La transformation naturelle est la capacité de certaines bactéries à incorporer et à recombiner activement de l’ADN extra-cellulaire. Ce procédé majeur augmente la plasticité et l’adaptabilité des bactéries à Gram positif et négatif en réalisant des échanges génétiques intra- et inter-espèces. S. pneumoniae est un pathogène majeur de l’Homme. Cette bactérie est responsable d’infections sévères telles que des pneumonies, des méningites et des septicémies. Dans cette espèce, la transformation naturelle est corrélée au phénomène de changement de capsule et à la baisse d’efficacité des vaccins. La plupart des bactéries à Gram positif naturellement transformables possèdent un opéron comG, semblable aux opérons codant pour la famille des pili de type IV, extrêmement répandus chez les bactéries à Gram négatif. Il a été proposé que l’opéron comG est responsable de la formation d’un petit filament, nommé pseudo- pilus. Cependant, un tel filament n’a jamais été observé. Par des techniques de mutagenèse, de caractérisation biochimique, de microscopie optique et électronique, nous sommes parvenus à identifier des filaments de plusieurs micromètres de long à la surface de bactéries S. pneumoniae compétentes. Nous avons confirmé l’appartenance de ces filaments à la famille des pili de type IV. Par conséquent, nous avons infirmé l’hypothèse de la formation d’un pseudo-pilus par l’opérons comG chez S. pneumoniae. De plus, nous avons montré que les pili se lient à l’ADN et qu’ils sont requis pour la capture de l’ADN extra-cellulaire. Ces résultats apportent des informations cruciales concernant les premières étapes de capture de l’ADN durant la transformation naturelle. Nous proposons un nouveau modèle dans lequel le pilus agirait comme un « piège à ADN », capturant l’ADN à la surface des bactéries compétentes pour le guider jusqu’au pore d’entrée dans la cellule. / Natural transformation is the ability of bacteria to actively take up and recombine extracellular DNA. This crucial process increases genome plasticity and adaptability of Gram-negative and Gram-positive bacteria through intra- and inter-species genetic exchange. S. pneumoniae is a major human pathogen responsible for severe diseases such as pneumonia, meningitis and septicemia. In this species, transformation has been linked to capsular serotype switching and reduced vaccine efficiency. Most transformable Gram-positive bacteria carry a comG operon that resembles operons encoding a widespread family of pili in Gram-negative bacteria, the type IV pili. It has been commonly proposed that the comG operon is responsible for the formation of a short pseudo-pilus filament. However, such an appendage had never been visualized in any bacterium. By mutagenesis, biochemical characterization, optical and electron microscopy techniques we were able to identify long, micrometer-sized appendages protruding from the surface of competent S. pneumoniae. We confirmed the Type IV pili nature of these appendages, we showed that they bind DNA, and are absolutely required for DNA uptake. We consequently overthrew the pseudopilus hypothesis at least in S. pneumoniae, and provided crucial information concerning the initial step of DNA uptake. We propose a revised model in which the transformation pilus acts as a “DNA trap” capturing DNA at the surface of competent cells, guiding it to the translocation channel.

During my PhD, I have participated to the characterization of Pleurodeles waltl (urodele amphibian) antibody heavy chains and to the discovery of a new isotype that we named IgP. I have also demonstrated that each antibody heavy chain has its human counterpart. P. waltl IgM are the counterpart of human IgM. IgY are expressed in mucosa and are therefore the physiological counterpart of human IgA. Finally, IgP are predominantly expressed in larvae and are less diverse than IgM. These two characteristics are shared with antibodies produced by mammalian B1 cells. These studies allowed me to approach the effects of a long term spaceflight on the humoral immune response, i.e. the antibody mediated response, which up to now has been poorly studied. The Development and Immunogenetics team, JE 2537, has immunized adult P. waltl during their five month stay onboard the Mir space station and showed that heavy chain variable domains of specific IgM are encoded by genes belonging to the VHII and VHVI families. However, these families are used in different proportions in animals immunized onboard Mir by comparison to animals immunized on Earth. To better understand this difference, I have determined how these animals use their individual VHII and VHVI genes. My work revealed that only one VHII gene and four VHVI genes (A, B, C and D) are used by immunized animals. I observed an increase in the expression of IgM heavy chain mRNAs encoded by the VHII, VHVI.C and VHVI.D genes and a strong decrease in the expression of IgM heavy chain mRNAs encoded by the VHVI.A and VHVI.B genes in spaceflight animals, demonstrating that this environment affects the humoral response. These observations may be due to a change in B-cell selection under spaceflight conditions. Furthermore, I described for the first time the effects of spaceflight on somatic hypermutations. I isolated and characterized the P. waltl mRNA coding for the main effector of these mutations: the activation-induced cytidine deaminase (AID). I demonstrated that this protein is present and conserved in P. waltl. Then, I described somatic hypermutations in P. waltl. I mapped somatic hypermutations, studied their distribution and calculated their frequency in animals immunized on Earth and in animals immunized onboard the Mir space station. This work revealed a strong depression of somatic hypermutations in animals immunized onboard Mir. This observation does not result from a change in AID transcription. We believe that this may be the consequence of a lower B lymphocyte survival under spaceflight conditions. / Durant ma thèse, j'ai participé à la caractérisation des isotypes de chaînes lourdes d'anticorps chez le pleurodèle (Pleurodeles waltl, amphibien urodèle) et à la mise en évidence d'un nouvel isotype d'anticorps : les IgP. J'ai également montré que chaque chaîne lourde a son équivalent humain. Les IgM du pleurodèle sont l'équivalent des IgM humaines. Les IgY sont exprimées principalement au niveau des muqueuses tout comme les IgA humaines. Enfin, les IgP sont observées majoritairement chez les