A fertilização promove incrementos de 30 a 50 % na produtividade de eucaliptos, com especial resposta ao P. O manejo adequado da fertilização fosfatada contribui para a otimização dos custos no primeiro ano. Existem no mercado diversas opções de fornecimento de P às plantas. Em geral, as fontes fosfatadas distinguem-se pela concentração, forma e solubilidade do P. O alto teor de oxihidróxidos de Fe e Al nos solos tropicais diminuem a eficiência desse nutriente devido ao processo de adsorção. Novas tecnologias de fertilizantes fosfatados estão sendo desenvolvidas visando aumentar esta eficiência de utilização, as quais necessitam de validação e comprovação dos seus efeitos em condições reais de crescimento do povoamento. Uma alternativa para aumentar a eficiência do P é a complexação deste com substâncias húmicas (complexo P-metal- SH), pois podem diminuir os processos de adsorção e possibilitar o maior aproveitamento do nutriente. O uso de técnicas de fracionamento do P no solo são amplamente utilizadas para identificar os reservatórios de P no solo e, consequentemente, sua disponibilidade à planta. A dinâmica das frações de P no solo é influenciada diretamente pela planta e pela microbiota do solo por meio de adaptações físicas e químicas do sistema radicular e ou remobilização interna de ácidos orgânicos. Objetivando compreender a dinâmica do P na interface planta- solo em um plantio de Eucalyptus grandis, foram propostos dois estudos: i) caracterização dos reservatórios de P a longo prazo e as adaptações desenvolvidas pelas plantas para aumentar a absorção de P, ii) identificação dos reservatórios de P inorgânico (Pi) lábil e a remobilização dos ácidos orgânicos nos tecidos vegetais ao longo de um ano. Constatou-se que o uso de fontes minerais de P alteram as frações lábeis e moderadamente lábeis do P no solo, não influenciando a fração não-lábil. As frações orgânicas lábeis e moderadamente lábeis contribuem consideravelmente para a nutrição da planta, em especial quando não há fertilização com P. O uso do complexo P-metal-SH incrementou a fração orgânica moderadamente lábil nos primeiros 12 meses com posterior redução. Houve equilíbrio entre as frações de P no solo e após o esgotamento das frações lábeis, as frações não lábeis foram reduzidas. O P-residual diminuiu em todos os tratamentos, em especial, no tratamento Controle. A produção de raízes finas na camada de 0-100 cm ultrapassou 6 Mg ha-1, sem diferenças entre os tratamentos. Todavia, notou-se claramente o efeito da aplicação localizada do fertilizante na densidade do sistema radicular, que apresentou maiores concentrações na linha de plantio. O comprimento específico das raízes finas na camada superficial apresentou distribuição oposta à atividade da fosfatase ácida e da ectomicorrização nos tratamentos Controle e fosfato reativo (FNR), exceto para o P solúvel convencional (PSC) que apresentou distribuição homogênea ao redor da árvore. O uso do P solúvel convencional estimulou a simbiose com micorrizas, e estas contribuíram para os processos de mineralização das frações orgânicas de P no solo por meio da exsudação de fosfatase ácida. Analisando a dinâmica das frações inorgânicas lábeis em curto período, nos primeiros 120 dias pós-plantio foi observado equilíbrio dinâmico entre as frações de Pi lábil no solo, exceto para o Controle que apresentou reduções constantes em todas as frações. Em períodos de excedente hídrico, as plantas absorveram altas quantidades de P, acumulando altos teores de ácidos orgânicos no tronco e, em períodos de estresse hídrico, houve remobilização dos ácidos orgânicos do tronco para as folhas, a fim de manter os processos metabólicos. / Fertilization promotes 30 to 50% increments in forest productivity, with a special response to P input. The adequate management of phosphate fertilization contributes to cost optimization in the first year. There are several options on the market for supplying P to plants. In general, phosphate sources are distinguished by the concentration, form and solubility of P. The high content of Fe and Al oxyhydroxides in tropical soils reduces the efficiency of this nutrient due to adsorption processes. New phosphate fertilizer technologies are being developed aiming to increase this efficiency of use, which need validation and proof of their effects under real conditions of population growth. An alternative to increase the efficiency of the P is the complexation of this with humics substances (AH- CA-P complex), since they can decrease the adsorption processes and allow the greater use of the nutrient. The use of P fractionation techniques in soil are widely used to identify P reservoirs in the soil and consequently their availability to the plant. The dynamics of P fractions in soil are directly influenced by the plant and soil microbiota through physical and chemical adaptations of the root system and / or internal remobilization of organic acids. Two experiments were carried out: i) long-term characterization of P reservoirs and adaptations developed by plants to increase P uptake; and ii) identification of labile Pi reservoirs and remobilization of organic acids in plant tissues over a year. It was found that the mineral source use of P changes the labile and moderately labile fractions of P in the soil, not influencing the non-labile fraction. The labile and moderately labile organic fractions contribute considerably to plant nutrition, especially when not fertilized with P. The use of the P- metal-SH complex increased the moderately labile organic fraction in the first 12 months with subsequent reduction. We observed the equilibrium between the fractions of P in the soil and after the exhaustion of the labile fractions, the non-labile fractions were reduced. The P-residual decreased for all treatments, especially for the control treatment. The yield of fine roots in the 0- 100 cm layer exceeded 6 Mg ha-1, with no differences between treatments. However, the effect of the localized application of the fertilizer on the density of the root system, which presented higher concentrations in the planting line, was clearly noticed. The specific length of the roots in the superficial deep presented opposite distribution to the activity of the acid phosphatase and ectomycorrhizal colonization for all the treatments, except for the PSC that presented homogenous distribution around the tree. The use of conventional soluble phosphorus stimulated the symbiosis with mycorrhizae, and this contributed to the processes of mineralization of the organic fractions of P in the soil through the exudation of acid phosphatase. Analyzing the dynamics ofthe inorganic fractions in a short period, in the first 120 days post-planting, equilibrium was observed between the fractions of labile Pi in the soil, except for the control treatment that showed constant reductions in all fractions. In periods of water supply, the plants absorbed high amounts of P, accumulating high levels of organic acids in the stem and during periods of water stress, it was observed the remobilization of the AOs from the stem to the leaves, to maintain the metabolic processes.

