Made available in DSpace on 2015-07-13T12:10:13Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-04-16. Added 1 bitstream(s) on 2015-07-13T12:25:38Z : No. of bitstreams: 1 000835916_20170416.pdf: 69227 bytes, checksum: 87eb14dd41d66da225f5d081d8d7e566 (MD5) Bitstreams deleted on 2017-04-17T13:37:14Z: 000835916_20170416.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2017-04-17T13:38:02Z : No. of bitstreams: 1 000835916.pdf: 520048 bytes, checksum: 1a74fa0bb8c7b95416b6bed3ddeb0ca5 (MD5) / O fígado é um órgão importante no metabolismo animal, sendo responsável pelo processamento e distribuição dos nutrientes, por meio da corrente sanguínea, para os outros órgãos e tecidos do organismo. Como o fígado é responsável pela realização de vários processos de síntese e tendo em vista a escassez de informação acerca das funções das fosfatases ácida e alcalina hepáticas, o presente trabalho teve por objetivo analisar as atividades dessas enzimas envolvidas no metabolismo de fósforo de girinos de rã-touro (L. catesbeianus) durante a metamorfose, visando gerar maiores informações sobre esse período da vida do animal e obtenção de imagos sadios. A metamorfose é uma etapa crucial no desenvolvimento dos anfíbios, sendo caracterizada por uma série de eventos que possibilitam aos girinos ocuparem o ambiente terrestre. Durante a metamorfose e fase adulta terrestre, a fosfatase ácida presente no fígado atua como um indicador da atividade lisossomal, o que pode ser observado pelo aumento de sua atividade no fim do clímax metamórfico, sugerindo aumento da morte celular devido ao reaproveitamento dos nutrientes. A fosfatase alcalina hepática, uma enzima de membrana, atua como fosfomonohidrolase e na detoxificação, principalmente ésteres de fosfato gerados durante o metabolismo animal. A diminuição da atividade da fosfatase alcalina quando utilizado um substrato artificial, demonstra a queda na geração de compostos secundários, devido a não ingestão de alimentos nessa fase de vida, enquanto que a utilização de um substrato fisiológico sugere um importante papel da mesma na proteção do organismo animal. / The liver is an important organ in animal metabolism, being responsible for the processing and distribution of nutrients through the blood system to other organs and tissues. Since the liver is responsible for various processes of synthesis and concerning the lack of information about the functions of liver acid and alkaline phosphatases, the aim of the study was to analyze the activities of these enzymes involved in phosphorus metabolism of bullfrog's tadpoles (L. catesbeianus) during metamorphosis, aiming to a better understanding about this period of life of the animal and to produce healthy juveniles. Metamorphosis is a crucial stage in amphibian's development, it is characterized by a series of events that enable tadpoles to occupy the terrestrial environment. During metamorphosis and terrestrial adult stage, the acid phosphatase present in the liver acts as an indicator of lysosomal activity, it can be observed by the increase in its activity at the end of the metamorphic climax, suggesting increased cell death due to recycling of nutrients. The liver alkaline phosphatase, a membrane bound enzyme, acts as a phosphomonohydrolase and in the detoxification of compounds, especially phosphate esters generated in animal metabolism. The decrease in alkaline phosphatase activity when an artificial substrate is used demonstrates a reduction in the generation of secondary metabolites because there is no food intake at this stage of life, on the other hand the use of a physiological substrate suggests an important role in protecting the organism.

Orientador: João Martins Pizauro Junior / Banca: Saulo Santesso Garrido / Banca: Claudinei da Cruz / Resumo: O fígado é um órgão importante no metabolismo animal, sendo responsável pelo processamento e distribuição dos nutrientes, por meio da corrente sanguínea, para os outros órgãos e tecidos do organismo. Como o fígado é responsável pela realização de vários processos de síntese e tendo em vista a escassez de informação acerca das funções das fosfatases ácida e alcalina hepáticas, o presente trabalho teve por objetivo analisar as atividades dessas enzimas envolvidas no metabolismo de fósforo de girinos de rã-touro (L. catesbeianus) durante a metamorfose, visando gerar maiores informações sobre esse período da vida do animal e obtenção de imagos sadios. A metamorfose é uma etapa crucial no desenvolvimento dos anfíbios, sendo caracterizada por uma série de eventos que possibilitam aos girinos ocuparem o ambiente terrestre. Durante a metamorfose e fase adulta terrestre, a fosfatase ácida presente no fígado atua como um indicador da atividade lisossomal, o que pode ser observado pelo aumento de sua atividade no fim do clímax metamórfico, sugerindo aumento da morte celular devido ao reaproveitamento dos nutrientes. A fosfatase alcalina hepática, uma enzima de membrana, atua como fosfomonohidrolase e na detoxificação, principalmente ésteres de fosfato gerados durante o metabolismo animal. A diminuição da atividade da fosfatase alcalina quando utilizado um substrato artificial, demonstra a queda na geração de compostos secundários, devido a não ingestão de alimentos nessa fase de vida, enquanto que a utilização de um substrato fisiológico sugere um importante papel da mesma na proteção do organismo animal. / Abstract: The liver is an important organ in animal metabolism, being responsible for the processing and distribution of nutrients through the blood system to other organs and tissues. Since the liver is responsible for various processes of synthesis and concerning the lack of information about the functions of liver acid and alkaline phosphatases, the aim of the study was to analyze the activities of these enzymes involved in phosphorus metabolism of bullfrog's tadpoles (L. catesbeianus) during metamorphosis, aiming to a better understanding about this period of life of the animal and to produce healthy juveniles. Metamorphosis is a crucial stage in amphibian's development, it is characterized by a series of events that enable tadpoles to occupy the terrestrial environment. During metamorphosis and terrestrial adult stage, the acid phosphatase present in the liver acts as an indicator of lysosomal activity, it can be observed by the increase in its activity at the end of the metamorphic climax, suggesting increased cell death due to recycling of nutrients. The liver alkaline phosphatase, a membrane bound enzyme, acts as a phosphomonohydrolase and in the detoxification of compounds, especially phosphate esters generated in animal metabolism. The decrease in alkaline phosphatase activity when an artificial substrate is used demonstrates a reduction in the generation of secondary metabolites because there is no food intake at this stage of life, on the other hand the use of a physiological substrate suggests an important role in protecting the organism. / Mestre

