Orientadora: Ana Maria Pires Soubhia / Banca: Glauco Issamu Miyahara / Banca: Alan Roger dos Santos Silva / Resumo: O presente estudo teve como objetivo investigar em glândulas submandibulares de ratos tratados com aguardente de cana, a morfologia, atividade funcional das fosfatases e níveis de mucina. 24 ratos machos e adultos foram divididos em 4 grupos (n=6) de acordo com o tipo de bebida fornecida, aguardente de cana (39º GL) ou água, e ao tempo de tratamento de 75 ou 105 dias. Após os períodos de tratamento, os animais foram submetidos à cirurgia para remoção das glândulas submandibulares, seguido da eutanásia. As glândulas submandibulares do lado direito foram processadas para análise histomorfométrica (Image J) dos ductos estriados, ductos granulosos e ácinos. As glândulas do lado esquerdo foram pesadas e armazenadas a -80 °C, para avaliação da atividade funcional da fosfatase ácida total (FAT), fosfatase ácida resistente ao tartarato (FART), fosfatase alcalina (FAL) e determinação dos níveis de mucina. Para isso foram feitos ensaios bioquímicos por métodos espectrofotométricos. Os dados quantitativos foram submetidos à análise estatística (p<0,05). Os pesos absolutos e relativos das glândulas submandibulares apresentam-se reduzidos em relação aos controles (p<0,05). Na análise histomorfométrica, observamos que houve relevante redução da área dos ácinos (p<0,05) e redução não significativa dos ductos estriados (p>0,05). Nos ductos granulosos ocorreu aumento não significativo da área (p>0,05). As atividades de FAT e FART se apresentaram expressivamente diminuídas nos grupos experim... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The present study aimed to investigate submandibular glands of rats treated with cane brandy, morp hology, functional activity of phosphatases and levels of mucin. 24 male and adult rats were divided into 4 groups (n = 6) according to the type of beverage provided, cane brandy (39° GL) or water, and treatment time of 75 or 105 days. After the treatment periods, the animals were submitted to surgery to remove the submandibular glands, followed by euthanasia. The submandibular glands on the right side were processed for histomorphometric analysis (Image J) of the striated ducts, granular ducts and acini. T he left glands were weighed and stored at - 80 °C for evaluation of the functional activity of total acid phosphatase (TAP), tartrate - resistant acid phosphatase (TRAP), alkaline phosphatase (ALP), and determination of mucin levels. For this, biochemical tes ts were carried out by spectrophotometric methods. Quantitative data were submi tted to statistical analysis (p <0.05). The absolute and relative weights of the submandibular glands are reduced in relation to the controls (p <0.05). In the histomorphometric analysis, we observed that there was a significant reduction of the acini area (p <0.05) and a non - significant reduc tion of the striated ducts (p> 0.05). In the granular ducts a not significant in crease of the area occurred (p> 0.05). The TAP and TRAP activi ties were significantly decrease d in the experimental groups (p <0.05), while the ALP functional activity decrease d moderately (p> 0.05). There was a significant reduction of mucin levels by the effect of chronic alcoholism (p <0.05). From these data it was p ossible to conclude that chronic alcoholism due to the use of cane brandy affects the biochemical functionality and morphology of the submandibular gland / Mestre

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Físicas e Matemáticas. Programa de Pós-Graduação em Química. / Made available in DSpace on 2012-10-22T18:16:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 230074.pdf: 2278286 bytes, checksum: 566304e98f55e0e1a2b3ede6927d6cf0 (MD5) / A natureza aprendeu a utilizar propriedades especiais dos metais para realizar uma ampla variedade de funções associadas aos sistemas vivos. Metaloproteínas que realizam funções catalíticas são denominadas de metaloenzimas, constituindo então uma classe especial de compostos bioinorgânicos. Neste contexto, as fosfatases ácidas púrpuras (PAPs), metaloenzimas pertencentes à classe das hidrolases, catalisam