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Orientador: João Cláudio Thoméo / Banca: Márcia Luiza Rizzatto / Banca: Roberto da Silva / Resumo: Este trabalho teve como objetivo produzir enzimas lipolíticas por fermentação em estado sólido em um biorreator de leito fixo, empregando para isso o fungo mesofílico Metarhizium anisopliae ICB 421 e o fungo termofílico Thermomucor indicae-seudaticae N31, utilizando como substrato bagaço de cana de açúcar (BC), farelo de trigo (FT) e grãos de soja moída (S). As enzimas produzidas podem ser utilizadas para diversos fins industriais, entre eles a produção de biodiesel. Os testes para produção de enzimas foram realizados inicialmente em sacos de polipropileno e apresentaram para M. anisopliae atividade lipolítica de 13,71 U/gss a 28 °C, em meio composto por 50% BC, 25% FT e 25% S, com umidade de 70% e cultivado por 5 dias; para T. indicae-seudaticae atividade lipolítica de 2,81 U/gss a 45 °C, em meio composto por 50% BC, 25% FT e 25% S, com umidade de 70% e cultivado por 2 dias. Nestes ensaios, as variáveis testadas, composição do meio, umidade inicial, substituição do óleo de soja por farelo de soja e tempo de fermentação, afetaram a atividade das enzimas obtidas. Na sequência, como parte do aumento de escala, os ensaios foram conduzidos em dois biorreator de leito fixo, tendo-se como variáveis a vazão de ar e a umidade inicial do substrato, sendo que ambas afetaram a atividade enzimática, que atingiu 5,61 U/gss para M. anisopliae a 28 °C, em meio composto por 50% BC, 25% FT e 25% S, com umidade de 70%, vazão ar 180 L/h, cultivado por 5 dias, e 2,48 U/gss para T. indicae-seudaticae a 45°C, em meio composto por 50% BC, 25% FT e 25% S, com umidade de 70%, vazão ar 80 L/h, cultivado por 2 dias. Das enzimas produzidas, a de M. anisopliae apresentou valores muito baixos de transesterificação, descartando-a para a aplicação na obtenção de biodiesel, mas a de T. indicae-seudaticae mostrou-se promissora para esta aplicação / Abstract: This study aimed to produce lipolytic enzymes through solid state fermentation (SSF) in a fixed-bed bioreactor, using Metarhirium anisopliae ICB 421 mesophilic fungi and Thermomucor indicae-seudaticae N31 thermophilic fungi, and sugar cane bagasse, wheat, and soybeans as substrate. The enzyme produced can be used for various industrial purposes, including biodiesel production. Tests for enzyme production initially performed in polypropylene and showed to M. anisopliae lipolytic activity of 13.71 U / gds at 28 ° C in medium composed of 50% BC, and 25% FT 25% S, with 70% humidity and cultivated for 5 days for T. indicae seudaticae lipolytic activity of 2.81 U / gds at 45 ° C in medium composed of 50% BC, and 25% FT 25% S, with 70% humidity and cultivated for 2 days. In these assays, the variables tested, medium composition, initial moisture, replacement of soybean oil by soybean meal and fermentation time, affected the activity of the enzymes obtained. Furthermore, as part of scaling, tests were conducted in a fixed bed bioreactor, testing again the process conditions for optimizing the production of lipase; the variables used in this step were air flow, and initial substrate moisture, both of which affect the enzymatic activity, that reached 5.61 U/gds to M. anisopliae at 28°C in medium composed of 50% BC, and 25% FT 25% S, with 70% humidity, air flow 180 L/h, for 5 days, and 2.48 U/gds for T. indicae-seudaticae at 45°C in medium composed of 50% BC, and 25% FT 25% S, with 70% humidity, air flow 80 L/h, for 2 days. . Enzymes produced, M. anisopliae showed very low transesterification, dismissing the application for obtaining biodiesel, but for T. indicae-seudaticae has shown promise for this application / Mestre

Orientador: Roberto da Silva / Banca: Hamilton Cabral / Banca: Gustavo O. Bonilla Rodriguez / Resumo: Proteases constituem uma das mais importantes enzimas industriais e uma de suas principais aplicações é na indústria láctica para produção de queijos. Devido à escassez do coalho tradicional de origem animal, proteases coagulantes microbianas estão sendo pesquisadas como substitutos. O coalho apresenta duas ações hidrolíticas sobre a caseína que caracterizam sua adequação como um bom coagulante, que são a atividade coagulante e a proteolítica. Quanto maior a razão entre coagulante / proteolítica (AC/AP), melhor o coagulante. O presente trabalho objetivou estudar a produção e caracterização