larves et ont une diversité plus faible que les IgM. Ces deux caractéristiques sont partagées avec les anticorps produits par les cellules B1. Ces travaux m'ont ensuite permis d'aborder l'impact d'un séjour de longue durée dans l'espace sur la réponse immunitaire humorale, c'est-à-dire la réponse médiée par les anticorps qui, jusqu'à présent, a été très peu étudiée. L'équipe Développement et Immunogénétique, JE 2537, a immunisé des pleurodèles lors d'un séjour de 5 mois à bord de la station spatiale Mir et a montré que les chaînes lourdes d'IgM produites en réponse à la stimulation antigénique sont fabriquées à partir de gènes des familles VHII et VHVI. Cependant ces familles sont utilisées dans des proportions différentes chez les animaux immunisés dans Mir. Mes travaux ont permis d'approfondir ces résultats par une étude des gènes VHII et VHVI utilisés dans ces chaînes lourdes. J'ai ainsi montré qu'un seul gène VHII et quatre gènes VHVI (A, B, C et D) sont utilisés par les animaux immunisés. Les gènes VHII, VHVI.C et VHVI.D sont plus exprimés chez les animaux immunisés dans Mir alors que l'expression des gènes VHVI.A et VHVI.B est fortement diminuée chez ces mêmes animaux. Ces résultats démontrent clairement que le séjour dans Mir a affecté la réponse immunitaire humorale de ces animaux. Ces observations pourraient résulter d'un changement de la distribution et de sélection des lymphocytes B dans l'espace. Par ailleurs, j'ai décrit pour la première fois les effets d'un séjour dans l'espace sur les hypermutations somatiques. Avant d'étudier ce phénomène, j'ai isolé et caractérisé chez le pleurodèle l'ARNm codant l'effecteur indispensable pour ces mutations : la protéine AID (activation-induced cytidine deaminase). J'ai ainsi montré que cette protéine est bien présente et conservée dans cette espèce. J'ai ensuite mis en évidence et caractérisé pour la première fois le phénomène des hypermutations somatiques chez le pleurodèle. Pour cela, j'ai étudié les profils des mutations observées, cartographié ces dernières et calculé leur fréquence. Ces différents critères ont été comparés entre les animaux immunisés sur Terre et les animaux immunisés à bord de la station Mir. Ainsi, j'ai pu montrer que la fréquence des hypermutations somatiques est diminuée chez les pleurodèles immunisés dans Mir. Cette diminution n'est pas due à un changement de la transcription d'AID mais pourrait être due à une diminution de la survie des lymphocytes B dans l'espace.

Cette recherche a été focalisée sur l’étude de la variabilité génétique et des mécanismes associés à une adaptation d’A. bisporus à la culture dans des conditions subtropicales. Elle a été subdivisée en trois parties : 1- identification de la diversité de l’aptitude à fructifier à haute température (FHT+) dans un échantillon de souches sauvages collectées dans plusieurs localités de pays d’Amérique du Nord et d’Europe. Dans cet ensemble nous avons inclus des représentants des trois variétés d’Agaricus à savoir: les variétés bisporus, burnettii et eurotetrasporus; 2- la caractérisation d’un gène candidat de thermo-tolérance dans des souches FHT+ et FHT- et l’identification de son implication dans le caractère FHT+; 3- l’étude du déterminisme génétique du caractère FHT+. Toutes les souches de la variété burnettii sont capables de produire des champignons avec de forts rendements à haute température. Cette aptitude est un élément de leur adaptation aux conditions climatiques rencontrée par la population originale. Seulement quelques souches d’A. bisporus var. bisporus ont révélés un bon potentiel pour fructifier à 25°C, mais sans relation avec les conditions climatiques de leur zone d’origine. Le gène étudié n’était que légèrement impliqué dans la réaction au stress thermique. Nous l’avons renommé aap1 car nous avons montré qu’il appartient à une nouvelle sous-famille des homologues du gène YAP1 de levure. Il n’est pas un contributeur dominant pour la thermo-tolérance d’A. bisporus, mais la protéine qu’il code peut être impliquée comme facteur de transcription de résistance générale au stress. En fait le caractère FHT+ est un caractère quantitatif sous contrôle polygénique. Il peut être hérité d’un parent de la variété burnetti dans une descendance inter variétale. Au cours de ce travail, des souches d’A. bisporus possédant des potentiels intéressants pour la culture en conditions subtropicales ont été identifiées et les bases génétiques pour un programme de création variétale pour introduire ces caractères dans des souches déjà cultivées ont été identifiées. / This work focused mainly on studying genetic variability andmechanisms associated with an adaptation of Agaricus bisporus for cultivation undersubtropical conditions of Mexico. The research was divided into three parts: 1-Identification of the diversity for fructification at a high temperature (FHT+) in a pool ofwild strains gathered in numerous locations of North America and Europe andrepresentative of the three varieties known in the species: bisporus, burnettii y eurotetrasporus; 2- characterization of a candidate gene of thermo-tolerance in FHT+ and FHT- strains and identification of its involvement in the FHT+ trait; 3- studies on the genetic determinism of FHT+ trait. All the strains of A. bisporus var burnettii produced mature sporophores at high temperatures with high yields. This ability is a part of the adaptation to the climatic conditions faced by the original population. For the A. bisporus var bisporus only some strains expressed the FHT+ trait and very few produced significant yield at high temperatures. There was no correlation with the geographical origin of the strains. The candidate gene studied was only weakly involved in the FHT+ trait. This study allowed a better characterization of one of the genes. We renamed it aap1 because it belongs to a new sub-family of counterparts of the gene YAP1 of yeast. It is not a dominant contributor to the thermo-tolerance of A. bisporus, but the protein that it encodes can be involved as a factor in transcription of general resistance to stress. Actually FHT+ was shown to be a quantitative trait under polygenic control, and it can be inherited from the A. bisporus var. burnettii in an intervarietal progeny. Strains of A. bisporus with interesting potential for cultivation under subtropical conditions and genetic bases of breeding programs for introducing this potential in already cultivated strains had been identified.