a hidrólise de ésteres e anidridos do ácido fosfórico em uma faixa de pH de 4 a 7. A característica cor púrpura dessa subclasse de fosfatases ácidas é resultado de um de transferência de carga do tipo ligante metal (OTyr?FeIII) em torno de 560 nm. Os complexos modelos tiveram papel fundamental no entendimento das propriedades físicos-químicas das PAPs, antes da resolução das estruturas cristalinas das mesmas. Assim, através do estudo estrutural, espectroscópico e de testes de reatividade, busca-se esclarecer o mecanismo através do qual ocorre o processo catalítico em complexos modelos para que estes possam auxiliar na elucidação do mecanismo pelo qual a enzima nativa atua. Neste trabalho foram sintetizados e caracterizados por análise elementar de CHN; medidas de condutividade; espectroscopias no infravermelho, eletrônica e Mössbauer; eletroquímica e titulação potenciométrica dois novos complexos de ferro(III)cobalto(II) e gálio(III)cobalto(II) empregando-se o ligante H2BPBPMP76, já descrito na literatura. Os complexos 1 - [FeIIICoII(BPBPMP)(µ-OAc)2]ClO4 . 0,25 H2O e 2 - [GaIIICoII(BPBPMP)(µ-OAc)2]ClO4 . H2O tiveram suas estruturas cristalinas resolvidas apresentando-se isoestruturais entre si, sendo ainda apontados como modelos estruturais para as PAPs metalo-substituídas, pois mimetizam os resíduos de aminoácidos presentes no sítio ativo das PAPs e simulam a distância intermetálica presente nas mesmas. Os estudos realizados frente à hidrólise do substrato modelo 2,4-bisdinitrofenilfosfato (2,4-BDNPP) resultaram em fatores de aceleração de 19,2 e 21,2 mil vezes, espectivamente, em relação à reação não catalisada sendo o complexo 2 (GaIIICoII) o que se apresentou mais efetivo na conversão do substrato a produtos. Estudos inibitórios (por íons OAc- e HPO4 2-) para a reação do 2,4-BDNPP mostraram que os íons acetato à baixas concentrações não influenciam significativamente o processo catalítico, porém, íons fosfato devido a sua alta constante de associação podem comprometer a catálise mesmo em concentrações reduzidas. A partir dos dados estruturais, espectroscópicos, eletroquímicos, cinéticos e de titulação potenciométrica foi possível propor um ciclo catalítico para a hidrólise do 2,4-BDNPP, mediada pelos complexos 1 e 2 compatível com outros já descritos na literatura.

Orientador: Hiroshi Aoyama / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-02T14:51:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Goncalves_MariaAngelica_M.pdf: 9143256 bytes, checksum: aa14d687161f89068c82024fdc8fdc9c (MD5) Previous issue date: 2000 / Resumo: Quatro isoformas APl, AP2Al, AP2A2 e AP2B da fosfatase ácida (E.C. 3.1.3.2.) de fígado de cação (Rhizoprionodon lalandei) foram detectadas e parcialmente purificadas através de bath em Hidroxiapatita, cromatografias em colunas de SP-Sephadex, DEAE-Sephadex, Sephacryl S200 e Concanavalina A-Sepharose 4B. As isoformas AP2Al, AP2A2 e AP2B foram parcialmente purificadas cerca de 68_ 57 e 34 vezes, com atividades específicas de 5,6_ 4,7 e 2,8 !lmol min-l . mg-l respectivamente. Neste estágio de purificação, estas isoformas mostraram-se altamente instáveis. A isoforma APl foi parcialmente purificada cerca 20 vezes, com atividade específica de 1,66 !lmol min-1. mg-l. A massa molecular relativa da isoforma APl, determinada por HPLC da Shimadzu (coluna Shim pack diol 150), foi de 58 kDa. Esta isoforma mostrou-se mais estável que as isoformas AP2. As propriedades cinéticas da fração APl foram estudadas. A enzima apresentou alta atividade em pH 4,7 - 5,0_ a temperatura ótima obtida foi de 65°C. A hidrólise a 37°C e pH 5,0 foi linear até 45 minutos e a energia de ativação para a hidrólise do pNPP, determinada pela equação de Arrhenius, foi de 39,37 kJ.mor1. Um valor da Km de 0,97 mM foi obtido utilizando-se pnitrofenilfosfato como substrato. Dentre os substratos testados, a isoforma API apresentou maior especificidade pelo PPi. Utilizando-se pNPP como substrato vários compostos foram testados como potenciais inibidores. Molibdato (O,lmM) e NaF (5mM) inibiram 100%, pCMB (lmM) e NaF (1mM) inibiram cerca de 80%, o-vanadato (0,1 mM) e tartarato (5mM) , cerca de 500/0. Baseado no estudo