Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Latex of Calotropis procera was described as a source of pharmacologically active proteins such as anti-inflammatory and analgesic activities. This study evaluated the cytotoxic activity in vitro of proteins (LP) recovered from the latex of the medicinal plant C. procera against human cancer cells and the in vivo growth inhibition of Sarcoma 180. LP exhibited significant cytotoxicity for cell lines with IC50 values ranging from 0.11 to 1.36 Âg/ml for tested cell lines (HL-60, SF295, HCT-8 and MDA-MB-435). There were no visible effects on the viability or morphology of healthy mononuclear cells exposed to PL (10 Âg / ml) for 72 h, showing that PL was selective for malignant cells. Fractionation of PL by ion exchange chromatography (pH 5.0) gave rise to three new protein fractions (PI, PII and PIII) and almost all cytotoxicity present in PL was retained in fraction PI. The cytotoxic effects of PL and PI were diminished when pre-treated with pronase or 2-mercaptoethanol, reinforcing the protein nature of active molecules. PI was absent on cysteine protease activity, indicating that this enzyme abundantly found in PL is not involved in cytotoxicity. Mechanistic studies of LP cytotoxicity using HL-60 cells revealed that PL induces apoptosis probably due to changes in DNA topology since PL interfered in the activity of topoisomerase I. The cytotoxic activity present in PI seems to be performed by the synergic action of different proteins. This hypothesis is suggested since PI subjected to gel filtration chromatography produced distinct protein peaks that shared cytotoxic activity, although with lower extent than PI. Studies on growth inhibition of Sarcoma 180 showed that animals treated with PL by oral (10 or 20 mg/kg) or intraperitoneal (2 or 5 mg/kg) rout reduced tumor growth significantly (up 51.83%, po) and increased life span of transplanted animals for up to four days. The inhibitory activity of tumor growth was lost when the LP was subjected to proteolysis, acidic treatment or collected in iodoacetamide. On the other hand, LP maintained its in vivo activity after heat treatment, suggesting that thermo stable proteins are involved in the suppression of tumor growth. Biochemical parameters such as the enzymatic activity of aspartate aminotransferase (AST) and alanine aminotransferase (ALT) and the content of urea in serum were not affected in animals treated with LP. Treatment of animals with LP induced increasing of leukocyte numbers and protected from leukopenia induced by 5-FU administration. In addition, no significant changes in the histopathology of liver of animals treated with oral LP were seen. In vivo antitumor activity was retained in the PII and this activity was observed even when animals received a single dose of PII. It seems that the in vivo action of latex proteins is related to an immunestimulant event and not to the cytotoxic action of protein on cells Sarcoma 180. PII-3, recovered after PII fractionation on ion exchange column at pH 6.0, retained the tumor growth inhibition activity found in PII. PII-3 was shown to possess cysteine proteinase and papain inhibitor activities; however is not completely clear weather this molecules are involved in the antitumor activity. This study confirms the pharmacological potential of latex proteins from C. procera to control the development of tumor cells. / O lÃtex de Calotropis procera foi descrito como uma fonte de proteÃnas farmacologicamente ativas como atividade antiinflamatÃria e analgÃsica. O presente trabalho avaliou a atividade citotÃxica in vitro das proteÃnas (PL) recuperadas do lÃtex da planta medicinal C. procera contra cÃlulas de cÃncer humano e a inibiÃÃo do crescimento do Sarcoma 180 transplantado em camundongos. PL apresentou significante citotoxicidade para as linhagens celulares com valores de IC50 variando entre 0,11 a 1,36 Âg/ml para as linhagens celulares testadas (HL-60, SF295, HCT-8 e MDA-MB-435). NÃo foram observados efeitos visÃveis sobre a viabilidade ou a morfologia de cÃlulas mononucleares saudÃveis expostas a PL (10 Âg / ml) por 72 h, mostrando que PL apresentou seletividade para cÃlulas tumorais. O fracionamento de PL por cromatografia de troca iÃnica (pH 5,0) deu origem a trÃs novas fraÃÃes (PI, PII e PIII) e quase toda citotoxicidade presente em PL ficou retida na fraÃÃo PI. Os efeitos citotÃxicos de PL e PI foram diminuÃdos quando previamente tratados com pronase, ou 2-mercaptoetanol, sugerindo uma natureza protÃica de molÃculas ativas. PI nÃo apresentou atividade de proteinase cisteÃnica, indicando que esta enzima, encontrada em abundÃncia em PL, nÃo està envolvida na citotoxicidade. Estudos do mecanismo da aÃÃo citotÃxica de PL utilizando cÃlulas HL-60 revelou que PL induz apoptose celular provavelmente devido a alteraÃÃes na topologia de DNA, jà que PL interferiu na atividade de topoisomerase I. A atividade citotÃxica presente em PI parece ser desempenhada pela aÃÃo combinada de diferentes proteÃnas uma vez que PI submetida à cromatografia de filtraÃÃo em gel gerou picos protÃicos distintos que compartilharam atividade citotÃxica, embora com menor potÃncia que PI. Estudo de inibiÃÃo do crescimento do Sarcoma 180 revelou que animais tratados com PL por via oral (10 or 20 mg/kg) ou intraperitoneal (2 or 5 mg/kg) reduziram de modo significativo o crescimento do tumor (em atà 51,83%; v.o.) e prolongou o tempo de sobrevivÃncia dos animais transplantados por atà quatro dias. A atividade inibitÃria do crescimento do tumor foi perdida quando a fraÃÃo PL foi submetida à proteÃlise, tratamento Ãcido ou com iodoacetamida. No entanto, PL conservou a sua atividade in vivo apÃs o tratamento tÃrmico, sugerindo que proteÃnas termoestÃveis estÃo envolvidas na supressÃo do crescimento tumoral. Os parÃmetros bioquÃmicos, como a atividade enzimÃtica da aspartato aminotransferase (AST) e alanina aminotransferase (ALT) e o teor de urÃia no soro, nÃo foram afetados nos animais tratados com PL. PL induziu aumento no nÃmero de leucÃcitos de animais tratados e ainda eliminou completamente a leucopenia induzida pela administraÃÃo do 5-FU. Em adiÃÃo, nÃo foram observadas mudanÃas na histopatologia do fÃgado de animais tratados com PL por via oral. Atividade antitumoral in vivo ficou retida no PII e esta atividade foi observada mesmo quando animais transplantados receberam uma Ãnica dose de PII sugerindo que a aÃÃo in vivo de proteÃnas do lÃtex està relacionada a um evento imunoestimunate de proteÃnas e nÃo à aÃÃo citotÃxica sobre as cÃlulas do Sarcoma 180. PII-3, obtido apÃs fracionamento de PII em coluna de troca iÃnica em pH 6,0 reteve a atividade de inibiÃÃo do crescimento tumoral de PII. Esta fraÃÃo possui atividade de proteinase cisteÃnica e atividade de inibidor de papaÃna, porÃm nÃo à completamente claro o envolvimento dessas molÃculas na atividade in vivo. Este estudo confirma o potencial farmacolÃgico das proteÃnas do lÃtex de C. procera para controlar o desenvolvimento de cÃlulas tumorais.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / IntroduÃÃo: A mucosite induzida por antineoplÃsicos à um fator limitante na terapia anticÃncer. Mucosite à um termo clÃnico que descreve uma sÃndrome caracterizada por ulceraÃÃo da mucosa de todo o trato digestivo. O trato gastrintestinal à vulnerÃvel por causa da alta proliferaÃÃo e freqÃÃncia de renovaÃÃo celular. Assim, a mucosite intestinal resulta de eventos inflamatÃrios, que levam as alteraÃÃes de permeabilidade e trÃnsito intestinal e de alteraÃÃes na motilidade intestinal tanto na fase inflamatÃria, como na fase pÃs-inflamatÃria. Pentoxifilina (PTX) à um importante inibidor da sÃntese de citocinas, alÃm de apresentar efeito protetor sobre a mucosite oral por 5-FU em hamster. A dexametasona (DEXA) à um glicocorticÃide cujo principal efeito farmacolÃgico decorre de sua aÃÃo antiinflamatÃria e imunossupressora. Objetivos: Avaliar o efeito do tratamento com pentoxifilina ou dexametasona na resposta inflamatÃria e nas alteraÃÃes da motilidade digestiva associadas a mucosite intestinal experimental induzida por 5-FU. MÃtodos: Ratos Wistar machos (200 â 250g) foram tratados no d0 com 5-FU (150 mg/Kg, i.p. dose Ãnica) ou com 5-FU + PTX (90mg/Kg, s.c.) ou 5-FU + DEXA (2,5mg/Kg, i.p.). A PTX e a DEXA foram administradas meia hora apÃs a administraÃÃo de 5-FU no d0 e diariamente atà o sacrifÃcio. No d3 os animais foram sacrificados, amostras do duodeno, jejuno e Ãleo, foram removidas para avaliar a injÃria epitelial por morfometria, escores histolÃgicos, pela atividade de MPO e pela concentraÃÃo de GSH. Para avaliaÃÃo de citocinas amostras de duodeno foram retiradas e pelo mÃtodo de ELISA foi determinada a concentraÃÃo de TNF- e IL-1 e pela imunohistoquÃmica foi observado a imunomarcaÃÃo. Jà na tÃcnica de esvaziamento gÃstrico os animais receberam o mesmo tratamento descrito anteriormente. Posteriormente, foram deixados em jejum de 18 horas do d2 para o d3. No d3, foram administrados 1,5 ml da soluÃÃo glicosada (5%) contendo vermelho de fenol (VF) a 0,75 mg/ml em cada animal. ApÃs 20 min, os animais foram sacrificados e submetidos a uma laparotomia mediana. O intestino delgado foi exposto e divido em 3 partes iguais: proximal, medial e distal. Com o auxÃlio de uma proveta contendo uma soluÃÃo de NaOH (100ml, 0,1N) o volume do estÃmago e dos segmentos do intestino delgado foram determinados. A absorbÃncia da amostra foi lida sob um comprimento de onda de 540 nm. Resultados: O tratamento com 5-FU foi capaz de induzir uma lesÃo intestinal com um importante comprometimento da barreira epitelial funcional com a presenÃa das seguintes alteraÃÃes: encurtamento acentuado das vilosidades intestinais, necrose parcial de criptas, vacuolizaÃÃo de cÃlulas, presenÃa de infiltrado mono e polimorfonucleares, produÃÃo de radicais livres com consumo de GSH, aumento na concentraÃÃo de TNF- e IL-1 com maior imunomarcaÃÃo (no duodeno) e alteraÃÃes na motilidade digestiva. O tratamento com DEXA e PTX reduziu significativamente as lesÃes intestinais, com recuperaÃÃo da altura dos vilos, recuperaÃÃo da profundidade das criptas, diminuiÃÃo do infiltrado neutrofÃlico, aumento dos nÃveis de glutationa e reduÃÃo da concentraÃÃo de TNF-, IL-1 com uma menor imunomarcaÃÃo. Contudo somente o tratamento com DEXA foi capaz de reverter o retarde do esvaziamento gÃstrico e do transito gastrintestinal. ConclusÃo: 5-FU induz mucosite intestinal em ratos com a participaÃÃo de TNF- e IL-1, a qual se associa com retarde no esvaziamento gÃstrico e no transito gastrintestinal. O tratamento com PTX ou DEXA foram capaz de reverter parte dos achados inflamatÃrios, entretanto, somente o tratamento com DEXA foi capaz de reverter parcialmente Ãs alteraÃÃes na motilidade digestiva associadas a mucosite por 5- FU em ratos. / Introduction: One of the most important limitation of antineoplasic chemotherapy is the intestinal mucositis. Mucositis is a clinical term wich describes a syndrome characterized for ulceration in the digestive tract. Gastrointestinal tract is vulnerable because it have elevated proliferation cellular renovation. Intestinal mucositis results in inflammatory events, that leads the alterations in permeability and gastrointestinal motility in the inflammatory phase, as in the post-inflammatory phase. Pentoxifylline (PTX) is important inhibitor of the cytokines synthesis, with a protective effect against 5-FU- induced oral mucositis in hamster. Dexamethasone (DEXA) is glucorticoide with anti-inflammatory and immunosuppressive effects. Aim: To evaluate the effect of the pentoxifylline or dexamethasone treatments in the inflammatory response and alterations of the gastrointestinal motility associate with 5-FU- induced intestinal mucositis. Methods: Male Wistar rats (200 