da protease coagulante produzida pelo fungo termofilico Thermomucor indicae-seudaticae N31 via fermentação submersa. As condições de produção estudadas foram: natureza e concentração da fonte de carbono e da solução salina, períodos de incubação e velocidade de agitação. Após a produção foi feita a caracterização físico- química que consistiu em determinar as condições de atuações ótimas da enzima. A partir dos resultados, observou-se que a melhor composição no meio fermentativo foi: 4 % de farelo de trigo, 0,3 % de solução salina, 72 horas de incubação a 45 °C e 150 rpm de agitação. Nestas condições os valores da atividade coagulante e da razão AC/AP foram 60,5 U/mL e 510, respectivamente. A enzima coagulante apresentou as características: pH e temperatura ótimos foram 5,5 e 65 °C, respectivamente; pH e temperatura de estabilidade foram 3,5 - 5,0 (retendo cerca de 80 % da atividade depois de 24 horas à temperatura ambiente) e até 60 °C (após uma hora na ausência de substrato). O conjunto dos resultados sugere a conclusão que a protease coagulante é promissora do ponto de vista tecnológico como substituto do coalho animal, principalmente, devido à sua alta especificidade representada pelo elevado valor da razão / Abstract: Proteases are one of the most important industrial enzymes and one of its main applications is in the dairy industry for the production of cheese. Due to the scarcity of renin bovine, microbial coagulants proteases are being researched as a substitute. The rennet has two hydrolytic action on casein featuring its suitability as a good coagulant, which are the milk-clotting and proteolytic activity. The higher the ratio milk-clotting / proteolytic (MCA/PA), the better the coagulant. The present study investigated the production and characterization of coagulant protease produced by thermophilic fungus Thermomucor indicae-seudaticae N31 on submerged fermentation. The production conditions were: nature and concentration of the carbon source and saline, incubation and agitation speed. After production was performed physicochemical characterization that determined the conditions optimal of the enzyme. From the results, it was observed that the best composition of the fermentative medium was: 4 % wheat bran, 0,3 % saline, 72 hours of incubation at 45 °C and 150 rpm agitation. In these conditions the values of milk-clotting activity and the ratio MCA/PA were 60,5 U/mL and 510, respectively. The clotting enzyme had the characteristics: optimum of pH and temperature were 5,5 and 65 °C, respectively, pH and temperature of stability were 3,5 - 5,0 (retaining approximately 80 % of activity 24 hours at temperature environment) and even 60 °C (after one hour in the absence of substrate). The group of results showed that coagulant protease is promising technological point of view as a substitute for animal rennet, mainly due to their high specificity shown by the high value of the ratio / Mestre

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:28Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-03-05Bitstream added on 2014-06-13T18:50:37Z : No. of bitstreams: 1 silva_bl_me_sjrp_parcial.pdf: 68972 bytes, checksum: 03431955c8d6cea4c3ed5570639d9b21 (MD5) Bitstreams deleted on 2015-03-16T11:30:17Z: silva_bl_me_sjrp_parcial.pdf,Bitstream added on 2015-03-16T11:31:01Z : No. of bitstreams: 1 000713868.pdf: 583338 bytes, checksum: 2ab049d7d1dee609368d97ffcc42cfc4 (MD5) / Proteases constituem uma das mais importantes enzimas industriais e uma de suas principais aplicações é na indústria láctica para produção de queijos. Devido à escassez do coalho tradicional de origem animal, proteases coagulantes microbianas estão sendo pesquisadas como substitutos. O coalho apresenta duas ações hidrolíticas sobre a caseína que caracterizam sua adequação como um bom coagulante, que são a atividade coagulante e a proteolítica. Quanto maior a razão entre coagulante / proteolítica (AC/AP), melhor o coagulante. O presente trabalho objetivou estudar a produção e caracterização da protease coagulante produzida pelo fungo termofilico Thermomucor indicae-seudaticae N31 via fermentação submersa. As condições de produção estudadas foram: natureza e concentração da fonte de carbono e da solução salina, períodos de incubação e velocidade de agitação. Após a produção foi feita a caracterização físico- química que consistiu em determinar as condições de atuações ótimas da enzima. A partir