de inibidores a isoforma APl da fosfatase ácida de cação apresenta características mais similares as fosfatases ácidas de Imamíferos de alta massa molecular / Abstract: Four isoforms API, AP2AI, AP2A2 and AP2B of acid phosphatase (E.C. 3.1.3.2.) were detected and partially purified from shark (Rhizoprionodon Ia/andei) liver through bath Hydroxyapatite, cromatography columns of SP-Sephadex, DEAE-Sephadex, Sephacryl S-200 and Concanavalin A-Sepharose 4B.The fractions AP2AI, AP2A2 and AP2B were purified 68.3; 57.3 and 34.2-fold, with specific activities of 5.6; 4.7 and 2.8 Jlmol min-1.mg-l respectively. The fraction APl was partially purified 20-fold, with specific activity of 1,66 Jlmol min-1.mg-l. The relative molecular mass ofthis fraction, determined by HPLC (Shim pack diol 150 column), was 58 kDa. At this stage of purification the fraction APl has shown to be more stable than the isoforms AP2. The kinetic properties of the API fraction were determined using pnitrophenyl phosphate (pNPP) as substrate. High activities were observed at pH around 4.7 - 5.0, and temperature of 65° C, at temperature of 37°C, pH 5.0 the hidrolysis was linear up to 45 minutes. The activation energy value of 39,37 kJ.mor1 for the hidrólysis ofpNPP, was calculated from the Arrhenius equation. An apparent Km value of 0.97 mM was determined for pNPP. From the substrates tested, inorganic pyrophosphate was the best substrate, whit a 5-fold lower Km and 2-fold higher specificity constant, when compared with pNPP. Several compounds were tested as potential inhibitors, with pNPP as substrate. Molybdate (O.lmM) and fluoride (5mM) inhibited 100%; p-CMB (lmM) and NaF (ImM) inhibited about 80%, and o-vanadate (0.1 mM) and tartrate (5mM), about 50%. Based on inhibitors studies the API isoform of acid phosphatase purified from shark liver presents more similar characteristics the fosfatases acid of mammals of high molecular mass / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientadores : Carmen Verissima Ferreira, Hiroshi Aoyama / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-03T11:58:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pinheiro_KarinaCristinaSeregatte_M.pdf: 2536223 bytes, checksum: 84daa316e88c5a44bbbb304adbae7323 (MD5) Previous issue date: 2002 / Resumo: Neste trabalho foi avaliada a citotoxicidade do peróxido de hidrogênio sobre as células V79, bem como o efeito deste oxidante sobre a fosfatase total isolada destas células. A viabilidade celular foi avaliada através de 4 parâmetros: incorporação do vermelho neutro (NRU) - (integridade lisossomal); conteúdo de ácidos nucléicos (NAC) - (número de células); redução do MTT (integridade mitocondrial) e atividade fosfatásica (metabolismo celular), tendo sido obtidos os seguintes valores de ICso 970, 1470, 840 e 870 IJM para NRU, NAC, MTT e fosfatase, respectivamente. Para os parâmetros NRU e NAC observou-se efeito diferente do peróxido, dependendo da concentração, como aumento da incorporação do corante pelos lisossomos e do número de células até as concentrações de 500 e 750 IJM respectivamente. O efeito de potenciais inibidores de fosfatases sobre a fosfatase total das células V79 revelou que a principal hidrolase presente no extrato corresponde a uma proteína tirosina fosfatase. Estes resultados foram reforçados pela sensibilidade desta enzima ao peróxido (ICso = 10mM). A presença de antioxidantes reverteu a ação inibitória do peróxido de hidrogênio. Do mesmo modo, a atividade fosfatásica também foi inibida, em maior grau, pelo pervanadato (ICso = 1001JM) o qual também atua como oxidante. O efeito inibitório do H202 e o pervanadato sobre a fosfatase foi aumentado após diálise do extrato celular. As células V79 apresentam alta concentração de glutationa reduzida, sugerindo que a maior resistência destas células frente ao peróxido de hidrogênio pode ser devido à presença deste antioxidante. Tanto o peróxido quanto o pervanadato apresentaram maior efeito inibitório após diálise, reforçando a importância da glutationa reduzida / Abstract: In this work was evaluated the hydrogen peroxide cytotoxicity on V79 cells, and the effect of this oxidant on the total phosphatase