Les kisspeptides (KP), puissants sécrétagogues de la GnRH, agissent par l'intermédiaire du récepteur couplé aux protéines G, le GPR54. Une perfusion i.v. de KP est non seulement capable de synchroniser les ovulations chez la brebis cyclique, mais également d’induire un cycle chez la brebis en anoestrus. L'objectif de ma thèse a été d'étudier la neuroanatomie du système KP / GnRH, et de définir des applications potentielles du KP dans le contrôle du cycle chez la jument cyclique et en anoestrus. Nos résultats ont permis de montrer que 1) le KP interagit avec le système GnRH au niveau hypothalamique, 2) une perfusion i.v. de KP en début de phase folliculaire conduit à une stimulation - quoique transitoire – de la sécrétion des gonadotropines, 3) une capacité limitée pour reconstituer le stock en GnRH et / ou LH / FSH pourrait expliquer la nature transitoire de la stimulation par le KP, 4) une perfusion de KP pendant 3 jours, depuis le début de la phase folliculaire, tend à avancer le pic péri-ovulatoire de LH et l'ovulation, 5) une perfusion plus longue (soit plus de 3 jours) de KP, pendant toute la phase folliculaire, n’induit pas une ovulation plus précoce, 6) pendant la saison d'anoestrus, une perfusion de KP pendant 3 jours stimule la sécrétion de LH, avec une intensité néanmoins inférieure à celle observée avec une perfusion de GnRH. En conclusion, bien que l'utilisation potentielle du KP pour synchroniser ou induire l'ovulation pendant la saison de reproduction semble discutable, sa capacité à induire des cycles durant la période d'anoestrus présente un intérêt et mérite des études plus approfondies. / Kisspeptins (KP) are very potent secretagogues of GnRH which act through the G protein-coupled receptor GPR54. An i.v. infusion of KP is not only able to synchronize ovulations of cyclic ewes, but also to induce cycle in anoestrus ewes. The aim of my thesis was to investigate the neuroanatomy of the KP / GnRH system, and define potential applications for KP in the control of the estrus cycle in the cyclic and anoestrus mares. Our results showed that 1) KP interact with GnRH systems at the hypothalamic level, 2) an i.v. infusion of KP during early follicular phase leads to an enhanced - albeit transient - secretion of gonadotropins, 3) a limited ability to replenish GnRH and/or LH/FSH stores might explain the transient nature of the KP stimulation, 4) an infusion of KP for 3 days, since early follicular phase, modestly advances the periovulatory LH surge and the ovulation, 5) a longer (i.e. more than 3 days) infusion of KP during all the follicular phase does not lead to precocious ovulation, 6) during the anoestrus season, an infusion of KP for 3 days heightens LH secretion, with however a lower intensity to that observed with an infusion of GnRH. In conclusion, albeit the potential use of KP to synchronize or induce ovulation during the breeding season appears questionable, its ability to induce cycles during the anoestrus period is of interest and warrants further investigation.

A influência do momento da ablação do folículo dominante antes do início do tratamento superovulatório, e seu efeito sobre a dinâmica folicular ovariana e a taxa de produção de embriões, ainda permanece indeterminada em bovinos. O presente estudo foi desenvolvido com objetivo de avaliar a resposta superovulatória de fêmeas da raça Limousin, determinando os efeitos da influência do dia de início da superovulação (SOV) de animais no diestro; da presença ou ausência de folículos palpáveis nos ovários no momento de início do tratamento (status ovariano); e do tempo, em horas, entre a ablação folicular e o início da SOV. Foram realizadas 244 lavagens uterinas para coleta de embriões em novilhas (n=98) e vacas (n=146), divididas em cinco grupos de acordo com o status ovariano no momento de início da SOV, durante o intervalo de 8 a 12 dias após o estro: grupo sem folículo perceptível (n=106); grupo com folículo mantido intacto (n=62) e grupos com folículo puncionado 48 h (n=10), 24 h (n=35) e 0 h (n=31) antes do início da SOV. Nos grupos em que foi realizada a ablação, utilizou-se uma cânula de metal contendo uma agulha para transposição da parede vaginal e ovariana até a aspiração do conteúdo folicular sob controle tátil por via retal. Os resultados obtidos determinaram que a presença de folículos palpáveis no momento de início da SOV reduz significativamente a resposta superovulatória. Os dados de ablação folicular realizada imediatamente ou até 24 h antes do início do tratamento de SOV aumentaram significativamente o número total de embriões viáveis. Entretanto, a resposta do tratamento superovulatório não foi afetada pelo dia do início da aplicação de gonadotrofina no período de 8 a 12 dias após o estro e nem pela categoria animal (novilha ou vaca). Em conclusão, a ablação de folículos perceptíveis por palpação retal entre os dias 8 a 12 do ciclo estral, quando realizada até 24 h antes do início do tratamento de SOV, aumentou o número total de embriões transferíveis por coleta em gado de corte (Bos taurus taurus). / The influence of the timing for the ablation of dominant follicle prior to superovulatory treatment, and its effect on ovarian follicular growth and embryo yield, still remain elusive in cattle. The present study was designed to evaluate the superovulatory response of Limousin cattle, aiming to determine the effect of the day at mid-diestrus for the onset of superovulation (SOV); presence or absence of large ovarian follicles (ovary status); and the time of follicular ablation, in hours, prior to the SOV. A total of 244 uterine flushings for embryo collections were made using two female categories (heifers or cows) at 8 to 12 days after the estrous. Based on ovary status, the females were allocated into 5 groups: group without palpable follicle(s) (n=106); group with intact follicle(s) (n=62), and groups with follicle ablation at 48 h (n=10), 24 h (n=35) and 0 h (n=31) before the beginning of SOV. Follicles were aspirated transvaginally using a specially designed custom-built steel cannula for follicular cyst puncture. Ovaries bearing follicles were positioned adjacent to the vaginal wall by rectal manipulation. The needle was pushed through the vaginal wall for the puncture and aspiration of the follicular contents. Data obtained demonstrated that the presence of large follicles at the onset of SOV treatment reduced the superovulatory response. The follicular ablation performed immediately or up to 24 h before the SOV increased the total number of viable embryos. However, the superovulatory response was not affected by the day of the start the SOV and by the animal category (heifer or cow) at the period of 8 to 12 days after estrus. In conclusion, the ablation of palpable follicles between days 8 to 12 of the estrous cycle, when accomplished up to 24 h before the beginning of the treatment of SOV, increased the total number of transferable embryos per flushing in beef cattle (Bos taurus taurus).