dos resultados, observou-se que a melhor composição no meio fermentativo foi: 4 % de farelo de trigo, 0,3 % de solução salina, 72 horas de incubação a 45 °C e 150 rpm de agitação. Nestas condições os valores da atividade coagulante e da razão AC/AP foram 60,5 U/mL e 510, respectivamente. A enzima coagulante apresentou as características: pH e temperatura ótimos foram 5,5 e 65 °C, respectivamente; pH e temperatura de estabilidade foram 3,5 – 5,0 (retendo cerca de 80 % da atividade depois de 24 horas à temperatura ambiente) e até 60 °C (após uma hora na ausência de substrato). O conjunto dos resultados sugere a conclusão que a protease coagulante é promissora do ponto de vista tecnológico como substituto do coalho animal, principalmente, devido à sua alta especificidade representada pelo elevado valor da razão / Proteases are one of the most important industrial enzymes and one of its main applications is in the dairy industry for the production of cheese. Due to the scarcity of renin bovine, microbial coagulants proteases are being researched as a substitute. The rennet has two hydrolytic action on casein featuring its suitability as a good coagulant, which are the milk-clotting and proteolytic activity. The higher the ratio milk-clotting / proteolytic (MCA/PA), the better the coagulant. The present study investigated the production and characterization of coagulant protease produced by thermophilic fungus Thermomucor indicae-seudaticae N31 on submerged fermentation. The production conditions were: nature and concentration of the carbon source and saline, incubation and agitation speed. After production was performed physicochemical characterization that determined the conditions optimal of the enzyme. From the results, it was observed that the best composition of the fermentative medium was: 4 % wheat bran, 0,3 % saline, 72 hours of incubation at 45 °C and 150 rpm agitation. In these conditions the values of milk-clotting activity and the ratio MCA/PA were 60,5 U/mL and 510, respectively. The clotting enzyme had the characteristics: optimum of pH and temperature were 5,5 and 65 °C, respectively, pH and temperature of stability were 3,5 – 5,0 (retaining approximately 80 % of activity 24 hours at temperature environment) and even 60 °C (after one hour in the absence of substrate). The group of results showed that coagulant protease is promising technological point of view as a substitute for animal rennet, mainly due to their high specificity shown by the high value of the ratio

Made available in DSpace on 2014-11-10T11:09:55Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-07-18Bitstream added on 2014-11-10T11:57:43Z : No. of bitstreams: 1 000788979.pdf: 1462052 bytes, checksum: 88994a9af4a6e667a22d00970d06ebd8 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Cento e quarenta e oito linhagens fúngicas, mesofílicas e termofílicas, foram isoladas de amostras de solo e de matéria orgânica em decomposição de áreas de Cerrado no estado do Mato Grosso Sul. Essas linhagens tiveram suas capacidades de crescimento a 35 ºC e 45 °C analisadas em meios contendo palha de milho como fonte de carbono. Sessenta e seis fungos, com crescimento a 45 ºC foram selecionados para testes de produção enzimática. A maioria das linhagens isoladas produziram xilanase e celulases (avicelase e CMCase) por fermentação em estado sólido (FES), inicialmente utilizando o farelo de trigo como substrato. Posteriormente, foram realizados os estudos do efeito da fonte de carbono e do perfil de produção de enzimas, utilizando diferentes substratos como: farelo de trigo, bagaço de cana-de-açúcar, serragem, sabugo de milho e com misturas destes na proporção de 1:1. A produção mais elevada de CMCase, 18 U/g, foi obtida pelo fungo Penicillium sp 1IP4-A2, em farelo de trigo, após 48 horas de cultivo. As maiores produções de avicelase 13,1 U/g, e xilanase, 370 U/g, foram obtidas pelo fungo Aspergillus sp 1IP2B1, quando cultivado em farelo de trigo e sabugo de milho, após 24 horas e 96 horas de cultivo, respectivamente. A xilanase referida acima, produzida pelo fungo Aspergillus sp 1IP2B1, apresentou atividade máxima em 55 ºC com pH de 5,5 e se manteve estável até 55 °C / One hundred forty-eight mesophilic and thermophilic fungal strains were isolated from samples of soil and decomposing organic matter from Cerrado in the state of Mato Grosso do Sul. These strains have had their capacity for growth at 