trom these cells. The cell viability was analyzed through 4 parameters: neutral red uptake (NRU) (Iisossome integrity); nucleic acid content (NAC) - (cell number); MTT reduction (mitochondria function) and phosphatase activity (cell metabolism). The following ICso values were obtained: 970, 1470, 840 and 870 J.lM for NRU, NAC, MTT and phosphatase, respectively. Hydrogen peroxide presented different effect on the NRU and NAC depending on its concentration. In concentrations up to 500 and 750 J.lM, was observed increase of dye uptake and cell number, respectively. The inhibiton studies using phosphatase inhibitors showed that the major phosphatase present on the V79 cells extract is a protein tyrosine phosphatase. This result was reinforced by the high sensibility of this phosphatase when hydrogen peroxide (ICso = 10 mM) and pervanadate (ICso = 100J.lM) were addictioned in the reaction medium. In the presence of antioxidant this effect was prevented. Finally, the concentration of reduced glutathione was determined, V79 cells presented high content of this compound then, our results suggest that the low toxicity of this compound on these cells could be due to the action of this antioxidant. Other result reinforce this hypothese, both oxidant (hydrogen peroxide and pervanadate) presented higher inhibitory effect of the phosphatase activity after dialyse / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Físicas e Matemáticas. Programa de Pós-Graduação em Química. / Made available in DSpace on 2012-10-18T05:22:46Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / A presença dos resíduos de aminoácidos histidina e tirosina em uma variedade de metaloidrolases tem levado os químicos bioinorgânicos a projetar e sintetizar novos complexos modelo para esses sistemas contendo grupos que mimetizam tais resíduos. Nesse trabalho foram sintetizados ligantes inéditos contendo resíduos imidazólicos, fenólicos, amínicos e piridinicos. A partir desses ligantes foram sintetizados complexos inéditos, sendo: um complexo binuclear Fe2III (Complexo 1), dois complexos binucleares de Cu2II (Complexos 3 e 5) e cinco complexos mononucleares (Complexos 2, 4, 6, 7 e 8). Estes foram caracterizados por várias técnicas incluindo análise elementar, condutivimetria, eletroquímica, espectroscopias de RPE, infravermelho e eletrônica, titulação potenciométrica e medidas magnéticas. Os complexos 1, 2, 4, 6, 7, 8 e 9 foram caracterizados estruturalmente por difração de raios X. As propriedades estruturais, magnéticas e espectroscópicas do Complexo 1 sugerem que este pode ser considerado um modelo estrutural para o sítio ativo da forma Fe2III (oxidada) das fosfatases ácidas púrpuras. A caracterização dos complexos 2, 4, 6, 7 e 8 conduziram aos testes de reatividade desses complexos frente a hidrólise do 2,4-BDNPP. Os estudos de hidrólise do 2,4-BDNPP promovidos pelos complexos 2, 4 e 6 elegeram esses complexos como modelos funcionais para as fosfatases alcalinas. Testes preliminares de clivagem de DNA na presença dos complexos 2, 4, 6, 7 e 8 levaram a considerá-los como novas nucleases químicas. Testes de mutagenicidade e citotoxicidade realizados para o Complexo 2 com a bacteria Salmonella typhimurium (teste de Ames) e com células de tumor pequeno de pulmão revelaram um possível agente quimioterápico. A presença dos resíduos de aminoácidos histidina e tirosina em uma variedade de metaloidrolases tem levado os químicos bioinorgânicos a projetar e sintetizar novos complexos modelo para esses sistemas contendo grupos que mimetizam tais resíduos. Nesse trabalho foram sintetizados ligantes inéditos contendo resíduos imidazólicos, fenólicos, amínicos e piridinicos. A partir desses ligantes foram sintetizados complexos inéditos, sendo: um complexo binuclear Fe2III (Complexo 1), dois complexos binucleares de Cu2II (Complexos 3 e 5) e cinco complexos mononucleares (Complexos 2, 4, 6, 7 e 8). Estes foram caracterizados por várias técnicas incluindo análise elementar, condutivimetria, eletroquímica, espectroscopias de RPE, infravermelho e eletrônica, titulação potenciométrica e medidas magnéticas. Os complexos 1, 2, 4, 6, 7, 8 e 9 foram caracterizados