â 250g) treated in d0 by 5-FU (150 mg/Kg, i.p. only dose) or 5-FU + PTX (90 mg/Kg, s.c.) or 5-FU + DEXA (2.5mg/Kg, i.p.). PTX or DEXA were administrated 30â after 5-FU, and then daily. In d3, animals were sacrificed, samples duodenum, jejunum and ileum were removed for assessment epithelial damage for morphometric, histological scores, MPO activity and GSH concentration. In order to evaluate the concentration of TNF- and IL-1, duodenum samples were removed and ELISA or imunohistoquimic for this cytocines were performed. In order to evaluated the gastrointestinal motility, animals received same treatment described previously, then were fasted for 18h of the d2 to d3. In d3 the animals were gavage-fed with a test meal and sacrificed 20 min later. Stomach and consecutive intestinal segments same (proximal, medial and distal) were obtained. Each segment was placed in a measuring cylinder and the volume measured by adding 100 mL of 0.1 NaOH. The absorbance of the sample was read at a 540 nm. Results: The treatment with 5-FU induced intestinal damage with an important disruption of the functional epithelial barrier and presence of these following alterations: shortening villus, partial necrosis crypts, vacuolated cells, presence of infiltrated mono and polymorphonuclears, production of free radicals with GSH consumption, increase in the concentration of TNF- and IL-1 in the duodenum, and gastrointestinal dismotility. The treatment with DEXA and PTX significantly reduced the intestinal damage, with recovery of the high villus, depth of crypt, reduction of the neutrophil infiltration, increase of the levels of glutathione and reduction in the TNF- and IL-1 concentrations. However, only the treatment with DEXA was able to reverse the delays gastric emptying and gastrointestinal transit induced by intestinal mucositis. Conclusion: 5-FU induces intestinal mucositis in rats with the participation of TNF- and IL-1. It associates with delayed gastric emptying and gastrointestinal transit. We conclude also that PTX or DEXA- treatments decreases the inflammatory response. On the other hand, only DEXA treatment reversed gastrointestinal dismotility associate with 5â FU- induced intestinal mucositis in rats.

O carcinoma de células escamosas (SCC) é um tumor maligno de origem epitelial no qual o receptor de fator de crescimento epidermal (EGFR) está superexpresso e associado a malignização. O cetuximabe é um anticorpo monoclonal, capaz de se ligar seletivamente ao EGFR. A combinação de cetuximabe com o quimioterápico hidrofílico 5-fluorouracil (5-FU) é utilizada na clínica pela via intravenosa e é associada a efeitos colaterais. A administração tópica de 5-FU também é realizada a partir de cremes convencionais, porém sua eficácia é limitada a doenças pré-cancerosas e o carcinoma basocelular. Estima-se que a conjugação do cetuximabe à superfície de lipossomas, os quais podem ser administrados na pele em associação a um método físico, como a iontoforese, seja capaz de direcionar a liberação do 5-FU para as camadas da pele onde os tumores estão presentes, além de aumentar o uptake celular em linhagem EGFR positiva, viabilizando o tratamento tópico de SCC. Assim, o objetivo do presente trabalho foi avaliar a influência do cetuximabe conjugado a um lipossoma (imunolipossoma) na penetração cutânea passiva e iontoforética do 5-FU e na regressão do SCC. Para tanto, um método analítico e um método bioanalítico foram desenvolvidos e validados para quantificação de 5-FU. Lipossomas convencionais foram preparados a partir de diferentes composições lipídicas, métodos de preparo e razão fármaco/lipídeo para selecionar aqueles que encapsulassem maior porcentagem de 5-FU. Lipossomas compostos por 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfocolina e colesterol (DSPC:Chol, 55:45), preparados por hidratação do filme lipídico, na razão fármaco/ lipídeo 0,1, de aproximadamente 140 nm, foram escolhidos por encapsularem cerca de 50% de 5-FU. Para obtenção dos imunolipossomas, o cetuximabe foi primeiramente conjugado ao lipídeo DSPE acoplado ao ligante maleimida(polietilenoglicol)-2000 (DSPE-PEG-Mal), resultando em 94% de eficiência de conjugação. Os imunolipossomas foram então obtidos da mesma forma que os lipossomas e apresentaram tamanho e porcentagem de encapsulação do 5-FU semelhante a apresentada pelos lipossomas. Estudo in vitro em linhagem EGFR positiva (A431) mostrou sinergismo entre 5-FU e imunolipossoma, resultando em valores de IC50 cerca de 3 vezes menores do que o apresentado pelo 5-FU em solução. O uptake celular do imunolipossoma foi 3,5 vezes maior do que o do lipossoma. Nos estudos de penetração cutânea in vitro observou-se que, em relação a uma solução de 5-FU, lipossomas e imunolipossomas diminuíram a quantidade de 5- FU que atravessou a pele. A iontoforese aumentou a penetração do 5-FU a partir de todas as formulações. Neste caso, o acúmulo de 5-FU na epiderme viável, onde os tumores estão presentes, foi duas vezes maior quando este estava encapsulado no imunolipossoma em relação ao lipossoma. In vivo, as formulações foram administradas por via subcutânea ou tópica usando iontoforese em modelo xenográfico de SCC. O tratamento com os imunolipossomas diminuiu o crescimento tumoral em mais de 60% em relação ao controle e em torno de 50% em relação aos tratamentos com solução e lipossoma de 5-FU. A administração tópica por iontoforese apresentou maior redução tumoral do que a subcutânea quando os tumores foram tratados com solução de 5-FU e lipossomas, mas foi igualmente eficaz para os imunolipossomas. Análise imunohistológica revelou que o potencial de proliferação celular foi reduzido para os grupos tratados. Desta forma, a administração por iontoforese de imunolipossomas contendo 5-FU é uma estratégia promissora para o tratamento tópico de SCC / Squamous cell carcinoma (SCC) is a malignant tumor of epithelial