Introdução: A taxa da prevalência da infertilidade em casais com idade reprodutiva atinge 8-10%. A fim de tentar contornar esse problema, esses casais optam pela reprodução assistida. Em muitos dos casos, os resultados das técnicas de reprodução assistida (TRA) são bem sucedidos ao realizarem a fertilização in vitro (FIV), em outros não são satisfatórios ou ocorrem gestações múltiplas que aumenta o risco de morbidade a essas gestantes. Diante deste quadro, estudam-se formas de aperfeiçoar as TRA no que se refere à seleção do embrião. O hormônio anti-Mülleriano (AMH) já desempenha este papel ao refletir a reserva ovariana na rotina das clínicas de FIV. Os antígenos leucocitários humanos-G solúveis (sHLA-G) vêm sendo investigado no seu papel em refletir a qualidade embrionária. A existência da associação entre as concentrações de HLA-G mensuradas em fluido folicular e a qualidade embrionária avaliada pelo critério de pontuação Graduated Embryo Score (GES) poderia caracterizar o sHLA-G como um possível biomarcador de qualidade embrionária. Objetivos: Investigar a associação entre as concentrações do sHLA-G no fluido folicular (FF) e a pontuação dos embriões gerados avaliados pelo critério GES em ciclos de mulheres submetidas à fertilização in vitro (FIV). Métodos: Um estudo transversal foi realizado. Avaliaram-se setenta e três mulheres com idade ≤ 39 anos, submetidas à FIV pelas seguintes causas: fator tubário, fator masculino e/ou endometriose, com ambos os ovários e níveis hormonais de TSH, FSH e PRL dentro dos valores de referência. Não foram elegíveis ao estudo mulheres com síndrome de hiperestimulação ovariana no ciclo avaliado, com doença auto-imune, com síndrome dos ovários policísticos, com luteinização precoce e/ou endometrioma. Realizou-se a mensuração de sHLA-G por ELISA no FF de um pool de folículos puncionados das mulheres submetidas à indução de ovulação para a FIV. Os embriões obtidos após fertilização foram classificados segundo o critério GES. As outras variáveis necessárias foram transcritas dos prontuários das pacientes participantes no estudo. Resultados: A associação entre as concentrações de sHLA-G e o escore médio dos embriões gerados não foi observada. Observou-se uma sensibilidade aumentada do teste ELISA, quando comprada aos estudos da literatura, com detecção em mais de 98% das amostras analisadas. Foi encontrada uma associação significativa entre o AMH e a idade (r=-0,38; p=0,003), entre AMH e total de oócitos ( r=0,53; p<0,05) e idade e total de oócitos (r= -0,31, p=0,009). A mensuração de sHLA-G em mulheres com endometriose e sem endometriose (fator tubário e masculino) não mostrou diferença significativa (p=0,57). Conclusão: Não houve associação entre a qualidade embrionária e dosagens de sHLA-G. Diante destes resultados, ainda está controverso o uso de sHLA-G mensurado em FF como marcador prognóstico de qualidade de embrião embrionária avaliada pelo critério GES. Os resultados encontrados referentes ao AMH corroboram com a literatura. / Background: The prevalence of infertility rate in the couples in reproductive age reaches 8-10%. In order to solve this problem, these couples opt for assisted reproduction. In many cases, the results of assisted reproduction techniques (ART) are successful in performing the in vitro fertilization (IVF), while in others they are not satisfactory or occur multiple pregnancy that increase morbidity risk to these pregnant women. In this context, several studies attempt new forms for to improve the ART in the selection the embryo. The anti-Müllerian hormone (AMH) already plays this role to reflect the ovarian reserve in IVF clinics routine. Soluble human leukocyte antigen-G (sHLA-G) has been investigated its role to reflect the embryo quality. The existence of the association between the sHLA-G concentrations measured in follicular fluid and embryo quality based on Graduated Embryo Score (GES) criteria could characterize the sHLA-G as a possible biomarker of embryo quality. Objectives: Our study investigated the association between the sHLA-G concentrations in follicular fluid (FF) and the score of embryo evaluated by Graduated Embryo Score (GES) criteria in women cycles treated by in vitro fertilization (IVF). Methods: A cross-sectional study was conducted. Evaluated a total of seventy-three women aged ≤ 39 years, undergoing IVF because of tubal factor, male factor and / or endometriosis, with both ovaries and hormone levels of TSH, FSH and PRL within the range of reference. It was not eligible to study women with ovarian hyperstimulation syndrome in the evaluated cycle, autoimmune disease, polycystic ovary syndrome, with early luteinization and / or endometrioma. In this study was measured the sHLA-G by ELISA in FF from a pool of follicles punctured of women undergoing ovulation induction for IVF. The embryos after fertilization were classified by GES criteria. The other study variables were transcribed from medical records of patients. Results: The association between concentrations of sHLA-G and the average score of the generated embryos was not observed. Sensitivity of the ELISA was observed with detection by more than 98% of the samples. Significant association was found between AMH and age (r = -0.38; p = 0.003), between AMH and total oocytes (r = 0.53; p <0.05) and age and total oocytes (r = -0.31, p = 0.009). The results of sHLA-G in women with endometriosis and without endometriosis (tubal and male factor) showed no significant difference (p = 0.57). Conclusion: There was no association between embryo quality and the dosages of sHLA-G. Considering these results, the use of sHLA-G measured in FF as a prognostic marker of quality embryo based on GES criteria is still controversial. The results for the AMH corroborate with the literature.