35 °C and 45 °C analyzed in culture medium containing corn straw as the carbon source. Sixty-six fungi, growing at 45 °C, were selected for enzyme production testing. The most of the isolated strains produced xylanase and cellulase (CMCase and avicelase) by solid state fermentation (SSF), initially using wheat bran as substrate. Subsequently, studies of the effect of carbon source and enzyme production profile were performed using different substrates: wheat bran, sugar cane bagasse, sawdust, corn cobs and mixtures in a 1:1 ratio. The highest CMCase production, 18 U/g, was produced by fungi Penicillium sp 1IP4-A2 in wheat bran, after 48 hours of cultivation. The highest avicelase production, 13.1 U/g, and xylanase, 370 U/g, were obtained by fungi Aspergillus sp 1IP2B1, in wheat bran and corn cob, after 24 hours and 96 hours of culture on solid fermentation, respectively. The xylanase produced by fungi Aspergillus sp 1IP2B1 showed maximum activity at 55 °C at pH 5.5 and it was stable up to 55 °C

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:24:46Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-02-06Bitstream added on 2014-06-13T18:52:39Z : No. of bitstreams: 1 ignacio_eo_me_sjrp.pdf: 543030 bytes, checksum: 69449426c829671ed9efa1ecc7b8a9db (MD5) / Este trabalho teve como objetivo produzir enzimas lipolíticas por fermentação em estado sólido em um biorreator de leito fixo, empregando para isso o fungo mesofílico Metarhizium anisopliae ICB 421 e o fungo termofílico Thermomucor indicae-seudaticae N31, utilizando como substrato bagaço de cana de açúcar (BC), farelo de trigo (FT) e grãos de soja moída (S). As enzimas produzidas podem ser utilizadas para diversos fins industriais, entre eles a produção de biodiesel. Os testes para produção de enzimas foram realizados inicialmente em sacos de polipropileno e apresentaram para M. anisopliae atividade lipolítica de 13,71 U/gss a 28 °C, em meio composto por 50% BC, 25% FT e 25% S, com umidade de 70% e cultivado por 5 dias; para T. indicae-seudaticae atividade lipolítica de 2,81 U/gss a 45 °C, em meio composto por 50% BC, 25% FT e 25% S, com umidade de 70% e cultivado por 2 dias. Nestes ensaios, as variáveis testadas, composição do meio, umidade inicial, substituição do óleo de soja por farelo de soja e tempo de fermentação, afetaram a atividade das enzimas obtidas. Na sequência, como parte do aumento de escala, os ensaios foram conduzidos em dois biorreator de leito fixo, tendo-se como variáveis a vazão de ar e a umidade inicial do substrato, sendo que ambas afetaram a atividade enzimática, que atingiu 5,61 U/gss para M. anisopliae a 28 °C, em meio composto por 50% BC, 25% FT e 25% S, com umidade de 70%, vazão ar 180 L/h, cultivado por 5 dias, e 2,48 U/gss para T. indicae-seudaticae a 45°C, em meio composto por 50% BC, 25% FT e 25% S, com umidade de 70%, vazão ar 80 L/h, cultivado por 2 dias. Das enzimas produzidas, a de M. anisopliae apresentou valores muito baixos de transesterificação, descartando-a para a aplicação na obtenção de biodiesel, mas a de T. indicae-seudaticae mostrou-se promissora para esta aplicação / This study aimed to produce lipolytic enzymes through solid state fermentation (SSF) in a fixed-bed bioreactor, using Metarhirium anisopliae ICB 421 mesophilic fungi and Thermomucor indicae-seudaticae N31 thermophilic fungi, and sugar cane bagasse, wheat, and soybeans as substrate. The enzyme produced can be used for various industrial purposes, including biodiesel production. Tests for enzyme production initially performed in polypropylene and showed to M. anisopliae lipolytic activity of 13.71 U / gds at 28 ° C in medium composed of 50% BC, and 25% FT 25% S, with 70% humidity and cultivated for 5 days for T. indicae seudaticae lipolytic activity of 2.81 U / gds at 45 ° C in medium composed of 50% BC, and 25% FT 25% S, with 70% humidity and cultivated for 2 days. In these assays, the variables tested, medium composition, initial moisture, replacement of soybean oil by soybean meal and fermentation time, affected the activity of the enzymes obtained. Furthermore, as part of scaling, tests were conducted in a fixed bed bioreactor, testing again the process conditions for optimizing the production of lipase; the variables used in this step were air flow, and initial substrate moisture, both of which affect the enzymatic activity, that reached 5.61 U/gds to M. anisopliae at 28°C in medium composed of 50% BC, and 25% FT 25% S, with 70% humidity, air flow 180 L/h, for 5 days, and 2.48 U/gds for T. indicae-seudaticae at 45°C in medium composed of 50% BC, and 25% FT 25% S, with 70% humidity, air flow 80 L/h, for 2 days. . Enzymes produced, M. anisopliae showed very low transesterification, dismissing the application for obtaining biodiesel, but for T. indicae-seudaticae has shown promise for this application