Les mutations du gène SCN1A, sont impliquées dans des épilepsies du nourrisson : le Syndrome de Dravet (SD), une épilepsie rare et pharmaco-résistante ou l’Epilepsie généralisée avec crises fébriles plus (GEFS+), une épilepsie plus légère. GEFS+ et SD sont associés à des crises épileptiques fébriles dès l’âge de 6 mois. Dans le SD on voit apparaitre des retards mentaux mais également des déficits moteurs, visuels, langagiers et mnésiques au cours de l’évolution de la maladie. L’impact des crises épileptiques au cours l’enfance sur ces déficits cognitifs n’est pas connu. Le SD est considéré comme une encéphalopathie épileptique où les crises étaient les principales responsables du phénotype à l’âge adulte. Récemment, un rôle potentiel de la mutation dans les troubles cognitifs a été mis en évidence changeant la définition de SD d’encéphalopathie épileptique à une canalopathie. La question est quel est le rôle des crises épileptiques répétées sur les fonctions cognitives à l’âge adulte ? Nous avons utilisé un modèle murin de la maladie portant une mutation du gène Scn1a, et qui présente une pathologie très légère. Nous avons induit des crises épileptiques par hyperthermie à l’âge de 21 jours (10 jours) et testé les effets à long-terme à l’âge adulte. Nos résultats révèlent que l’induction de crises induit une hyperactivité, des altérations dans les interactions sociales et des déficits en mémoires hippocampo et cortex préfronto-dépendantes. Ainsi nous avons mis en évidence que les crises épileptiques répétées pendant le développement ont un fort impact sur la fonction cérébrale et qu’il est donc capital de les prévenir afin de diminuer, voir de prévenir, ces déficits. / The SCN1A gene codes for the voltage-gated sodium channel Nav1.1 α-subunit. SCN1A mutations cause genetic epilepsies, as Generalized Epilepsy with Febrile Seizures plus (GEFS+), a mild epilepsy, or Dravet Syndrome (DS), a rare, severe and drug-resistant epileptic encephalopathy (EE). DS patients show severe cognitive/behavioral impairments that, according to the definition of EE, should be caused by the recurrent epileptic activity. Yet, this causal relationship has never been proved and it is been challenged by studies in mouse models showing that the genetic mutation itself, which causes a decrease in GABAergic activity, can be responsible for DS cognitive outcome. We studied the implication of repeated seizures during childhood to the later long-term modifications on cognitive/behavioral and epileptic phenotypes by submitting the Scn1a mouse model carrying the R1648H missense mutation and presenting mild phenotype to a protocol of repeated seizures induction by hyperthermia (10 days/one seizure per day). We observed that early life seizures can worsen the epileptic phenotype and induce cognitive/behavioral defects notably by inducing hyperactivity, sociability deficits and hippocampus- and prefrontal cortex-dependent memory deficits. We found that early life seizures can worsen the epileptic phenotype and induce cognitive/behavioral defects. Although the effect of NaV1.1 dysfunction in altering brain synchrony and the effect of repeated seizure activity in the young brain are not mutually exclusive, we thus conclude that epileptic seizures are sufficient to convert a Scn1a mouse model carrying a mild phenotype into a severe phenotype.

L’acide gras synthase, codé par le gène FASN, est une protéine multi-enzyme homodimérique responsable de la lipogenèse de novo à partir de l’acétyl-CoA et du malonyl- CoA. La finalité de cette lipogenèse est la production de l’acide palmitique, un acide gras simple, précurseur des acides gras à très longues chaînes. L’acide palmitique est impliqué dans plusieurs processus biologiques, dont la palmitoylation qui permet d’ancrer diverses protéines à la membrane cellulaire sous-tendant, entre autres, la transmission synaptique. Le rôle de l’acide gras synthase dans le développement embryonnaire est bien établi. En effet, il est exprimé de manière ubiquitaire dans l’embryon, principalement dans les tissus en pleine croissance et soumis à un remodelage, participant ainsi activement au développement cérébral. Par conséquent, des mutations du gène FASN ont été associées à plusieurs maladies, incluant divers types de cancers, les maladies cardiovasculaires, mais également, plus récemment, à certaines maladies du neurodéveloppement, incluant les troubles du spectre de l’autisme. Des données récentes des laboratoires Rossignol et Campeau, au CHU Ste-Justine, suggèrent un lien entre des mutations récessives ou de novo du gène FASN et des formes précoces d’épilepsie avec atteinte cognitive (encéphalopathies épileptogènes). Nous postulons que les mutations du gène FASN modifient la synthèse de l’acide palmitique et perturbent le développement des réseaux neuronaux, en altérant la migration, le développement morphologique, l’excitabilité et/ou la fonction synaptique de populations neuronales spécifiques, résultant en une hyperexcitabilité neuronale et à l’épilepsie. Pour explorer cette hypothèse, nous avons recueilli les informations cliniques de dix patients porteurs de mutations du gène FASN dans le cadre d’études génomiques en cours au CHU Ste- Justine et à travers le monde. Nous avons également généré un nouveau modèle murin de la maladie, exprimant une mutation retrouvée chez un membre de notre cohorte clinique, que nous avons caractérisé sur les plans histochimique et électrophysiologique. Nos données suggèrent que les mutations du gène FASN induisent chez l’humain un phénotype clinique de retard global du développement évoluant vers une déficience intellectuelle, s’accompagnant d’un éventail de signes neurologiques (déficit moteur, spasticité, réflexes ostéotendineux vifs, hypotonie et ataxie) et d’un risque accru d’épilepsie. De plus, notre modèle de souris knock-in Fasn.S154N révèle la fonction critique de ce gène dans le développement embryonnaire puisqu’une mutation homozygote entraîne une mortalité in utero. Par ailleurs, les souris porteuses de mutations hétérozygotes survivent et présentent un phénotype clinique rappelant celui observé chez les patients, incluant un comportement anxieux, une activité épileptique interictale à l’électroencéphalogramme ainsi qu’un abaissement du seuil convulsif lors d’une exposition au pentylenetetrazole (PTZ). Nous discutons certains mécanismes sous-jacents contribuant potentiellement au développement de l’épilepsie dans cette maladie, incluant une altération de l’activité de l’acide gras synthase au niveau du cortex préfrontal et de l’amygdale, une palmitoylation aberrante des protéines synaptiques, une plus grande vulnérabilité