origin in which the epidermal growth factor receptor (EGFR) is overexpressed and associated with malignization. Cetuximab is a monoclonal antibody, able to selectively bind EGFR. The combination of the chemotherapy with the hydrophilic drug 5-fluorouracil (5- FU) and cetuximab is applied in the clinic by intravenous injection and is associated with side effects. Cetuximab conjugation onto liposomal surface, which can be administered topically onto the skin using physical methods, such as iontophoresis, is able to direct 5-FU release to the skin layers where tumors are localized and to increase cellular uptake in EGFR positive cells, making possible the topical treatment of SCC. Thus, the objective of this work was to investigate the influence of cetuximab conjugation to liposomes (immunoliposomes) in the passive and iontophoresis skin penetration of 5-FU and SCC regression. For this purpose, an analytical and a bioanalytical method were developed and validated for 5-FU quantification. Then, conventional liposomes were prepared using different lipid compositions, preparation methods and drug to lipid ratios in order to select those able to load higher percentages of 5-FU. Liposomes composed by 1,2-Distearoylsn- glycero-3-phosphocholine and cholesterol (DSPC:Chol, 55:45) prepared by the thin lipid film hydration with drug/lipid ratio 0.1 with approximately 140 nm, were chosen because they encapsulated about 50% of 5-FU. For the obtainment of immunoliposomes, cetuximab was first coupled to the lipid DSPE linked to maleimide (polyethylene glycol)-2000 (DSPE-PEG-Mal) as an anchor for the antibody conjugation, resulting in 94% coupling efficiency. The immunoliposomes were obtained similarly to liposomes, with similar particle size and loading efficiency of 5-FU. In vitro studies using EGFR positive cells (A431) showed synergism for 5-FU and cetuximab, resulting in IC50 values about 3 times lower than 5-FU solution. Cellular uptake of immunoliposomes increased 3.5-fold compared to the liposomes. In vitro skin penetration studies revealed that, compared to the 5-FU solution, liposomes and immunoliposomes reduced the amount of 5-FU that passed through the skin. Iontophoresis increased the amount of 5-FU retained in viable epidermis for all formulations. In this case, the amount of 5-FU in viable epidermis, where tumors are localized, was 2 times higher when it was encapsulated in immunoliposomes compared to liposomes. In vivo, the formulations were administered subcutaneously or topically with iontophoresis in xenograft animal model of SCC. Treatment with immunoliposomes reduced tumor growth more than 60% compared to the negative control and about 50% compared to the treatments with 5-FU solution and liposomes. The topical administration using iontophoresis resulted in improved tumor reduction compared to the subcutaneous administration when tumors were treated with 5-FU solution and liposomes, but was equally effective for the immunoliposomes. The histological analysis showed the reduction of cellular proliferation for the treated groups. In conclusion, the administration of immunoliposomes containing 5-FU using iontophoresis is a promising strategy for the topical treatment of SCC

Vários métodos de análise para o ensaio do quimioterápico 5-Fluorouracil (5-FU) em fluidos biológicos de humanos e animais, foram previamente relatados. Considerando que a administração do 5-FU altera de alguma maneira a morfologia e função das glândulas salivares, e que a presença do quimioterápico na mucosa oral pode levar a algumas complicações orais, este trabalho teve como objetivo de determinar a presença de 5-FU na saliva de hamsters que receberam o quimioterápico pela técnica de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE), uma vez que este modelo animal é usado nos estudos com mucosite oral e hipofunção glandular, induzidas por 5-FU. Doze animais foram divididos em 4 grupos: CP e CPI, onde os animais receberam intraperitonealmente pilocarpina (CP) ou pilocarpina + isoproterenol (CPI) e o veículo do quimioterápico, e os grupos QP e QPI, onde os animais receberam, respectivamente, os mesmos secretagogos listados acima e o quimioterápico 5-FU. Após a administração do secretagogo, foi coletada a saliva de todos os animais, por um período de 60 min. Em seguida, a saliva foi congelada a -80 ?C para posterior determinação do quimioterápico por CLAE. Após análise dos cromatogramas, e com base nos resultados obtidos, foi possível identificar a presença do 5-FU nas amostras de saliva de hamsters que receberam o quimioterápico via intraperitoneal pela técnica da CLAE. / Various analytical methods for testing the chemotherapeutic agent 5-fluorouracil (5-FU) in biological fluids of humans and animals have been reported previously. Whereas the administration of 5-FU alter in any way the morphology and function of the salivary glands, and that the presence of chemotherapy in the oral mucosa can lead to some oral complications, this study aimed to determine the presence of 5-FU in chemotherapy treated hamsters saliva by Liquid Chromatography High Performance (HPLC), since this animal model is used in studies of oral mucositis and gland hypofunction induced by 5-FU. Twelve animals were divided into 4 groups: intraperitoneally pilocarpine (CP), pilocarpine + isoproterenol (CPI) and the chemotherapy of the vehicle, and the QP and QPI groups where the animals were, respectively, the same secretagogues listed above and 5-FU chemotherapy. After administration secretagogue, the saliva from all animals was collected for a period of 60 min. Then the saliva was frozen at -80 ºC for subsequent determination of chemotherapy by HPLC. After analysis of chromatograms, and based on the results obtained, it was possible to identify the presence of 5-FU in Hamsters saliva samples that received intraperitoneal chemotherapy via the technique of HPLC.

