Objetivos: O objetivo deste trabalho foi o estabelecimento de um modelo PK/PD capaz de descrever o efeito fungistático de fluconazol (FCZ) contra diferentes espécies de Candida. Método: a fim de atingir esse objetivo, as seguintes etapas foram realizadas: i) métodos bioanalíticos foram desenvolvidos e validados em CL-EM/EM e CLAE/UV para a determinação do FCZ em plasma e microdialisado renal de rato, respectivamente; ii) a verificação das condições da microdiálise do FCZ e sua recuperação in vitro pelos métodos da diálise (RRD) e retrodiálise (RRE) e in vivo por RRE; iii) avaliação das concentrações livres de FCZ no rim de ratos Wistar saudáveis e infectados por Candida albicans através do uso da microdiálise após a administração de 10 mg/kg de FCZ pela via intravenosa e de 50 mg/kg de FCZ pela via oral, a fim de estabelecer a relação entre os níveis livres renais e plasmáticos totais do FCZ em ambas as condições, iv) a modelagem PK/PD do efeito fungistático do FCZ contra Candida albicans, Candida parapsilosis e Candida tropicalis empregando o modelo de Emax-modificado e a determinação de seus parâmetros PK/PD utilizando um modelo de infecção in vitro, em que as concentrações renais livres de FCZ esperadas em seres humanos após diferentes posologias foram simuladas: a) concentrações flutuantes do fármaco - 200, 400 e 800 mg q8h, q12h e q24h - e concentrações constantes, múltiplas da concentração inibitória mínima (CIM) – 0,5, 1, 2, 4 e 8 vezes a CIM. Os dados de farmacocinética e farmacodinâmica foram modelados com o auxílio do software Scientist®. Resultados e Conclusões: i) os métodos analíticos para quantificação do FCZ foram desenvolvidos e validados, sendo específicos, exatos e precisos, com limites de quantificação de 100 ng/mL e 10 ng/mL para detecção em plasma e microdialisado, respectivamente, ii) as recuperações determinadas in vitro por RRD e RRE foram independentes do fluxo e da concentração. Os valores de recuperação das sondas de microdiálise determinada in vitro por RRD (53,4 ± 2,3%) e RRE (54,2 ± 1,8%) e in vivo por RRE (49,7 ± 2,2%) foram estatisticamente semelhantes nas condições experimentais investigadas (α = 0,05), indicando que o FCZ é um fármaco adequado para ser avaliado por esta abordagem; iii) não houve diferença estatística na área sob a curva de concentração versus tempo (AUC 0-∞) renal livre e plasmática total em ratos Wistar, saudáveis ou infectados por Candida albicans, pela mesma via de administração investigada. A penetração renal do FCZ foi semelhante para ambas as doses nas condições investigadas (variando entre 0,77 e 0,84) e a sua fração plasmática livre, determinada por microdiálise, foi independente da concentração (86,0 ± 2,0%). Utilizando as equações farmacocinéticas apropriadas, os parâmetros plasmáticos farmacocinéticos determinados foram capazes de prever os valores de concentrações livres renais em ratos sadios e infectados, assumindo que a ligação a proteínas plasmáticas é conhecida. Além disso, a candidíase sistêmica não interfere na penetração renal do FCZ, indicando que as suas concentrações plasmáticas livres são boas preditoras do valor de concentração tecidual livre (farmacologicamente ativa) em animais sadios e infectados, podendo ser utilizada para estabelecer e otimizar os regimes posológicos do FCZ para o tratamento de candidíase disseminada; iv) a concentração que causa 50% do efeito fungistático máximo (CE50) do FCZ foi estatisticamente menor para C. albicans (4.4 ± 1.4 μg/mL) do que para C. parapsilosis e C. tropicalis, 8.1 ± 1.6 μg/mL e 8.3 ± 1.8 μg/mL respectivamente, ao simular-se diferentes regimes de dose, bem como concentrações constantes do fármaco (CE50, C. albicans = 3.5 ± 1.3 μg/mL; CE50, C. parapisolosis = 6.1 ± 1.2 μg/mL; CE50, C. tropicalis = 6.5 ± 1.2 μg/mL) (α = 0.05). A taxa de morte fúngica (kmax) foi estatisticamente semelhante para todas as espécies de Candida estudadas. (aproximadamente 0,4 h-1) e sempre estatisticamente menor do que a taxa de crescimento fúngico, k0 (aproximadamente de 2 h-1) (α = 0,05). O modelo PK/PD foi capaz de descrever o efeito fungistático do FCZ contra as três espécies de Candida investigadas in vitro. O FCZ se mostrou igualmente eficaz contra essas leveduras, porém sua potência foi maior frente a C.albicans do que frente a C. parapsilosis e C. tropicalis. O modelo PK/PD utilizado pode ser empregado para simular esquemas posológicos alternativos, para comparar o efeito farmacológico do FCZ com o efeito de outros antifúngicos e, finalmente, para otimizar a terapia deste fármaco para o tratamento de candidíase sistêmica. / Objective: The aim of this work was the development of a pharmacodynamic/pharmacokinetic (PK/PD) model able to describe the fungistatic effect of fluconazole (FCZ) against Candida spp. Method: in order to reach this objective, the following steps were realized: i) bioanalytical methods were developed and validated in LC-MS/MS and HPLC/UV for determination FCZ in rat plasma and kidney microdialisate, respectively; ii) analysis of microdialysis of FCZ conditions and its recovery in vitro by dialysis (RRD) and retrodialysis (RRE) methods and in vivo by RRE; iii) evaluation of free levels of FCZ in the kidney of healthy and Candida albicans infected Wistar rats using microdialysis, after a 10 mg/kg i.v. dosing and 50 mg/kg oral dosing in order to establish the relationship between free renal and total plasma levels in both conditions; iv) the fungistatic pharmacological effect of FCZ against Candida albicans, Candida parapsilosis and Candida tropicalis ATCC strains by pharmacokinetic/pharmacodynamic (PK/PD) modeling of the time–kill curves employing an Emax model was determined using an in vitro infection model, where the free kidney concentrations of FCZ in humans after different posologies were simulated: a) fluctuating drug concentrations - 200, 400 and 800 mg q8h, q12h e q24h – and constant concentrations, multiples of the minimum inhibitory concentrations (MIC) – 0,5, 1, 2, 4 and 8 times the MIC. The pharmacokinetic and pharmacodynamic data were modeled with the software Sientist®. Results and Conclusions: i) the analytical methods developed were specific, precise, and accurate with limits of quantification of 100 ng/mL and 10 ng/mL for microdialisate and plasma, respectively; ii) the recoveries determined by RRD and RRE in vitro were concentration independent and flow rate dependent on the ranges investigated. The recoveries determined in vitro by RRD (53.4 ± 2.3%) and RRE (54.2 ± 1.8%) and in vivo by RRE (52.3 ± 2.3%) were statistically similar under the experimental conditions investigated (α = 0.05), indicating that FCZ is a suitable drug to be evaluated by microdialysis; iii) There were no statistical differences between the area under the free concentration-time curve (AUC 0–∞) in plasma and in tissue for either healthy or infected groups for the same dose regimen investigated. The antifungal tissue penetration