O folículo ovariano é composto pelo oócito (gameta feminino) e por várias camadas de células foliculares somáticas, sendo que destas, as mais intimamente associadas com o oócito são as células do cumulus oophorus (CCs), as quais estão em contato direto com o gameta feminino e formam o complexo cumulus-oócito (CCO), e as células murais da granulosa (CGs), que revestem a parede do folículo ovariano. Visto que estas CGs e CCs são facilmente acessadas durante tratamentos de reprodução assistida (RA), que podem ser coletadas sem comprometimento do oócito e que são descartadas após a recuperação do oócito é possível que elas sejam utilizadas em pesquisas que visam elucidar a fisiologia ovariana. No entanto, quando recuperadas, nos ciclos de reprodução assistida, estas células se encontram em um estado luteinizado, devido ao tratamento hormonal que as pacientes realizam. Sabe-se que o uso de CGs luteinizadas em cultura celular para o estudo do processo molecular ovulatório é limitado visto esta prévia exposição celular às gonadotrofinas e ao seu estado luteinizado. Porém, foi demonstrado que CGs luteinizadas podem readquirir sua capacidade de resposta à estimulação por gonadotrofinas, recuperando características semelhantes às daquelas de folículos não luteinizados nos estágios iniciais de diferenciação (early antral não luteinizado). A estimulação destas células com FSH causa aumento na expressão de genes que caracterizam CGs típicas de folículos pré-ovulatórios (pré-ovulatório não luteinizado). Ainda, outra questão importante com relação ao folículo ovariano diz respeito à ação dos androgênios nesta estrutura ovariana, sendo que já se sabe que a ativação do receptor de androgênio, localizado nas células foliculares, é capaz de modular a expressão e a atividade de genes importantes para a manutenção do desenvolvimento do folículo ovariano. Desta forma, sugere-se que o efeito reprodutivo do tratamento com dehidroepiandrosterona (DHEA) e seu sulfato (SDHEA), importantes androgênios, pode ser devido às suas ações justamente no microambiente folicular. Portanto, o objetivo deste trabalho foi analisar a exposição de células foliculares desluteinizadas (estágios early antral e pré-ovulatório) ao SDHEA. Para isto, células da granulosa e do cumulus foram obtidas de pacientes submetidas à fertilização in vitro e foram cultivas separadamente. Inicialmente, fez-se a determinação do melhor tempo de cultivo deste modelo celular proposto, dentre 6, 8 ou 10 dias de cultivo. As análises de viabilidade celular realizadas mostraram que o melhor tempo para o cultivo primário folicular, para as próximas etapas do trabalho, seria de oito dias. Após, também por análises de viabilidade celular, a melhor dose de SDHEA para exposição às células foliculares foi determinada dentre cinco doses testadas em comparação a um controle sem exposição hormonal. As análises mostraram que a dose mais adequada a ser utilizada era a dose de 0,08 μM de SDHEA. Posteriormente, tendo definido o melhor tempo de cultivo e a dose ideal de exposição das células em questão ao SDHEA, os experimentos foram realizados com dois grupos experimentais distintos: células early antral não luteinizadas e células pré-ovulatórias não luteinizadas – expostas ao FSH. Ambos os grupos foram divididos em dois subgrupos: grupo controle (sem exposição hormonal) e grupo SDHEA (com exposição ao SDHEA). Foram feitas dosagens hormonais de SDHEA, de estradiol e de progesterona nos dias 1, 4, 6 e 8 do sobrenadante do cultivo celular. A análise ao longo do tempo mostrou que os valores das dosagens de SDHEA se mantiveram constantes no grupo controle durante todo o período de cultivo celular, não havendo diferença estatística entre as quatro dosagens hormonais feitas neste grupo. Por outro lado, no grupo tratado houve diferença nos valores deste hormônio nos dias 6 e 8, em comparação aos dias 1 e 4, devido justamente ao tratamento com SDHEA realizado neste grupo experimental. Com relação ao estradiol, independente do tipo celular e do estágio de desenvolvimento, foi possível ver que a sua secreção era elevada no primeiro dia de cultivo, diminuindo nos outros dias devido às condições e ao tempo de cultivo do protocolo de desluteinização celular. Além disso, as células tratadas com SDHEA apresentaram uma secreção de estradiol superior àquelas não tratadas. Por fim, as dosagens de progesterona revelaram que o tratamento com SDHEA não alterou a secreção deste hormônio pelas células, em nenhum dos dois estágios de desenvolvimento. Ainda, as células apresentaram uma secreção aumentada de progesterona no sexto dia de cultivo celular em comparação ao primeiro e ao quarto dia; porém, esta secreção começou a diminuir quando do oitavo dia de cultivo. Tendo em vista os resultados obtidos, podemos concluir que o tratamento com SDHEA é capaz de aumentar a secreção de estradiol de células foliculares não luteinizadas, não alterando a secreção de progesterona dessas mesmas células. Mais estudos são necessários para um melhor entendimento dos efeitos do SDHEA nos processos que compõem a foliculogênese. / Ovarian follicle is formed by the oocyte (female gamete) and somatic follicular cells. Those closer to the oocyte are cumulus oophorus cells (CCs), which are in direct contact with the female gamete, and the granulosa mural cells (GCs), which form the wall of the ovarian follicle. As GCs and CCs are easily accessed during assisted reproduction procedures and are discarded after oocyte retrieval, they can be used in research aimed at elucidating ovarian physiology. However, when recovered in assisted reproduction cycles, these cells are in a luteinized state due patient hormonal treatment. It is known that the use of luteinized GCs to study the molecular ovulatory process is limited due to this prior cellular exposure to gonadotrophins and their luteinized state. However, luteinized CGs have been shown to reacquire similar