuiu a produção de CXCL12 de maneira distinta entre células e entre antígenos (p< 0,05). Fibroblastos de polpa decídua não apresentaram qualquer alteração na produção desta quimiocina pelos antígenos (p> 0,05). No período experimental de 24 h, a expressão do RNAm para CXCL12 não foi alterada enquanto a de CCL3 não foi detectada. A produção de pró-colágeno I se mostrou aumentada (p< 0,05) na presença do desafio antigênico em células de polpa com exceção para fibroblastos de polpa permanente que apresentaram diminuição na produção desta proteína quando estimulados com EfLTA. Em condições basais, fibroblastos do mesmo doador apresentaram perfil distinto de expressão de microRNAs envolvidos com a produção das proteínas-alvo deste estudo. A expressão de imunomiRs por EcLPS também se mostrou modificada de maneira distinta entre os fibroblastos, em especial os de ligamento periodontal. Com base nestes resultados, pode-se concluir que fibroblastos de diferentes tecidos orais apresentam comportamento diferencial frente a antígenos bacterianos comumente relacionados a patologias que afetam a cavidade oral. / Fibroblasts are the dominant cells within oral tissues such as gingiva, periodontal ligament and dental pulp. Besides the architectural maintenance of the connective tissues, fibroblasts are also involved in connective tissue immune response through antigen recognition and production of inflammatory mediators and cytokines. Recent studies also demonstrated that fibroblasts do not constitute a unique group of cells. Taken this togeter, the objectives of the present study were: (I) to evaluate the production of the chemokines CCL3 and CXCL12 by human gingival, periodontal ligament as well as permanent and deciduous dental pulp fibroblasts; (II) to evaluate the production of procollagen I by dental pulp fibroblasts and (III) to evaluate the differential pattern of expression of microRNAs by the oral fibroblasts. Recently extracted teeth (non-carious third molars) and fragments of healthy gingiva from three adults were obtained at the Laboratory for Clinical Pharmacology and Physiology at Dental School of Bauru. Deciduous canines from two patients with orthodontic indication for extraction were obtained at Pediatrics Clinics of Dental School of Bauru. Primary cultures of fibroblasts from gingiva (n=3), periodontal ligament (n=3) as well as permanent pulp (n=3) and deciduous pulp (n=2) were established through an explant technique. After the fourth passage, fibroblasts were challenged with increasing concentrations (0 10 µg/mL) of Enterococcus faecalis lipoteichoic acid (EfLTA), Porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide (PgLPS) or Escherichia coli LPS (EcLPS) for 1, 6 and 24 h. The chemokines were assessed through ELISA while the mRNA for CCL3 and CXCL12 (EcLPS at 24 h) were assessed through reverse transcription followed by quantitative polymerase chain reaction. The expression of microRNAs was screened through a microarray assay. The production of CCL3 on cell supernatants was detected in all cellular groups, with higher amounts at gingival fibroblasts. EcLPS induced more important chemokine differences compared to the other antigens. CXCL12 basal levels were higher for gingival fibroblasts followed by periodontal ligament ones, but also detected in dental pulp fibroblasts. The production of this chemokine was decreased by stimulation in a different fashion for each antigen and cell type. Deciduous pulp fibroblasts did not display any differences in CXCL12 synthesis even in the presence of the microbial challenge. No differences were detected at mRNA level for CXCL12, while no expression for CCL3 could be detected at 24 h. Increased production of procollagen type I was observed for dental pulp cells in general, with the only exception for permanent pulp cells which displayed decreased production of the protein with EfLTA. Microarray analysis showed differential expression pattern of microRNAs comparing unstimulated cells from the same donnor. EcLPS was able to alter immunomiRs expression in some of the cellular groups, in particular periodontal ligament fibroblasts. In conclusion, our results showed that fibroblasts from distinct oral tissues display differential behavior against bacterial antigens commonly related to the diseases that affect the oral cavity.