Le cancer colorectal (CCR) représente la seconde cause de mortalité par cancer dans le monde. Les tumeurs sont classées selon les grades histologiques (état de différenciation cellulaire), en bas et haut grades. Les grades les plus avancés sont associés à de faibles taux de survie globale après chimiothérapie à base de 5-Fluorouracile (5-FU). Les taux de réponse aux traitements basés sur l’utilisation du 5-FU en première ligne de traitement demeurent relativement faibles (20–30%) et associés à de mauvais pronostics et des échappements thérapeutiques, dus à la résistance des cellules cancéreuses. Ces données soulignent donc la nécessité d’identifier de nouveaux biomarqueurs de résistance des cellules de CCR au 5-FU. Les travaux réalisés au cours de cette thèse ont porté sur l’étude de la sortiline, une protéine « multi-tâches » appartenant à la famille des récepteurs à domaine VPS10P avec sorLA et sorCS1-3, qui agit comme un (co)récepteur et un régulateur du traffic et de la sécrétion de protéines. La sortiline (et non sorLA), constitue un biomarqueur d’agressivité dans le CCR et est de mauvais pronostique. In vivo et in vitro, au sein des tumeurs et des cellules de CCR (lignées cellulaires et cultures primaires) résistantes au 5-FU, seule la sortiline apparait surexprimée au niveau transcriptomique et protéique. Ces données indiquent que la sortiline constitue également un biomarqueur de résistance au 5-FU, quels que soient les grades, stades et statuts mutationnels. Cette surexpression de la sortiline est majoritairement localisée au sein de l’appareil de Golgi des cellules résistantes et semble être régulée transcriptionnellement via une down-régulation d’ATF-3. L’inhibition génétique (shRNA) ou pharmacologique (CADA) de la sortiline potentialise les effets cytotoxiques du 5-FU, résultant en une forte augmentation de la mort cellulaire. La sortiline semble donc être également impliquée dans la résistance des cellules de CCR au 5-FU ; l’expression de sorLA ne variant pas après son inhbition. Ces résultats suggèrent que la sortiline pourrait constituer un biomarqueur d’agressivité et de résistance des cellules de CCR au 5-FU, mais aussi une nouvelle cible thérapeutique potentielle. / Worldwide, colorectal cancer (CRC) is the second leading cause of cancer-related deaths. Colorectal adenocarcinomas are divided into low and high grades. More advanced tumor grade is associated with poorer global survival following 5-fluorouracil (5-FU)-based systemic chemotherapy. Even when 5-FU is used as the first-line molecule, responsiveness is only 20–30%, and drug resistance contributes to both poor patient prognosis and relapses, emphasizing the need to identify biomarkers involved in this process. In this study, we focused on sortilin, a multifunctional protein among VPS10P domain-related receptors with sorLA and sorCS1-3, that acts as a receptor and co-receptor as well as a regulator of intra- and extracellular protein sorting and trafficking. We obtained evidence that sortilin, but not sorLA, is a biomarker of CRC aggressiveness associated with poor clinical outcomes. In vivo and in vitro, in both 5-FU–resistant CRC cell lines and primary cultures, only sortilin was overexpressed at both protein and mRNA levels, indicating that it could serve as a biomarker of 5-FU resistance regardless of tumor grade and mutational status. Sortilin overexpression is especially localized in Golgi apparatus of 5-FU resistant cells and seems to be transcriptionally regulated through ATF-3 downregulation. Genetic (shRNA) and pharmacological (CADA) inhibition of sortilin potentiated 5-FU–induced cytotoxicity, resulting in a significant increase in cancer cell eradication, implying that sortilin is also actively involved in 5-FU resistance. Moreover, sorLA expression is unchanged upon sortilin inhibition. Our findings indicate that sortilin is a promising biomarker of 5-FU resistance in CRC, as well as a potential therapeutic target for overcoming 5-FU resistance.

A administração intraperitoneal de 5-fluorouracil (5-FU) no pós-operatório imediato reduz a recorrência local e prolonga a sobrevida dos pacientes com câncer colônico. Contudo, esse tratamento também pode prejudicar a cicatrização das anastomoses intestinais. O objetivo deste estudo foi determinar os efeitos da quimioterapia (QT) intraperitoneal (IP) pós-operatória (PO) precoce com o 5-FU e da selagem anastomótica com o TachoSil sobre o processo de cicatrização de anastomoses colônicas. Quarenta ratos foram divididos em quatro grupos (I - IV, com dez ratos em cada) e submetidos à secção do cólon esquerdo seguida por anastomose. As anastomoses dos ratos dos grupos II e IV foram cobertas com o TachoSil. Solução salina (2 ml/dia grupos I e II) ou 5-FU (20 mg/kg/dia grupos III e IV) foi administrado por via IP uma vez ao dia, desde do procedimento cirúrgico até a morte programada dos animais no quarto dia pós-operatório. Foram realizadas medidas da pressão de ruptura e análise histopatológica das anastomoses. A perda relativa de peso foi significativamente maior nos animais do grupo III comparado a todos os demais grupos (p=0,0004). Não houve diferença significativa entre os grupos no que se refere à presença de fístulas, coleções perianastomóticas, sinais de dilatação intestinal pré-anastomótica ou aderências pós-operatórias. A pressão de ruptura foi significativamente menor no grupo III comparada a todos os demais grupos (p=0,001). A neoangiogênese foi significativamente menor no grupo III comparada aos grupos I e II (p=0,05). A infiltração fibroblástica foi significativamente maior no grupo I e em comparação ao grupo III (p=0,035). Não ocorreu diferença significativa entre os grupos no que concerne à presença de infiltração de células inflamatórias e deposição de colágeno. Os dados obtidos permitem concluir que a QT IP precoce com 5-FU afetou negativamente a fase inicial da cicatrização de anastomoses colônicas. Contudo, a selagem com o TachoSil foi capaz de reverter alguns dos efeitos adversos decorrentes da QT. / The administration of 5-fluorouracil (5-FU) during the early postoperative period can decrease local cancer recurrence but may also cause impairment of the anastomotic healing. This study examined the effects of the use of this therapy and of the anastomotic sealing with a fibrin-collagen patch (TachoSil) on the healing of colon anastomoses. Forty male rats were divided into four groups (I to IV, 10 rats each) that underwent transection and anastomosis of the left colon. The anastomoses were covered with TachoSil in groups II and IV. Saline solution (2 ml/day groups I and II) or 5-FU (20 mg/kg/day; groups III and IV) was administered intraperitoneally (IP) once daily for three days. Bursting pressure (BP) was recorded and the anastomoses were examined macroscopically and graded histologically. The relative weight loss was significantly higher in group III than in the other groups (p=0.0004). Anastomotic dehiscense, postoperative adhesion formation, perianastomotic collections, and preanastomotic dilatation did not differ significantly among groups. BP was significantly lower in group III compared to all other groups (p=0.001). Neoangiogenesis was significantly lower in group III compared to groups I and II (p=0.05). Fibroblastic activity was significantly higher in group I compared to group III (p=0.035). Inflammatory cell infiltration and collagen deposition did not differ significantly among groups. Our results shown that the early postoperative IP chemotherapy with 5-FU impaired the healing of colon anastomoses. However, anastomotic sealing with TachoSil reversed some of the negative effects of this therapy.