characteristics to those of non-luteinized follicles in early stages of differentiation (non-luteinized early antral). Stimulation of these cells with follicle stimulating hormone (FSH) increases expression of genes that characterize CGs typical of pre ovulatory follicles (non-luteinized pre ovulatory). Another important question regarding the ovarian follicle relates to androgens action in this ovarian structure. As it is known, androgen receptor activation, located in follicular cells, is able to modulate expression and activity of important genes for the maintenance of ovarian follicle development. Thus, authors suggest that the reproductive effect of dehydroepiandrosterone (DHEA) and their sulfate (SDHEA) treatment, important androgens, may be due their actions precisely in the follicular microenvironment. Consequently, the aim of this work was to analyze the exposure to SDHEA of non-luteinized follicular cells (early antral and pre-ovulatory stages). Granulosa and cumulus cells were obtained from patients submitted to in vitro fertilization and were separately cultivated. Initially, the best culture time of this proposed cellular model was determined among 6, 8 or 10 days of culture. Cellular viability analysis showed that primary follicular culture for the next steps of the study would be of 8 days. Thereafter, cellular viability assays were used to determine the best SDHEA dose among 5 doses to follicular cells exposure in comparison to a control without hormonal exposure. The analysis showed that the best dose to use was 0,08 μM of SDHEA. Subsequently, after defined the best culture time and the ideal exposure dose of the cells to SDHEA, experiments were performed with two different experimental groups: non-luteinized early antral cells and non-luteinized pre ovulatory cells – exposed to FSH. Both groups were divided in two subgroups: control group (no hormonal exposure) and SDHEA group (with SDHEA exposure). SDHEA, estradiol and progesterone hormonal dosages of the cell culture supernatant were done on days 1, 4, 6 and 8. Over time analysis revealed that SDHEA values were constant in control group during all the cell culture period, without statistical difference between the four hormonal dosages performed in this group. However, treated group showed a difference in the values of this hormone on days 6 and 8, compared to days 1 and 4, due to treatment with SDHEA of these experimental group . Regarding estradiol, independent of cell type and stage of development, it was possible to see that its secretion was high on the first day of culture, decreasing in others due to conditions and time of culture of the non-luteinized cells protocol. In addition, the SDHEA treated cells presented higher estradiol secretion than those not treated. Finally, progesterone dosages revealed that treatment with SDHEA did not alter this hormone secretion from the cells in either of the two development stages. Besides that, the cells had an increased progesterone secretion on the sixth cell culture day compared to first and fourth day; however, this secretion began to decrease on the eight day of culture. In conclusion, SDHEA treatment is able to increases the non-luteinized follicular cells secretion of estradiol, but it is not able to modify the progesterone secretion of the same cells. More studies are needed to better understand the effects of SDHEA on the process that make part of folliculogenesis.

Orientadora: Prof. Dra. Marcella Pecora Milazzotto. / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biotecnociência, 2016. / A maturação de oócitos in vitro é amplamente utilizada para produção de embriões e tenta mimetizar as condições fisiológicas foliculares, permitindo a capacitação oocitária. No entanto, as condições foliculares a que os oócitos estão submetidos previamente a aspiração podem ser responsáveis por diferenças que serão refletidas no fenótipo embrionário. O objetivo deste trabalho foi quantificar marcadores metabólicos no fluido folicular (FF) e transcritos das células da granulosa (CG) de bovinos envolvidos na capacitação do oócito e sua relação com a competência embrionária (avaliada pela cinética e desenvolvimento a blastocisto). Para isso, foram aspirados individualmente complexo cumulus-oocito (COCs) e respectivos FFs e CG de folículos de 7-8mm de ovários de abatedouro comercial. As moléculas de glicose, colesterol, estradiol e piruvato foram quantificadas nos FFs por fluorimetria e os transcritos de receptor de FSH (FSH-R), receptor de angiotensina II (AngIIAT2), receptor de EGF (EGF-R) e aromatase (CYP19A) foram quantificados nas CG por RT-PCR. Os COCs foram fecundados e cultivados individualmente in vitro e os índices de clivagem e cinética embrionária foram avaliados as 40hpi e índices de blastocistos as 186hpi. Posteriormente os dados de desenvolvimento embrionário foram analisados em função dos dados dos respectivos FF e CG. Foram realizadas as seguintes comparações: não clivados x clivados (NCL x CL), clivados rápidos (> 4 células as 40hpi) x clivados lentos (< 4 células as 40hpi) (CLR x CLL), desenvolvimento a blastocisto x bloqueado (BL x NBL), clivados que se desenvolveram a blastocisto x clivados bloqueados (CLBL x CLNBL) e blastocistos derivados do grupo rápido x derivados do grupo lento (BLR x BLL). Os dados foram analisados pelo programa SAS System for Windows pelo teste t de Student, e o nível de significância de 5%. Não houve diferença entre os índices de CLR e CLL (19,2±3,8% e 25,1±3,8%, respectivamente). Da mesma forma, nenhum dos metabólitos e transcritos analisados foram distintos entre CLR x CLL, tampouco NCL x CL, a exceção do FSHR, que foi menos expresso CL, BL e CLBL quando comparados a NCL, NBL e CLNBL. O índice de BL foi (27,3±3,9%) e maior índice de blastocisto foi para BLR do que BLL (18,5±2,7% e 8,8±2,5%, respectivamente). BL e CLBL apresentaram maior quantidade de piruvato e colesterol, aumento