des cellules granulaires du gyrus denté, un dysfonctionnement des cellules souches neurales, une neurogénèse insuffisante, ainsi qu’une altération de la myélinisation et de la croissance axonale impactant la migration des interneurones. Ces mécanismes sont prédits pour altérer l’excitabilité neuronale et la transmission synaptique, perturbant la fonction des circuits. Des études subséquentes permettront d’élucider lesquels de ces divers mécanismes contribuent au phénotype clinique dans notre nouveau modèle murin de la maladie. / Fatty Acid Synthase is a large protein complex encoded by the FASN gene, which is responsible for de novo lipogenesis from acetyl-CoA and malonyl-CoA in the presence of NADPH. The endpoint of this process is the production of palmitic acid. The roles of fatty acid synthase in embryonic development are well established: it is ubiquitously expressed in early embryos, particularly in tissues undergoing active proliferation, outgrowth, and remodelling, and it is thus essential for normal brain development and neuronal function. Consequently, FASN gene mutations have been associated with several neurodevelopmental conditions, including autism spectrum disorders (ASD). Recently, the laboratories of Drs. E. Rossignol and P. Campeau at the CHU Ste-Justine (Université de Montréal), with their international collaborators, have identified 10 patients with neurodevelopmental disorders (i.e., developmental delay, intellectual disability and/or epilepsy) carrying recessive or de novo mutations in the FASN gene, supporting a critical role of FASN in regulating neuronal circuit development and function. However, the mechanisms by which mutations in the FASN gene result in epilepsy are unknown. We postulate that FASN mutations alter palmitic acid synthesis and disrupt neuronal network development, resulting in network hyperexcitability and epilepsy. In this study, we expand the phenotypic description of patients carrying FASN mutations, while generating a novel mouse model carrying a patient-derived FASN mutation to explore the underlying cellular and network mechanisms. Our data reveal that FASN mutations, in humans, generate neurodevelopmental disorders characterized by epilepsy, global developmental delay (GDD), intellectual disability (ID), and a broad range of neurological signs (motor deficit, spasticity, hyperreflexia, hypotony, and ataxia). In our knock-in FasnS154N mouse model, homozygous mutations resulted in prenatal lethality. In contrast, heterozygous mutations caused a clinical phenotype reminiscent of the patient phenotype, with anxiety-like behaviors, spontaneous interictal spikes on electroencephalograms (EEG), and a tendency to a reduced PTZ-induced seizure threshold. We discuss the potential underlying mechanisms, including an altered FAS activity within the prefrontal cortex and the amygdala, aberrant palmitoylation of postsynaptic density proteins, the vulnerability of dentate gyrus granules cell, altered neural stem cells activity and neurogenesis, improper axonal growth and myelination, resulting in altered neuronal excitability and synaptic function, aberrant network activities and epilepsy. These mechanisms will be explored in subsequent studies using our novel animal model.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2004-2005 / Les cancers cutanés sont associés à la formation des dimères cyclobutyliques de pyrimidine (DCP) générés par les ultraviolets (UV) du soleil. Nos résultats indiquent que les transversions T-->G retrouvées suite aux UVA sont dues aux DCP formés majoritairement sur les TT. Nous avons également démontré que, contrairement au dogme établi, les protéines réparant les mésappariements n'influencent pas la réparation des DCP. p53 a indéniablement une influence sur la réparation des DCP. Cependant, la lignée SW480, contenant un gène p53 double-muté, est fonctionnelle en réparation par excision de nucléotides des DCP. Normalement, un stress est nécessaire à l'activation des effecteurs de p53. Cependant, la protéine p53 double-mutée des SW480 active constitutivement p21, un effecteur de p53. L'activation des protéines réparant les DCP par p53 se fait probablement de la même façon que p21. L'éclaircissement de ces mécanismes a amené une meilleure compréhension de l'induction des cancers.

Thèse ou mémoire avec insertion d'articles / Le cancer du sein est le cancer le plus fréquent au niveau mondial chez la femme, représentant 12% des nouveaux cas de cancers en 2020. C'est une maladie complexe et hétérogène classée en fonction de l'expression de trois marqueurs moléculaires : le récepteur aux estrogènes (ER), le récepteur à la progestérone (PR) et le récepteur épidermique humain 2 (HER2) qui donnent lieu à quatre sous-types moléculaires qui sont les sous-types luminal A (ER+ et/ou PR+, HER2-), luminal B (ER+ et/ou PR+, HER2+), HER2 (ER-/PR-,HER2+) et triple-négatif (ER-, PR- et HER2-). Chaque sous-type moléculaire possède des caractéristiques spécifiques qui le définissent. En effet, la prévalence, le taux de survie, l'agressivité ou encore les types de traitements administrés sont différents. Les traitements du cancer du sein se basent sur l'histologie de la tumeur, le sous-type moléculaire ainsi que sur l'âge et le statut ménopausique de la patiente. Il existe deux principaux types de stratégies thérapeutiques : la thérapie généralisée (ou thérapie non ciblée) et la thérapie personnalisée. D'une part, la thérapie généralisée, comme la chimiothérapie, la radiothérapie et la chirurgie qui sont utilisées de manière routinière dans le traitement du cancer du sein, s'appuie sur la capacité des cellules à devenir malignes. D'autre part, la thérapie personnalisée consiste à cibler spécifiquement un biomarqueur impliqué dans le cancer du sein comme le sont ER et HER2. Ainsi, la thérapie endocrinienne (hormonothérapie) cible directement ER ou la synthèse des estrogènes, tandis que les thérapies anti-HER2 ciblent le domaine extracellulaire du récepteur ou bloquent son activité tyrosine kinase. Toutefois, malgré des progrès importants dans le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques, le traitement du cancer du sein reste un défi de taille. En effet, certaines patientes ne peuvent pas recevoir de traitements ciblés comme les patientes avec une tumeur triple-négative puisqu'elles n'expriment ou ne surexpriment aucun des trois marqueurs moléculaires. De plus, que ce soit la thérapie généralisée ou la thérapie personnalisée, tous ces traitements entraînent des effets secondaires qui peuvent être délétères pour les patientes. Finalement, chez certaines patientes la thérapie prescrite peut se révéler