Orientador: Ana Cláudia de Melo Stevanato Nakamune / Banca: José Mauro Granjeiro / Banca: Célio Percinoto / Resumo: A saliva é coletada através de métodos simples e não invasivos, além de ser facilmente armazenada. A coleta não-traumática é atrativa especialmente para crianças e quando repetidas coletas são requeridas. A desvantagem da saliva como uma ferramenta de diagnóstico é a variabilidade, que ocorre em decorrência dos fatores fisiológicos e do modo de coleta. Numa primeira etapa o trabalho teve por objetivo estudar as atividades das enzimas fosfatase alcalina (FAlc), fosfatase ácida total (FAT) e fosfatase ácida resistente ao tartarato (TRAP) na saliva total não estimulada de crianças, investigando as influências de fatores como sexo, faixa etária e horário de coleta, bem como a correlação das enzimas com a taxa de fluxo salivar. Nesta etapa, 120 crianças saudáveis de ambos os sexos, nas faixas etárias de 1-5 e 6-12 anos de idade tiveram as amostras de saliva coletada entre 8:00-10:00 horas ou entre 14:00-16:00 horas. A segunda parte do trabalho teve por objetivo avaliar a correlação das atividades enzimáticas da FAT, TRAP, proteína tirosina fosfatase de baixa massa molecular relativa (PTP-BMr) e FAlc na saliva e no soro de crianças, além de analisar a influência do sexo e da faixa etária na atividade das enzimas, no soro e na saliva total. Para tanto 32 crianças de ambos os sexos, nas faixas etárias de 1-5 anos e 6-12 anos de idade tiveram as amostras de saliva e sangue coletadas entre 8:00-10:00 horas. Os resultados da primeira etapa sugerem que as atividades da FAT, TRAP e FAlc são influenciadas, de formas distintas, pelos fatores sexo, faixa etária e horário de coleta e que não existe correlação entre as atividades das enzimas e a taxa de fluxo salivar. / Abstract: Saliva can be collected by simple, non-invasive methods and is easily stored. The non-traumatic collection is specially appealing for children and when repeated collections are required. The main disadvantage of the saliva as a diagnosis tool is the variability that happens due to the physiologic factors and dependence on mode of the collection. In a first stage the work had for objective to study the activities of the enzymes alkaline phosphatase (ALP), total acid phosphatase (TAP) and tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) in the whole unstimulated saliva of children, investigating the influences of factors as sex, age group and time of collection, as well as the correlation of the enzymes with the salivary flow rate. In this stage, 120 healthy children of both sexes, in the age groups of 1-5 and 6-12 years of age had the saliva samples collected between 8:00-10:00 hours or between 14:00-16:00 hours. In a second stage, the work had for objective to evaluate the correlation of the enzymatic activities of TAP, TRAP, low molecular weight protein tyrosine phosphatase (LMW-PTP) and ALP in the saliva and in the children's serum, besides analyzing the influence of the sex and of the age group in the activity of the enzymes, in the serum and in the whole unstimulated saliva. For so much 32 children of both sexes, in the 1-5 year-old age groups and 6-12 years of age had the saliva samples and blood collected between 8:00-10:00 hours. The results of the first stage suggest that the activities of TAP, TRAP and ALP are influenced, in different ways, for the factors sex, age group and time of collection and that correlation doesn't exist between the activities of the enzymes and the salivary flow rate. / Mestre

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Arbuscular Mycorrhizal Fungi (AMF) can increase the tolerance of plants to heavy metals, as well as their ability to enhance the acquisition of phosphorus (P). The aim of this study was to evaluate how the inoculation with AMF and P application can remedy the effects of high levels of copper (Cu) in the soil on Crotalaria juncea. The effects of AMF and P on the growth of plants, the enzymatic activity of acid phosphatase (APases) in plant and soil as well as the presence of glomalina. The experiment was conducted in a greenhouse in a 3 x 2 factorial arrangement (natural content of P, 40 and 100 mg kg-1 of P, with and without inoculation Rhizophagus clarus) with three replications in a soil with high levels of Cu (60 mg kg -1). Besides the treatments of P and AMF in soil with high levels of Cu, were evaluated two additional treatments in soil with natural levels of Cu (0.55 mg kg-1) containing 40 mg kg-1 of P, with and without AMF inoculation. The results showed that the combination of P and AMF (Rhizophagus clarus) may be an interesting strategy for the reduction of Cu phytotoxicity in Crotalaria juncea, as provided increments in dry matter production of plants and a decrease in the activity of acidic enzyme APases in soil and plants. Furthermore, it was showed that Glomalin produced by AMF can decrease Cu availability to the plants with phytoprotector consequent effect. / Os Fungos Micorrízicos Arbusculares (FMA) podem aumentar a tolerância das plantas a metais pesados, bem com sua capacidade de melhorar a aquisição de fósforo (P). O estudo objetivou avaliar como a inoculação com FMA e a aplicação de P podem remediar os efeitos de altos teores de Cu no solo sobre Crotalaria juncea. Foram avaliados os efeitos de FMA e P sobre o crescimento de plantas, a atividade enzimática de fosfatase ácida (APases) na planta e no solo, bem como a presença de glomalina. O experimento foi montado em casa de vegetação em esquema fatorial 3 x 2 (teor natural de P, 40 e 100 mg kg-1 de P, com e sem inoculação de Rhizophagus clarus com três repetições em um solo com altos teores de Cu (60 mg kg-1). Além destes tratamentos de P e FMA em solo com altos teores de Cu foram avaliados dois tratamentos adicionais em solo com teores naturais de Cu (0.55 mg kg-1) contendo 40 mg kg-1 P, com e sem inoculação de FMA. Os resultados demonstram que a combinação entre fósforo e o FMA (Rhizophagus clarus) pode ser uma estratégia interessante para a redução da fitotoxidez de Cu em Crotalaria juncea, pois proporcionaram incrementos na produção de matéria seca das plantas e uma diminuição na atividade das enzimas APases ácida no solo e nas plantas. Além disso, foi demonstrado que o aumento nos teores de glomalina produzida pelos FMA pode diminuir a disponibilidade do Cu para as plantas com consequente efeito fitoprotetor.