de CYP19 e, no caso de CLBL, ainda maiores níveis de ANGII e EGF-R 2 quando comparados a NBL e CLNBL. Em relação a cinética de desenvolvimento, CLR e BLR apresentaram aumento de ANGII e estradiol. Além disso, BLR ainda apresentaram diminuição de CYP19 e EGF-R, sugerindo uma alta atividade esteroidogênica mais relacionada à secreção do que com a síntese de esteroides, provavelmente por um efeito negativo do estradiol no controle da expressão destes genes. Os dados deste estudo permitem concluir que o status folicular tem relação direta com a habilidade do oócito a se desenvolver a blastocisto. Além disso, o aumento da disponibilidade de substrato energético e da capacidade esteroidogênica parece influenciar positivamente a capacitação oocitária. Da mesma forma, embriões de cinética distinta parecem ser derivados de folículos com atividade esteroidogênica distinta. / Follicular conditions established prior to aspiration for in vitro maturation may be responsible for differences that will reflect in the embryonic phenotype. In this work, cumulus-oocyte complex (COCs) and their respective follicular fluid (FF) were individually aspirated from slaughterhouse ovaries. Metabolic biomarkers as glucose, pyruvate, cholesterol and estradiol were quantified in FF by fluorimetry. Specific granulosa cells (GC) transcripts related to oocyte capacitation and steroidogenic capacity such as aromatase (CYP19A), FSH (FSH-r), angiotensin II (ANGII AT2) and EGF (EGF-r) receptors were quantified by RT-PCR. Bovine embryos were produced in vitro following conventional protocols. Embryos were cultured individually and divided into: Fast (> 4 cells at 40 hpi) and Slow (< 4 cells at 40hpi). Blastocyst rates and embryonic competence (evaluated through developmental kinetics and blastocysts rates) were assessed at 186hpi. Embryonic development data was analyzed in function of FF and GC results by comparing: non-cleaved vs. cleaved (NCL x CL), fast vs. slow (CLF x CLS), development to blastocyst x blocked (BL x NBL), cleaved that reached blastocyst stage vs. cleaved that blocked (CLBL x CLNBL) and blastocysts originated from fast vs. slow (BLF x BLS). Embryonic development, quantification of metabolites and transcripts were compared by Student t test using SAS for Windows considering á=5%. Cleavage rates were not different between fast and slow embryos (19.2±3.8% and 25.1±3.8%, respectively). Except for FSH-r, that was less expressed in CL, BL and CLBL than their respective counterparts NCL, NBL and CLNBL, all the other metabolites and transcripts did not present any differences. Total blastocyst rate was 27.3±3.9%, being 18.5±2.7% from BLF and 8.8±2.5% from BLL groups. BL and CLBL presented higher amounts of pyruvate and cholesterol, and an increased expression of CYP19 when compared to NBL and CLNBL, respectively. Also, CLBL presented higher levels of ANGII AT2 and EGF-r than CLNBL, suggesting that BL and CLBL derived follicles have a greater steroidogenic capacity. Regarding developmental kinetics, CLR and BLR presented an increase in ANGII AT2 and estradiol and diminished levels of CYP19 and EGF-R, suggesting an elevated secretion of steroids. Therefore, BLL, with increased expression of CYP19 and EGF-r under lower levels of estradiol and ANGII AT2 are preferably directed to the synthesis than secretion of this hormone. In summary, our results show that follicular status is direct ly related to the oocytes 4 ability to develop to blastocyst. In addition, the increased availability of energy substrates and steroidogenic capacity appears to positively influence the oocyte capacitation. Likewise, embryos with distinct developmental kinetics seem to originate from follicles with distinct steroidogenic activity.

Submitted by FELIPE MORALES DALANEZI null (fmdalanezi@gmail.com) on 2016-03-01T17:52:28Z No. of bitstreams: 1 Dissertação_EV_MIV_Felipe_Dalanezi.pdf: 987917 bytes, checksum: 4a81200cfc32872f02a3c22702235ec4 (MD5) / Approved for entry into archive by Sandra Manzano de Almeida (smanzano@marilia.unesp.br) on 2016-03-01T19:24:45Z (GMT) No. of bitstreams: 1 dalanezi_fm_me_bot.pdf: 987917 bytes, checksum: 4a81200cfc32872f02a3c22702235ec4 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-03-01T19:24:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dalanezi_fm_me_bot.pdf: 987917 bytes, checksum: 4a81200cfc32872f02a3c22702235ec4 (MD5) Previous issue date: 2016-02-26 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Vários são os componentes que tem a capacidade de interferir no metabolismo e desenvolvimento do oócito no interior do folículos, dentre esses fatores estão As EVs. Sendo assim o objetivo deste estudo foi avaliar a modulação da maturação oocitária in vitro pelas EVs extraídos de vacas submetidas ao estresse térmico (ET) ou não. Para tanto 12 vacas da raça holandesa foram submetidas ao ET e 12 vacas foram mantidas em condições de termo-neutralidade, em seguida tiveram seus folículos aspirados em dois momentos do ciclo estral (pré-ovulação e desvio). Após a separação das EVs do fluido folicular, e visualizados pela microscopia eletrônica. Então As EVs foram colocados em meio de maturação para avaliação da ação destas vesículas durante a maturação oocitária. Após 22 horas de maturação, os oócitos e as células do cummulus foram recuperados para posterior análise de progressão da maturação e também para expressão de genes de interesse. Não foi observada diferença estatística entre os grupos na análise de progressão meiótica nem na integridade do DNA. Indicando que As EVs não interferiram na morfologia oocitária. A expressão gênica no entanto demonstrou que genes relacionados a expansão do cummulus (BMP15, HAS2, GDF9, PTX3), metabolismo energético (BMP15,CPT1B, PFKP), IGF (IGFBP2 e 4) e apoptose (BCL2 e STAT3), apresentaram expressão diminuída no grupo termo-neutro. Os dados do nosso estudo indicam que o ambiente termo-neutro levou a uma