inefficace à cause des cellules tumorales qui sont ou sont devenues résistantes au traitement. Ce projet de doctorat se découpe en deux parties distinctes qui font face aux deux problématiques mentionnées : trouver des thérapies plus personnalisées mais aussi des thérapies généralisées (aussi appelées thérapies non-ciblées) qui soient plus efficaces et avec le moins d'effets secondaires possible. La première partie porte sur l'étude des effets du trastuzumab (thérapie anti-HER2 conventionnellement administrée pour les patientes avec une tumeur HER2+) en fonction de la phosphorylation du récepteur dans les tumeurs HER2-. La deuxième partie quant à elle se consacre à l'étude de la nouvelle molécule de synthèse RM-581 sur les différents sous-types moléculaires du cancer du sein. La première étude a permis d'identifier un sous-groupe de patientes qui ne surexpriment pas HER2 mais qui présentent la forme phosphorylée du récepteur - spécifiquement sur la tyrosine 877- (HER2-/pHER2$^\textup{Y877}$+), sur une cohorte de 497 patientes représentatives de la distribution des sous-types moléculaires grâce à des tests d'immunohistochimie. Cette étude a aussi permis de montrer que pHER2$^\textup{Y877}$ était un marqueur de sensibilité au trastuzumab en faisant des tests de prolifération sur différentes lignées cellulaires du cancer du sein représentant les différentes combinaisons de statut HER2 et pHER2$^\textup{Y877}$. Ces résultats ouvrent la voie vers une nouvelle stratégie de traitement pour les patientes qui ne peuvent pas recevoir de trastuzumab car ne surexpriment pas HER2, comme les patientes avec une tumeur triple-négative, mais qui surexpriment pHER2$^\textup{Y877}$. La deuxième étude a permis de confirmer que l'aminostéroïde RM-581 est efficace contre tous les sous-types moléculaires du cancer du sein, notamment les sous-types luminal A et triple-négatif, dans des lignées cellulaires du cancer du sein cultivées aussi bien en 2D qu'en 3D en réalisant des tests de prolifération permettant de calculer la concentration médiane inhibitrice. Nous avons également confirmé que RM-581 entraîne l'activation du stress du réticulum endoplasmique (RE) menant à l'apoptose cellulaire puisque celui-ci entraîne l'augmentation de l'expression de marqueurs de l'apoptose due au stress du RE. Cette étude a donc permis de mettre en avant RM-581 comme une nouvelle molécule anticancéreuse pour le cancer du sein et particulièrement le sous-type triple-négatif, ce qui pourrait offrir un nouveau traitement pour ces patientes. Ce projet a permis d'identifier deux nouvelles stratégies thérapeutiques (l'une très personnalisée et l'autre plus généralisée/non-ciblée) contre le cancer du sein et plus spécifiquement contre le sous-type triple-négatif qui est le sous-type moléculaire le plus agressif et avec le plus mauvais pronostic. / Breast cancer is the most diagnosed cancer among women worldwide, representing 12% of all new cancer cases in women in 2020. This is a complex and heterogenous disease classified according to the expression of three molecular markers: estrogen receptor (ER), progesterone receptor (PR) and human epidermal receptor 2 (HER2) leading to four molecular subtypes which are luminal A (ER+ and/or PR+, HER2-), luminal B (ER+ and/or PR+, HER2+), HER2 (ER-/PR-, HER2+) and triple-negative -TNBC- (ER-, PR- and HER2-). Each molecular subtype has specific characteristics such as prevalence, survival, grade, and the type of treatments. Breast cancer treatments are based on the tumor histology, molecular subtypes and patient's age and menopausal status. There are two major types of therapeutic strategies: generalized therapy and personalized therapy. Firstly, generalized therapy, like chemotherapy, radiotherapy, and surgery which are commonly used for breast cancer treatment, is based on the capacity of cells to become malignant. On the other hand, personalized therapy specifically targets a biomarker involved in breast cancer such as ER or HER2. Endocrine therapy can directly target ER or estrogen biosynthesis whereas anti-HER2 therapies can target the extracellular domain of the receptor or its tyrosine kinase domain. However, despite significant progress in the development of new therapeutic strategies, breast cancer treatment remains a major challenge. For example, some patients cannot receive targeted therapies, like TNBC patients as they do not express or overexpress any of the three biomarkers. Furthermore, all breast cancer treatments (targeted and generalized or non-targeted therapies) cause side effects that can be deleterious for patients. Lastly, the prescribed therapy can be ineffective for some patients because of tumoral cells that are or became resistant to the treatment. This project is composed of two distinct parts that face the two issues mentioned: to find more personalized therapies and to find generalized therapies (also called non-targeted therapies) that are more effective and less deleterious. The first part focuses on the study of trastuzumab (anti-HER2 treatment) effects depending on HER2 phosphorylation in HER2-negative breast cancer cell lines. The second part focuses on the study of RM-581, a new synthesis molecule, on the different breast cancer molecular subtypes. The first study identified a subgroup of patients who do not overexpress HER2 but express the phosphorylated form of HER2 at tyrosine 877 specifically (HER2-/pHER2$^\textup{Y877}$+), on a cohort of 487 patients that is representative of breast cancer molecular subtypes distribution. This study showed that pHER2$^\textup{Y877}$ was a marker of trastuzumab sensitivity. In fact, we performed proliferation assay on breast cancer cell lines according to their combination of HER2 and pHER2$^\textup{Y877}$ status. These results paved the way for a new therapeutic strategy for breast cancer patients who overexpress pHER2$^\textup{Y877}$ but could not receive trastuzumab (because they do not overexpress HER2), like TNBC patients. The second study confirmed that the aminosteroid RM-581 is effective against all breast cancer molecular subtypes, especially luminal A and TNBC subtypes, in breast cancer cell lines cultured in 2D and 3D. We also confirmed that RM-581 induces endoplasmic reticulum stress leading to cellular apoptosis. These results proved that RM-581 could be a new anticancer molecule for breast cancer treatment, in particular for TNBC patients. This project emphasized two new therapeutic strategies (one more personalized, and the other more generalized) for breast cancer and more specifically TNBC which is the most aggressive and with the worst survival breast cancer molecular subtype.