Orientador: Hiroshi Aoyama / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-04T22:35:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Jonsson_ClaudioMartin_D.pdf: 891938 bytes, checksum: c636143a4bde0645fb4a629221db8dd0 (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: Selenastrum capricornutum é uma alga clorofícea unicelular mundialmente distribuída em corpos de água doce e solos. Devido a sua natureza cosmopolita, o seu uso em estudos de ecotoxicidade é recomendado por protocolos nacionais e internacionais. A fosfatase ácida de algas desempenha importantes funções metabólicas tais como decomposição de fosfato orgânico em fosfato inorgânico, processos autofágicos, reciclagem de material celular e formação do zigoto durante a reprodução. Agentes químicos introduzidos em compartimentos ambientais em decorrência da atividade agrícola, tais como agrotóxicos e contaminantes de lodo usado como fertilizante, podem alterar a atividade da enzima nesses produtores primários. No presente trabalho foram estudados a extração, estabilidade, especificidade por substratos, efeito de inibidores e cinética da fosfatase ácida do extrato bruto de Selenastrum capricornutum. Foi também avaliado o efeito in vitro de 30 poluentes de origem agrícola (24 orgânicos e 6 metais pesados), sendo que experimentos mais detalhados in vitro e estudos in vivo, foram realizados com os agentes que promoveram maior efeito inibidor ou ativador. Os resultados demonstraram que a extração foi aumentada pelo congelamento/descongelamento entre os ciclos de sonicação. A enzima apresentou atividade ótima em pH 5,0 , um valor de Km = 0,27 mM para o substrato p-NPP e mostrou-se estável após o armazenamento em freezer durante aproximadamente 6 meses. A enzima foi inibida pelo tartarato (35%), fluoreto (75%) e Pi (45%) e p-CMB (48%). Substratos orgânicos naturais como FMN, frutose 1,6 difosfato e a-glicero fosfato são clivados em um grau similar ao do substrato sintético p-NPP, sugerindo-se o possível envolvimento da enzima no metabolismo desses intermediários. Os resultados demonstraram que somente o surfactante alquil benzeno linear sulfonado (LAS) e os metais pesados Hg2+, Al3+ e Cu2+ produziram uma alteração marcante (>50%) da atividade enzimática. A ordem de inibição da atividade na maior concentração testada foi LAS> Hg2+= Al3+> Se3+=Pb2+>Cd2+. Os valores de concentração de inibição média (CI50) para Hg2+ e LAS foram, respectivamente, 0,085 e 0,289 mM. Um mecanismo de inibição não-competitiva foi atribuído para o primeiro (Ki = 0,0365 mM), enquanto que o LAS comportou-se como um inibidor competitivo (Ki = 0,010 mM). Os estudos in vivo com culturas de algas tratadas durante 24 horas mostraram que a atividade enzimática e teor de proteína diminuíram nos tratamentos com Hg2+, enquanto que aumentaram em exposições ao LAS. Diferentemente dos experimentos a curto prazo, a inibição da atividade específica foi observada nos organismos expostos durante 7 dias, sendo atribuído um valor de concentração efetiva média (CE50) equivalente a 12,63 µM de Hg2+ e uma redução de 39% para LAS 2 mM. Os resultados de experimentos in vitro com Cu2+, como um ativador da fosfatase ácida, demonstraram uma EC50 e uma KdCu2+ (constante de dissociação para Cu2+) equivalente a 1,80 e 1,64 µM, respectivamente. Quando a enzima foi pré-incubada na presença de Cu2+ 0,2 mM, a Km e a Ea (energia de ativação) diminuíram enquanto que a Vmax praticamente não alterou. De acordo com dados de estabilidade em função do tempo e de experimentação em condições de pré-incubação, sugere-se que o efeito ativador do cobre seja devido ao aumento da estabilidade térmica da enzima. Nas exposições in vivo das culturas de S. capricornutum ao Cu2+, nas concentrações de 1 e 10 mM, foram obtidas diminuições significativas da atividade da fosfatase ácida e da concentração de proteína, entretanto estes efeitos não foram observados na concentração 0,1 mM. O íon metálico não alterou a atividade específica da enzima nas condições de exposição testadas. Os estudos sobre a ação conjunta inibitória indicaram que o Hg2+ possui menor valor de CI50 que o Al3+ ou LAS; e que as misturas Hg2++Al3+ e Hg2++LAS possuíam , respectivamente, efeito aditivo e levemente antagônico. O Cu2+, que demonstrou ter efeito ativador quando pré-incubado com a enzima, comportou-se como um leve antagonista contra o efeito inibidor do Hg2+. Espera-se que os resultados do presente trabalho auxiliem no delineamento experimental e discussão de resultados em estudos com enzimas de algas ou outros organismos, no que se refere a sua extração, caracterização e efeitos de agentes químicos. Espera-se ainda que os resultados melhorem o entendimento dos eventos básicos sobre o impacto de poluentes de origem agrícola em níveis bioquímicos de produtores primários / Abstract: Selenastrum capricornutum is an unicellular green algae widely distributed in freshwater and soils among the world. Because this cosmopolitan characteristic its use is recommended by national and international protocols in ecotoxicity studies. Algae acid phosphatase plays important roles in the metabolism such as decomposing organic phosphates into free phosphates and organic compounds; autophagic digestive process recycling cellular materials, and zygote formation during reproduction. Chemicals released into the environment from agriculture activities like pesticides and sewage sludge contaminants may impair algae phosphatase activity. In this work it was studied the extraction, stability, substrates specificity, effect of inhibitors and kinetics of acid phosphatase in the Selenastrum capricornutum crude extract. It was also evaluated the in vitro effect of thirty agriculture pollutants (24 organic and 6 heavy metals) and performed more detailed in vitro studies and in vivo experiments with the more potent inhibitors or activators. The results showed that the extraction increased by freezing/thawing between cycles of probe sonication. The enzyme showed an optimum pH of 5, a Km value of 0.27 mM for p-NPP and stability by freezing storage during approximately 6 months. The