sinalização intrafolicular das EVs com a finalidade de indicar uma situação favorável para o oócito. / There are several components that have the ability to interfere with the metabolism and development of the oocyte in side of follicles, among these factors are the EVs. Thus the aim of this study was to evaluate the modulation of oocyte maturation in vitro by EVs extracted from cows under heat stress or not. For that, 12 Holstein cows were subjected to heat stress and 12 cows were kept in a thermo-neutral conditions, then had their follicles aspirated in two stages of the estrous cycle (pre-ovulation and deviation). After separation of the EVs from follicular fluid, and visualized by electron microscopy. The EVs were placed in maturation medium for evaluation of the action of these vesicles during oocyte maturation. After 22 hours of maturation, oocytes and cummulus cells were recovered for further analysis of meiotic progression and for expression of genes of interest. There was no statistical difference between the groups in meiotic progression analysis or the DNA integrity. Indicating that the EVs not interfere in oocyte morphology. Gene expression however demonstrated that genes related to the expansion of the cumulus (BMP15, HAS2, GDF9, PTX3), energy metabolism (BMP15, CPT1B, PFKP), IGF (IGFBP2 and 4) and apoptosis (BCL2 and STAT3) showed decreased expression the thermo-neutral group. The data from our study indicate that the thermo-neutral environment led to a intrafollicular signaling EVs in order to indicate a favorable situation for the oocyte.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:31:09Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006-12-08Bitstream added on 2014-06-13T20:21:59Z : No. of bitstreams: 1 cordeiro_mf_dr_jabo.pdf: 737504 bytes, checksum: 28b79a078c889bdd457fb2f63a6e13b7 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O uso repetido da laparoscopia para aspiração folicular (LAF) associado ou não à estimulação hormonal foi avaliado. Para tanto foram utilizadas 40 fêmeas caprinas sem-raça-definida, divididas aleatoriamente em 4 grupos com 10 animais cada, sendo: Grupo 1 - adultas estimuladas com 80 mg de FSHp e 300 UI de eCG; Grupo 2 - adultas não estimuladas (controle); Grupo 3 - prépúberes estimuladas com metade das doses preconizadas para o G1 e Grupo 4 - pré-púberes não estimuladas. Cada fêmea foi submetida a seis sessões de colheita com intervalo de uma semana entre as intervenções. A estimulação hormonal foi feita em dose única, 36 horas antes do ato operatório. A técnica consistiu do uso de duas punções para a introdução do endoscópio e da pinça de manipulação atraumática. Após a visualização dos ovários, os folículos visíveis na sua superfície foram puncionados com auxílio de agulha de aspiração acoplada a um sistema de vácuo. Os oócitos encontrados foram classificados de acordo com a qualidade, submetidos à maturação in vitro por 27 horas, e posteriormente fixados e corados para avaliação do estádio de maturação. A técnica utilizada, embora tenha apresentado redução da qualidade dos oócitos, não interferiu na taxa de maturação ao longo das seis intervenções. A resposta ovariana diminuiu com o uso repetido da estimulação com FSH exógeno. Não houve comprometimento da condição corporal e da fertilidade dos animais. A avaliação das funções hepática e renal e da analgesia, indica que o protocolo anestésico utilizado é seguro e eficiente para este tipo de procedimento cirúrgico. Diante dos resultados obtidos pode-se concluir que a técnica de laparoscopia para aspiração folicular é adequada para a obtenção de oócitos de fêmeas caprinas pré-púberes e adultas. / The repeated use of the laparoscopy to follicular aspiration (LFA) associated or not the hormonal stimulation was evaluated. Forty crossbred goat females were used, divided randomly in 4 groups with 10 animals each, being: Group 1 - adult stimulated with 80 mg of FSHp and 300 UI of eCG; Group 2 - adult not stimulated (control); Group 3 - pre-pubertal stimulated with half of the dose praised for the G1 and Group 4 - prepubertal not stimulated. Each female was submitted the six sessions of harvest with interval of one week between the interventions. The hormonal stimulation was made in only dose, 36 hours before the surgery. The technique consisted of the use of two punctions for the introduction of the endoscopy and the clamp atraumatic manipulation. After the visualization of the ovaries, the visible follicles in its surface were punched with aid of needle of aspiration connected to a vacuum system. The recovery oocytes were classified in accordance with the quality, submitted to in vitro maturation for 27 hours, and later fixed and stained for evaluation of maturation state. The used technique does not interfered in the maturation rate although oocytes quality has reduced. However the ovulatory response diminished with the repeated use of exogenous FSH stimulation. Damage was not observed in corporal condition nor fertility. The evaluation of the hepatic function, renal and pain analysis, showed that the anaesthetic protocol used is safe and efficient for this type of surgery. In conclusion, the technique of laparoscopy to follicular aspiration is adjusted for the attainment of oocytes in goat females adult and prepubertal.