was similar for both doses and all conditions investigated (ranging from 0.77 to 0.84). Unbound FCZ plasma fraction, determined by microdialysis, was concentration-independent (86.0 ± 2.0%). Using appropriate equations, pharmacokinetic (PK) parameters determined by fitting plasma concentration-time profiles were able to predict free renal levels.The results showed FCZ easily penetrates the kidney and PK parameters determined in plasma can be used to predict free tissue levels of the drug assuming the drug protein binding is known. Furthermore, systemic candidiasis does not interfere with the drug kidney penetration, indicating that free plasma concentrations are a good surrogate for active levels in both healthy and infected kidney and can be used to establish and optimize FCZ dosing regimens to treat disseminated candidiasis; iv) FCZ concentration necessary to produce 50% of the maximal fungistati effect (EC50) was statiscally smaller against C. albicans (4.4 ± 1.4 μg/mL) than against C. parapsilosis and C. tropicalis, 8.1 ± 1.6 μg/mL and 8.3 ± 1.8 μg/mL respectively, when simulating multiple dosing regimens as well as constant concentrations (EC50, C. albicans = 3.5 ± 1.3 μg/mL; EC50, C. parapisolosis = 6.1 ± 1.2 μg/mL; EC50, C. tropicalis = 6.5 ± 1.2 μg/mL) (α = 0.05). The maximum killing rate constant (kmax) was statistically similar for the Candida spp. (approximately 0.4 h-1) and always statistically smaller than the natural grown rate k0 (approximately 2 h-1) (α = 0.05). The PK/PD model was able to describe the fungistatic effect of fluconazole in vitro against the three Candida spp investigated. Fluconazole showed equivalent efficacy against these yeasts and higher potency against C. albicans than against C. parapsilosis and C. tropicalis. The model can be used to simulate alternative regimens, to compare its pharmacological effect with other antifungals and to optimize FCZ therapy to treat systemic candidiasis.

Submitted by Marlene Santos (marlene.bc.ufg@gmail.com) on 2016-08-01T19:55:39Z No. of bitstreams: 3 Dissertação- Reginaldo Teixeira Nunes - 2014.pdf: 2255035 bytes, checksum: 70c145eb933df8fd6b89f116a91cade4 (MD5) Ata da Defesa de Mestrado. Reginaldo Texeira Nunes.jpg: 2607204 bytes, checksum: fb38ba2b64baafd566c2d99c81304371 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2016-08-02T12:26:59Z (GMT) No. of bitstreams: 3 Dissertação- Reginaldo Teixeira Nunes - 2014.pdf: 2255035 bytes, checksum: 70c145eb933df8fd6b89f116a91cade4 (MD5) Ata da Defesa de Mestrado. Reginaldo Texeira Nunes.jpg: 2607204 bytes, checksum: fb38ba2b64baafd566c2d99c81304371 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-02T12:26:59Z (GMT). No. of bitstreams: 3 Dissertação- Reginaldo Teixeira Nunes - 2014.pdf: 2255035 bytes, checksum: 70c145eb933df8fd6b89f116a91cade4 (MD5) Ata da Defesa de Mestrado. Reginaldo Texeira Nunes.jpg: 2607204 bytes, checksum: fb38ba2b64baafd566c2d99c81304371 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2014-07-04 / The basidiomycete Cryptococcus neoformans is a pathogenic yeast responsible for causing meningoencephalitis in patients with a compromised immune system, leading to high mortality rates worldwide. Presently available antifungal drugs for treating this disease are not always efficient and they may lead to serious side effects and sometimes to fungal resistance. This situation has caused an increasing search for natural products derived from plants with antifungal action. Cymbopogon winterianus Jowitt (Poaceae), popularly known as citronella and Thymus vulgaris L. (Labiatae), known as thyme, are two plants commonly used in folk medicine. This study aimed at evaluating the biological activity of both C. winterianus and T. vulgaris essential oils (EOs) on C. neoformans clinical isolates. We evaluated the in vitro susceptibility of C. neoformans to each EO by the broth microdilution method, the in vitro interaction between EOs and fluconazole by the checkerboard method, their toxicity on human erythrocytes and their effects on the mitochondrial metabolism of fungal cells. Both EOs showed to possess antifungal activity against the tested isolates, with minimum inhibitory concentrations (MICs) ranging from 32 to 256 μg/mL for C. winterianus and from 32 to 128 μg/mL for T. vulgaris. No synergism between the EOs and fluconazole was observed. C. winterianus and T. vulgaris EOs did not cause hemolysis on human erythrocytes at concentrations corresponding to MIC values, indicating, therefore, low toxicity. The MTT assays showed no alterations on mitochondrial metabolism of fungal cells by C. winterianus at concentrations ≤ 128μg/mL, as well as no alterations at any concentrations corresponding to MIC values by T. vulgaris, suggesting that the main mechanism of action of both EOs is not by interfering with mitochondrial activity. Results show that C. winterianus and T. vulgaris EOs may be promising on the production of new antifungal drugs. / O basidiomiceto Cryptococcus neoformans é uma levedura patogênica causadora de meningoencefalite em pacientes imunocomprometidos, levando a altas taxas de mortalidade em todo o mundo. Os antifúngicos atualmente disponíveis para o tratamento dessa enfermidade nem sempre são eficazes, podendo causar efeitos colaterais graves e levar a casos de resistência. Diante dessa situação, a busca por produtos naturais, com ação antifúngica, oriundos de plantas tem crescido consideravelmente. Cymbopogon winterianus Jowitt (Poaceae), conhecida popularmente como citronela e Thymus vulgaris L. (Labiatae), conhecida como tomilho-branco, são duas plantas comumente utilizadas na medicina popular. Este trabalho avaliou a atividade biológica dos óleos essenciais (OEs) de ambas, em isolados clínicos de C. neoformans. Foram avaliados a suscetibilidade in vitro destes isolados ao OE de cada planta pelo método de microdiluição em caldo, a interação in vitro entre os OEs e fluconazol pelo método de checkerboard, sua toxicidade em eritrócitos humanos e seus efeitos no metabolismo mitocondrial de células fúngicas. Ambos os OEs apresentaram atividade antifúngica, com concentrações inibitórias mínimas (CIMs) variando de 32 a 256μg/mL, para C. winterianus, e de 32 a 128μg/mL para T. vulgaris. Não houve sinergismo entre os OEs e fluconazol. Os OEs de C. winterianus e T. vulgaris não causaram hemólise em eritrócitos humanos nas concentrações correspondentes às CIMs, mostrando-se de baixa toxicidade. Nos ensaios com MTT, observou-se que não houve alterações no metabolismo mitocondrial das células fúngicas por C. winterianus em concentrações iguais ou inferiores a 128μg/mL, e em nenhum dos valores correspondentes às CIMs por T. vulgaris, sugerindo que o principal mecanismo de ação antifúngica desses OEs nas CIMs não ocorre por interferência na atividade mitocondrial. Os resultados obtidos demonstram que OEs de C. winterianus e T. vulgaris podem ser promissores para a produção de novos antifúngicos.