enzyme was inhibited by tartrate (35%), fluoride (75%), Pi (45%) and p-CMB (48%). Natural organic substrates like FMN, fructose 1,6 diphosphate and a-glycero-phosphate were cleaved in a similar extent as the synthetic p-NPP, suggesting the possibility of the enzyme involvement in the cellular metabolism of such intermediates. The results demonstrated that only the surfactant linear alkyl benzenesulphonate (LAS) and the heavy metals Hg2+, Al3+ and Cu2+ altered markedly (>50%) the enzyme activity. The order of inhibition at the highest concentration tested was LAS> Hg2+= Al3+> Se3+=Pb2+>Cd2+. Calculated median inhibition concentration (IC50) values for Hg2+ and LAS were 0.085 and 0.289 mM, respectively. A non-competitive inhibition mechanism was attributed for the former (Ki = 0.0365 mM) while LAS behaved as a competitive inhibitor (Ki = 0.010 mM). In vivo studies with treated algae cultures for 24 hours showed that enzyme activity and protein content diminished in Hg2+ treatments whereas increased in LAS exposures. In contrast with short term treatments, the inhibition of specific activity was observed in exposed algae during 7 days with estimated median effect concentration (EC50) value of 12.63 µM for Hg2+and 39% reduction for LAS 2 mM. The results of in vitro experiments with Cu2+ as an activator demonstrated a EC50 and a KdCu2+ (dissociation constant for Cu2+) equivalent to 1.80 and 1.64 µM, respectively. When the enzyme was preincubated in the presence of Cu2+ 0.2mM, Km and Ea (activaction energy) decreased whereas Vmax practically did not changed. According to the data of stability as a function of time and the preincubation conditions during some experiments, it was suggested that the activator effect of copper might be explained by the increase on the thermal stability of the enzyme. In vivo experiments showed significantly diminution of the enzyme activity together with protein content at 1 and 10 mM Cu2+ but not at 0.1 mM. This metal did not specifically affect the activity of the enzyme in exposed algae at the experimental conditions. Join action inhibition studies indicated that Hg2+ has a lower IC50 value than Al3+ or LAS , and that the Hg2++Al3+ and Hg3++LAS mixtures have respectively, additive and slight antagonism effects. Copper, which demonstrated an activator effect when was preincubated with the enzyme, behaved as a slight antagonist for the inhibitor effect of Hg2+. It can be expected that the results of this work will help in the experimental design and discussion of results in algae enzyme studies regarding the extraction, characterization and effect of chemicals. We hope that the results presented in this work can improve the understanding of the basic events of the impact of agriculture pollutants at biochemical levels in primary producers organisms / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:16:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao de mestrado completa Amanda A Souza.pdf: 994299 bytes, checksum: 8cf098dd70299abaf08a216436f38888 (MD5) Previous issue date: 2011-06-29 / Trichoderma harzianum is a saprophytic fungus, known for its potential as a biological control agent of different phytopathogens that causes losses in crops. Its action is based on different mechanisms like volatile and non-volatile antibiotics production, competition for nutrient and space, production of hydrolytic enzymes and mycoparasitism. This fungus also plays an important role in the release of carbon, nitrogen and phosphorus from insoluble macromolecules to the medium, favoring the growth of plants. Phosphorus is a limiting nutrient for plant growth, however, over 80% of the phosphorus applied to the soil, it becomes unavailable, due to its adsorption, precipitation or conversion to organic form. One way to obtain phosphate compounds in soil is through the action of enzymes called phosphatases, which catalyze the hydrolysis of phosphate esters producing soluble phosphorus. High levels of acid phosphatase (ACP) were produced by Trichoderma harzianum ALL42. This study evaluated the ability of T. harzianumALL42produce acid phosphatases(ACPs) in minimal medium modified by varying the concentration of glucose and phosphate (KH2PO4). The results showed that the concentration of glucose and phosphate in the culture medium regulated the production of ACPs T. harzianum ALL42. Thisfungusproducedanacid phosphatase(ACPII) inculture mediumcontainingglucose0.5% and0.04% phosphate. Theenzymewaspartiallypurifiedby hydrophobic interaction chromatography on Phenyl Sepharose. A typical procedure provided 2,0 fold purification with 32.65 % yield. It was optimally active in the pH range 5,2 and at 50°C. The enzyme was heat-stable, retaining approximately 60% of its activity after heating for 60 min at 60°C. Kinetic parameters calculated for the hydrolysis of p-nitrophenyl phosphate by acid phosphatase were Km= 0,054 M and Vmax= 2,058 units.min-1. The enzyme was strongly inhibited by KH2PO4, FeCl3 and sodium tungstate. The enzyme is inhibited by KH2PO4 and sodium tungstate through mixed inhibition. The acid phosphatase hydrolyzed a number of phosphate esters ATP, ADP, AMP, D-glucose-1-phosphate, D-fructose-6-phosphate, includingphytic acid, showinganactivityofphytase. / Trichoderma harzianum é um fungo saprofítico, conhecido pelo seu grande potencial como agente de controle biológico de diferentes fitopatógenos. Sua ação é baseada em diferentes mecanismos como a produção de antibióticos voláteis e não-voláteis, competição por espaço e nutrientes, produção de enzimas hidrolíticas e o micoparasitismo. Esse fungo também desempenha um importante papel na liberação de carbono, nitrogênio e fósforo, a partir de macromoléculas insolúveis, para o meio, favorecendo o crescimento de plantas. O fósforo é um nutriente limitante para o crescimento da planta, entretanto, mais de 80% do fósforo aplicado diretamente no solo, torna-se indisponível, devido a sua adsorção, precipitação ou conversão para forma orgânica. Uma forma de se obter compostos fosfatados no solo é através da ação de enzimas denominadas fosfatases, que catalisam