Le développement de la multirésistance chez Escherichia coli est un problème important en médecine animale et humaine. En outre, l’émergence et la diffusion des déterminants de résistance aux céphalosporines à larges spectres de troisième génération (ESCs) parmi les isolats, incluant des céphalosporines essentielles en médecine humaine (ex. ceftriaxone et ceftiofur), est un problème majeur de santé publique. Cette thèse visait trois objectifs. D’abord étudier la dynamique de la résistance aux antimicrobiens (AMR) ainsi que la virulence et les profils génétiques de la AMR des E. coli isolées de porcs recevant une nourriture post-sevrage supplémentée avec de la chlortétracycline et de la pénicilline G, et, accessoirement, évaluer les effets d'additifs alimentaires sur cette dynamique en prenant pour exemple d'étude un minéral argileux, la clinoptilolite, étant donné son possible lien avec le gène blaCMY-2 qui confère la résistance au ceftiofur. L'objectif suivant était d'investiguer les mécanismes menant à une augmentation de la prévalence du gène blaCMY-2 chez les porcs qui reçoivent de la nourriture médicamentée et qui n'ont pas été exposés au ceftiofur Ici encore,nous avons examiné les effets d’un supplément alimentaire avec un minéral argileux sur ce phénomène. Enfin, notre dernier objectif était d’étudier, dans le temps, les génotypes des isolats cliniques d'E. coli résistant au ceftiofur, isolés de porcs malades au Québec à partir du moment où la résistance au ceftiofur a été rapportée, soit de 1997 jusqu'à 2012. Dans l'étude initiale, la prévalence de la résistance à 10 agents antimicrobiens, incluant le ceftiofur, s’accroît avec le temps chez les E.coli isolées de porcelets sevrés. Une augmentation tardive de la fréquence du gène blaCMY-2, encodant pour la résistance au ceftiofur, et la présence des gènes de virulence iucD et tsh a été observée chez les isolats. La nourriture supplémentée avec de la clinoptilolite a été associée à une augmentation rapide mais, par la suite, à une diminution de la fréquence des gènes blaCMY-2 dans les isolats. En parallèle, une augmentation tardive dans la fréquence des gènes blaCMY-2 et des gènes de virulence iucD et tsh a été observée dans les isolats des porcs contrôles, étant significativement plus élevé que dans les porcs ayant reçu l'additif au jour 28. La diversité, au sein des E. coli positives pour blaCMY-2 , a été observée au regard des profils AMR. Certaines lignées clonales d'E.coli sont devenues prédominantes avec le temps. La lignée clonale du phylotype A prédominait dans le groupe supplémenté, alors que les lignées clonales du phylotype B1, qui possèdent souvent le gène de virulence iucD associé aux ExPEC, prédominaient dans le groupe contrôle. Les plasmides d'incompatibilité (Inc) des groupes, I1, A/C, et ColE, porteurs de blaCMY-2, ont été observés dans les transformants. Parmi les souches cliniques d'E.coli ESC-résistantes, isolées de porcs malades au Québec de 1997 à 2012, blaCMY-2 était le gène codant pour une β-lactamase le plus fréquemment détecté; suivi par blaTEM et blaCTX-M,. De plus, les analyses clonales montrent une grande diversité génétique. Par contre, des isolats d'E. coli avec des profils PFGE identiques ont été retrouvés dans de multiples fermes la même année mais aussi dans des années différentes. La résistance à la gentamicine, kanamycine, chloramphenicol, et la fréquence de blaTEM et de IncA/C diminuent significativement au cour de la période étudiée, alors que la fréquence de IncI1 et de la multirésistance à sept catégories d'agents antimicrobiens augmente significativement avec le temps. L'émergence d'isolats d'E. coli positifs pour blaCTX-M, une β-lactamase à large spectre et produisant des ESBL, a été observée en 2011 et 2012 à partir de lignées clonales distinctes et chez de nombreuses fermes. Ces résultats, mis ensemble, apportent des précisions sur la dissémination de la résistance au ceftiofur dans les E. coli isolées de porcs. Au sein des échantillons prélevés chez les porcs sevrés recevant l'alimentation médicamentée sur une ferme, et pour laquelle une augmentation de la résistance au ceftiofur a été observée, les données révèlent que les souches d'E. coli positives pour blaCMY-2 et résistantes aux ESCs appartenaient à plusieurs lignées clonales différentes arborant divers profils AMR. Le gène blaCMY-2 se répand à la fois horizontalement et clonalement chez ces E. coli. L'ajout de clinoptilotite à la nourriture et le temps après le sevrage influencent la clonalité et la prévalence du gène blaCMY-2 dans les E. coli. Durant les 16 années d'étude, plusieurs lignées clonales différentes ont été observées parmi les souches d'E. coli résistantes au ceftiofur isolées de porc malades de fermes québécoises, bien qu’aucune lignée n'était persistante ou prédominante pendant l'étude. Les résultats suggèrent aussi que le gène blaCMY-2 s'est répandu à la fois horizontalement et clonalement au sein des fermes. De plus, blaCMY-2 est le gène majeur des β-lactamases chez ces isolats. À partir de 2011, nous rapportons l'émergence du gène blaCTX-M dans des lignées génétiques distinctes. / Development of multidrug resistance in Escherichia coli is an important problem in animal and human medicine. Further, emergence and spread of determinants for resistance to third generation extended-spectrum cephalosporins (ESCs) such as the critically important cephalosporins in human medicine (e.g. ceftriaxone and ceftiofur) among isolates is a public health concern. Thus, the objectives of the present thesis were (1) to study the dynamic of antimicrobial resistance (AMR) phenotypes as well as virulence and AMR gene profiles in E. coli from pigs receiving a feed medicated with chlortetracycline and penicillin G following weaning and to study the effect of feed supplementation with a clay mineral, clinoptilolite, on this dynamic; (2) To investigate the mechanisms leading to an increase in the prevalence of blaCMY-2 conferring resistance to ceftiofur in pigs receiving medicated feed but which had not received ceftiofur, and to examine the effect of feed supplementation with a clay mineral on this phenomenon; and (3) to investigate the temporal characterization of clinical isolates of ceftiofur-resistant E.coli from diseased pigs in Quebec, Canada from 1997, when ceftiofur resistance was first reported, to 2012. In the initial study, prevalence of resistance to 10 antimicrobial agents, including ceftiofur, increased over time in E.coli isolates from weaned pigs. A late increase in the frequency