estruturalmente por difração de raios X. As propriedades estruturais, magnéticas e espectroscópicas do Complexo 1 sugerem que este pode ser considerado um modelo estrutural para o sítio ativo da forma Fe2III (oxidada) das fosfatases ácidas púrpuras. A caracterização dos complexos 2, 4, 6, 7 e 8 conduziram aos testes de reatividade desses complexos frente a hidrólise do 2,4-BDNPP. Os estudos de hidrólise do 2,4-BDNPP promovidos pelos complexos 2, 4 e 6 elegeram esses complexos como modelos funcionais para as fosfatases alcalinas. Testes preliminares de clivagem de DNA na presença dos complexos 2, 4, 6, 7 e 8 levaram a considerá-los como novas nucleases químicas. Testes de mutagenicidade e citotoxicidade realizados para o Complexo 2 com a bacteria Salmonella typhimurium (teste de Ames) e com células de tumor pequeno de pulmão revelaram um possível agente quimioterápico.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Físicas e Matemáticas. Programa de Pós-Graduação em Química. / Made available in DSpace on 2012-10-20T20:27:42Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / As Fosfatases Ácidas Púrpuras - PAPs constituem uma classe de metaloenzimas que contém um sítio ativo do tipo Fe3+M2+ (M = Fe, Mn ou Zn), capazes de promover a hidrólise de ésteres de fosfato e anidridos numa faixa de pH de 4-7. Durante a catálise o grupo fosfato liga-se ao sítio M2+ onde é ativado para um ataque nucleofílico do hidróxido terminal ligado ao sítio de Fe3+ sobre o fósforo. O grupo de saída é então protonado seguido da quebra da ligação P-OR onde os produtos da reação são liberados e a enzima restabelecida a forma ativa. Acredita-se que a utilização de ligantes binucleantes N,O-doadores que possam induzir ambientes de coordenação assimétricos para os centros metálicos e sítios lábeis para reatividade é uma estratégia conveniente na busca de modelos estruturais e funcionais para as PAPs. Assim apresentamos nesse trabalho um novo procedimento sintético para o desenvolvimento de ligantes não simétricos que possam mimetizar o ambiente de coordenação dos íons metálicos no sítio ativo das PAPs. Além de novos ligantes, foram também sintetizados e caracterizados novos complexos de FeZn e FeCu cuja atividade catalítica na hidrólise do substrato bis(2,4-dinitrofenil)fosfato revelou uma aceleração de até 9200 vezes em relação a reação não catalisada. Estudos de interação com DNA mostraram que os compostos estudados são capazes de promover a clivagem hidrolítica da dupla fita.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Físicas e Matemáticas. Programa de Pós-Graduação em Química. / Made available in DSpace on 2012-10-21T01:58:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 245683.pdf: 1956585 bytes, checksum: 25bba0ab4f84d64da835fe8cd1f2ee1c (MD5) / Enzimas são moléculas protéicas que possuem forma tridimensional globular. Algumas enzimas têm sido estudadas para o desenvolvimento de novas drogas contra uma variedade de doenças, incluindo osteoporose, câncer, fibrose cística e depressão. Além disso, são de grande interesse como substâncias que podem ser utilizadas no combate ao terrorismo bem como na bioremediação, visto que, modificadas podem degradar gases organofosforados tóxicos e pesticidas. Aqui descreve-se a síntese e caracterização de 4 complexos binucleares inéditos de FeCu com ligantes derivados do H2bpbpmp contendo grupos substituintes metila, nitro, di-terc-butil e bromo. As estruturas cristalinas de dois complexos foram obtidas e revelaram que estes são isosestruturais. Os complexos sintetizados foram testados na hidrólise do substrato 2,4-bis-dinitrofenilfosfato e apresentram acelerações entre 10 e 15 mil em comparação a reação não catalisada. Estudos preliminares utilizando o triéster 2,4-dinitrofenil dietil fosfato foram realizados. Baseado nos estudos de reatividade realizados foi possível propor que o nucleófilo responsável pela catálise do substrato 2,4-BDNPP mediada pelos complexos de FeCu seja diferente daquele proposto para a série de complexos análogos de FeZn já descrita anteriormente e semelhante àquele que foi proposto recentemente para a fosfatase ácida púrpura extraída da batata doce (FeMn PAP).