a hidrólise de ésteres fosfatados produzindo fósforo solúvel. Altos níveis de fosfatase ácida foram produzidos por Trichoderma harzianum ALL42. Neste trabalho avaliou-se a capacidade de T. harzianum ALL42 produzir fosfatases ácidas (ACPs) em meio mínimo modificado, variando a concentração de glicose e fosfato (KH2PO4). Os resultados obtidos demonstraram que, a concentração de glicose e fosfato no meio de cultura regulou a produção de ACPs por T. harzianum ALL42. Esse fungoproduziu uma fosfatase ácida (ACPII) em meio de cultura contendo glicose 0,5% e fosfato 0,04%. A enzima foi parcialmente purificada através da cromatografia de interação hidrofóbica Phenyl-Sepharose. O processo de purificação obteve um fator de purificação de 2,0 e rendimento de 32,65%. A atividade ótima encontrada foi na faixa de pH 5,2 e a 50 ºC. A enzima foi termoestável, mantendo aproximadamente 60% de sua atividade após incubação por 60 min a 60 ºC. Os parâmetros cinéticos calculados pela hidrólise de ƿ-nitrofenilfosfato pela fosfatase ácida foram de Km = 0,054 µmol e Vmáx = 2,028U.min-1. A enzima foi fortemente inibida por KH2PO4,FeCl3 e tungstato de sódio. A enzima foi inibida por KH2PO4 e tungstato de sódio por inibição mista. A fosfatase ácida hidrolisou todos os ésteres fosfatados testados (ATP, ADP, AMP, D-glicose-1-fosfato, D-frutose-6-fosfato, fenil fosfato de sódio), inclusive ácido fítico, demonstrando uma atividade de fitase.

Orientador: Hiroshi Aoyama / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-22T19:29:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Leme_CamilaWielewski_M.pdf: 1648747 bytes, checksum: 5bd3c268b5ff076939204e230a1dc0e9 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: Atualmente, muito tem sido descoberto acerca dos mecanismos de controle do crescimento e coordenação celular, principalmente em células eucarióticas. Dentre tais mecanismos, o balanço entre a fosforilação e a desfosforilação de proteínas é a base para o controle de diversos eventos biológicos. As fosfatases são hidrolases que utilizam como substrato fosfatomonoésteres, e são amplamente distribuídas na natureza. As fosfatases ácidas (FAcs) são enzimas que apresentam melhor atividade em meio ácido. O objetivo do presente trabalho é estudar o efeito de peróxido de hidrogênio em duas fosfatases ácidas cujos sítios ativos contêm cisteína. Para tanto, FAc de sementes de mamona e FAc de rim bovino, ambas obtidas previamente em nosso laboratório, foram utilizadas no estudo. A primeira é uma glicoproteína, ao passo que a segunda não contém carboidrato em sua estrutura. Ensaios enzimáticos utilizando o substrato sintético p-nitrofenilfosfato (pNPP) foram realizados, em diferentes condições de incubação e exposição das enzimas. A FAc de mamona apresentou grande resistência ao peróxido de hidrogênio (H2O2), fato que se mostrou independente da presença de carboidrato em sua estrutura. Ensaios na presença de ditiotreitol (DTT) ou glutationa reduzida (GSH) provocaram inibição da enzima, porém a combinação de DTT ou GSH a H2O2 foi capaz de recuperar completamente a atividade enzimática. A exposição da FAc de mamona a DTT ou GSH não protegeu totalmente o sítio catalítico contra a oxidação por H2O2, apesar de acarretar em menores taxas de inibição por esse composto. A exposição da enzima a H2O2 elevou a sua inibição. A FAc de rim bovino apresentou grande susceptibilidade ao H2O2. Os compostos DTT e GSH provocaram inibição de sua atividade, assim como observado para a FAc de mamona. A combinação de DTT ou GSH a H2O2 não restabeleceu a atividade enzimática, sugerindo que há diferenças no processo de oxidação por esse composto entre as duas FAcs utilizadas nesse trabalho. A exposição da FAc de rim bovino a DTT ou GSH não foi eficaz na proteção do sítio catalítico, e a exposição dessa enzima a H2O2 elevou a inibição da atividade enzimática. Nossos resultados sugerem que as FAcs, independentemente da presença de carboidrato na estrutura, sofreram oxidação de maneiras diferentes, apresentando comportamentos bastante divergentes entre si. Hipotetizamos que a Fac de mamona atingiu um estado reversível de oxidação, sendo que a cisteína tornou-se ácido sulfênico. Já a FAc de rim bovino deve ter alcançado um estado irreversível de oxidação, com a cisteína na forma de ácido sulfínico ou sulfônico / Abstract: Currently, much has been discovered about the mechanisms of control of cell growth and coordination, especially in eukaryotic cells. Among such mechanisms, the balance between the phosphorylation and dephosphorylation of proteins is the basis for the control of various biological events. The phosphatases are hydrolases using as substrate phosphate monoesters, and are widely distributed in nature. The acid phosphatases are enzymes that have better activity under acidic conditions. The goal of this work is to study the effect of hydrogen peroxide (H2O2) in two acid phosphatases which contains cysteine in their active site. Therefore, castor bean and bovine kidney acid phosphatases, both previously obtained in our laboratory, were used in this study. The first is a glycoprotein, whereas the second contains no carbohydrate in its structure. Enzyme assays using the synthetic substrate p-nitrophenylphosphate (pNPP) were performed at different incubation conditions and exposure of the enzymes. The castor bean acid phosphatase showed great resistance to H2O2, a fact that was independent of the presence of carbohydrate in their structure. Assays in the presence of dithiothreitol (DTT) or reduced glutathione (GSH) caused enzyme inhibition, but the combination of the GSH or DTT and H2O2 was able to completely recover enzyme activity. Exposure of castor bean acid phosphatase to DTT or GSH did not fully protect the catalytic site against oxidation by H2O2, although result in lower rates of inhibition by this compound. Exposure of the enzyme to H2O2 increased its inhibition. Acid phosphatase from bovine kidney showed high susceptibility to H2O2. The compounds DTT and GSH caused inhibition of its activity, as was observed for castor bean acid phosphatase. For this enzyme, the combination of DTT or GSH to H2O2 not reestablished enzyme activity, suggesting that there are differences in the oxidation process for this compound between the two phosphatases used in this work. Exposure of bovine kidney acid phosphatase to DTT or GSH was not effective in protecting the catalytic site, and the exposure of the enzyme to H2O2 increased the inhibition of enzyme activity. Our results suggest that the acid phosphatases, regardless of the presence of carbohydrate in the structure, underwent oxidation by different ways, presenting quite divergent behaviors. We hypothesize that the castor bean acid phosphatase reached a state of reversible oxidation, and cysteine became sulfenic acid. As for acid phosphatase bovine kidney must have reached a state of irreversible oxidation with cysteine as sulfonic or sulfinic acid / Mestrado / Bioquimica / Mestra em Biologia Funcional e Molecular