Orientador: Carmen Veríssima Ferreira / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-16T13:47:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ferreira_PaulaAnastacia_D.pdf: 2451128 bytes, checksum: a13caa2510a3ac1dca624878d50fafab (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: A eficiência do tratamento da leucemia sob vários aspectos, mesmo com os avanços farmacotecnológicos, ainda permanece como desafio para a medicina. Diante desse fator, maiores informações sobre a base molecular da leucemia e o desenvolvimento de agentes que atuem de forma alvo-específico, apresentem poucos efeitos colaterais e possam impedir o escape das células tumorais à indução de morte são extremamente desejáveis. No presente trabalho, foram abordados 2 aspectos: indução de morte das células leucêmicas por calix[6]areno, flavonóides e diterpeno lactona e contribuição da proteína tirosina fosfatase de baixo massa molecular (LMWPTP) para a resistência de células leucêmicas. As linhagens K562, Lucena-1 (resistente) e HL60 foram utilizadas como modelos no estudo. Calix[6]areno apresentou o mesmo nível de toxicidade para as duas linhagens celulares, mostrando valores de IC50 na faixa de 1-5 µM para K562 e 5-10 µM para Lucena-1. Calix[6]areno induziu vias apoptóticas como demonstrado pelo aumento da razão Bax/Bcl-2 e clivagem de PARP. A proteína tirosina fosfatase PTEN foi ativada pelo Calix[6]areno, fato relacionado com a diminuição da sobrevivência e proliferação. O Calix[6]areno aumentou a expressão de algumas enzimas antioxidantes e não afetou a atividade da proteína associada com o fenótipo de resistência, P-Glicoproteína. As células Lucena-1, que apresentam alta expressão da P-Glicoproteína, também apresentam altos níveis da LMWPTP. Observamos que quando esta enzima foi silenciada, a resposta frente a quimioterápicos das células leucêmicas se tornou mais eficiente. Por outro lado, o aumento da expressão da LMWPTP em células não resistentes provocou insensibilidade das mesmas à vincristina. Nossos dados sugerem que a LMWPTP contribui com o fenótipo resistente através da ativação das quinases Src e BCR-ABL. Outro aspecto investigado neste trabalho foi a indução da diferenciação e apoptose por compostos naturais. Quercetina e a apigenina apresentaram os dois efeitos desejados a um agente quimioterápico, ou seja, expressiva indução da diferenciação das células e também apoptose. Estes efeitos foram dependentes do tempo e modulação do estado redox celular. / Abstract: Leukemia therapy efficiency, under several aspects, even with the progress of pharmacotechnology, remains as a challenge in medicine. According to this, new information about the molecular basis of leukemia and development of agents that act on specific target, present low side-effects and prevent cancer cells escaping from death induction, are extremely desirable. In this work 2 aspects were evaluated: death induction of leukemia cells by calix[6]arene, flavonoids and diterpene lactone and the contribution of the low molecular weight protein tyrosine phosphatase (LMWPTP) for leukemia cells resistance. K562, Lucena-1 and HL60 cells were used as models in this study. Calix[6]arene presented the same level of toxicity on K562 and Lucena-1 cells, displaying an IC50 value ranging 1-5 µM to K562 cells and 5-10 µM to Lucena-1 cells. Calix[6]arene induce apoptosis signaling on both K562 and Lucena cells as molecularly demonstrated by the increased Bax/Bcl-2 ratio and PARP cleavage. Protein tyrosine phosphatase PTEN from leukemia cells became more active in the presence of calix[6]arene, which is related to a decrease of survival and proliferation. Calix[6]arene enhanced the expression of antioxidant enzymes and did not affect P-Glycoprotein activity. Lucena cells, which present high expression of P-Glycoprotein also contain high level of LMWPTP. Interestingly, when this phosphatase was silenced the leukemia cells response appeared to be more efficient towards chemotherapics. On the other hand, overexpression of this enzyme in K562 (non resistant cells) provoked insensitivity to vincristine. Our findings suggest that LMWPTP contributes with the resistance phenotype by supporting the activation status of Src and BCR-ABL kinases. Another aspect examined in this study was the induction of differentiation and apoptosis by natural compounds. Quercetin and apigenin displayed both desired effects of chemotherapics: induction of differentiation and apoptosis. These effects were time- and cellular redox status dependent. / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientadores: Hiroshi Aoyama, Marcio Andre Miranda / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-09T01:06:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Camargo_CamiladeAndrade_M.pdf: 1153945 bytes, checksum: d090e6ed4e436a5029c6e36de7786df1 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: Os flavonóides são fitocompostos polifenólicos, caracterizados quimicamente como heterosídeos flavônicos. Apresentam diversas atividades biológicas devido às suas propriedades antioxidantes e habilidades em modular a atividade de diversas enzimas ou receptores celulares, tornando-os responsáveis pelo efeito protetor contra doenças relacionadas ao sistema cardiovascular; certas formas de câncer e doenças de fotossensibilidade e envelhecimento. As fosfatases ácidas, enzimas que hidrolisam ésteres fosfatos em meio ácido, encontram-se amplamente distribuídas no organismo. Estas enzimas são importantes no catabolismo de diversas substâncias, acreditando-se que a alteração da atividade destas enzimas esteja relacionada com modificações induzidas por drogas e por várias doenças. As transaminases são enzimas hepáticas cujo nível aumenta quando há lesão das células hepáticas (hepatócitos) provocada por qualquer tipo de agressão, como vírus, consumo excessivo de álcool ou drogas. O acetaminofeno é uma droga frequentemente usada como analgésico e antipirético. O dano hepático causado pelo uso frequente ou exagerado do acetaminofeno é comum hoje em dia. A manutenção correta dos sistemas metabólicos hepáticos é de grande importância para a manutenção da saúde. Desta forma, o estudo do flavonóide quercetina como possível protetor dos efeitos hepatotóxicos provocados pelo acetaminofeno pode ser