Desenvolveram-se métodos bioanalíticos para determinação de anfotericina B e fluconazol em apenas 200 L de plasma e líquor (LCR) através da cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE UV-VIS). A anfotericina B foi determinada através de CLAE-VIS utilizando p-nitrofenol como padrão interno, após purificação das matrizes biológicas com acetonitrila, seguida da análise em coluna Nova Pak C18 (150 x 3,9mm, 4 micron) e fase móvel constituída por tampão acetato 0,1M pH 5,0 e acetonitrila (50:50,v/v) 0,5mL/min em 385nm; o tempo de corrida foi 15 min. Através da validação o método mostrou-se robusto com 0,2-25,0 µg/mL(linearidade, r2 0,9999), LD 0,1 µg/mL, precisão (5,4% e 6,9%), exatidão expressa através do erro sistemático (3,3% e 2,2%): intra e interdias). Os estudos de estabilidade evidenciaram 1,0% para o erro sistemático e 3% de precisão na bandeja (tempo e condição de análise por 24 h), e os ciclos de congelamento evidenciaram boa estabilidade uma vez que todos os ensaios foram realizados em Laboratório de luz amarela. O fluconazol foi determinado através de CLAE-UV utilizando carbamazepina como padrão interno, após purificação das matrizes biológicas pela extração líquido-líquido com diclorometano em meio alcalino, seguido da análise em coluna Nova Pak C18 (150 x 3,9mm, 4 micron) e fase móvel constituída por água UP e acetonitrila (70:30,v/v) 0,5mL/min em 210nm; o tempo de corrida foi 15 min. O método mostrou-se robusto com 0,2-250 µg/mL(linearidade, r2 0,9998), LD 0,1µg/mL, com boa recuperação absoluta (98%) e relativa (100%), precisão 0,5%/1,3%, exatidão expressa através do erro sistemático (1,2%). Evidenciou-se ótima estabilidade para os extratos em bandeja (tempo e condição de análise por 24 h), na longa duração (20° C, 9 meses) e através dos ciclos de congelamento. Investigaram-se 21 pacientes adultos de ambos os sexos portadores de meningite criptocócica com AIDS após internação emergencial em terapia de alta dose com anfotericina B (1mg/Kg) e fluonazol (400 mg, 12/12 horas) durante 12 semanas. O monitoramento das concentrações de anfotericina B e fluconazol no plasma e no LCR forneceram as razões que permitiram estimar a penetração dos antifúngicos no SNC. Obtiveram-se concentrações de anfotericina B, médias (IC95%): 2,30 (0,02-5,08) µg/mL no plasma e 0,30 (0,19-0,36) µg/mL no LCR. As concentrações do fluconazol, médias (IC95%) foram: 31,7 (20,1-43,3) µg/mL no plasma e 19,4 (11,1-27,7) µg/mL no LCR. Com base nos resultados obtidos conclui-se que a penetração da anfotericina B foi insuficiente (10-27%), enquanto que a do fluconazol mostrou-se adequada com valores médios (IC95%) de 67 (47-87) %. / Analytical methods were developed to determine amphotericin B and fluconazole in only 200 L of plasma and in cerebrospinal fluid (CSF) by liquid chromatography (HPLC UVVIS). Amphotericin B was determined by HPLC - VIS using p-nitrophenol as internal standard, after the purification of biological matrices using acetonitrile, followed by chromatographic analysis in a Nova Pak C18 column (150 x 3.9mm, 4 micron) and mobile phase consisting of acetate buffer 0.1M pH 5.0 plus acetonitrile (50:50,v/v) 0.5mL/min at 385nm; the run time required was 15 min. Bioanalytical method validated showed robustness, 0.2-25,0µg/mL (linearity, r2 0.9999), DL 0.1µg/mL, precision (5.4%/6.0%), accuracy expressed as systematic error (3.3%/2.2%). The stability was investigated, error systematic was 1% for the vials on the rack (time and conditions of drug analysis, 24h). Thawing cycles showed good stability after three freezing-thawing cycles. All procedures were performed under yellow light at room temperature. Fluconazole was determined by HPLC - UV using carbamazepine as internal standard, after the purification of biological matrices using liquid-liquid extraction in alkaline medium, followed by chromatographic analysis in a Nova Pak C18 column (150 x 3.9mm, 4 micron) and mobile phase consisting of purified water plus acetonitrile (70:30,v/v) 0.5mL/min at 210nm; the run time required was 15 min. Bioanalytical method validated showed robustness, 0.2-250 µg/mL(linearity, r2 0.9998), DL 0.1µg/mL. Absolute recovery was 98% and relative recovery was 100%, intra/interday precision were 0,5/-1,3%; accuracy expressed as systematic error were 1.2%/1.2%.and relative recovery was 100%. Good stability for the vials on the rack (time and conditions of drug analysis, 24h) and long term stability (at 20o C for 9 months) were demonstrated. Also thawing cycles showed good stability after three freezing-thawing cycles. Twenty one adult patients of both sex were investigated. Inpatients with meningitis by Cryptococcus neoformans with AIDS were under high dose therapy with amphotericin B 1mg/Kg plus fluonazole 400 mg, every 12h during 12 weeks. Therapeutic monitoring of amphotericin B and fluconazole in plasma and in CSF showed ratios that indicate the penetration of antifungal drugs into CNS. Mean (CI95%) data were for amphotericin B 2.30 (0.02-5.08 ) µg/mL in plasma and 0.30 (0.19-0.36) µg/mL in CSF. Fluconazole showed 31.7 (20.1-43.3) µg/mL in plasma and 19.4 (11.1-27.7) µg/mL in CSF. Based on data obtained we conclude that the penetration of amphotericin B was poor (10-27%) while fluconazole was adequate 67% (47-87%), mean (CI95%).