Introdução e Objetivos. Fosfatases são enzimas promissoras para aplicação na degradação de organofosforados. Por exemplo, a enzima paraoxonase 1 (PON1), associada à lipoproteína de alta densidade (HDL), hidrolisa lactonas, ésteres aromáticos e compostos organofosforados (OP) neurotóxicos. \"Módulos de ligação a carboidrato\" (CBM) têm diversas aplicações biotecnológicas. Nosso objetivo é a obtenção de proteínas quiméricas contendo fosfatases ligadas a um módulo de ligação de celulose, o que possibilitaria a imobilização dessas enzimas em suportes de celulose. Resultados. Como prova de conceito, uma proteína quimérica contendo uma \"fosfatase ácida\" (appA) de E.coli e CBM familia 2 (CBM2) de uma celulase de Xanthomonas axonopodis pv citri foi montada e produzida em E. coli como uma proteína recombinante solúvel. appA-CBM2 purificada demonstrou ser totalmente funcional exibindo atividade de ligação à celulose microcristalina (Avicel PH101) e atividade de fosfatase sobre p-nitrofenil fosfato. A ligação à Avicel evidenciou um comportamento de saturação descrito por uma \"constante de ligação\" (Kb) de 26 mg e um \"máximo de ligação\" (Bmax) de 4,45 U/&#181;g. Além disso, a ligação de appA-CBM2 em Avicel foi maior em pH 2,5 e diminuiu acima de pH 6,5, como observado anteriormente para CBM2. Finalmente, o efeito de concentração de p-nitrofenil fosfato na atividade catalítica de appA-CBM2 e appA foi idêntico, exibindo um Km de 2,8 mM. Portanto, esses dados mostram que o conceito de uma proteína que combina as propriedades da fosfatase e do domínio de ligação à celulose é possível e funcional. De forma similar, os segmentos de DNA que codificam para o CBM2 e para a PON1 de Homo sapiens, foram fusionados resultando em um segmento que codifica para uma proteína quimérica (PON1-CBM2). PON1 nativa e PON1-CBM2 foram produzidas na forma solúvel e ativa em E.coli cepa Arctic. Embora não tenha sido viável sua purificação, estas enzimas foram caracterizadas. PON1-CBM2 liga-se em Avicel PH101 com um comportamento de saturação, descrito por uma constante de ligação (Kb) de 27 mg, valor idêntico àquele observado para appA-CBM2, o que sugere que o domínio CBM2 é igualmente funcional nestas duas enzimas quiméricas. PON1-CBM2 também exibe atividade paraoxonásica com Km similar àquele observado para PON1 nativa (1,3 mM), sugerindo que o \"domínio\" PON1 encontra-se totalmente funcional na enzima quimérica. Conclusão. Uma estratégia para a construção e expressão heteróloga em E. coli de PON1 e das enzimas quiméricas appA-CBM2 e PON1-CBM2 foi desenvolvida. As enzimas quiméricas mostraram-se totalmente funcionais e conservaram as propriedades de seus \"domínios\" constituintes. / Introduction and Aims. Phosphatases are promising enzymes for application in the degradation of organophosphates, whereas carbohydrate binding module has significant and demonstrated biotechnological applications. The high-density lipoprotein-associated enzyme paraoxonase 1 (PON1) hydrolyzes lactones, aromatic esters, and neurotoxic organophosphorus (OP) compounds. Our aim is to obtain chimeric proteins containing a phosphatase domain linked to a carbohydrate binding module (CBM), which could be immobilized on a cellulose supports. Results. As a proof of concept, a chimeric protein combining an acid phosphatase (appA) from E.coli and a CBM family 2 (CBM2) from Xanthomonas axonopodis pv. citri was assembled and produced in E.coli as a recombinant soluble protein. Purified appA-CBM2 was fully functional, was bound to microcrystalline cellulose and exhibited phosphatase activity upon p-nitrophenyl phosphate. The binding to microcrystalline cellulose Avicel PH101 exhibited saturation with a binding constant (Kb) of 26 and a maximum binding (Bmax) of 4,45 U/&#181;g. In addition, the binding was higher at pH 2.5 and decreased above pH 6.5, as previously observed for CBM2. Finally, effect of p-nitrophenyl phosphate concentration on appA-CBM2 and native appA activities were identical, exhibiting a Km of 2.8 mM. Taken together, these data show