Made available in DSpace on 2017-06-01T18:20:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_adriana_lima.pdf: 7041201 bytes, checksum: 00f3f7db548b1395dca70e5eccf2aa13 (MD5) Previous issue date: 2008-02-28 / Considering the biotechnological potential of Trichoderma harzianum in the xenobiotic metabolization and its resistance to heavy metals, the aim of this work was to evaluate the utrastructural and biochemical behavior related to cadmium tolerance and removal. The microorganism was grown in different media, containing 1mM, 2mM and 3mM of cadmium. Aspects of the growth profile was obtained by biomass production, glucose consumption, acid and alkaline phosphatase activities, morphology by optical microscopy, ultrastructure by scanning electron microscopy, total protein profile, polyphosphate acumulation and metal removal were evaluated. The results obtained revealed the inhibitory effects of the heavy metal on the microbial growth and the aspects of the tolerance to cadmium. The glucose consumption and the enzymes activities were also affected by cadmium and its different concentrations. The morphological analysis revealed variations related to hyphae thickness, branching pattern, texture and homogenity, electrondensity, and presence of granular structures. The ultrastructural aspects revealed alterations related to cell electrondensity, mycelia density, branching pattern and reduced chlamidospores number. The grown in presence of the metal induced a reduction in the total protein content related to cadmium concentration. The isolate was able to accumulate polyphosphate, and its grown in cadmium induced the polymer degradation. The cadmium removal was observed and revealed variations related to metal concentrations. The results for the first time revealed the effects of cadmium on T. harzianum polyphosphate accumulation and its potential application in the metal remediation / Considerando o potencial biotecnológico do fungo Trichoderma harzianum no processo de metabolização de compostos xenobióticos e sua resistência a metais pesados, o presente trabalho teve como finalidade estabelecer conhecimentos bioquímicos e ultraestruturais associados ao processo de remoção de cádmio. O microrganismo foi cultivado em meio contendo diferentes concentrações de cádmio: 1mM, 2mM e 3mM. O perfil de crescimento foi estabelecido em função da biomassa produzida, do consumo de glicose e fosfato, conteúdo intracelular de polifosfato, atividade das enzimas fosfatases ácida e alcalina, perfil de proteínas totais e remoção do metal. Os resultados obtidos sugerem efeitos do metal sobre o crescimento do organismo em diferentes meios de cultura. O crescimento em meio padrão revela a tolerância do organismo frente a altas concentrações de cádmio, e que tal cultivo induz variações no consumo de glicose e atividade das fosfatases. A utilização da microscopia óptica revelou variação na morfologia do organismo como resposta a variação do meio de cultivo e da presença e ausência do metal. Modificações relativas a processo de ramificação, textura e espessura das hifas foram visualizadas. Os aspectos ultraestruturais através de varredura demonstraram que T. harzianum cultivado na presença de cádmio apresentou variações associadas a eletrondensidade, densidade micelial, maior ramificação e menor número de clamidósporos. A análise do perfil de proteínas totais revelou que o cultivo em cádmio induziu a diminuição do conteúdo de proteínas dependendo da concentração. O isolado foi capaz de acumular polifosfato, e a presença do metal induziu a degradação do polímero em função da concentração. A remoção de cádmio do meio foi avaliada, revelando variação em função da concentração. Os resultados demonstram o efeito do cádmio sobre T. harzianum, pela primeira vez, e demonstram o potencial do microrganismo em acumular polifosfato e sua possível aplicação na remediação de metais pesados

Eventos como fosforilação e desfosforilação estão presentes nos processos de crescimento e diferenciação celular. As proteínas tirosina fosfatases estão envolvidas nestes processos. Estas enzimas são encontradas em animais, plantas e ocorrem em diversas formas, diferindo no peso molecular, substrato específico e sensibilidade a inibidores. As enzimas que possuem baixo peso molecular (entre 18-20 KDa), hidrolisam p-nitrofenilfosfato e são sensíveis ao p-hidroximercuribenzoato são chamadas como proteínas tirosina fosfatases de baixo peso molecular relativo (PTP-BMr) ou fosfatases ácidas. Vários dados sugerem que tipos de células de osso, como osteoblastos, podem expressar esta enzima ativa. Aqui, culturas de osteoblastos derivadas da medula removida do fêmur de rato foram investigadas para padronizar a metodologia de obtenção da PTP-BMr. A expressão e atividade catalítica desta enzima em diferentes estágios de crescimento de osteoblastos também foram verificadas. Foi observado que são necessários de 16-19 dias de cultura para obter maiores níveis de atividade da PTP-BMr em extrato citoplasmático. O nível de expressão do gene da PTP-BMr foi determinado por PCR em tempo real e uma maior quantificação de RNAm foi obtida em 16 dias de crescimento de osteoblasto. A caracterização