A criptococose clinica foi observada por volta do primeiro dia da inoculação e a sobrevida dos animais 15 dias após-inoculação (PI). Isolamos C. neoformans no cérebro a partir do 5º dia (PI) e no pulmão a partir 11º dia (PI). No 1º dia (PI) observamos por meio do tecido cerebral que já havia um quadro inicial de infecção, presença de edema, que evoluiu durante todo o período. C. neoformans foi visualizado primeiramente nos vasos capilares, o que nos leva a sugerir que seja esta rota importante para a entrada da levedura no órgão. A meningite aguda aconteceu por volta do 7º dia quando visualizamos o microrganismo na meninge e com um discreto infiltrado inflamatório. A partir do 13º dia a doença evoluiu para crônica permanecendo até o óbito dos animais. A monoterapia com anfotericina B (AMB) reduziu a sobrevida dos animais, enquanto que, o tratamento isolado com fluconazol (FLC) prolongou a mesma. A associação AMB-FLC foi eficaz, quando iniciamos o tratamento 24 horas (PI), enquanto que, o mesmo tratamento iniciado a partir do 7º dia quando já tínhamos um quadro compatível de meningite aguda não foi satisfatório. É importante ressaltar que os resultados descritos foram referentes à inoculação com isolado sensível in vitro ao fluconazol, enquanto que, o tratamento não resultou em êxito quando empregamos isolado resistente in vitro ao fluconazol. / Clinical cryptococcosis was observed on day 1 postinoculation (PI), and the animals survived until day 15 PI. C. neoformans was isolated from brain tissue starting on day 5 PI, and from lung tissue starting on day 11 PI. On day 1 PI, signs of infection were already observed in brain tissue, with presence of edema, which evolved throughout the period. C. neoformans was first seen in the capillaries, suggesting that this is an important route for the entrance of the yeast into this organ. Acute meningitis occurred around day 7 PI, when the microorganism was observed in the meninges, along with a discrete inflammatory infiltrate. From day 13 PI onward the disease became chronic, persisting until the death of the animals. Treatment with amphotericin B (AMB) alone shortened the animals\' survival, while treatment with fluconazole (FLC) alone lengthened it. Treatment with the two drugs in association was effective when treatment was begun at 24 hours PI, however, when treatment was begun at day 7 PI, already with signs of acute meningitis, the effectiveness was unsatisfactory. It is important to emphasize that these results relate to inoculation with an isolate susceptible in vitro to fluconazole, while the treatment was not effective for an isolate resistant in vitro to fluconazole.

Orientadores: Adriana Vitorino Rossi, Regina Buffon / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química / Made available in DSpace on 2018-08-22T19:48:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Manzoor_Suryyia_D.pdf: 4523839 bytes, checksum: 9aa2a7bc8376699193b0d5e83f0ec0f5 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: Este trabalho envolveu um estudo elaborado da técnica de impressão molecular para síntese, caracterização e avaliação de materiais impressos molecularmente (MIMs) para fluconazol (FLU), cafeína (CAF) e antocianinas (ACYs). O polímero de impressão molecular para FLU (FLUMIP) foi sintetizado utilizando-se ácido metacrílico (monômero funcional), etilenoglicoldimetacrilato (EGDMA) (agente reticulador) e acetonitrila em polimerização térmica. O FLUMIP foi caracterizado e aplicado como sorvente em cartuchos de extração em fase sólida (SPE). Sua capacidade de interação seletiva com o analito foi avaliada, obtendo-se alta afinidade para FLU, em comparação com análogos estruturais, com limite de detecção menor que 1,63X10 mmol/L com cromatografia de ultra alta eficiência acoplada com espectrometria de massas. Este MIP foi usado em cartuchos de SPE para extrair o analito de medicamento em cápsula, com recuperação de 91±10 % (n=9). Outro MIM obtido foi uma sílica organicamente modificada (ORMOSIL) para extração de CAF, a partir da reação de metacrilato de 3- (trimetoxisilil) propila e acetato de vinila, seguindo-se condensação e hidrólise com tetraetilortosilicato usando CAF como molécula modelo. Este ORMOLSIL foi caracterizado e testado quanto à sua eficácia de extrair CAF de amostras de café, com recuperação de 88±5 % (n=9); ele atuou como grupo seletivo com alta porcentagem de recuperação para teofilina (77 %) e teobromina (82 %). Limites de detecção e quantificação 5,14x10 e 1,71x10 mmol/L respectivamente foram obtidos com cromatografia líquida de alta eficiência. Também foi sintetizado um MIP usando rutina molécula modelo (RUTMIP), acrilamida (monômero funcional), EGDMA (agente reticulador) e tetraidrofurano por polimerização em bulk. Embora tenha sido alcançada impressão bem sucedida de rutina, confirmada pela comparação de afinidade de RUTMIP em aplicação de SPE (12 vezes maior que afinidade do polímero não impresso), não se alcançou a seletividade esperada para ACYs utilizando o RUTMIP / Abstract: This work involves an elaborative study of molecularly imprinting technique. Keeping in view its robustness and selectivity, this technique was applied for the synthesis of molecularly imprinted materials for the extraction of fluconazole (FLU), caffeine (CAF) and anthocyanins (ACYs). Molecularly imprinted polymer (MIP) for FLU (FLUMIP) was synthesized using methacrylic acid (functional monomer), ethyleneglycoldimethacrylate (crosslinker) and acetonitrile through thermal polymerization. The FLUMIP was characterized and applied as sorbent in solid phase extraction (SPE) cartridges. It was then evaluated for its ability to selectively interact with the analyte and presented an apparent affinity for FLU, which was confirmed by comparing it with structural analogues. The application of ultra high performance liquid chromatography with spectrometer mass detection, allowed a limit of detection 1.63x10 mmol/L. Furthermore, the SPE procedure was applied to extract FLU from medicine samples with recovery of 91±10 % (n=9). An organically modified silica (ORMOSIL) for CAF was also synthesized by reacting vinyl acetate and 3- (trimethoxysilyl) propyl methacrylate, followed by the condensation and hydrolysis with tetraethyl orthosilicate, using CAF as template molecule. The ORMOSIL was characterized and tested for its efficiency to extract the analyte from coffee samples and the percentage recovery of 88±5 % (n=9) was obtained. The cross reactivity studies for theophylline and theobromine showed high recovery (77 % and 82% respectively). The limit of detection and quantification, 5.14x10 and 1.71x10 mmol/L respectively, were achieved using high performance liquid chromatography. Also, a MIP for ACYs (RUTMIP) was synthesized using rutin (template molecule), EGDMA (cross linker) and tetrahydrofuran by the bulk polymerization method. A successful imprinting of rutin was attained. This can be confirmed by the high affinity of rutin for MIP (12 times greater than non imprinted polymer) during SPE procedure; however, the RUTMIP was not efficient enough to selectively extract ACYs from vegetal extracts / Doutorado / Doutora em Ciências

The genus Candida includes several opportunistically pathogenic species which are common causative agents of the yeast infections in humans. Although current medical research is focused mostly on cancer, AIDS or Alzheimer disease, the problem of systemic candidiases cannot be neglected. These infections represent a real threat to the immunocompromissed patients, they are connected with a high mortality rate and expensive medication with poor prognosis. Pseudomonas aeruginosa could be an inspiration in a way of how to eliminate the pathogenic yeasts. The bacterium can inhibit growth of the most common yeast species of the genus Candida, C. albicans. This effect is based on production of toxic substances by the bacterium and on interaction of the bacterium with the C. albicans cell wall, which leads to the lysis of the yeast cells and which is not fully understood. Nevertheless, coexistence of these microorganisms is also possible and their relationship is affected by various factors. Knowledge of these inter- microbial interactions was obtained from studies of diseases and pathologies, during which C. albicans + P. aeruginosa coinfections occur. In this thesis I studied mechanisms of interaction between pathogenic yeast C. albicans and bacterium P. aeruginosa by a) C. albicans gene expression...