A administração intraperitoneal de 5-fluorouracil (5-FU) no pós-operatório imediato reduz a recorrência local e prolonga a sobrevida dos pacientes com câncer colônico. Contudo, esse tratamento também pode prejudicar a cicatrização das anastomoses intestinais. O objetivo deste estudo foi determinar os efeitos da quimioterapia (QT) intraperitoneal (IP) pós-operatória (PO) precoce com o 5-FU e da selagem anastomótica com o TachoSil sobre o processo de cicatrização de anastomoses colônicas. Quarenta ratos foram divididos em quatro grupos (I - IV, com dez ratos em cada) e submetidos à secção do cólon esquerdo seguida por anastomose. As anastomoses dos ratos dos grupos II e IV foram cobertas com o TachoSil. Solução salina (2 ml/dia grupos I e II) ou 5-FU (20 mg/kg/dia grupos III e IV) foi administrado por via IP uma vez ao dia, desde do procedimento cirúrgico até a morte programada dos animais no quarto dia pós-operatório. Foram realizadas medidas da pressão de ruptura e análise histopatológica das anastomoses. A perda relativa de peso foi significativamente maior nos animais do grupo III comparado a todos os demais grupos (p=0,0004). Não houve diferença significativa entre os grupos no que se refere à presença de fístulas, coleções perianastomóticas, sinais de dilatação intestinal pré-anastomótica ou aderências pós-operatórias. A pressão de ruptura foi significativamente menor no grupo III comparada a todos os demais grupos (p=0,001). A neoangiogênese foi significativamente menor no grupo III comparada aos grupos I e II (p=0,05). A infiltração fibroblástica foi significativamente maior no grupo I e em comparação ao grupo III (p=0,035). Não ocorreu diferença significativa entre os grupos no que concerne à presença de infiltração de células inflamatórias e deposição de colágeno. Os dados obtidos permitem concluir que a QT IP precoce com 5-FU afetou negativamente a fase inicial da cicatrização de anastomoses colônicas. Contudo, a selagem com o TachoSil foi capaz de reverter alguns dos efeitos adversos decorrentes da QT. / The administration of 5-fluorouracil (5-FU) during the early postoperative period can decrease local cancer recurrence but may also cause impairment of the anastomotic healing. This study examined the effects of the use of this therapy and of the anastomotic sealing with a fibrin-collagen patch (TachoSil) on the healing of colon anastomoses. Forty male rats were divided into four groups (I to IV, 10 rats each) that underwent transection and anastomosis of the left colon. The anastomoses were covered with TachoSil in groups II and IV. Saline solution (2 ml/day groups I and II) or 5-FU (20 mg/kg/day; groups III and IV) was administered intraperitoneally (IP) once daily for three days. Bursting pressure (BP) was recorded and the anastomoses were examined macroscopically and graded histologically. The relative weight loss was significantly higher in group III than in the other groups (p=0.0004). Anastomotic dehiscense, postoperative adhesion formation, perianastomotic collections, and preanastomotic dilatation did not differ significantly among groups. BP was significantly lower in group III compared to all other groups (p=0.001). Neoangiogenesis was significantly lower in group III compared to groups I and II (p=0.05). Fibroblastic activity was significantly higher in group I compared to group III (p=0.035). Inflammatory cell infiltration and collagen deposition did not differ significantly among groups. Our results shown that the early postoperative IP chemotherapy with 5-FU impaired the healing of colon anastomoses. However, anastomotic sealing with TachoSil reversed some of the negative effects of this therapy.