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:35:10Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-03-11Bitstream added on 2014-06-13T19:45:10Z : No. of bitstreams: 1 barbosa_cp_dr_jabo.pdf: 277709 bytes, checksum: bb4ed336bed6a785faaefe8d1318a305 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A produção in vitro (PIV) de embriões em bovinos tem se estabelecido a cada dia como uma biotecnologia de uso frequente, devido à rapidez na multiplicação de produtos oriundos de fêmeas de alto valor genético. Este trabalho comparou a produção de ovários com e sem corpo lúteo (CL) de vacas Nelore, em relação à quantidade e qualidade de ovócitos recuperados, embriões produzidos, taxas de prenhez e proporção dos sexos após a PIV. Foram realizadas aspirações foliculares dos dois ovários em 250 seções, igualmente distribuídas em cinco grupos, sendo G1=fêmeas gestantes; G2=não gestantes, com CL e submetidas à tratamento hormonal com progestágeno+BE+PGF2µ; G3=não gestantes, sem CL e com o mesmo tratamento de G2; G4=não gestantes, com presença de CL e sem tratamento; G5=não gestantes, sem presença de CL e sem tratamento. Os resultados foram avaliados pela Análise de Variância (ANOVA) e aplicado o Teste de Tukey para comparação entre médias, a 5% de significância, pelo programa SISVAR. Já para comparação de proporção de sexos dentro e entre os grupos, foi utilizado o teste de comparação múltipla de proporções. O G4 produziu maior média de ovócitos totais aspirados que G2 e G3. Comparando os três grupos que apresentavam CL (G1, G2, G4), o G4 foi superior a G1 e G2 em ovócitos totais, no ovário com e sem CL. Em ovócitos viáveis, G2 foi superior a G1 no ovário com CL. Os ovários com CL produziram mais embriões do que os sem CL. As vacas gestantes produziram melhor nos ovários sem CL, com mais ovócitos viáveis (p<0,05) e iguais em embriões (p>0,05), em relação ao ovário com CL. As taxas de prenhez e proporção dos sexos foram semelhantes entre os grupos (p>0,05). A concentração de P4 foi diferente entre os grupos, mas não influenciou as variáveis analisadas. A utilização do tratamento hormonal não melhorou os resultados de nenhuma... / The in vitro production (IVP) bovine embryos has been established each day as a frequent use of biotechnology because of the speed of the multiplication products from females of high genetic value. This study compared the production of ovaries with and without corpus luteum (CL) of cows in relation to quantity and quality of oocytes aspirated, embryos obtained, pregnancy rates and sex ratio after the IVP. Follicular aspirations were performed on both ovaries in 250 sections, equally divided into five groups: G1 = pregnant, G2 = not pregnant, with CL and submitted to hormonal therapy with progestin+BE+PGF2µ; G3 = not pregnant, without CL and with the same treatment of G2; G4 = not pregnant, with the presence of CL and no treatment; G5 = not pregnant, without the presence of CL and no treatment. The statistical analysis was performed with analysis of variance (ANOVA) and the Tukey Test was applied to compare means at 5% significance level, by SISVAR program. To the comparison of sex ratio within and between groups was used the multiple comparison test of proportions. The G4 has produced higher mean total aspirated oocytes that G2 and G3. Comparing the three groups that had CL (G1, G2, G4), G4 was higher than G1 and G2 in total oocytes in ovaries with and without CL. G2 was superior to G1, on viable oocytes from ovary with CL. Ovaries with CL produced more embryos than those without CL. The ovaries without CL produced better in pregnant cows in despite of viable oocytes (p<0.05) and similar embryo production (p>0.05), when compared with ovaries presenting CL. Pregnancy rates and sex ratio were similar between groups (p>0.05). The P4 concentration was different between groups, but did not influence any variable. The use of hormonal treatment did not improve the results of any variable. The choice of donor for PIV is independent of hormone treatment or presence of CL

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:43Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-10-01Bitstream added on 2014-06-13T19:50:48Z : No. of bitstreams: 1 teixeira_ppm_me_jabo.pdf: 919906 bytes, checksum: b2c15789fbac17124ed31790a17fab93 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Avaliou-se macro e microscopicamente os ovários de ovelhas submetidas a sucessivas aspirações foliculares, com o objetivo de se verificar se houve ou não interferência na produção oocitária e morfologia das gônadas; além da avaliação macroscópica do trato genital interno. Dezoito ovelhas da raça Santa Inês, distribuídas aleatoriamente compuseram três grupos experimentais de igual número (n=6). G0, G1, G9 com 0, 1 e 9 repetições, respectivamente. A sincronização do estro foi feita utilizando-se protocolo curto com MAP, seguindo-se estimulação, em dose única, com 80mg de FSHp e 300 UI de eCG (IM) e após 36 horas realizavam-se as aspirações foliculares por vídeolaparoscopia, com intervalo de 7 dias. Os folículos visibilizados, os aspirados e os oócitos recuperados foram contabilizados. Após a última intervenção foi realizada ovariectomia para avaliar os macro e microscopicamente, a existência ou não de lesões causadas pelas punções foliculares, classificando a intensidade do processo em ausente (0), leve (1), moderada (2) e severa (3). Os dados foram expressos em média e desvio padrão, comparados pelo teste one-way ANOVA e teste de Tukey. Os números de folículos visibilizados, aspirados e oócitos recuperados foram de 13,24±2,0, 11,27±3,03 e 5,79±2,3 respectivamente, com taxa de recuperação de 51,69%, não havendo diferenças entre as nove sessões (p>0,05). Também não se verificou, macroscopicamnte, lesões no trato genital interno, nem alterações consideráveis nas análises histológicas, sendo o escore 0±0 para o G0, 0,1±0,4 para o G1 e 0±0 para o G9 (p>0,05). Conclui-se que as nove sessões de superovulação e aspiração folicular não causam lesões ovarianas e não interferiram na produção de folículos em ovelhas da raça Santa Inês / We evaluated macroscopically and microscopically the ovaries of ewes to repeated follicular aspiration, in order to verify whether or not there was interference with the production oocyte and gonad morphology, besides the macroscopic evaluation of internal genital tract. Eighteen sheep Santa Ines, randomly distributed three groups composed of equal numbers (n = 6). G0, G1, G9 with 0, 1 and 9 replicates, respectively. Synchronization