muito promissor. O objetivo do presente trabalho foi estudar os efeitos preventivos e terapêuticos, in vivo, do flavonóide quercetina sobre as atividades de fosfatases ácidas (total, tartarato-resistente e de baixa massa molecular relativa) e de transaminases glutâmica oxalacética (TGO) e glutâmica pirúvica (TGP) no fígado de camundongos, tratados ou não com acetaminofeno. Para o desenvolvimento deste trabalho foi realizado um tratamento agudo (24 horas), de camundongos machos da linhagem Swiss, com quercetina e acetaminofeno, utilizando-se óleo de milho ou nujol como veículo para o flavonóide. A dosagem da TGO e da TGP confirmou que o acetaminofeno pode realmente ser considerado hepatotóxico, quando administrado ou ingerido em grandes concentrações no organismo. A quercetina, dissolvida em óleo mineral, reverteu a hepatotoxicidade induzida pelo acetaminofeno, nos tratamento terapêutico e, em conjunto com acetaminofeno. A quercetina dissolvida em óleo de milho, no tratamento preventivo, pode não ser a única responsável pela reversão da hepatotoxicidade causada pela administração do acetaminofeno, uma vez que quando se substituiu o veículo utilizado, óleo de milho pelo óleo mineral, este efeito não foi mais observado. Comparando-se os resultados obtidos entre fosfatases e transaminases pode-se observar que a atividade da FATR, no tratamento com nujol, demosntra uma semelhança muito grande com os resultados observados nos gráficos das atividades das transaminases e provavelmente pode se considerada uma marcadora de dano hepático. O alfa-tocoferol, presente no óleo de milho, pode ter exercido um efeito antioxidante, e mascarado o efeito protetor da quercetina e a hepatotoxicidade do acetaminofeno. Este estudo foi importante para mostrar que a atividade dos flavonóides no organismo vivo pode ser influenciada por diversos fatores, como: a natureza do veículo utilizado na sua administração, ordem de administração e o tempo de permanecia no organismo / Abstract: Flavonoids are polyphenolic phytocompounds chemically characterized as flavonic heterosides. These compounds present several biological activities due to their antioxidant properties and hability to modulate the activities of enzymes or cellular receptors, making them responsible for the protector effect against diseases related to the cardiovascular system, certain forms of cancer, photosensibility diseases and aging. Acid phosphatases, enzymes that hydrolyze phosphate esters at acid medium, are largely distributed in the organisms. These enzymes are important in the catabolism of several compounds and could be related to the modifications induced by drugs and diseases. Transaminases are hepatic enzymes which levels increase in consequence of hepatic cells (hepatocytes) lesions provoked by agressions such as virus and excessive alcohol and drug consumption. Acetaminophen is a drug frequently used as analgesic and antipyretic. It is common the hepatic damage caused by the frequent or exaggerated use of acetaminophen. The correct maintenance of the hepatic metabolic systems is of great importance for the health. In this way, the study of the flavonoid quercetin as a possible protector of the hepatotoxic effects provoked by acetaminophen seems to be promising. The objectif of the present work was to study the in vivo effects of the flavonoid quercetin on the activities of acid phosphatases (total, tartrate-resistant and relative low molecular weight) and of transaminases glutamic oxalacetic (GOT) and glutamic pyruvic (GPT) in mice livers treated with acetaminophen. To develop this work, it was performed an acute treatment (24 hours) of Swiss male mice, with quercetin and acetaminophen, using corn oil or nujol as a vehicle for the flavonoid. The determination of GOT and GPT activities confirmed that acetaminophen can be considered hepatotoxic, when administered or ingested in great amount. In the therapeutic treatments, when applied with acetaminophen, quercetin, solubilized in mineral oil, reverted the acetaminophen-induced hepatotoxicity. In the preventive treatment, quercetin, solubilized in corn oil, might not be the only responsible for the reversibility, since this effect was no more observed when the vegetal oil was replaced by the mineral oil. The results with FATR, in the treatment with nujol, showed great similarity with the results obtained with transaminases, suggesting that this class of phosphatases could be considered as markers of hepatic damage. The alphatocopherol, present in the corn oil, could be exerting an antioxidant effect, masking the protector effect of quercetin and the acetaminophen hepatotoxicity. The importance of the present study was to stress that the in vivo flavonoids activities can be influenced by several factors, such as, the nature of the vehicle used in the administration, the order of administration and the retention time in the organism / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientadores: Hiroshi Aoyama, Claudio Martín Jonsson / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-16T01:07:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dantzger_Miriam_M.pdf: 2456182 bytes, checksum: ce7e4445d55ff9a2572a6ad4f3dea90d (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: Daphnia similis é um microcrustáceo da família dos cladóceros que se encontra amplamente distribuído em ambientes de água doce. Devido a sua natureza cosmopolita e sensibilidade, o seu uso em estudos de ecotoxicidade, como biomarcador, é recomendado em protocolos nacionais e internacionais. Agentes poluentes como os agrotóxicos, efluentes industriais e metais são diariamente despejados nos corpos d'água, influenciando sistemas locais e podendo causar efeitos toxicológicos aos organismos aquáticos. Tendo em vista a necessidade da normalização de biomarcadores enzimáticos, nossa proposta foi analisar a atividade enzimática de fosfatases de D. similis como uma alternativa.Especificamente, nossos objetivos foram: a) analisar o efeito de poluentes agrícolas e metais nas atividades in vitro de fosfatases ácidas e alcalinas de D. similis, com o intuito de selecionar a enzima mais sensível à ação dos poluentes; b) realizar estudos mais detalhados in vitro com a fosfatase mais sensível na presença de poluentes préselecionados; c) avaliar a atividade in vivo desta enzima perante concentrações subletais de poluentes provenientes de ensaios de toxicidade aguda. Dessa forma, foram analisados os efeitos in vitro de vários agentes poluentes (metais e pesticidas) nas atividades da fosfatase ácida total (FAT) e fosfatase alcalina. A FAT apresentou maior alteração em relação à fosfatase