A microbiota vaginal saudável é constituída, majoritariamente, por espécies de lactobacilos que representam uma barreira natural contra microrganismos causadores de doenças como a candidíase vulvovaginal (CVV), vaginose bacteriana (VB) e infecções do trato urinário (ITU), que juntas acometem cerca de um bilhão de mulheres no mundo anualmente. Um melhor entendimento da ecologia microbiana vaginal pode ser útil na otimização de tratamentos existentes para as infecções urogenitais, os quais podem destruir parcialmente a microbiota autóctone, predispor a novas infecções, contribuir para a seleção de microrganismos resistentes e causar efeitos colaterais indesejáveis. A utilização de microrganismos certificadamente probióticos, Lactobacillus rhamnosus GR-1 e Lactobacillus reuteri RC-14, representa uma alternativa terapêutica promissora na abordagem de VB e CVV, uma vez que são capazes de colonizar o trato vaginal, apresentam atividade inibitória frente a diversos patógenos do trato urogenital, exibem risco mínimo para a seleção de microrganismos resistentes e podem auxiliar na restauração da microbiota vaginal. Os objetivos deste trabalho foram: (i) avaliar a prevalência de espécies de lactobacilos na microbiota vaginal de mulheres saudáveis e diagnosticadas com infecções vaginais (CVV e VB) da cidade de Ribeirão Preto (São Paulo, Brasil), (ii) avaliar a capacidade de isolados de lactobacilos produzirem peróxido de hidrogênio (H2O2) e (iii) determinar a eficácia da utilização de L. rhamnosus GR-1 e L. reuteri RC-14 no tratamento de CVV e VB, quando co-administrados com medicamentos antimicrobianos tradicionais. Participaram deste estudo, 196 pacientes voluntárias, atendidas por médicos ginecologistas de centros de saúde ligados à Universidade de São Paulo, campus de Ribeirão Preto (64 saudáveis, 68 diagnosticadas com CVV e 64 diagnosticadas com VB) e duas amostras vaginais de cada paciente foram coletadas com o auxílio de zaragatoas esterilizadas. Uma zaragatoa foi utilizada para semeadura em ágar MRS (de Man, Rogosa & Sharpe), os isolados de bactérias láticas obtidos foram analisados através da técnica de PCR-ARDRA (Reação em cadeia da polimerase Análise de restrição do DNA ribossomal amplificado) e a habilidade de Lactobacillus spp. produzir H2O2 foi determinada semi-quantitativamente. A outra zaragatoa foi utilizada para a análise das espécies de lactobacilos da microbiota vaginal pela técnica independente de cultivo PCR-DGGE (Reação em cadeia da polimerase Eletroforese em gel de gradiente de desnaturação). As leveduras do gênero Candida foram obtidas através da semeadura das amostras vaginais provenientes de pacientes saudáveis e com CVV no meio Chromagar® Candida e identificadas através de provas bioquímicas de referência. As pacientes diagnosticadas com CVV participaram de um estudo randomizado, duplo-cego, placebo-controlado e foram tratadas com dose única de fluconazol (150mg) e suplementação diária durante 28 dias com (i) duas cápsulas contendo os microrganismos probióticos L. rhamnosus GR-1 e L. reuteri RC-14 (Urex-Cap-5®) ou (ii) duas cápsulas de placebo. As pacientes com VB também participaram de um estudo randomizado, duplo-cego, placebo-controlado e foram tratadas com dose única de tinidazol (2g) e suplementação diária com cápsulas do probiótico (Urex-Cap-5®) ou placebo, conforme descrito acima. Todas as pacientes foram reavaliadas ao final do tratamento, no 28º dia. Foram realizados experimentos para averiguar o possível efeito de L. rhamnosus GR-1 e L. reuteri RC-14 na modulação in vitro da infecção por Candida albicans em culturas de células epiteliais vaginais humanas (VK2/E6E7) Os resultados mostraram que, pela técnica de PCR-ADRA, L. crispatus foi a espécie mais prevalente nos grupos de pacientes saudáveis (37,0%) e com CVV (35,9%), enquanto que L. gasseri foi predominante no grupo de pacientes com VB (34,6%). De acordo com o método de PCR-DGGE, L. iners foi o microrganismo mais prevalente nos três grupos de pacientes avaliados: saudáveis, com CVV e VB (48,7%, 44,7% e 65,0%, respectivamente). A maioria dos isolados de Lactobacillus spp. obtidos nos grupos de pacientes saudáveis (98,6%) e diagnosticadas com CVV (97,4%) foram capazes de produzir H2O2 (1 a 100mg/L), em comparação a apenas 68,2%, determinado no grupo de pacientes com VB (p<0,05). L. crispatus e L. johnsonii produziram as maiores quantidades médias de H2O2 (30mg/L). A taxa de colonização por leveduras do gênero Candida foi de 26,6% no grupo de pacientes saudáveis (C. albicans correspondeu a 52,4% de todos os isolados), enquanto que no grupo de pacientes com CVV, 89,2% dos isolados leveduriformes foram identificados como C. albicans. Para as análises estatísticas dos dados obtidos com os testes clínicos, foram consideradas 55 pacientes diagnosticadas com CVV (pela presença de sinais e sintomas da infecção e cultura positiva para Candida sp.) e foi observado que a utilização de dose única de fluconazol e suplementação diária com o probiótico, resultou em taxa de cura mais elevada para a infecção (89,7%) em comparação com aquela verificada no grupo placebo (65,4%) (p<0,05). A utilização de tinidazol em associação com a ingestão diária de Urex-Cap-5® no tratamento de pacientes com VB também resultou em taxa de cura mais elevada para a condição (87,5%), em comparação àquela observada no grupo placebo (50,0%) (p<0,05). A atividade anti-Candida de L. rhamnosus GR-1 e L. reuteri RC-14 foi observada através do modelo in vitro para infecção vaginal. Em conclusão, quando as técnicas de PCR-ARDRA e PCR-DGGE foram comparadas entre si, foi observado que ambas apresentaram limitações, evidenciando a importância do emprego de diferentes metodologias para avaliação adequada das espécies de lactobacilos presentes na microbiota vaginal. As espécies de lactobacilos vaginais determinadas nas mulheres saudáveis do presente trabalho foram semelhantes àquelas verificadas em estudos prévios descritos na literatura com pacientes com dieta e localização geográfica notadamente distintas. Os dados do presente trabalho sugerem que a presença de lactobacilos produtores de H2O2, isoladamente, não confere proteção contra CVV, enquanto que a ausência desses microrganismos pode ser um fator contribuinte para VB. Além disso, foi demonstrado que a utilização de medicamentos antimicrobianos tradicionais e suplementação com os microrganismos probióticos L. rhamnosus GR-1 e L. reuteri RC-14 foi mais eficiente no tratamento de CVV e VB em comparação com