Orientadores: Mirna Lúcia Gigante, Carolina Merheb Dini / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-22T15:56:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Alves_LaisdeSouza_M.pdf: 3863466 bytes, checksum: 898c248c98187c8e24cc306b374d7b13 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: O objetivo deste trabalho foi comparar o efeito do coagulante microbiano sobre o rendimento, características físico-químicas, sensoriais e firmeza do queijo Prato durante a maturação. Os queijos foram fabricados a partir de leite tratado termicamente usando como coagulantes a protease do fungo Thermomucor indicae-seudaticae N31, e coagulante comercial de Rhizomucor sp. O experimento foi do tipo fatorial 2 x 6, em blocos completamente aleatorizados com três repetições. Os resultados foram avaliados por Análise de Variância (ANOVA) e teste de médias de Tukey ao nivel de 5% de significância. O leite, o soro e os queijos foram avaliados quanto à composição centesimal e rendimento. Os queijos foram analisados após 2, 9, 16, 30, 40 e 50 dias de armazenamento com relação ao pH, acidez, umidade, proteólise, firmeza e degradação das frações de caseína por eletroforese em gel. A aceitação sensorial dos queijos foi realizada após 26 dias de fabricação. Os diferentes coagulantes não afetaram a composição dos queijos que apresentou, em média, 42,68% ± 1,87 de umidade, 28,58% ± 1,06 de gordura e 1,91% ± 0,021 de sal, conforme o esperado para queijo Prato. A recuperação de proteína e gordura e o rendimento dos queijos não foram afetados pelos diferentes coagulantes. Ambos os queijos apresentaram boa aceitação sensorial e apresentaram nota média para a aceitação global de 7,1 ± 0,05. Durante a maturação, a proteólise aumentou de maneira similar para ambos os queijos e houve redução de firmeza. A eletroforese em gel de ureia mostrou que o perfil de hidrólise proteica dos queijos foi muito semelhante. O conjunto de dados mostra que a nova protease apresentou comportamento similar à enzima comercial, sugerindo o potencial tecnológico da enzima do Thermomucor indicae-seudaticae N31 como agente coagulante para a fabricação de queijo Prato / Abstract: The aim of this study was to compare the effect of the microbial coagulant on Prato cheese yield and on the development of its physico-chemical, sensory and firmness characteristics during ripening. Cheeses were manufactured using the following coagulants: laboratory obtained protease, from the fungus Thermomucor indicae-seudaticae N31 and commercial coagulant from Rhizomucor sp. A 2 x 6 factorial design with 3 replications was performed and the results were evaluated by ANOVA and mean values were compared by Tukey¿s test at a 5% significance level. Milk, whey and cheese composition were evaluated and cheese yield was calculated. Cheeses were monitored after 2, 9, 16, 30, 40 and 50 days of storage regarding pH, acidity, moisture, proteolysis, firmness and degradation of casein fractions by gel electrophoresis. Sensory acceptance was evaluated after 26 days of manufacture. The different coagulants did not affect cheese composition, which exhibited average content of 42.68% ± 1.87 for moisture, 28.58% ± 1.06 for fat and 1.91% ± 0.02 for salt, as expected for Prato cheese. Protein and fat recovery and cheese yield were not affected by the coagulants as well. Both cheeses presented good sensory acceptance with overall liking scores of 7.1 ± 0.05 representing the `like moderately¿ category. For both cheeses, proteolysis increased and firmness decreased throughout ripening. Urea-PAGE showed that the protein hydrolysis profile was very similar. The gathered data suggest that ripening developed in the same way for both cheeses suggesting the technological potential of protease from Thermomucor indicae-seudaticae N31 as milk clotting agent for Prato cheese manufacture / Mestrado / Tecnologia de Alimentos / Mestra em Tecnologia de Alimentos