Vários métodos de análise para o ensaio do quimioterápico 5-Fluorouracil (5-FU) em fluidos biológicos de humanos e animais, foram previamente relatados. Considerando que a administração do 5-FU altera de alguma maneira a morfologia e função das glândulas salivares, e que a presença do quimioterápico na mucosa oral pode levar a algumas complicações orais, este trabalho teve como objetivo de determinar a presença de 5-FU na saliva de hamsters que receberam o quimioterápico pela técnica de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE), uma vez que este modelo animal é usado nos estudos com mucosite oral e hipofunção glandular, induzidas por 5-FU. Doze animais foram divididos em 4 grupos: CP e CPI, onde os animais receberam intraperitonealmente pilocarpina (CP) ou pilocarpina + isoproterenol (CPI) e o veículo do quimioterápico, e os grupos QP e QPI, onde os animais receberam, respectivamente, os mesmos secretagogos listados acima e o quimioterápico 5-FU. Após a administração do secretagogo, foi coletada a saliva de todos os animais, por um período de 60 min. Em seguida, a saliva foi congelada a -80 ?C para posterior determinação do quimioterápico por CLAE. Após análise dos cromatogramas, e com base nos resultados obtidos, foi possível identificar a presença do 5-FU nas amostras de saliva de hamsters que receberam o quimioterápico via intraperitoneal pela técnica da CLAE. / Various analytical methods for testing the chemotherapeutic agent 5-fluorouracil (5-FU) in biological fluids of humans and animals have been reported previously. Whereas the administration of 5-FU alter in any way the morphology and function of the salivary glands, and that the presence of chemotherapy in the oral mucosa can lead to some oral complications, this study aimed to determine the presence of 5-FU in chemotherapy treated hamsters saliva by Liquid Chromatography High Performance (HPLC), since this animal model is used in studies of oral mucositis and gland hypofunction induced by 5-FU. Twelve animals were divided into 4 groups: intraperitoneally pilocarpine (CP), pilocarpine + isoproterenol (CPI) and the chemotherapy of the vehicle, and the QP and QPI groups where the animals were, respectively, the same secretagogues listed above and 5-FU chemotherapy. After administration secretagogue, the saliva from all animals was collected for a period of 60 min. Then the saliva was frozen at -80 ºC for subsequent determination of chemotherapy by HPLC. After analysis of chromatograms, and based on the results obtained, it was possible to identify the presence of 5-FU in Hamsters saliva samples that received intraperitoneal chemotherapy via the technique of HPLC.

Le 5-Fluorouracile (5-FU) est un anti-métabolite intensément utilisé dans les traitements chimio-thérapeutiques de nombreux cancers. Cependant, les mécanismes moléculaires de l'action de cet agent anti-cancer, son impact sur la biologie cellulaire et les processus de résistance restent encore largement à déterminer. Nous avons proposé que le 5-FU, en s'intégrant dans l'ARN induit une altération de la traduction. Dans cette étude, nous avons déterminé pour la lignée de cellules de cancer colorectal HCT116 la dose et le temps de traitement qui induit une modification du comportement cellulaire sans conduire à une mort cellulaire massive. Nous avons ensuite analysé le translatome de ces cellules traitées et celui de cellules non traitées. Pour cela, les fractions cytoplasmiques ont été purifiées et séparées sur gradients de saccharose pour séparer les ARNm qui sont associés aux polysomes de ceux associés aux monosomes et des ARN libres. L'analyse des modifications du translatome induites par le 5-FU montre que cette drogue est capable de stimuler la traduction d'un grand nombre d'ARNm qui codent pour des protéines possédant diverses fonctions. Cette activation traductionnelle est probablement médiée, au moins en partie, par une action du 5-FU sur les microARN. C'est ainsi que nous avons démontré que la stimulation de la traduction de l'ARNm du gène HIVEP2 est un mécanisme dépendant du microARN miR-155 / 5-Fluorouracil (5-FU) is an anti-metabolite intensely used in chemotherapeutic treatments in various cancers. The cellular and molecular mechanisms of action of this anti-cancer agent still remain to be determined. Because 5-FU is incorporated within all classes of RNA, knowledge of the different levels of gene expression regulation affected by 5-FU will help to decipher its mode of action. We hypothesized that the translational control is altered by 5-FU treatment as a consequence of disrupted RNA metabolism. In this study, the colorectal cancer cell line HCT116 has been treated or not by different doses of 5-FU for different periods of time to determine the time and dose window that induces modifications of cell behavior without leading to an extensive cell death. Translational reprogramming was then analyzed during this time and dose window. For this, cytoplasmic fractions were purified and separated through sucrose gradients to distinguish the actively translated mRNAs that are associated with polysomes from the inactive mRNAs associated with monosomes or free mRNAs. A microarray analysis was then performed to identify the mRNAs presented in monosome and polysome fractions with and without treatment. This polysome profiling approach reveals that 5-FU treatment did not turn-off the global translation efficiency, but rather modulates translation efficiency of specific mRNAs. Secondly, more than 640 mRNAs were found to be up-translated following 5-FU treatment. Finally, we have demonstrated that 5-FU induced up-regulation of HIVEP2 by a molecular mechanism involving an action of 5-FU on miR-155

Made available in DSpace on 2017-07-24T19:37:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dhesmon Lima.pdf: 3726533 bytes, checksum: d3be37b6257d9747cd2404bc48091086 (MD5) Previous issue date: 2016-02-26 / In this work, glassy carbon paste electrodes (GCPE) were modified with porphyran- capped gold nanoparticles (GCPE/AuNps-PFR) and applied for the determination of an anticancer drug, 5-fluorouracil (5-FU), by using differential pulse voltammetry (DPV). The PFR polysaccharide was isolated from commercial Nori seaweed, and its characterization was carried out by FTIR and 13C-NMR as well as by determining its total sugar and sulfate contents, which resulted in 82.8% and 11.9%, respectively. These experiments confirmed the chemical identity and purity of the extracted polysaccharide, which was used as reducing and capping agent to the synthesis of gold nanoparticles (AuNps-PFR). The temperature and the concentrations of AuCl4- and PFR for the AuNps-PFR synthesis were optimized by a 23 full factorial design including