bioquímica parcial confirma uma banda de atividade em gel de poliacrilamida com peso molecular de 17,6 KDa, e pH ótimo de 5,5. A hidrólise do p-nitrofenilfosfato demonstra uma pequena cooperatividade relativa (n=1,2) com K0,5= 0,12 e Vmax= 3,5U/mg. Esta atividade foi fortemente inibida (60 a 75%) por molibdato de amônio (10mM); fosfato de sódio (10mM); ortovanadato de sódio (10mM) e p-hidroximercuribenzoato de sódio (10mM). Estas propriedades são típicas desta classe. A interação entre osteoblastos e diferentes superfícies pode ativar ou desativar genes. Este presente projeto investigou se a interação com superfície de titânio pode modificar o perfil de atividade da PTP-BMr. Quando em presença de uma superfície de titânio há um maior aumento na atividade catalítica do que nos níveis de RNAm da PTP-BMr o que sugere uma estimulação da enzima a qual pode estar auxiliando no processo de formação óssea. / Events as phosphorilation and desphosphorilation are experienced in cell growth and differentiation processes. Tyrosine phosphatases proteins are involved in these processes. These enzymes are found in animals, plants and occur in multiple forms, differing in relative molecular weight, substrate specificity and sensitivity to inhibitors. The enzymes that have low molecular weight (between 18-20KDa), hydrolize p-nitrophenilphosphate and are sensible to p-hidroximercuribenzoate are known as low molecular weight relative tyrosine phosphatase proteins (PTP-LMWr) or acid phosphatase. Several data suggest that bone cell types, such as osteoblasts, may express this enzyme activity. Here, osteosblast cultures derived from medulla removed from rat femur were investigated to standardize the methodology of PTP-LMW obtainment. The expression and the catalytic activity of this protein in different stages of osteoblast growth were checked as well. It was observed that 16-19 culture days are necessary to obtain greater levels of activity of PTP-LMW in the cytoplasmatic extracts. The gene expression level of PTP-LMW was determined by quantitative real-time PCR, and a greater quantity of mRNA was observed within sixteen days of osteoblast growth. The partial biochemistry characterization confirms a single active band in poliacrilamide gel with molecular weight of about 17.6KDa, and a pH-optimum around 5.5. p-nitrophenilphosphate hydrolysis shows a small cooperative behavior (n=1.2) with K0.5=0.12mM and Vmax=3.5U/mg. This activity was strongly inhibited (about 60-95%) by ammonium molybdate (10mM); sodium phosphate (10mM); sodium orthovanadate (10mM) and sodium p-hydroximercuribenzoate (10mM). These properties are typical for this enzyme class.

Submitted by Jean Medeiros (jeanletras@uepb.edu.br) on 2016-05-03T13:54:53Z No. of bitstreams: 1 PDF - Antônio Manoel da Silva Filho.pdf: 1626282 bytes, checksum: 35f4f3bebdefb1abb1e520955b76a0e8 (MD5) / Approved for entry into archive by Secta BC (secta.csu.bc@uepb.edu.br) on 2016-07-25T19:29:57Z (GMT) No. of bitstreams: 1 PDF - Antônio Manoel da Silva Filho.pdf: 1626282 bytes, checksum: 35f4f3bebdefb1abb1e520955b76a0e8 (MD5) / Approved for entry into archive by Secta BC (secta.csu.bc@uepb.edu.br) on 2016-07-25T19:32:57Z (GMT) No. of bitstreams: 1 PDF - Antônio Manoel da Silva Filho.pdf: 1626282 bytes, checksum: 35f4f3bebdefb1abb1e520955b76a0e8 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-25T19:32:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PDF - Antônio Manoel da Silva Filho.pdf: 1626282 bytes, checksum: 35f4f3bebdefb1abb1e520955b76a0e8 (MD5) Previous issue date: 2016-02-18 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The utilization of Gluconacetobacter diazotrophicus in agriculture has shown promise in optimization morphophysiological aspects, biochemical and yield of plants. The culture of red rice (Oryza sativa L.) presents great socioeconomic and environmental importance in the semi- arid northeast. The production of this culture still suffers by the not full use of appropriate technologies, due to scarcity of studies and development of technologies. Given the above, the objective of this study was to evaluate the potential effect of G. diazotrophicus on germination and initial growth of red rice.The experiment was conducted in a completely randomized design, with six treatments (SNE-seeds not soaked in water, SE H2O-seeds soaked in water for 24 hours, SE H2O + GA3 seed soaked in gibberellic acid solution for 24 hours, SE H2O + GD-seeds soaked in water for 24 + G. diazotrophicus, SE H2O + GA3 + GD-seeds soaked in gibberellic acid solution for 24 hours + G. diazotrophicus and SNE + GD-seeds not soaked in water + G. diazotrophicus) with six replicates.The concentration of gibberellic acid (GA3) used was 50 mg -1 L . Evaluated were the aspects physiological, biochemical, molecular and initial growth of red rice seedlings. Data were submitted to analysis of variance, mean test and Pearson correlation. Treatments significant effect on the growth variables, physiological, biochemical and molecular.It was verified that treatment with non-imbibed seeds inoculated with G. diazotrophicus promote increase of 28.7; 41.7; 28.7; 49.5; 69.6; 48.5; 61.5; 38.5; 46; 97; 86 and 89% for the variables: germination, germination speed index, first count, root length, shoot length, total fresh mass, total dry mass of α-amylase activity, activ acid phosphatase, expression GAMYB transcription factor, α-amylase and S-adenosyl-L-methionine (SAM) synthase, respectively, in relation to the treatment of seeds not soaked in water and not inoculated.It was concluded that the inoculation with G. diazotrophicus red rice seeds enhances the speed of germination and seedling germination, root length, shoot length, and acid phosphatase activities of α-amylase, total fresh mass, total dry mass, GAMYB expression of the transcription factor, α- amylase expression and SAM. Therefore presents great potential agronomic and biotechnology for use as growth promoter in the red rice crop, increasing the germination and early growth independently of seed imbibition. / A utilização de Gluconacetobacter