Orientador: Heloiza Ferreira Alves Prado / Banca: Maria de Lourdes Texeira de Moraes Polizeli / Banca: Paulo Cezar Ceresini / Resumo: Cento e quarenta e oito linhagens fúngicas, mesofílicas e termofílicas, foram isoladas de amostras de solo e de matéria orgânica em decomposição de áreas de Cerrado no estado do Mato Grosso Sul. Essas linhagens tiveram suas capacidades de crescimento a 35 ºC e 45 °C analisadas em meios contendo palha de milho como fonte de carbono. Sessenta e seis fungos, com crescimento a 45 ºC foram selecionados para testes de produção enzimática. A maioria das linhagens isoladas produziram xilanase e celulases (avicelase e CMCase) por fermentação em estado sólido (FES), inicialmente utilizando o farelo de trigo como substrato. Posteriormente, foram realizados os estudos do efeito da fonte de carbono e do perfil de produção de enzimas, utilizando diferentes substratos como: farelo de trigo, bagaço de cana-de-açúcar, serragem, sabugo de milho e com misturas destes na proporção de 1:1. A produção mais elevada de CMCase, 18 U/g, foi obtida pelo fungo Penicillium sp 1IP4-A2, em farelo de trigo, após 48 horas de cultivo. As maiores produções de avicelase 13,1 U/g, e xilanase, 370 U/g, foram obtidas pelo fungo Aspergillus sp 1IP2B1, quando cultivado em farelo de trigo e sabugo de milho, após 24 horas e 96 horas de cultivo, respectivamente. A xilanase referida acima, produzida pelo fungo Aspergillus sp 1IP2B1, apresentou atividade máxima em 55 ºC com pH de 5,5 e se manteve estável até 55 °C / Abstract: One hundred forty-eight mesophilic and thermophilic fungal strains were isolated from samples of soil and decomposing organic matter from Cerrado in the state of Mato Grosso do Sul. These strains have had their capacity for growth at 35 °C and 45 °C analyzed in culture medium containing corn straw as the carbon source. Sixty-six fungi, growing at 45 °C, were selected for enzyme production testing. The most of the isolated strains produced xylanase and cellulase (CMCase and avicelase) by solid state fermentation (SSF), initially using wheat bran as substrate. Subsequently, studies of the effect of carbon source and enzyme production profile were performed using different substrates: wheat bran, sugar cane bagasse, sawdust, corn cobs and mixtures in a 1:1 ratio. The highest CMCase production, 18 U/g, was produced by fungi Penicillium sp 1IP4-A2 in wheat bran, after 48 hours of cultivation. The highest avicelase production, 13.1 U/g, and xylanase, 370 U/g, were obtained by fungi Aspergillus sp 1IP2B1, in wheat bran and corn cob, after 24 hours and 96 hours of culture on solid fermentation, respectively. The xylanase produced by fungi Aspergillus sp 1IP2B1 showed maximum activity at 55 °C at pH 5.5 and it was stable up to 55 °C / Mestre

Orientadores: Sérgio Marangoni, Saulo Luis da Silva / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-10-31T14:37:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 GasparJunior_PascoalJose_D.pdf: 6862970 bytes, checksum: 60c120eb2e9159656d5c493ee05eca1a (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A triagem de fungos produtores de holocelulases é uma estratégia para a obtenção de enzimas capazes de hidrolisar o material lignocelulósico da biomassa vegetal, contribuindo para aumentar a viabilidade da produção de etanol celulósico Este trabalho avaliou o potencial enzimático dos fungos Penicillium corylophilum e Penicillium simplicissimum com relação às enzimas (endoglicanase, exoglicanase, ?-glicosidase, FPase, xilanase, pectinase e mananase) sobre substratos lignocelulósicos e comerciais como fonte de carbono. Além disso, avaliou-se também a influência da adição de diferentes fontes orgânicas e inorgânicas de nitrogênio sobre a atividade enzimática. Os fungos foram cultivados em triplicata em meio líquido suplementar com 1% de substrato lignocelulósico como fonte de carbono, em pH 7,0. A inoculação foi feita por suspensão de esporos (108 esporos/mL). O cultivo foi feito sob agitação a 120 rpm, a 28°C e os filtrados resultantes em 12, 24, 72 e 120 horas foram utilizados como fontes enzimáticas pelo método do DNS (ácido-3,5- dinitrosalicílico) em triplicata. De todas as atividades enzimáticas analisadas nas fontes lignocelulósicas, a atividade de xilanase do P. simplicissimum sobre a linhaça foi a mais expressiva (3,87 e 3,97 UI/ml), cultivados em 72 e 120 horas, respectivamente, e selecionada para os testes de purificação proteica. A atividade xilanásica específica aumentou consideravelmente após os passos