a central point assayed in triplicate. The smallest particles were produced with 128.7 nm by employing a temperature of 70 °C and concentrations of 2.5 mmol L-1 for AuCl4- and 0.25 mg mL-1 for PFR. The characterization of the AuNps-PFR nanocomposite was performed by UV-VIS, FTIR and DLS spectroscopies, FESEM, zeta potential and XRD. The UV-VIS spectrum showed an absorption at 524 nm (plasmon band), with no significant changes in its shape and absorption frequency for 90 days. This observation suggests that the AuNps-PFR are stable in suspension, which is in good agreement with the zeta potential of -30.5 mV obtained for the sample. The FTIR spectrum revealed that interactions between the AuNps and the PFR may exist, as a consequence of displacements in the frequency of the bands in the AuNps-PFR spectrum compared to that obtained for the PFR individually. The electrochemical characterization of the porphyran modified GCPE (GCPE/PFR) was carried out by cyclic voltammetry and electrochemical impedance spectroscopy in the presence of the Fe(CN)63-/4- probe, revealing that the polysaccharide had a positive effect on the electrode response, since higher current values and a lower charge transfer resistance for the electrochemical probe redox process were achieved compared to the unmodified GCPE. Even better responses were obtained after the modification of the GCPE with the synthetized AuNps-PFR, as a consequence of the high electrical conductivity and large surface area displayed by the nanocomposite. The 5-FU was oxidized on the GCPE/AuNps-PFR surface according to an irreversible, pH dependent and diffusion controlled mechanism, showing an anodic wave at +1,1 V in BR buffer solution 0.04 mol L-1. The highest current value for 5-FU determination was achieved in BR buffer with pH 8.0, by DPV; therefore, this value was chosen for the further analysis. A linear relationship was observed between the anodic peak potential and the pH of the medium with a slope of -69 mV pH-1, demonstrating that the same number of protons an electrons participate in the 5-FU oxidation mechanism. The GCPE/AuNps-PFR exhibited a linear relationship between the peak current and 5-FU concentration over the range of 29.9 to 234.0 μmol L-1, with low detection (0.66 μmol L-1) and quantification limits (2.22 μmol L-1). Besides the good sensitivity for detecting 5-FU, the modified electrode showed reproducibility, and its response was not influenced by interfering compounds such as glucose, urea, albumin, ascorbic acid, Na+ and K+, suggesting its potential application to determine 5-FU in biologic matrices. The practical utility of the developed sensor was demonstrated for the quantification of 5-FU in pharmaceutical injection sample. A good average recovery percentage of 104.0% was achieved, with an acceptable relative standard deviation of 2.25%. So, these results could confirm the promising analytical performance of the modified electrode for the electroanalysis of 5-FU in real samples. / Neste trabalho, eletrodos de pasta de carbono vítreo (EPCV) foram modificados com nanopartículas de ouro estabilizadas no polissacarídeo sulfatado porfirana (PFR) e aplicados para a determinação do agente antitumoral 5-fluorouracil (5-FU), utilizando voltametria de pulso diferencial (VPD). A PFR foi extraída a partir de alga Nori comercial, e sua caracterização foi realizada por FTIR, RMN-13C e pela determinação dos teores de carboidratos totais e de grupos SO42-, os quais resultaram em 82,8% e 11,9%, respectivamente. Tais experimentos confirmaram a pureza e a identidade química do polissacarídeo extraído, que foi empregado como agente redutor e estabilizante para a síntese de nanopartículas de ouro (AuNps-PFR). A temperatura, a concentração do precursor AuCl4- e a concentração de PFR empregadas para a síntese das AuNps-PFR foram otimizadas por meio de um planejamento fatorial 23 com triplicata no ponto central. Um menor tamanho de partícula (128,7 nm) foi alcançado ao se empregar uma temperatura de 70 °C e concentrações de AuCl4- e PFR iguais a 2,5 mmol L-1 e 0,25 mg mL-1, respectivamente. As AuNps-PFR obtidas foram caracterizadas pelas espectroscopias UV-VIS, FTIR e DLS, MEV-FEG, potencial zeta e DRX. O espectro de UV-VIS mostrou uma banda em 524 nm (banda plasmon), que não apresentou variações significativas na forma e frequência de absorção durante 90 dias. Tais observações sugeriram que as AuNps-PFR são estáveis em suspensão, o que corrobora com o potencial zeta de -30,5 mV obtido para a mesma. O espectro de FTIR evidenciou a existência de interações entre as AuNps e a PFR, devido a deslocamentos das bandas apresentadas no espectro das AuNps-PFR em relação ao obtido para a PFR. A caracterização eletroquímica do EPCV/PFR, realizada por voltametria cíclica (VC) e espectroscopia de impedância eletroquímica em meio da sonda Fe(CN)63-/4-, evidenciou que o polissacarídeo conferiu aos eletrodos maiores valores de corrente e menor resistência à transferência de carga para o processo redox da sonda eletroquímica em comparação aos eletrodos não modificados. Respostas de corrente ainda maiores foram obtidas ao se empregar o EPCV/AuNps-PFR, como uma consequência da elevada condutividade e alta área superficial apresentada pelas nanopartículas. Por VC, verificou-se que o 5-FU foi oxidado irreversivelmente na superfície do EPCV/AuNps-PFR segundo um mecanismo dependente do pH e controlado por difusão, apresentando um processo anódico em +1,1 V em tampão BR 0,04 mol L-1. O pH do tampão BR para a determinação de 5-FU foi otimizado por VPD, tendo-se observado um máximo de corrente em pH 8,0, valor empregado para a obtenção das curvas analíticas. A relação linear observada entre o potencial de pico e o pH do meio com inclinação de -69,0 mV pH-1 evidenciou que o mesmo número de prótons e elétrons estão envolvidos no processo de oxidação. O EPCV/AuNps-PFR apresentou linearidade de resposta na faixa de 29,9 a 234,0 μmol L-1 de 5-FU, com limites de detecção e de quantificação iguais a 0,66 e 2,22 μmol L-1, respectivamente. Além da boa sensibilidade ao 5-FU, o EPCV/AuNps-PFR apresentou reprodutibilidade de resposta, e não sofreu interferência significativa de compostos como glicose, ácido ascórbico, ureia, albumina e íons Na+ e K+, sugerindo sua potencial aplicação para a determinação de 5-FU em matrizes biológicas. O eletrodo modificado foi aplicado para a quantificação do 5-FU em formulação farmacêutica comercial injetável, tendo-se obtido uma porcentagem média de recuperação igual a 104,0, com desvio padrão relativo dentro dos limites aceitáveis (2,25%). Confirma-se, deste modo, o bom desempenho analítico do sensor e da metodologia voltamétrica desenvolvida para a eletroanálise do 5-FU em amostras reais.