medicamentos clássicos e placebo. Estes resultados podem contribuir para prolongar a vida útil de medicamentos cuja eficácia pode ser comprometida devido à seleção de microrganismos resistentes e também reduzir o tempo de tratamento para pacientes que necessitam de terapias clássicas por períodos prolongados. / The vaginal microbiota is mainly constituted by lactobacilli species, which represent a natural barrier against microorganisms that cause vulvovaginal candidiasis (VVC), bacterial vaginosis (BV), and urinary tract infections (UTI). Together, these conditions afflict each year an estimated one billion women worldwide. A better understanding of the vaginal microbial ecology may be useful to improve the current available treatments for urogenital infections, which can partially destroy the autochthonous microbiota, predispose to other infections, contribute for the selection of resistant microorganisms and cause undesirable collateral effects. The use of microorganisms with demonstrated probiotic properties, Lactobacillus rhamnosus GR-1 and Lactobacillus reuteri RC-14, represents a promising therapeutic alternative for BV and VVC, since they are able to colonize the vaginal tract, present inhibitory against several urogenital pathogens, pose minimal risk for the selection of resistant microorganisms and can help to restore the vaginal microbiota. The objectives of this work were: (i) to evaluate the prevalence of lactobacilli species in the vaginal microbiota of healthy women and those diagnosed with vaginal infections (VVC and BV) in the city of Ribeirão Preto (São Paulo, Brazil), (ii) to evaluate the ability of the lactobacilli isolates to produce hydrogen peroxide (H2O2) and (iii) to determine the efficacy of the use of L. rhamnosus GR-1 and L. reuteri RC-14 in the treatment of VVC and BV, in co-administration with traditional antimicrobials. 196 voluntary subjects were examined by the gynecologists team from health centers affiliated with Universidade de São Paulo, campus at Ribeirão Preto (64 healthy, 68 diagnosed with VVC and 64 diagnosed with BV) and two vaginal samples from each patient were collected by the use of two sterile swabs. One swab was cultured in MRS (de Man, Rogosa & Sharpe) agar, the isolates of lactic acid bacteria obtained were analyzed by PCR-ARDRA (Polymerase chain reaction - Amplified ribosomal DNA restriction analysis) and the ability of Lactobacillus spp. to produce hydrogen peroxide was determined semi-quantitatively. The other swab was used for the analysis of lactobacilli species from the vaginal microbiota using the culture-independent PCR-DGGE (Polymerase chain reaction Denaturating gradient gel electrophoresis). The yeasts belonging to Candida genus were obtained also by culturing the vaginal material from healthy and VVC patients in Chromagar® Candida and were identified by standard biochemical tests. VVC patients were enrolled in a randomized, double-blind, placebo-controlled trial and treated with a single dose fluconazole (150mg) and daily supplementation for 28 days with (i) two capsules containing the probiotic microorganisms L. rhamnosus GR-1 and L. reuteri RC-14 (Urex-Cap-5®) or (ii) two placebo capsules. BV patients were also enrolled in a randomized, double-blind, placebo controlled trial and treated with a single dose of tinidazole (2g) and supplementation with probiotic capsules (Urex-Cap-5®) or placebo, as described above. All patients were re-evaluated at the end of treatment, on the 28th day. Experiments were also conducted to assess the possible effect of L. rhamnosus GR-1 and L. reuteri RC-14 in the in vitro modulation of vaginal infection by Candida albicans on cultures of human vaginal epithelial cells (VK2/E6E7). The results revealed that according to PCR-ADRA, L.crispatus was the most prevalent species in the groups of healthy women (37.0%) and those with VVC (35.9%), while L. gasseri was dominant in BV patients (34.6%). By PCR-DGGE method, L. iners was the most prevalent Lactobacillus species in all the three groups evaluated: healthy, VVC and BV (48.7%, 44.7% and 65.0%, respectively). The majority of the isolates of Lactobacillus spp. from healthy women (98.6%) and those with VVC (97.4%) were able to produce H2O2 (1 to 100mg/L) in comparison with only 68.2% assessed for the BV group (p<0.05). L. crispatus and L. johnsonii produced the highest average levels of H2O2 (30mg/L). Colonization rate by yeasts belonging to Candida genus was 26.6% in the group of healthy patients (C. albicans represented 52.4% of all isolates), whereas in the VVC group, 89.2% of yeast isolates were identified as C. albicans. For the performance of statistical analysis of the results obtained with the clinical trials, 55 patients diagnosed with VVC (by the presence of symptoms and signals of the infection and positive culture for Candida sp.) were taken into consideration and it was observed that the use of a single dose of fluconazole and daily supplementation with probiotics, yielded a higher cure rate (89.7%), in comparison with the placebo group (65.4%) (p<0.05). The use of tinidazole plus probiotic also resulted in higher cure rate of the infection (87.5%), compared to placebo group (50.0%) (p<0.05). An anti-Candida activity of L. rhamnosus GR-1 and L. reuteri RC-14 was observed in the in vitro model of vaginal infection. In conclusion, when PCR-ARDRA and PCR-DGGE were compared, it was verified that both presented limitations, which evidences the need of using different techniques for a better knowledge of lactobacilli species present in the vaginal microbiota. The lactobacilli species found in healthy women in this work were similar to those reported in previous studies described in the literature for patients with distinctly different diet and geographic localization. The data of the present work indicate that solely the presence of H2O2-producing isolates does not render protection against VVC, whereas the absence of those microorganisms may be a contributing factor for BV. Moreover, it was demonstrated that the use of classical medicines supplemented with the probiotics L. rhamnosus GR-1 and L. reuteri RC-14 was more efficient to treat VVC and BV in comparison with classical medicines plus placebo. These results may contribute to extend the longevity of drugs whose efficacy is compromised due to the selection of resistant microorganisms and also to shorten the length of treatment courses for patients that require long regimens with standard therapy.