of blaCMY-2, the gene encoding resistance to ceftiofur, and the presence of virulence genes iucD and tsh were observed in the isolates. Feed supplementation with clinoptilolite was associated with an early increase but later decrease in the frequency of the blaCMY-2 gene in isolates. Concurrently, a later increase in the frequency of the blaCMY-2 and the virulence genes iucD and tsh was observed in the control pig isolates, being significantly greater than in the supplemented pigs at day 28. Diversity among the blaCMY-2-positive E. coli isolates with respect to AMR patterns was observed. Certain clonal lineages of E. coli became predominant with time. The clonal lineage of phylotype A predominated in the supplemented group, whereas the clonal lineages of phylotype B1 which often possessed the ExPEC-associated virulence gene iucD, predominated in the control group. The blaCMY-2-carrying plasmids of incompatibility (Inc) groups, I1, A/C, and ColE were observed in transformants. In ESC-resistant E.coli clinical isolates from diseased pigs in Quebec, from 1997 to 2012, blaCMY-2 was the most frequently detected β-lactamase gene, followed by blaTEM and blaCTX-M and clonal analysis showed high diversity. E. coli isolates with identical PFGE patterns were found in multiple farms in the same year and also in different years. Resistance to gentamicin, kanamycin, chloramphenicol, and the frequency of blaTEM and IncA/C significantly decreased over the study time, whereas the frequency of IncI1 and multidrug-resistance to seven antimicrobial categories significantly increased over time. Emergence of blaCTX-M-positive, extended-spectrum β-lactamase (ESBL)-producing E. coli isolates was observed in 2011 and 2012 from distinct clonal lineages and multiple farms. Taken together, this work gives some insight into the spread of ceftiofur resistance in E.coli isolates from pigs. Results reveal that in weaned pigs receiving medicated feed on one farm in which an increase in ceftiofur resistance was observed, the blaCMY-2-positive E.coli resistant to ESCs belonged to several different clonal lineages with diverse AMR patterns. The blaCMY-2 gene spread both horizontally and clonally in E. coli. Feed supplementation with clinoptilolite and time period after weaning influenced the clonality and the prevalence of blaCMY-2 gene in E. coli. In ceftiofur-resistant E.coli strains isolated from diseased pigs in farms throughout Quebec over a 16 year period, several different pathogenic clonal lineages were observed, although none was persistent or predominant over the study time. The results suggest that blaCMY-2 gene spreads both horizontally and clonally on and between farms. Furthermore, blaCMY-2 was the major β-lactamase gene in these isolates. From 2011, we report the emergence of blaCTX-M in distinct clonal lineages.

L'épissage des ARN pré-messagers est une étape essentielle pour l'expression des gènes chez les eucaryotes supérieurs. La reconnaissance des exons par la machinerie d'épissage est réalisée grâce à différents éléments cis-régulateurs incluant les séquences consensus d'épissage et les séquences auxiliaires activatrices ou inhibitrices d'épissage. Le pré-ARNm représente une nouvelle cible thérapeutique pour le traitement des maladies génétiques. L'approche du saut d'exon thérapeutique, destinée à restaurer l'expression d'une protéine totalement ou partiellement fonctionnelle en interférant avec le processus d'épissage, suscite un grand intérêt notamment pour la dystrophie musculaire de Duchenne où la modification du transcrit permettrait d'obtenir une forme modérée de la maladie, la Dystrophie musculaire de Becker. Des oligonucléotides antisens sont utilisés pour masquer les signaux d'épissage de reconnaissance d'un exon par le spliceosome, et induire son excision (ou saut) du transcrit mature. La détermination de la meilleure séquence cible des AONs est une difficulté majeure de cette approche. Pour le gène DMD, nous avons pu établir grâce à des analyses bioinformatiques et statistiques combinées avec des tests fonctionnels utilisant des minigènes rapporteurs d'épissage, que le ciblage de motifs exoniques qui fixent le facteur d'épissage SF2/ASF permettait d'obtenir la meilleure efficacité des AONs. Par ailleurs, nous avons exploré la régulation de l'épissage des pseudoexons dans le gène DMD, et notamment les mécanismes conduisant à l'inclusion de ces séquences introniques dans le transcrit mature en condition pathologique. L'étude de deux cas exceptionnels d'activation de pseudoexons associée à des remaniements introniques rares (double délétion, inversion) élargit le spectre des mutations à l'origine de ces défauts d'épissage, et illustre le rôle encore mal connu des remaniements introniques en pathologie humaine. / Splicing of pre-messenger RNAs to mature transcripts is a crucial step in eukaryotic gene expression. The recognition of exon by the splicing machinery involves different cis-regulatory elements, including the splice site motifs and auxiliary sequences, which can act by stimulating or repressing splicing. The pre-mRNA represents a new therapeutic target for the treatment of genetic diseases. Notably, the exon skipping strategy is currently one of the most promising therapeutic approaches for the Duchenne muscular dystrophy. It intends to restore the expression of a partially functional protein by interfering with the splicing process, and converts the severe DMD phenotype into the moderate form of the disease, Becker muscular Dystrophy (BMD). Antisense oligonucleotides are used to mask the splicing signals involved in exon recognition by the spliceosome to induce its skipping from the mature transcript and restore an open reading frame. The determination of the best target sequence of the AONs is one of the major hurdles to overcome. For the DMD gene, a bioinformatic and statistical analysis combined with minigenes studies allowed us to establish that targeting binding sites for the splicing factor SF2/ASF maximizes the AONs efficiency. In a second part of this work, we investigated the splicing regulation of pseudoexons in the DMD gene, in particular the mechanisms leading to the inclusion of these intronic sequences in the mature transcript in pathological conditions. The study of two exceptional cases of pseudoexons activation associated with rare intronic rearrangements (double-deletions, inversion) expands the spectrum of missplicing mutations, and demonstrates the potential role of pure intronic rearrangements in human pathology.