cromatográficos de gel filtração e troca iônica (CTI), sendo inicialmente 3x10-3 atv/ µg de proteína no liofilizado e 19,2 atv/ µg de proteína na fração proveniente da CTI. Nos testes de pH, observou-se que a atividade de xilanase foi maior em pH=4,0 e temperatura de 50°C. Com relação à adição de substratos comerciais, a celulose microcristalina e a xilana apresentaram os resultados mais expressivos da indução da produção de xilanase, sendo que a concentração de 0,5% de xilana mostrou a melhor atividade enzimática em ambos os fungos estudados. A xilose apresentou uma concentração indutora mínima de 0,04% que foi suficiente para aumentar a atividade de xilanase do P. simplicissimum. Com relação à suplementação de fontes de nitrogênio no meio de cultivo para a produção de holocelulases, a adição de (NH4)2SO4 e caseína é uma alternativa importante para a potencialização das atividades de pectinase e de endoglicanase respectivamente pois foram fontes de nitrogênio que proporcionaram um aumento da atividade enzimática em ambos os fungos estudados como também nas duas fontes de carbono testadas. As frações contendo xilanases após cromatografia de gel filtração seguida de fase reversa, após análises por espectrometria de massas apresentam relação massa/carga de 18831,26 Da. A utilização do resíduo lignocelulósico da linhaça, como fonte de carbono para o cultivo submerso do Penicillium simplicissimum é uma opção ecologicamente correta, exequível e de baixo custo para a produção de xilanases. Diversas aplicações biotecnológicas como a utilização na ração animal, na indústria do papel e no etanol de segunda geração, dentre outros, possibilitam um acréscimo substancial do valor agregado desse substrato, permitindo uma ampliação da utilização da linhaça, além do aproveitamento do óleo, sem aumentar a área plantada / Abstract: Screening for producing fungi holocelulases is a strategy for obtaining enzymes that hydrolyze the lignocellulosic material from plant biomass, helping to increase the viability of cellulosic ethanol production This study evaluated the enzymatic potential of Penicillium simplicissimum and Penicillium corylophilum regarding enzymes (endoglicanase, exoglicanase, ?-glucosidase, FPase, xylanase, pectinase and mannanase) for commercial and lignocellulosic substrates as a carbon source. Furthermore, it was also evaluated the influence of the addition of different organic and inorganic nitrogen sources on enzyme activity. The fungus was grown in triplicate in a liquid medium supplement with 1% lignocellulosic substrate as carbon source, pH 7.0. The inoculation was done by the spore suspension (108 spores/ml). The cultivation was done with stirring at 120 rpm at 28 °C and the resulting filtered in 12, 24, 72 and 120 hours were used as enzyme sources for DNS (acid-3,5- dinitrosalicilic) method in triplicates. All enzymatic activities analyzed in lignocellulosic sources, the xylanase activity of P. simplicissimum about flaxseed was greater (3.87 and 3.97 IU/ml), grown at 72 and 120 h of cultivation, respectively, and selected for testing for protein purification. The specific xylanase activity increased considerably after the chromatographic steps of gel filtration and ion exchange (CTI), initially 3x10-3 atv/ mg of protein in lyophilized and 19.2 atv/ mg of protein in the fraction from the CTI. In pH testing, it was noted that the xylanase activity was higher at pH 4.0 and 50 °C. With respect to the addition of commercial substrates, microcrystalline cellulose and xylan showed the most significant results of induction of xylanase production, and the concentration of 0.5% xylan showed the best enzyme activity in both fungi studied. The xylose showed a minimal inducing concentration of 0.04% which was sufficient to increase the activity of xylanase from P. simplicissimum. With respect to supplemental nitrogen sources in the culture medium for the production of holocelulases, the addition of (NH4)2SO4 and casein can be an important tool for the enhancement of pectinase and endoglicanase activities respectively as alternative nitrogen sources that were provided an increase in enzyme activity in both fungi studied as well as the two carbon sources tested. The use of lignocellulosic residue of flaxseed as a source of carbon for submerged cultivation of Penicillium simplicissimum is an environmentally friendly, feasible and cost effective for the production of xylanases