that the conceptual design of a protein combining the properties and biotechnological advantages of phosphatases and cellulose binding domains is possible and functional. Similarly, DNA segments coding for CBM2 and for PON1 from Homo sapiens combined resulting in a segment coding for a chimeric protein (PON1-CBM2). Native PON1 and PON1-CBM2 were produced as recombinant protein in E. coli Arctic. Although purification was not accomplished, these enzymes were characterized. PON1-CBM2 binds to microcrystalline cellulose, exhibiting a saturation behavior described by a Kb of 27 mg. PON1 and PON1- CBM2 have the same Km for paraoxon (1.3 mM), indicating that the phosphatase domain was fully functional. Conclusion. An effective strategy for heterologous expression of the native PON1 and chimeric appA-CBM2 and PON1-CBM2 in E. coli was attained. The chimeric enzymes were fully functional and maintained the properties of their original domains

Resumo: A capacidade de bactérias endofíticas em solubilizar fosfato inorgânico é alvo de grande interesse por parte dos microbiologistas, uma vez que as fosfatases são responsáveis por hidrolisar compostos orgânicos produzindo fósforo solúvel. Dessa forma, a fosfatase ácida ligada à membrana (MBAP) foi obtida a partir de Enterobacter sp. isolada de raízes de Cattleya walkeriana (Orchidaceae) e identificada pelo seqüenciamento do gene 16S rRNA. A expressão da enzima mostrou-se estritamente regulada pelo fósforo (expressão ideal em 7 mm). O pH ótimo aparente (3,5) não foi afetado pela concentração de p-nitrofenilfosfato. Em pH 3,5, a enzima é uma fosfomonidrolase inespecífica capaz de hidrolisar os substratos PNPP (61,2 U/mg), ATP (19,7 U/mg), e o pirofosfato (29,7 U/mg), com K0.5 de 0,06 mM, 0,11 mM e 0,08 mM, respectivamente. A enzima exibi cinética "Michaelina" para o pNPP (n=1,2). Para o ATP e o pirofosfato interações sítio-sítio foram observadas com n=1,6 e 2,3, respectivamente. Os íons de magnésio foram potentes estimuladores (K0.5=2,2 mM), enquanto o arsenato e o fosfato foram potentes inibidores competitivos. A atividade PNPPase foi inibida pelo EDTA, mas não pelo cálcio, levamisol, zinco, cobalto e phidroximercuribenzoato. A entalpia de inativação térmica foi da ordem de 77,5 kcal.mol- 1. Os resultados sugerem que a produção da fosfatase ácida ligada à membrana representa um mecanismo de solubilização do fosfato mineral aumentando a disponibilidade de nutrientes para as plantas / Abstract: The ability of endophytic bacteria in solubilizing inorganic phosphate is of great interest by microbiologists since phosphatases are responsible for catalyzing the hydrolysis of organic compounds producing soluble phosphorus. Thus, the membranebound acid phosphatase (MBAP) was obtained from Enterobacter sp. isolated from Cattleya walkeriana (Orchidaceae) roots and identified by the 16S rRNA gene sequencing analysis. The enzyme expression was demonstrated to be strictly regulated by phosphorus (optimal expression at 7 mM). The enzyme was obtained by centrifugation at 100.000g for 1 h at 4ºC. The apparent optimal pH (3.5) was not affect by p-Nitrophenyl phosphate concentration. At pH 3.5, the enzyme showed a broad substrate specificity hydrolyzing different substrates such as PNPP (61.2 U/mg), ATP (19.7 U/mg), and pyrophosphate (29.7 U/mg), with K0.5 values of 0.06 mM, 0.11 mM and 0.08 mM, respectively. The hydrolysis of PNPP by the enzyme exhibited "Michaelian" kinetics with n= 1.2. For ATP and pyrophosphate site-site interactions were observed with n= 1.6 and 2.3, respectively. Although magnesium ions were stimulatory (K0.5= 2.2 mM), arsenate and phosphate were a powerful competitive inhibitor. The PNPPase activity was inhibited EDTA but not by calcium, levamisole, zinc, cobalt and phydroxymercurybenzoate. The ΔH for thermal inactivation was 77.5 kcal.mol-1. Our results suggest that the production of a membrane-bound acid phosphatase might be one mechanism of mineral phosphate solubilization turn it's nutrients availability to plants / Orientador: João Martins Pizauro Junior / Coorientador: Cecília Maria Costa do Amaral / Banca: Mariana Carina Frigieri / Banca: Jesus Aparecido Ferro / Mestre