alcalina quando exposta aos poluentes in vitro, sendo que, dentre estes, os metais apresentaram efeitos mais significativos. Dos metais testados, Al3+, Se3+ e Mo6+, exibiram maior efeito inibitório, enquanto permetrina e Cd2+ apresentaram efeito ativador. A energia de ativação da reação catalisada pela FAT, usando-se p-nitrofenilfosfato (pNPP) como substrato, foi reduzida de 13 para 10 Kcal.mol-1 na presença de 0,5mM de Cd2+. Na reação catalisada pela FAT, os valores de IC50 (concentração do metal que promove 50% de inibição da atividade enzimática) obtidos para Al3+, Se3+ e Mo6+, foram, respectivamente: 1,23 mM, 0,54 mM e 0,9 µM. A inibição da FAT mostrou-se do tipo não competitiva para oAl3+ e do tipo competitiva para Se3+ e Mo6+, com os seguintes valores de constante de inibição (Ki): 0,9 mM para o Al3+; 0,62 mM para o Se3+ e 1,32 µM para o Mo6+. Nos ensaios in vivo de toxicidade aguda 48h com D. similis, a permetrina apresentou maior toxicidade comparada aos demais poluentes, sendo que a ordem de toxicidade, em mM, foi: Permetrina (0,000056) > Cd2+ (0,00139) > Se4+ (0,004) > Mo6+ (0,024) > Al3+(0,072). A ordem de inibição da atividade da FAT de D. similis exposta ao EC50 (48h) assemelhouse à obtida nos ensaios de toxicidade aguda (Cd2+ > permetrina > Al3+ > Mo6+), sugerindo uma relação entre alteração de atividade enzimática com a toxicidade dos poluentes ao modelo biológico em estudo. Nos ensaios de toxicidade aguda também foram estudados os efeitos da mistura binária dos metais Al3+, Cd2+, Mo6+ e Se4+. Observou-se que somente Al3+ + Cd2+ (S = 0,588) e Al3+ + Mo6+ (S = 0,951) apresentaram efeito sinérgico sobre D. similis, constatado pelo valor de S<1; nas mesmas condições, a mistura Al3+ + Se4+ não mostrou nenhuma alteração significativa. A ordem de inibição da atividade da FAT para a concentração de EC50 e seus respectivos percentuais foram: Al3+ + Cd2+ (90%) > Al3+ + Mo6+ (78%) > Se4+ + Cd2+ (72%) > Mo6+ + Cd2+ (32%). Contraditoriamente, a mistura Se4+ + Mo6+ promoveu uma ativação de 50% na atividade enzimática nos mesmos níveis de toxicidade analisados para as demais misturas. Esses resultados evidenciam a necessidade de complementar os testes de toxicidade aguda com mistura de poluentes a partir da utilização de biomarcadores enzimáticos, tais como a FAT. Concluiu-se que a FAT, através da alteração de sua atividade in vivo, pode ser utilizada como biomarcadora de toxicidade em nível letal (EC50), para os poluentes permetrina e Al3+ e, em níveis subletais, para Cd2+ e Se4+, podendo-se predizer o impacto ambiental / Abstract: Daphnia similis, a microcrustacean of the cladoceran's family, is widely found in freshwater environment. Because of its cosmopolitan nature and sensitivity, this organism is recommended by national and international protocols as a biomarker in ecotoxicity analyses. Agrochemicals, industrial effluents and metals are daily released in the rivers, impairing local living systems and causing toxicological effects on aquatic organisms. In order to contribute with enzymatic biomarkers normalization, our purpose was to evaluate D. similis phosphatases activities in the presence of several pollutants. Specifically, our aim was: a) to analyze in vitro effects of metals and agrochemicals on D. similis alkaline and acid phosphatases activities, in order to select the more pollutants-sensitive enzyme; b) to perform more detailed in vitro studies with those more sensitive enzyme and selected pollutants; c) to analyze the in vivo activity of this enzyme at sub-lethal levels of pollutants, derived from acute toxicity assays. In this way, in vitro effects of several pollutants (metals and pesticides) were evaluated on total acid phosphatase (TAP) and alkaline phosphatase activities. Our results showed that TAP presented higher alterations in relation to alkaline phosphatase when exposed to in vitro pollutants, from which the metals showed more remarkable effects. The metals Al3+, Se3+ and Mo6+ exhibited higher inhibitory effects, whereas permethrin and Cd2+ presented activator effects. The activation energy of the reaction catalyzed by TAP, by using p-nitrophenylphosphate as substrate, was decreased from 13 to 10 kcal.mol-1, in the presence of 0,5mM Cd2+. IC50 (concentration of metal that promotes 50% of enzyme inhibition) values for Al3+, Se3+ and Mo6+ were determined to be: 1.23 mM, 0.54 mM e 0.9 µM, respectively, in the TAP catalyzed reaction. The TAP inhibition was of non-competitive type for Al3+, and competitive for Se3+ and Mo6+, with inhibition constant (Ki) values ranging 0.9 mM, 0.62 mM and 1.32 µM, respectively. In the 48 hours acute toxicity assays with D. similis, permethrin presented higher effect in relation to the other pollutants, with the following toxicity order (mM): Permethrin (0.000056) > Cd2+ (0.00139) > Se4+ (0.004) > Mo6+ (0.024) > Al3+ (0.072). The inhibition order of D. similis TAP activity exposed to 48 hours EC50 was similar to the acute toxicity values (Cd2+ > permethrin > Al3+ > Mo6+), suggesting a relationship between enzymatic activity alteration and the pollutants toxicity. Further, we decided to evaluate the effects of binary metals mixtures of Al3+, Cd2+, Mo6+ and Se4+ on the acute toxicity assays, it was observed that only Al3+ + Cd2+ (S = 0.588) and Al3+ + Mo6+ (S = 0.951) exhibited synergic effects on D. similis, evidenced by the S<1 values; at the same conditions the mixture Al3+ + Se4+ did not show significant alterations. The TAP activity inhibition order for EC50 concentration and its respective percentuals were: Al3+ + Cd2+ (90%) > Al3+ + Mo6+ (78%) > Se4+ + Cd2+ (72%) > Mo6+ + Cd2+ (32%). On the other hand, the mixture Se4+ + Mo6+ presented 50% enzyme activation at the same toxicity levels analyzed for the other mixtures. These results emphasize the need to complement acute toxicity tests with pollutants mixtures, using enzymatic biomarkers, such as TAP. In conclusion, TAP, through the alteration of its in vivo activity, could be used as a lethal level toxicity biomarker for the permethrin and Al3+, and at sub-lethal levels for Cd2+ and Se4+, predicting possible environmental impact / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Fernanda Ramos Gadelha / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-11T13:57:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 MoralesNeto_Raphael_M.pdf: 499454 bytes, checksum: de4a1750fcb9184b1cfcef4f5e0cc3ee (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: Trypanosoma cruzi, o agente etiológico da doença de Chagas, exibe um notável grau de heterogeneidade estrutural e funcional, o qual pode modular sua patogenicidade, sobrevivência e adaptação. Em eucariotos superiores, mecanismos de fosforilação e desfosforilação são fundamentais para a regulação de uma ampla variedade de eventos celulares. Por essa razão, um melhor entendimento da atividade de fosfatases em T. cruzi pode ser útil para a identificação de potenciais alvos para o desenvolvimento de terapias mais específicas. Neste trabalho, analisou-se o perfil das fosfatases, em homogenatos de duas cepas de T. cruzi, Tulahuen 2 e Y. A atividade de fosfatases foi determinada espectrofotometricamente utilizando-se o p-nitrofenilfosfato (p-NPP) como substrato. Na cepa Tulahuen 2, que apresenta maior resistência ao estresse oxidativo gerado pelo peróxido de hidrogênio (H2O2), foi observada uma atividade de fosfatase sete vezes maior quando comparada a cepa Y. Em relação ao pH ótimo a Tulahuen 2 mostrou uma expressiva atividade em pH 4,0, a qual foi aumentada na presença de Mg2+ exógeno em uma ampla faixa de pH (5,0 - 8,0). A cepa Y, embora em menores níveis, exibiu o mesmo perfil sem a adição de Mg2+, apresentando na presença desse íon um pico de atividade em pH 7,0. A adição de Ca2+ ao meio reacional afetou significativamente a cepa Tulahuen 2 em pH 8,0 e inibiu a atividade das fosfatases na cepa Y nos pHs 7,0 e 8,0. Inibidores clássicos de fosfatase ácida, bem como inibidores de proteína tirosina fosfatase e fosfatase alcalina, mostraram padrões distintos de inibição em ambas as cepas, reforçando a heterogeneidade entre os isolados de T. cruzi / Abstract: Trypanosoma cruzi, the etiological agent of Chagas'disease, displays a remarkably high degree of both, structural and functional intraspecific heterogeneity, which could modulate its pathogenicity, survival and adaptability. In higher eukaryotes, phosphorylation and dephosphorylation are fundamental pathways that regulate a wide variety of cellular events. Therefore, a better understanding of phosphatases activities in T. cruzi could be useful to identify potential targets for the development of a more specific therapy. In this work, we analysed the phosphatase activity profile in T. cruzi homogenates of two strains (Tulahuen 2 and Y). The phosphatase activities was determined spectrophometricaly using p-nitrophenylphosphate (p-NPP) as substrate. In the strain more resistant to the oxidative stress generated by H2O2, Tulahuen 2, it was observed a seven-fold higher phosphatase activity when compared to the other strain. In relation to optimum pH and substrate specificity, Tulahuen 2 had an expressive acid phosphatase activity (optimum pH at 4.0), which was even higher in the presence of Mg2+ and had a broad range (pH 5-8). Y strain, although at lower levels, showed the same activity profile in the presence or absence of Mg2+. The presence of calcium showed significant effect on the Tulahuen 2 strain only at pH 8.0 and had an inhibitory effect on phosphatase activity in the Y strain at pHs 7-8. Classical inhibitors of acid phosphatases, as well as inhibitors of phosphotyrosine phosphatase, showed distinct patterns of effects in phosphatases from both strains / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

RESUMO As fosfatases alcalinas sao enzimas que participam da atividade catalitica na hidrolise de ésteres fosfóricos. Nesta Dissertação, investigou-se a sua adsorção em monocamadas de Langmuir e também em filmes do tipo Langmuir-Blodgett (LB) de fosfolipídios em diferentes temperaturas. Esses sistemas são considerados como modelos para membranas biológicas. O efeito de um dissacarídeo (trealose), bem como as impurezas contidas na amostra do açúcar, foi testado na subfase que suporta a monocamada,. Constatou-se que a trealose nao purificada altera a isoterma superficial de monocamadas do sal de sódio do acido dimiristoilglicerofosfatidico, DMPA, e atua como um bom agente de ligação entre camadas sucessivas do fosfolipídio para a obtenção de filmes LB. Já para trealose purificada nao se observaram esses efeitos. A caracterização das impurezas foi realizada por espectroscopia na região do infravermelho e por absorção atômica, detectando-se a presença de moléculas anfifílicas e de íons metálicos (Na+, K+, Ca2+, Mg2+), respectivamente. Dois tipos de fosfatases alcalinas foram usadas: uma purificada de placa óssea de ratos por extração com tensoativo nâo-iônico, chamada de DSAP e outra purificada de conídia de Neurospora crassa, denominada CNCAP. As interações com o fosfolipídio foram estudas por meio das mudanças nas curvas -A e a adsorção em filmes LB de DMPA/Zn2+ e DMPA/trealose, por meio da técnica de microbalança a cristal de quartzo (QCM). A presença das enzimas nos filmes foi também comprovada pela detecção de suas atividades catalíticas na hidrolise do PNPP (p-nitrofenilfosfato). Para a DSAP, a melhor atividade foi obtida quando a imobilização da proteína ocorreu a baixa temperatura (10º C). / ABSTRACT Alkaline phosphatases (AP) are unspecific enzymes that hydrolyze phosphate esthers. In this Dissertation we have studied the adsorption of two forms of AP in phospholipid Langmuir monolayers and Langmuir-Blodgett films, considered as biomembrane models, at different temperatures. Further, the effect of the presence of a disaccharide, trehalose, as well as some impurities present in its commercial form, in the subphase of the monolayers was tested. We concluded that the use of trehalose without further purification alters the surface pressure-area (Pi-A) curves of the monolayers. In addition, it acts as a good linking agent between successive layers in the Langmuir-Blodgett films of the sodium salt of 1,2-dimirystoyl-sn-glicero-3-phosphate acid, DMPA. In the presence of purified trehalose instead, these effects were not observed. No difference was noticed in the Pi-A curves of DMPA for trehalose concentrations between 10-3 mmol L-1 to 0.1 mmol L-1. The characterization of the impurities by atomic absorption and infrared spectroscopy reveal the presence of amphiphilic compounds as well as electrolytes such as: sodium, magnesium, calcium and potassium Two forms of AP were used: one purified from rat osseous plates using detergent solubilization, named DSAP, and the other from Neurospora crassa conidia, CNCAP. Enzyme interaction with phospholipids was followed by changes in Pi-A curves, and their adsorption on DMPA/Zn2+ or DMPA/trehalose LB films using the quartz crystal microbalance technique, QCM. Their presence within the films was also monitored by catalytic activity assays, using PNPP (p-nitrophenylphosphate) as hydrolysis substrate. For DSAP, the highest enzymatic activity was observed when the immobilization was carried out at low temperature (10o C).

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2015. / Made available in DSpace on 2016-05-24T17:52:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 334243.pdf: 5585985 bytes, checksum: 4f3d8bd503e7a8f2e8284a04905635ec (MD5) Previous issue date: 2015 / Proteínas tirosina fosfatases (PTP) têm um importante papel na transdução de sinal e no controle de diversas funções celulares. Bactérias patogênicas como as do gênero Yersinia e do complexo Mycobacterium tuberculosis (Mtb), utilizam suas PTP para subverter as células de defesa do hospedeiro. As bactérias patogênicas do gênero Yersinia possuem em comum a produção de uma PTP chamada YopH que modula a resposta inflamatória do hospedeiro à bactéria através de processos que envolvem a inibição da fagocitose, quebra de adesões focais e subversão da função dos linfócitos B e T prevenindo a resposta imune adaptativa. As doenças humanas causadas pelas espécies patogênicas de Yersinia variam desde síndromes gastrointestinais à peste bubônica, sendo esta última uma doença grave que ainda não foi erradicada e é associada a milhares de mortes no passado. O Mtb causa a tuberculose, doença que afeta principalmente o trato respiratório. Segundo dados da Organização Mundial da Saúde, a tuberculose foi responsável por 1,5 milhões de mortes somente no ano de 2013. Durantes a invasão das células de defesa, o Mtb produz duas PTP, a PtpA e a PtpB. Estas fosfatases, assim como a YopH, tem por função burlar o mecanismo de defesa do hospedeiro. A PtpA é responsável por modular a apoptose celular e impedir a acidificação do fagossomo e a fusão deste com o lisossomo. Já a PtpB, impede a produção de IL-6 e previne a morte do macrófago pela ativação da via de sinalização de Akt e bloqueio da atividade da caspase-3. A busca de inibidores da YopH de Yersinia spp. e das fosfatases do Mtb é de grande interesse para a produção de possíveis fármacos que poderiam ser utilizados no tratamento das doenças provocadas por estas bactérias. No presente trabalho, uma biblioteca de 398 compostos foi triada com o objetivo de identificar novos inibidores da YopH. Dentre os inibidores encontrados, 22 apresentaram valores de IC50 inferiores a 10 µM, sendo que 3 estão na faixa de nanomolar (o que os coloca entre os melhores inibidores descritos para esta fosfatase até o momento). Foram encontrados tanto inibidores competitivos (12 compostos) como não competitivos (6 compostos) da YopH e cinco compostos (delfinidina, AAA e os três complexos de vanádio) apresentaram valores de Ki na faixa de nanomolar. Avaliou-se também a citotoxicidade em células THP-1 e HepG2 além da atividade antitubercular de seis inibidores das fosfatases de Mtb (PtpA e PtpB) previamente relatados por nosso laboratório em 2012. Identificou-se dois compostos que não são citotóxicos (compostos 43 e 95) e dois compostos que apresentaram atividade em ensaios de infecção intracelular (compostos 95 e 96). De acordo com todos os resultados obtidos no presente trabalho, identificamos novas chalconas como eficientes inibidores da YopH além de 3 complexos de vanádio com uma marcante inibição em escala nanomolar. Quanto aos inibidores da PtpA e PtpB, o composto 95 mostrou-se não citotóxico e com atividade nos ensaios de infecção intracelular. Este composto poderia ser utilizado como molde na busca de outros compostos mais ativos ajudando assim no desenvolvimento de novas terapias contra o Mycobacterium tuberculosis.<br> / Abstract : Protein tyrosine phosphatases (PTP) have an important role in signal transduction and in the control of many cell functions. Pathogenic bacteria from Yersinia genus and Mycobacterium tuberculosis (Mtb) complex, utilize their PTP to subvert host?s defense cells. Pathogenic bacteria from Yersinia genus have in common the production of a PTP named YopH, this enzyme modules the host inflammatory response against the bacteria through processes that evolves the phagocytosis inhibition, focal adhesion disruption and impairing the function of B and T lymphocytes preventing the adaptive immune response. Diseases caused by pathogenic species of Yersinia range from gastrointestinal syndromes to bubonic plague. Bubonic plague is a not eradicated disease that is associated with thousands of deaths in the past. Mtb causes tuberculosis, a disease that affects mainly the respiratory tract. According to World Health Organization data, only in 2013 tuberculosis caused 1.5 million deaths. During the defense cell invasion, Mtb produces two PTP, PtpA and PtpB. These phosphatases act like YopH, they help the bacteria to evade the host defense mechanism. PtpA modulates the cellular aptotosis and it also impairs the phagosome acidification and its fusion with lysosome. PtpB prevents the production of IL-6 and macrophage death by activation Akt signaling pathway and by blocking caspase 3 activity. The search for inhibitors of YopH from Yersinia and Mtb phosphatases is of great interest for the production of drugs that could be used in the treatment of the diseases caused by these bacteria. In this work, an in-house library of 398 compounds was screened with the objective to search new YopH inhibitors. Out of the inhibitors found, 22 presented IC50 values below 10 µM, three of those in nanomolar range (this characteristic put these three compounds between the best described inhibitors for this phosphatase). We found competitive inhibitors (12 compounds) and non-competitive inhibitors (6 compounds) for YopH and five compounds (Delphinidin, AAA and three vanadium complexes) presented Ki values in nanomolar range. Cytotoxicity assays were made with two human cell lines THP-1 and HepG2 we also assayed the antitubercular activity of six inhibitors of Mtb PTP. The inhibitory activity against PtpA and PtpB of these six compounds was previously described in 2012 by our lab. The cytotoxicity and antitubercular assays resulted in two non-cytotoxic compounds (compound 43 and 95) and two compounds that are activity in intracell infection assays (compounds 95 and 96). In this present work we show new chalcones as eficient inhibitors of YopH, we also identified 3 vanadium complex with remarkable inhibition in nanomolar scale. According to the results obtained to PtpA and PtpB inhibitors, we identified the compound 95 which is no cytotoxic and has activity in intracell assays. This compoud could be used for the design of new compound with improved activity helping in the development of new therapies against Mycobacterium tuberculosis.