A microbiota vaginal saudável é constituída, majoritariamente, por espécies de lactobacilos que representam uma barreira natural contra microrganismos causadores de doenças como a candidíase vulvovaginal (CVV), vaginose bacteriana (VB) e infecções do trato urinário (ITU), que juntas acometem cerca de um bilhão de mulheres no mundo anualmente. Um melhor entendimento da ecologia microbiana vaginal pode ser útil na otimização de tratamentos existentes para as infecções urogenitais, os quais podem destruir parcialmente a microbiota autóctone, predispor a novas infecções, contribuir para a seleção de microrganismos resistentes e causar efeitos colaterais indesejáveis. A utilização de microrganismos certificadamente probióticos, Lactobacillus rhamnosus GR-1 e Lactobacillus reuteri RC-14, representa uma alternativa terapêutica promissora na abordagem de VB e CVV, uma vez que são capazes de colonizar o trato vaginal, apresentam atividade inibitória frente a diversos patógenos do trato urogenital, exibem risco mínimo para a seleção de microrganismos resistentes e podem auxiliar na restauração da microbiota vaginal. Os objetivos deste trabalho foram: (i) avaliar a prevalência de espécies de lactobacilos na microbiota vaginal de mulheres saudáveis e diagnosticadas com infecções vaginais (CVV e VB) da cidade de Ribeirão Preto (São Paulo, Brasil), (ii) avaliar a capacidade de isolados de lactobacilos produzirem peróxido de hidrogênio (H2O2) e (iii) determinar a eficácia da utilização de L. rhamnosus GR-1 e L. reuteri RC-14 no tratamento de CVV e VB, quando co-administrados com medicamentos antimicrobianos tradicionais. Participaram deste estudo, 196 pacientes voluntárias, atendidas por médicos ginecologistas de centros de saúde ligados à Universidade de São Paulo, campus de Ribeirão Preto (64 saudáveis, 68 diagnosticadas com CVV e 64 diagnosticadas com VB) e duas amostras vaginais de cada paciente foram coletadas com o auxílio de zaragatoas esterilizadas. Uma zaragatoa foi utilizada para semeadura em ágar MRS (de Man, Rogosa & Sharpe), os isolados de bactérias láticas obtidos foram analisados através da técnica de PCR-ARDRA (Reação em cadeia da polimerase Análise de restrição do DNA ribossomal amplificado) e a habilidade de Lactobacillus spp. produzir H2O2 foi determinada semi-quantitativamente. A outra zaragatoa foi utilizada para a análise das espécies de lactobacilos da microbiota vaginal pela técnica independente de cultivo PCR-DGGE (Reação em cadeia da polimerase Eletroforese em gel de gradiente de desnaturação). As leveduras do gênero Candida foram obtidas através da semeadura das amostras vaginais provenientes de pacientes saudáveis e com CVV no meio Chromagar® Candida e identificadas através de provas bioquímicas de referência. As pacientes diagnosticadas com CVV participaram de um estudo randomizado, duplo-cego, placebo-controlado e foram tratadas com dose única de fluconazol (150mg) e suplementação diária durante 28 dias com (i) duas cápsulas contendo os microrganismos probióticos L. rhamnosus GR-1 e L. reuteri RC-14 (Urex-Cap-5®) ou (ii) duas cápsulas de placebo. As pacientes com VB também participaram de um estudo randomizado, duplo-cego, placebo-controlado e foram tratadas com dose única de tinidazol (2g) e suplementação diária com cápsulas do probiótico (Urex-Cap-5®) ou placebo, conforme descrito acima. Todas as pacientes foram reavaliadas ao final do tratamento, no 28º dia. Foram realizados experimentos para averiguar o possível efeito de L. rhamnosus GR-1 e L. reuteri RC-14 na modulação in vitro da infecção por Candida albicans em culturas de células epiteliais vaginais humanas (VK2/E6E7) Os resultados mostraram que, pela técnica de PCR-ADRA, L. crispatus foi a espécie mais prevalente nos grupos de pacientes saudáveis (37,0%) e com CVV (35,9%), enquanto que L. gasseri foi predominante no grupo de pacientes com VB (34,6%). De acordo com o método de PCR-DGGE, L. iners foi o microrganismo mais prevalente nos três grupos de pacientes avaliados: saudáveis, com CVV e VB (48,7%, 44,7% e 65,0%, respectivamente). A maioria dos isolados de Lactobacillus spp. obtidos nos grupos de pacientes saudáveis (98,6%) e diagnosticadas com CVV (97,4%) foram capazes de produzir H2O2 (1 a 100mg/L), em comparação a apenas 68,2%, determinado no grupo de pacientes com VB (p<0,05). L. crispatus e L. johnsonii produziram as maiores quantidades médias de H2O2 (30mg/L). A taxa de colonização por leveduras do gênero Candida foi de 26,6% no grupo de pacientes saudáveis (C. albicans correspondeu a 52,4% de todos os isolados), enquanto que no grupo de pacientes com CVV, 89,2% dos isolados leveduriformes foram identificados como C. albicans. Para as análises estatísticas dos dados obtidos com os testes clínicos, foram consideradas 55 pacientes diagnosticadas com CVV (pela presença de sinais e sintomas da infecção e cultura positiva para Candida sp.) e foi observado que a utilização de dose única de fluconazol e suplementação diária com o probiótico, resultou em taxa de cura mais elevada para a infecção (89,7%) em comparação com aquela verificada no grupo placebo (65,4%) (p<0,05). A utilização de tinidazol em associação com a ingestão diária de Urex-Cap-5® no tratamento de pacientes com VB também resultou em taxa de cura mais elevada para a condição (87,5%), em comparação àquela observada no grupo placebo (50,0%) (p<0,05). A atividade anti-Candida de L. rhamnosus GR-1 e L. reuteri RC-14 foi observada através do modelo in vitro para infecção vaginal. Em conclusão, quando as técnicas de PCR-ARDRA e PCR-DGGE foram comparadas entre si, foi observado que ambas apresentaram limitações, evidenciando a importância do emprego de diferentes metodologias para avaliação adequada das espécies de lactobacilos presentes na microbiota vaginal. As espécies de lactobacilos vaginais determinadas nas mulheres saudáveis do presente trabalho foram semelhantes àquelas verificadas em estudos prévios descritos na literatura com pacientes com dieta e localização geográfica notadamente distintas. Os dados do presente trabalho sugerem que a presença de lactobacilos produtores de H2O2, isoladamente, não confere proteção contra CVV, enquanto que a ausência desses microrganismos pode ser um fator contribuinte para VB. Além disso, foi demonstrado que a utilização de medicamentos antimicrobianos tradicionais e suplementação com os microrganismos probióticos L. rhamnosus GR-1 e L. reuteri RC-14 foi mais eficiente no tratamento de CVV e VB em comparação com medicamentos clássicos e