of estrus was performed using short protocol with MAP, followed by stimulation in a single dose of 80mg FSHp and 300 IU of eCG (IM) and after 36 hours was held at the follicular aspiration by laparoscopy with interval 7 days. The follicles visualized, aspirated and the oocytes recovered were counted. After the last intervention was performed ovariectomy was performed to assess the macro and microscopically, the presence or absence of lesions caused by follicular puncture, classifying the intensity of the process as absent (0), mild (1), moderate (2) and severe (3) . Data were expressed as mean and standard deviation and compared by using one-way ANOVA and Tukey test. The numbers of follicles visualized, aspirated and oocytes recovered were 13.24 ± 2.0, 11.27 ± 3.03 and 5.79 ± 2.3 respectively, with a recovery rate of 51.69%, with no differences among the nine sessions (p> 0.05). Nor is there, macroscopicamnte, internal genital tract injury, or significant changes in histological evaluations, with a score of 0 ± 0 for G0, 0.1 ± 0.4 for G1 and 0 ± 0 for the G9 (p> 0.05). We conclude the nine sessions of superovulation and ovum do not cause ovarian lesions and did not interfere in the production of follicles in Santa Ines sheep

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:47:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2142544 bytes, checksum: 8e7df43b18b62658d62b10baab0d7506 (MD5) Previous issue date: 2003-03-17 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The experiments of the present study were developed with the objectives of verifying the effect of the birth season on the first ovulation of fillies, to characterize some follicular parameters of fillies and to compare the occurrence of the first ovulation of the season, as well as some ovarian characteristics among fillies and mares. In addition, the relationship between the body condition and the hair coat length with the ovarian follicular activity were studied. Crossbred Breton Postier fillies (n=14) and mares (n=22) were used during three consecutive reproductive seasons. On Experiment 1, fillies born in the summer were used (Summer Group; n = 9, age = 8.5 ± 0.2 month old) and mares (Control Group; n = 5, age = 76.0 ± 10.2 months old). On Experiments 2 and 3, the animals used were divided into three Groups: Summer Group (fillies born in the summer; n = 9, age = 18.8 ± 0.2 month old and n = 6, age = 31.9 ± 0.3 month old), Spring Group (fillies born in the spring; n = 5, age = 10.1 ± 0.6 month old, and n = 5, age = 23.3 ± 0.6 months old) and Control Group (adult mares; n = 9, age = 91.4 ± 4.3 months old and n = 8, age = 82.5 ± 12 months old), respectively. Ovarian and uterine parameters were evaluated by ultrasonography. Every 14 days, the weight, the body condition score and the hair coat lengths were evaluated in the 3 experiments. Based on the results of this present study, it can be concluded that: a) the birth season influences the beginning of puberty in fillies; b) the fillies start the reproductive season later than the mares; c) the follicular development occur in waves in prepubertal fillies; d) the ovarian activity between mares and fillies is pretty similar during the transition phase and the interovulatory intervals, when only quantitative differences, not qualitative differences, can be observed; e) apparently the follicles of prepubertal fillies present estrogenic activity, since it was observed a positive correlation among the follicular diameters and the uterine echotexture; f) the body condition score, the weight and the hair coat length, during the prepubertal and pubertal phases, presented correlation with the ovarian follicular activity in fillies. / Os experimentos do presente estudo foram desenvolvidos com os objetivos de verificar o efeito da estação de nascimento na primeira ovulação de potras; caracterizar alguns parâmetros foliculares de potras; e comparar a ocorrência da primeira ovulação da estação, bem como algumas características ovarianas, entre potras e éguas. Adicionalmente, a relação entre a condição corporal e o comprimento do pêlo com a atividade folicular ovariana, foi estudada. Potras mestiças da raça Bretão Postier (n = 14) e éguas (n = 22) foram usadas durante três estações reprodutivas consecutivas. No Experimento 1, foram utilizadas potras nascidas no verão (Grupo Verão; n = 9, idade = 8,5 ± 0,2 mês) e éguas (Grupo Controle; n = 5, idade = 76,0 ± 10,2 meses). Nos Experimentos 2 e 3, os animais utilizados foram divididos em 3 grupos: Grupo Verão (potras nascidas no verão; n = 9, idade = 18,8 ± 0,2 mês e n = 6, idade = 31,9 ± 0,3 mês , Grupo Primavera (potras nascidas na primavera; n = 5, idade = 10,1 ± 0,6 mês e n = 5, idade = 23,3 ± 0,6 mês) e Grupo Controle (éguas adultas; n = 9, idade = 91,4 ± 4,3 meses e n = 8, idade = 82,5 ± 12 meses), respectivamente. Parâmetros ovarianos e uterinos foram avaliados por meio de exames ultra-sonográficos. A cada 14 dias, o peso, o escore da condição corporal e o comprimento do pêlo foram avaliados nos 3 experimentos. Com base nos resultados do presente estudo, pode-se concluir que: a) a estação do nascimento influencia o início da puberdade em potras; b) as potras iniciam a estação reprodutiva mais tardiamente que as éguas; c) potras apresentam o crescimento folicular em forma de ondas durante a fase pré-púbere; d) a atividade ovariana entre éguas e potras é bastante semelhante durante a fase de transição e o período interovulatório, observando-se apenas diferenças quantitativas e não qualitativas; e) aparentemente os folículos de potras pré-púberes apresentam atividade estrogênica, visto que foi observada correlação positiva entre os diâmetros foliculares e a ecotextura uterina; e f) o escore da condição corporal, o peso e o comprimento do pêlo, durante as fases pré-púbere e púbere, apresentaram correlação com a atividade folicular ovariana de potras.