Les moyens mis en oeuvre chez les animaux domestiques pour lutter contre les maladies dépendent de leur vitesse de propagation, de leur virulence et surtout de leur capacité à passer la barrière d'espèce. Certaines maladies entraînent des pertes économiques importantes chez l'animal(des centaines de milliers de vaches ont été abattues pendant l'épidémie de BSE). Bien plus, dans le cas des zoonoses, maladies transmissibles à l'homme, il convient d'appliquer des mesures de lutte extrêmement onéreuses s'organisant dans les élevages mais aussi à l'échelle des populations. Plusieurs stratégies de prévention et/ou de traitement des maladies infectieuses sont possibles: les traitements chimiques, la vaccination, la désinfection des bâtiments d'élevage et la conduite des troupeaux, le contrôle sanitaire et la traçabilité des produits alimentaires,l'abattage partiel ou total des troupeaux infectés. Ces mesures peuvent être très onéreuses et parfois peu efficaces. Ces maladies peuvent être mono ou multifactorielles. Quand une maladie est en partie régulée par une prédisposition génétique, il est possible de choisir des reproducteurs les plus résistants et diminuer ainsi l'incidence de la maladie. Si cette prédisposition est monogénique, ou pour le moins sous l'influence d'un gène à effet majeur, comme par exemple dans la tremblante ovine,la sélection assistée par gène peut être une stratégie complémentaire aux stratégies déjà existantes. Mais cette sélection ne peut se faire indépendamment de celle des caractères traditionnels de production qui ont permis d'améliorer par exemple la quantité de lait en races laitières ou le nombre et la croissance des animaux en races bouchères. La question qui se pose alors est d'arriver le plus rapidement possible à une incidence quasi nulle de la maladie en créant une population essentiellement porteuse des allèles de résistance au gène sélectionné tout en évitant de perdre le gain génétique acquis sur les caractères traditionnels de production. L'objectif de cette thèse a été de répondre à cette question en proposant une approche paramétrique permettant de modéliser et d'optimiser la stratégie de sélection. Le paramétrage du modèle permet de décrire de manière détaillée les caractéristiques du/des gène(s) de résistance sélectionné(s) et celles du schéma de sélection sur les caractères de production, souvent complexes chez les animaux domestiques. Les sorties du modèle sont l'évolution des distributions des caractères de production (moyennes, variabilités) et des fréquences des allèles de résistance / sensibilité. Afin de prendre en compte le processus de sélection, une modélisation dynamique a été utilisée. Des approches déterministe et stochastique ont été développées et ont été optimisées à l'aide d'un algorithme génétique. La stratégie optimale difficile à promouvoir sur le terrain a été alors considérée comme référence pour la mise en place de stratégies de sélection acceptables et efficaces. Il est possible ainsi d'évaluer différents scénarios concernant par exemple l'organisation du génotypage (pour le gène de résistance) dans la population sélectionnée, le choix des conjoints selon leur génotype, ainsi que la méthode de diffusion des reproducteurs vers les élevages de production. La méthodologie développée lors de ce travail a été appliquée au cas de la tremblante du mouton, un exemple possible parmi d'autres maladies. Différentes stratégies proches de l'optimale ont été combinée à un modèle épidémiologique afin d'analyser l'impact de ces dernières sur l'évolution de la maladie. / The resources to be used in domestic animals to fight against the diseases depend on their diffusion speed, their virulence and especially their ability to pass the species barrier. Some diseases cause significant economic losses in animals (hundreds of thousands of cows were culled during the BSE epidemic). Moreover, in the zoonotic case, diseases transmissible to humans, measures to be implemented are generally extremely expensive both at the farm and population levels. Several strategies for the prevention and / or treatment of infectious diseases are possible : chemical treatments, vaccination, disinfection of livestock buildings and herd management, health monitoring and traceability of food products, or partial or full slaughtering of herds . These measures can be very costly and sometimes ineffective. These diseases can be mono or multifactorial. In the case of genetic diseases (most often single gene such as sheep scrapie), gene-assisted selection can be a complementary strategy to existing strategies. But this selection can not be done independently of the selection of the traditional production traits such as the quantity of milk in dairy breeds or the number and the growth of animals in beef breeds. The question that arises is how to reach as quickly as possible an almost zero incidence of the disease by creating a population displaying a high proportion of the resistant allele at the gene of interest while minimizing the loss of genetic progress on traditional production traits. The objective of this thesis was to answer this question by proposing a parametric approach to model and optimize the selection strategy. The parametrization of the model allowed to describe in detail the characteristics of the gene (s) selected for resistance (s) and those of the breeding scheme on production traits, often complex in domestic animals. The model outputs were the evolution of distributions of production traits (means, variability) and allele frequencies of resistance / sensitivity. To take into account the selection process, a dynamic model was used. Deterministic and stochastic approaches have been developed and have been optimized using a genetic algorithm. The optimal strategy may be difficult to apply. The optimal strategy may be taken as a reference for the development of selection strategies. It is thus possible to evaluate different scenarios such as the genotyping organization (for the resistance gene) in the selected population, the choice of the mating according to their genotype, the method of dissemination of reproducers to the production farms. The methodology developed in this work has been applied to the scrapie case, a possible example among other diseases. Different strategies close to optimal have been combined with an epidemiological model to analyze their impact of the spread of the disease.