option. The fractions containing xylanases after gel filtration chromatography followed by reverse fase after analysis by mass spectrometry are related mass/charge of 18831 26 Da. The use of lignocellulosic waste of flaxseed as a source of carbon for submerged cultivation of Penicillium simplicissimum is an environmentally friendly, feasible and cost effective for the production of xylanases option. Various biotechnological applications such as use in animal feed, in the paper industry and in second generation ethanol, among others, allow a substantial increase in the value of this substrate, allowing an expansion of the use of flaxseed, plus the use of oil, without increasing acreage / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

CAPES / As lipases microbianas têm destaque comercial por apresentarem elevada especificidade e estabilidade em suas reações, permitindo assim, que a indústria de lipases seja composta por diversos segmentos, englobando a indústria alimentícia, farmacêutica, têxtil, tratamento de efluentes e reutilização de resíduos agrícolas. No presente estudo os subprodutos farelo de soja e okara foram avaliados quanto aos aspectos físico-químicos e morfológicos e tais características sugerem seu uso potencial como substrato em fermentações sólidas para a produção de lipase extracelular. Buscando a produção de enzimas lipolíticas a partir destes substratos, foram avaliadas quatro cepas selvagens de fungos filamentosos através de fermentações no estado sólido. O farelo de soja foi a biomassa que demonstrou maior potencial como substrato para a produção de lipase sem suplementação nutricional do meio. O isolado fúngico S4 (Penicillium sp) apresentou o maior potencial lipolítico entre os fungos avaliados. Um delineamento composto central rotacional 23 demonstrou que os parâmetros de cultivo concentração de conídios e umidade são variáveis que influenciam a produção da enzima pelo fungo. O tempo de cultivo não demonstrou ter efeito significativo sobre a produção da lipase e maior produção de lipase (73,85 U.L-1) foi obtida quando usando inóculo na concentração de 105 esporos / mL e meio de cultivo com umidade de 54%. A lipase bruta demonstrou condições ótimas de atividade a 35 ºC em pH 8,0 e foi ativa na faixa de pH entre 6 e 11. Apresentou atividade relativa superior a 50% entre as temperaturas 20 ºC e 40 ºC (30 minutos de aquecimento) e manteve 50 % de sua atividade quando aquecida a 40 ºC por 60 minutos. Os íons Ca2+, K+, Cu2+ (2 mM) e I- apresentaram efeito ativador sobre a atividade lipolítica da enzima, diferentemente do íon Fe2+, que apresentou forte inibição. A enzima bruta foi sensível à presença dos solventes orgânicos acetona, DMSO, metanol e propanol e foi ativada pelo solvente hexano. / Microbial lipases gain great commercial prominence because they have high specificity and stability in their reactions, allowing the lipase industry to be composed of several segments, such as food, pharmaceutical, textile, wastewater treatment and reuse of agricultural waste. Seeking for the production of lipolytic enzymes from these substrates, four wild strains of filamentous fungi was assessed by solid state fermentations. The soybean meal biomass showed higher potential as substrate for lipase production without nutritional supplementation of medium. The fungal isolated S4 (Penicillium sp) had the highest lipolytic potential among the evaluated fungi. A rotational central composite design 23 demonstrated that culture parameters spore concentration and moisture are variables that affect enzyme production by the fungus. The cultivation time demonstrated no significant effect on lipase production and increased production of lipase (73,85 UL-1) was obtained when using inoculum at a concentration of 105 spores / mL and culture medium with 54% moisture. Crude lipase showed optimum conditions of activity at 35 ° C at pH 8.0 and it was active in the pH range between 6 and 11. Enzymatic extract showed relative activity of 50% among the temperature of 20 ° C and 40 ° C (30 minutes of heating) and kept 50% of its activity when heated at 40 ° C for 60 minutes. The ions Ca2+, K+, Cu2+ (2 mM) and I- showed activating effect on the lipolytic activity of the enzyme, unlike ion Fe2+, which showed strong inhibition. The crude enzyme was sensitive to the presence of organic solvents as acetone, DMSO, methanol, propanol and the enzyme was activated by the hexane solvent.