Este trabalho teve por objetivo dissecar o papel potencial de fosforilação/desfosforilação como efeitos da ativação de PfSR25, um candidato a receptor serpentina de P. falciparum. Como a sinalização é um evento celular complexo, não excluímos a possibilidade de que outros mecanismos moleculares ocorram além dos aqui descritos. Nossas conclusões são que potássio modula PfSR25, ativando quinases/fosfatases, levando à ativação de moléculas efetoras. Encontramos MSP1, proteína já caracterizada e Pf4-4-13 e o fator básico de transcrição 3B (PfBTF3B), que ainda não foram caracterizados em P. falciparum, como efetores. Estes dados sugerem que pelo menos em parte, o mecanismo pelo qual PfSR25 exerce seu papel no desenvolvimento de P. falciparum seja através da ativação de quinases/fosfatases. Isto não é surpreendente, pois a sinalização de PfSR25 ocorre através de K+/cálcio e o segundo mensageiro é um modulador destas classes de proteínas. No entanto, deve ser investigado se cálcio tem algum efeito direto sobre o processamento/ativação dos efetores aqui identificados. / This work aimed at dissecting the potential role of phosphorylation/dephosphorylation as downstream effect of PfSR25 activation. PfSR25 is a serpentine receptor candidate from P. falciparum. As signaling is a quite complex cellular event, we do not exclude the possibility that other molecular mechanisms, take place additionally to those here described. Our conclusions are that potassium modulates PfSR25 by activation of kinases/phosphatases, leading to activation of effector molecules. We found MSP1 already characterized protein and Pf4.4.13 and the basic transcription factor 3B (PfBTF3B), which have not yet been characterized in P. falciparum as effectors. These data suggest that, at least in part, the mechanism by which PfSR25 exerts its role in the P. falciparum development is through the activation of kinase/phosphatase. This is not surprising, since PfSR25 signaling occurs through K+/Calcium and the second messenger is a modulator of these classes of proteins. However, remains to be investigated rather calcium has a direct effect on processing/activation the effectors here identified.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Aluminum (Al) toxicity and phosphorus (P) deficiency often coexist in acid soils that severely limit crop growth and production, including potato (Solanum tuberosum). Understanding the physiological mechanisms relating to plant Al and P interactions should facilitate the development of more Al-tolerant and/or P-efficient crops. The objective of this study was to investigate if P- efficiency were related to Al-tolerance and if P- efficiency was related to acid phosphatase activity. Eight potato genotypes (SMIC148-A, Dakota Rose, S. microdontum, SMINIA793101-3, SMIB106-7, SMIF212-3, SMIG145-1 and SMIJ319-7) showing different responses and/or efficiency to P were grown in a nutrient solution (pH 4.0) with 0 and 200 mg Al L−1 and P-starvation. Based on shoot length, nutrient solution consumption, and total fresh and dry weight, the potato genotypes were classified as Al-tolerant (SMIF212-3 (more tolerant), SMIC148-A and S. microdontum), Al-intermediate (SMINIA793101-3 and SMIB106-7) and Al-sensitive (Dakota Rose, SMIJ319-7 (more sensitive) and SMIG145-1). The Al-tolerance in potato genotypes appears to be related to the increase in P concentration in the tissues. The Al tolerance in genotypes (SMIC148-A and S. microdontum) might be associated with higher tissue Al immobilization due to the higher tissue P content, mainly in the leaves. The Al sensitivity in the potato genotypes under P-starvation condition was associated with decreasing P utilization and translocation efficiencies. Furthermore, the increase of Al accumulation affected the rate of uptake and distribution of nutrients in the different plant parts (roots, stem, leaf, stolon and tuber) of potato genotypes. The Al-tolerance in the SMIC148-A, S. microdontum and SMIF212-3 genotypes may be connected with highest levels of nutrients in the roots and leaves. Among the eight previously analyzed genotypes, four genotypes with contrasting Al-tolerance and P-efficiency/or responsive (Al-tolerant: SMIC148-A [NER] and SMIF212-3 [ENR]; Al-sensitive: Dakota Rose [ER] and SMIG145-1 [NENR]) were utilized to investigate the effects of Al-P interactions. Potato genotypes were grown in a nutrient solution (pH 4.0) with 0, 25 and 125 μM P and 0 or 200 mg Al L−1. In this second experiment the P supply did not influence on Al tolerance response. In both experiments, it was not observed a straight relationship between tissues APase activities and P utilization efficiency (PUE). With the objective of checking whether Al oxidative stress differs in potato genotypes, Dakota Rose (Al-sensitive) and SMIC148-A (Al-tolerant), which present distinct degrees of Al- avoidance, were cultivated in a split root system for seven days with five treatments of varying concentrations and locations of Al. In general, the Al exposure caused a reduction in growth parameters in both Al-tolerant and Al-sensitive genotypes. Furthermore, it was observed an increase in Al concentration in both Al-treated and Al-untreated root half. In both genotypes was observed decrease in the P concentration in the Al-treated root half, however, in the Al-untreated root half was observed an increased in the P concentration, mainly in the Al-tolerant genotype. In both genotypes was observed an increase in the P concentration in stem in all Al treatments, however, only in the Al-tolerant genotype was observed an increased in the leaf P concentration. In addition, in the Al-tolerant genotype the biochemistry parameters were lower affected than Al-sensitive genotype. In Al-tolerant genotype was observed an increase in the total chlorophyll and carotenoids concentration whereas in the Al-sensitive genotype was observed a decrease with Al exposure. In Al-sensitive genotype was observed an increased in the leaf and root lipid peroxidation in plants exposed at higher Al treatments. On the other hand, in the Al-tolerant genotype was not observed increase in the plants exposed at higher Al treatments. However, this difference between potato genotypes can be not related to antioxidant enzymes activities. In both genotypes, in general, the Al exposure caused a decreased in the root APX activity, an increased in the GPX activity and a slight increased in CAT activity. On the other hand, the Al-tolerance in the SMIC148-A can be associated to lower Al translocation for leaf mainly in the plants only one root half was exposed at Al and the higher ability this genotype in the remobilization P from Al-treated to Al-untreated root half. / A toxicidade do alumínio (Al) e a deficiência de fósforo (P) frequentemente coexistem em solos ácidos, sendo fatores limitantes para o crescimento e produção das plantas, incluindo a batata (Solanum tuberosum). A compreensão dos mecanismos fisiológicos relacionados à interação entre Al e P pode facilitar a obtenção de genótipos mais tolerantes ao Al e/ou eficientes no uso de P. O objetivo deste estudo foi verificar se genótipos eficientes no uso de P são tolerantes ao Al e se essa eficiência está vinculada à atividade de fosfatases ácidas. Oito genótipos de batata (SMIC148-A, Dakota Rose, Solanum microdontum, SMINIA793101-3, SMIB106-7, SMIF212-3, SMIJ319-7 e SMIG145-1), demostrando diferentes respostas ao P e/ou eficiência no uso de P foram cultivados em solução nutritiva (pH 4,0) com 0 e 200 mg de Al L−1 na ausência de P. Através da avaliação de diferentes parâmetros de crescimento, como comprimento da parte aérea, consumo de solução nutritiva, e massa fresca e seca total, os genótipos de batata foram classificados como tolerantes (SMIF212-3 (mais tolerante), SMIC148-A e S. microdontum), intermédiarios (SMINIA793101-3 e SMIB106-7) e sensíveis (Dakota Rose , SMIJ319-7 (mais sensível) e SMIG145-1) ao Al. A tolerância ao Al nos genótipos de batata parece estar relacionada com o aumento da concentração de P nos tecidos. Nos genótipos tolerantes ao Al (SMIC148-A e S. microdontum) foi verificado um aumento na concentração de P com o aumento da concentração de Al, principalmente nas folhas. A sensibilidade ao Al em genótipos de batata sob deficiência de P pode estar associada ao decréscimo na eficiência de utilização e translocação do P. Além disso, o aumento da concentração de Al afetou a taxa de absorção e distribuição dos nutrientes nas diferentes partes das plantas (raízes, caule, folhas, estolões e tubérculos). A tolerância ao Al nos genótipos SMIC148-A, S. microdontum e SMIF212-3 pode estar relacionada aos maiores níveis de nutrientes nas raízes e folhas. Entre os oito genótipos analisados anteriormente, quatro genótipos contrastantes quanto à tolerância ao Al e eficiência ao P (tolerante ao Al: SMIC148-A [NER] e SMIF212-3 [ENR]; sensível ao Al: Dakota Rose [ER] e SMIJ319-7 [NENR]) foram selecionados e utilizados para verificar os efeitos da interação entre Al e P. Os genótipos de batata foram cultivados em solução nutritiva (pH 4,0) com 0, 25 e 125 μM P e 0 ou 200 mg de Al L−1. Em geral, o aumento da concentração de P não influenciou na tolerância ao Al. Em ambos os experimentos, a atividade da fosfatase ácida não foi correlacionada à eficiência no uso do P. Com o objetivo de checar se o estresse oxidativo provocado pelo Al difere entre os genótipos Dakota Rose (sensível ao Al) e SMIC148-A (tolerante ao Al), os quais apresentam distinto grau de escape ao Al, foram cultivados em sistema de raízes divididas por sete dias, com cinco tratamentos de variação de concentração e localização de Al. De modo geral, a exposição ao Al causou uma redução nos parâmetros de crescimento tanto no genótipo tolerante quanto no sensível. Além disso, foi observado aumento na concentração de Al tanto na metade da raiz exposta quanto na metade da raiz não exposta ao Al. Em ambos os genótipos foi observado decréscimo na concentração de P na metade da raiz tratada com Al, contudo na metade da raiz não exposta ao Al foi observado aumento na concentração de P, principalmente no genótipo tolerante. Tanto no genótipo sensível quanto no genótipo tolerante ocorreu aumento da concentração de P no caule em plantas expostas ao Al, contudo, somente no genótipo tolerante observou-se aumento na concentração de P na folha. Além disso, no genótipo tolerante, os parâmetros bioquímicos avaliados foram menos afetados pelo Al do que no genótipo sensível. No genótipo tolerante foi observado aumento da concentração de clorofilas e carotenóides, enquanto que, no genótipo sensível foi observado decréscimo com a exposição ao Al. No genótipo sensível foi observado aumento da peroxidação lipídica nas raízes e folhas de plantas expostas às maiores doses de Al. Entretanto, no genótipo tolerante a mesma resposta não foi observada. Essas diferenças entre os genótipos não poderam ser associadas à atividade das enzimas antioxidantes. Tanto no genótipo tolerante quanto no sensível a exposição ao Al aumentou a atividade da POD e, de modo geral, promoveu um ligeiro aumento na atividade da CAT e diminuiu a atividade da APX na raiz. Por outro lado, a tolerância ao Al no genótipo SMIC148-A pode estar associada à menor translocação de Al para as folhas principalmente em plantas onde somente metade da raiz foi exposta ao Al e à maior habilidade de remobilização do P de raízes expostas ao Al para as raízes não expostas.