placebo. Estes resultados podem contribuir para prolongar a vida útil de medicamentos cuja eficácia pode ser comprometida devido à seleção de microrganismos resistentes e também reduzir o tempo de tratamento para pacientes que necessitam de terapias clássicas por períodos prolongados. / The vaginal microbiota is mainly constituted by lactobacilli species, which represent a natural barrier against microorganisms that cause vulvovaginal candidiasis (VVC), bacterial vaginosis (BV), and urinary tract infections (UTI). Together, these conditions afflict each year an estimated one billion women worldwide. A better understanding of the vaginal microbial ecology may be useful to improve the current available treatments for urogenital infections, which can partially destroy the autochthonous microbiota, predispose to other infections, contribute for the selection of resistant microorganisms and cause undesirable collateral effects. The use of microorganisms with demonstrated probiotic properties, Lactobacillus rhamnosus GR-1 and Lactobacillus reuteri RC-14, represents a promising therapeutic alternative for BV and VVC, since they are able to colonize the vaginal tract, present inhibitory against several urogenital pathogens, pose minimal risk for the selection of resistant microorganisms and can help to restore the vaginal microbiota. The objectives of this work were: (i) to evaluate the prevalence of lactobacilli species in the vaginal microbiota of healthy women and those diagnosed with vaginal infections (VVC and BV) in the city of Ribeirão Preto (São Paulo, Brazil), (ii) to evaluate the ability of the lactobacilli isolates to produce hydrogen peroxide (H2O2) and (iii) to determine the efficacy of the use of L. rhamnosus GR-1 and L. reuteri RC-14 in the treatment of VVC and BV, in co-administration with traditional antimicrobials. 196 voluntary subjects were examined by the gynecologists team from health centers affiliated with Universidade de São Paulo, campus at Ribeirão Preto (64 healthy, 68 diagnosed with VVC and 64 diagnosed with BV) and two vaginal samples from each patient were collected by the use of two sterile swabs. One swab was cultured in MRS (de Man, Rogosa & Sharpe) agar, the isolates of lactic acid bacteria obtained were analyzed by PCR-ARDRA (Polymerase chain reaction - Amplified ribosomal DNA restriction analysis) and the ability of Lactobacillus spp. to produce hydrogen peroxide was determined semi-quantitatively. The other swab was used for the analysis of lactobacilli species from the vaginal microbiota using the culture-independent PCR-DGGE (Polymerase chain reaction Denaturating gradient gel electrophoresis). The yeasts belonging to Candida genus were obtained also by culturing the vaginal material from healthy and VVC patients in Chromagar® Candida and were identified by standard biochemical tests. VVC patients were enrolled in a randomized, double-blind, placebo-controlled trial and treated with a single dose fluconazole (150mg) and daily supplementation for 28 days with (i) two capsules containing the probiotic microorganisms L. rhamnosus GR-1 and L. reuteri RC-14 (Urex-Cap-5®) or (ii) two placebo capsules. BV patients were also enrolled in a randomized, double-blind, placebo controlled trial and treated with a single dose of tinidazole (2g) and supplementation with probiotic capsules (Urex-Cap-5®) or placebo, as described above. All patients were re-evaluated at the end of treatment, on the 28th day. Experiments were also conducted to assess the possible effect of L. rhamnosus GR-1 and L. reuteri RC-14 in the in vitro modulation of vaginal infection by Candida albicans on cultures of human vaginal epithelial cells (VK2/E6E7). The results revealed that according to PCR-ADRA, L.crispatus was the most prevalent species in the groups of healthy women (37.0%) and those with VVC (35.9%), while L. gasseri was dominant in BV patients (34.6%). By PCR-DGGE method, L. iners was the most prevalent Lactobacillus species in all the three groups evaluated: healthy, VVC and BV (48.7%, 44.7% and 65.0%, respectively). The majority of the isolates of Lactobacillus spp. from healthy women (98.6%) and those with VVC (97.4%) were able to produce H2O2 (1 to 100mg/L) in comparison with only 68.2% assessed for the BV group (p<0.05). L. crispatus and L. johnsonii produced the highest average levels of H2O2 (30mg/L). Colonization rate by yeasts belonging to Candida genus was 26.6% in the group of healthy patients (C. albicans represented 52.4% of all isolates), whereas in the VVC group, 89.2% of yeast isolates were identified as C. albicans. For the performance of statistical analysis of the results obtained with the clinical trials, 55 patients diagnosed with VVC (by the presence of symptoms and signals of the infection and positive culture for Candida sp.) were taken into consideration and it was observed that the use of a single dose of fluconazole and daily supplementation with probiotics, yielded a higher cure rate (89.7%), in comparison with the placebo group (65.4%) (p<0.05). The use of tinidazole plus probiotic also resulted in higher cure rate of the infection (87.5%), compared to placebo group (50.0%) (p<0.05). An anti-Candida activity of L. rhamnosus GR-1 and L. reuteri RC-14 was observed in the in vitro model of vaginal infection. In conclusion, when PCR-ARDRA and PCR-DGGE were compared, it was verified that both presented limitations, which evidences the need of using different techniques for a better knowledge of lactobacilli species present in the vaginal microbiota. The lactobacilli species found in healthy women in this work were similar to those reported in previous studies described in the literature for patients with distinctly different diet and geographic localization. The data of the present work indicate that solely the presence of H2O2-producing isolates does not render protection against VVC, whereas the absence of those microorganisms may be a contributing factor for BV. Moreover, it was demonstrated that the use of classical medicines supplemented with the probiotics L. rhamnosus GR-1 and L. reuteri RC-14 was more efficient to treat VVC and BV in comparison with classical medicines plus placebo. These results may contribute to extend the longevity of drugs whose efficacy is compromised due to the selection of resistant microorganisms and also to shorten the length of treatment courses for patients that require long regimens with standard therapy.

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