diazotrophicus na agricultura tem-se mostrado promissora na otimização de aspectos morfofisiológicos, bioquímicos e rendimento das plantas. Acultura do arroz vermelho(Oryza sativa L.) apresenta grande importância socioeconômica e ambiental no semiárido nordestino. Aprodução dessa cultura ainda padece pela não utilização plena de tecnologias apropriadas, devido a escassez de estudos e desenvolvimento de tecnologias. Diante do exposto, objetivou-se com este trabalho avaliar o efeito potencial da G. diazotrophicussobre a germinação e crescimento inicialde arroz vermelho. O experimento foi realizado emdelineamento inteiramente casualisado, constando de seis tratamentos (SNE-sementes não embebidas em água, SE H2O-sementes embebidas em água por 24h, SE H2O + GA3-sementes embebidas em solução de ácido giberélicopor 24h, SE H2O + GD-sementes embebidas em água por 24h + G. diazotrophicus, SE H2O + GA3 +GD-sementes embebidas em solução de ácido giberélicopor 24h + G. diazotrophicuse SNE + GD-sementes não embebidas em água + G. diazotrophicus), com seis repetições. A concentração da solução de ácido giberélico (GA3) usada -1 foi de 50 mg L . Avaliaram-se os aspectos fisiológicos, bioquímicos, moleculares e de crescimento inicial das plântulas de arroz vermelho. Os dados foram submetidos à análise de variância, teste de médias e correlação de Pearson. Os tratamentos exerceram efeito significativo sobre as variáveis de crescimento, fisiológicas,bioquímicas e moleculares. Registrou-se que o tratamento com sementes não embebidas e inoculadas com G. diazotrophicuspromoveram incrementos de 28,7; 41,7; 28,7; 49,5; 69,6; 48,5; 61,5; 38,5; 46; 97; 86 e 89% para as variáveis: germinação, índice de velocidade de germinação, primeira contagem de germinação, comprimento radicular, comprimento da parte aérea, massa fresca total, massa seca total, atividade da α-amilase, ativida da fosfatase ácida, expressão do fator de transcrição GAMYB, α- amilase e S-adenosil-L-metionina (SAM) sintetase, respectivamente, em relação ao tratamento das sementes não embebidas em água e não inoculadas. Concluiu-se que a inoculação de G. diazotrophicus em sementes de arroz vermelho aumenta a velocidade de germinação e germinação das plântulas, comprimento radicular, comprimento da parte aérea, atividade s da fosfatase ácida e α-amilase, massa fresca total, massa seca total, a expressão do fator de transcrição GAMYB, expressão de α-amilase e SAM.Portanto apresenta grande potencial agronômico e biotecnológico para aplicação como promotora de crescimento na cultura do arroz vermelho, incrementando a germinação e crescimento inicial de modo independente de embebição das sementes.

Orientador: Iguatemy Lourenço Brunetti / Banca: Luís Carlos Spolidorio / Banca: Marília Afonso Rabelo Buzalaf / Banca: Maria Teresa Pepato / Banca: Maria Lúcia Rubo de Rezende / Resumo: O tratamento cirúrgico da fissura congênita do processo alveolar superior compreende o enxerto ósseo, um procedimento bem aceito e de grande importância na restauração da forma e da função perdidas. Associado ao enxerto ósseo tem-se utilizado um produto atóxico, não imunoreativo e de fácil obtenção, denominado plasma rico em plaquetas (PRP). Neste estudo foi analisado o comportamento dos marcadores fosfatase alcalina, fosfatase alcalina isoforma óssea, osteocalcina e fosfatase ácida tartarato resistente em 50 pacientes, com idade entre 10 e 20 anos e que foram submetidos à cirurgia de enxerto ósseo autógeno alveolar pelo serviço de Cirurgia Buco-maxilofacial do Hospital de Reabilitação de Anomalias Craniofaciais da Universidade de São Paulo. O objetivo foi acompanhar de forma sistêmica e em curto período a formação ou reabsorção óssea após a realização do enxerto ósseo alveolar, bem como avaliar a eficácia do uso do plasma rico em plaquetas no processo de formação óssea. O estudo concluiu que as propriedades restauradoras do PRP não puderam ser demonstradas por nenhum dos marcadores bioquímicos do metabolismo ósseo nos primeiros 70 dias do ato cirúrgico; a análise temporal dos marcadores de formação óssea testados demonstrou uma tendência de queda com 35 dias e retorno próximo aos níveis basais com 70 dias do ato cirúrgico nos dois grupos estudados; não houve uma correlação significativa dos marcadores com o número de plaquetas e nem com a área da fissura e o resultado do exame ao raio X foi considerado inconclusivo para a presença ou não de trabeculado ósseo organizado em fase inicial de formação. / Abstract: The surgical treatment of the congenital cleft of the upper alveolar process understands the bone graft, a well accepted procedure of great importance in the restoration of the lost form and function. Together with the bone graft it is being used a non-toxic, non imunoreactive and easily obtained product, denominated platelet-rich plasma (PRP). In this study it was analysed the behavior of the alkaline phosphatase, bone alkaline phosphatase, osteocalcin and tartrate-resistant acid phosphatase markers in 50 patients, with age between 10 and 20 years and that were undergone to alveolar autogenous bone graft performed by the Bucomaxillofacial Service of the "Hospital for Rehabilitation of Craniofacial Anomalies, University of São Paulo". The aim was follow in a sistemic and early way the bone formation or reabsorption after the accomplishment of the alveolar bone graft, as well as to evaluate the effectiveness of the use of the platelet-rich plasma in the process of bone formation. The study concluded that the restorative properties of the PRP could not be demonstrated by of the biochemistry markers of the bone metabolism in the first 70 days of the surgery; the temporal analisys of the bone formation markers tested demonstrated a fall tendency in 35 days with return near to basal levels in 70 days in the two studied groups; there was not a significant correlation between markers and the number of platelets and neither with the area of the cleft and the result of the x-ray examination was not considered conclusive for the presence or not of organized bone trabeculae in the initial phase of formation. / Doutor