Orientador: Maria Izabel Camargo Mathias / Coorientador: Patrícia Rosa de Oliveira / Banca: Gervasio Henrique Bechara / Banca: Erik Daemon de Souza Pinto / Resumo: Carrapatos são ectoparasitas obrigatoriamente hematófagos que podem transmitir diversas doenças aos hospedeiros durante o seu processo de alimentação. Ao lesionar mecanicamente o tecido acabam induzindo respostas inflamatórias na pele, local onde se fixam. Na tentativa de minimizar a ação destes sobre os hospedeiros tem-se recorrido ao controle químico por meio da utilização de diversos produtos, dentre estes a selamectina, princípio ativo de muitos acaricidas, inclusive do Revolution® (Pfizer), uma lactona macrocíclica capaz de causar danos neurotóxicos no carrapato. Foi objetivo deste trabalho analisar, por meio de técnicas histológica, histoquímica, detecção da atividade da fosfatase ácida (enzimas hidrolíticas responsáveis pela detecção de morte celular autofágica) e microscopia confocal de varredura a laser, a ocorrência de alterações morfofisiológicas na pele de coelhos hospedeiros expostos à selamectina e infestados por Rhipicephalus sanguineus adultos. Os coelhos (n=12) foram expostos ao produto nas concentrações de 100% (grupo de tratamento I - GTI) e de 80% (grupo de tratamento II - GTII) e posteriormente infestados apresentaram no exame histológico diminuição da espessura da camada córnea do epitélio, o qual sofreu diminuição da quantidade de camadas celulares (adelgaçamento), processo este acompanhado pela formação acentuada de edemas subepidérmicos (com aumento de exudato), o que provocou a desorganização das fibras colágenas do tecido conjuntivo da camada dérmica. Os testes histoquímicos revelaram forte marcação PAS positiva nos folículos pilosos e em algumas regiões da derme e ressíntese de fibras colágenas demonstrada por meio da técnica do tricômico de Mallory. Os resultados obtidos para a detecção da atividade da fosfatase ácida nos indivíduos expostos às... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Ticks are ectoparasites obligatorily hematophagous that can transmit various diseases to their hosts during the feeding process. By mechanically injured in the tissue eventually inducing inflammatory responses in the skin where they attach. In an attempt to minimize their action on the host has recourse to chemical control through the use of various acaricides, among these selamectin, the active principle of many acaricides, including the Revolution ® (Pfizer), a macrocyclic lactone capable of causing neurotoxic damage. This study aimed to analyze, using histological techniques, histochemical, detection of acid phosphatase activity (hydrolytic enzymes responsible for the detection of autophagic cell death) and confocal laser scanning, the occurrence of morphophysiological changes in the skin of hosts rabbits exposed to the selamectin and infested by adults of Rhipicephalus sanguineus. The rabbits (n=12) exposed to the product at concentration of 100% (treatment group I - TGI) and 80% (treatment group II - TGII) and infested showed, in histologic examination, a partial and/or complete decrease in the stratum corneum of epithelium, which suffered a decrease in the amount of cell layers with consequent reduction of stratification (thinning) of the epithelium and marked subepidermal edema formation (with increase of exudates) which caused the disorganization of the collagen fibers of the connective tissue of the dermal layer. Histochemical tests showed strong staining PAS positive in hair follicles and in some regions of the dermis, and the resynthesis of collagen fibers has been demonstrated by Mallory trichrome technique. The confocal images corroborate the results of the histological analysis, showing the thinning of the epithelium of the individuals' skin of the treatment groups I and II (TGI and TGII), where this layer... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre