L'épigénétique joue un rôle majeur dans le développement érythrocytaire de Plasmodium falciparum, tels que variation antigénique, pathogenèse, différenciation sexuée. Jusqu'à présent, ces éléments n'ont jamais été décrits chez les sporozoïtes. Pour caractériser la régulation épigénétique au niveau des sporozoïtes de P. falciparum, nous avons étudié les principaux régulateurs épigénétiques PfHP1 (P. falciparum hétérochromatine Protein 1) ainsi que PfSET6 et PfSET7 (méthyltransférases histone lysine). J'ai établi une cartographie génomique des marques épigénétiques répressives associées à l'hétérochromatine, et actives associées à l'euchromatine. J'ai identifié un nouveau mécanisme stade-spécifique de contrôle de l'expression génique, qui réprimés plusieurs gènes codant pour des protéines exportées. Ce mécanisme repose sur une expansion d'hétérochromatine. De plus, je démontre qu'un membre de la famille des gènes var, qui code pour le facteur de virulence PfEMP1 des stades sanguins, est exprimé à la surface des sporozoïtes. Cette localisation contraste avec les stades sanguins, où PfEMP1 est transporté à la surface des érythrocytes et participe à cytoadhérence. L'ensemble de ces résultats ouvre de nouvelles questions biologiques: quels sont les facteurs qui régulent la formation d'hétérochromatine chez les sporozoïtes? Quelle est la fonction de PfEMP1 sur la surface d'un sporozoïte? Mes conclusions indiquent un rôle putatif de PfEMP1 lors de la migration des sporozoïtes. En outre, l'expression, à la surface du sporozoïte, d'un antigène polymorphique et spécifique de souche pourrait expliquer la réponse immunitaire souche-spécifique, induite par les sporozoïtes atténués. / Epigenetic mechanisms control key processes during Plasmodium falciparum blood stage development such as antigenic variation, malaria pathogenesis and sexual commitment. However, the epigenetic landscape has not been reported for the sporozoites stage. To characterize epigenetic regulation in sporozoites, we tested the major epigenetic regulators P. falciparum Heterochromatin Protein 1 (PfHP1) and the histone lysine methyltransferases (PfSET6 and PfSET7) in P. falciparum sporozoites. I obtained a reliable genome-wide occupancy data for repressive heterochromatin and active euchromatin marks. Notably, I discovered an unprecedented stage specific mechanism of silencing, which represses several hundreds of genes, encoding parasite surface exported proteins. This is based on an expansion of facultative heterochromatin boundaries in sporozoites. Moreover, I demonstrate that a single member of the polymorphic var gene family, encoding the blood stage virulence factor PfEMP1, is expressed at the surface of sporozoites. This is in contrast to blood stages where PfEMP1 is transported to the erythrocyte surface participating in cytoadhesion. Overall, my findings rise new biological questions including what are the factors that regulate heterochromatin boundaries and what is the function of a virulence-associated surface antigen in sporozoites stage. My findings point to a putative function of this adhesion molecule in sporozoites migration. Moreover, the expression of a highly polymporphic and strain-specific antigen on the surface of sporozoites might provide a molecular explanation for the strain-specific protective immune response induced by attenuated sporozoites.

La voie de signalisation Notch joue un rôle essentiel dans le développement et l'homéostasie de l’épithélium intestinal et présente un potentiel oncogénique dans le cancer du côlon (CRC). L'un de ses gènes cibles, HES1, est un répresseur transcriptionnel de divers gènes, dont KLF4, facteur impliqué dans l'homéostasie intestinale et qui favorise la différenciation des cellules à mucus. De plus, afin d’éviter une activité aberrante de la voie Notch, HES1 exerce une boucle de rétrocontrôle négative sur son propre promoteur. Notre laboratoire s’intéresse à RIP140, un corégulateur transcriptionnel qui réprime l'activité de nombreux facteurs de transcription impliqués dans divers processus physiopathologiques. Dans l'épithélium intestinal, RIP140 inhibe la prolifération cellulaire et régule la différenciation en cellules de Paneth. L'objectif de ce travail a été d'étudier le dialogue entre RIP140 et la voie de signalisation Notch/HES1 ainsi que son impact sur différents paramètres cellulaires en utilisant différentes lignées cellulaires cancéreuses colorectales humaines ainsi que des modèles murins présentant une invalidation du gène Rip140. Pour cela, diverses expériences ont été mises en place en utilisant le gène HES1 comme principal marqueur d’activation de la voie Notch dans les lignées cellulaires de CRC SW620 et HT29. L’expression du gène HES1 a été analysée au niveau protéique, ARNm et transcriptionel en utilisant respectivement les techniques de Western-blot et d’immunofluorescence, de RT-QPCR et de gène rapporteur luciférase. L'activité de la voie Notch a été modulée par l'expression ectopique du domaine intracellulaire de récepteur Notch (NICD) ou en utilisant un inhibiteur de la γ-sécrétase. Le dialogue entre RIP140 et la voie de signalisation Notch est étroitement lié au niveau d'activation de la voie Notch et au niveau d’expression du facteur de transcription HES1. A de faibles niveaux d’activité de la voie Notch, RIP140 est une cible négative de NICD et exerce un effet positif sur la transcription du gène HES1 qui implique, au moins en partie, le complexe RBPJ/NICD. A de niveaux élevés d’activé de la voie Notch, RIP140 devient une cible positive de HES1 et exerce un effet négatif sur la transcription de ce gène en contribuant à la boucle de rétrocontrôle négative de HES1. De manière intéressante, comme le gène HES1, RIP140 a un impact important sur différents paramètres cellulaires. En effet, RIP140, est non seulement capable d’inhiber la prolifération des cellules intestinales, mais est également capable d’augmenter l'expression du gène KLF4 et de favoriser la différenciation en cellules à mucus. Conformément à ce dialogue entre RIP140 et la voie Notch/HES1, nous avons ensuite montré que HES1 et RIP140 inhibent mutuellement leurs effets sur la différenciation et la prolifération cellulaires. Nos données démontrent ainsi l'existence d'une boucle de rétrocontrôle impliquant RIP140 et la voie Notch/HES1 dans les lignées cellulaires de CRC. En effet, le gène RIP140 est à la fois une cible et un régulateur de la voie de signalisation Notch/HES1. Une activité aberrante de la voie Notch bascule la régulation de l'expression du gène HES1 par RIP140 d'un effet positif à un effet négatif via la boucle de rétrocontrôle négative de HES1. De plus, ce lien puissant entre RIP140 et HES1 a un impact sur la différenciation et la prolifération cellulaires. Il sera nécessaire d’analyser le recrutement de RIP140 et HES1 sur différents promoteurs cibles et de valider l'impact de ce dialogue in vivo, en utilisant un modèle de souris que j’ai développé au sein du laboratoire et qui présentent une invalidation conditionnelle du gène Rip140 dans l'épithélium intestinal. / The Notch signaling pathway plays an essential role in intestinal development and homeostasis and has an oncogenic potential in colon cancer (CRC). One of its target genes HES1 is a transcription repressor of a number of genes, including KLF4, which is implicated in intestinal homeostasis and promotes Goblet cell differentiation. In addition, to avoid aberrant activity of the Notch pathway, HES1 exerts a negative feedback loop on its own promoter. Our laboratory is studying RIP140, a transcriptional coregulator which represses the activity of many transcription factors involved in various pathophysiological processes. In the intestinal epithelium, RIP140 inhibits cell proliferation and regulates differentiation towards the Paneth cell lineage. The goal of this work was to investigate the crosstalk between RIP140 and the Notch/HES1 pathway and to study its cellular impacts in human CRC cells. Various experiments have been set up using the HES1 gene as the main output of the Notch pathway in two CRC cell lines (SW620 and HT29). HES1 gene expression has been assessed at the protein, mRNA and transcriptional levels using western-blot/immunofluorescence, RT-QPCR and luciferase reporter assays, respectively. The activity of the Notch pathway has been modulated through ectopic expression of the Notch intracellular domain (NICD) or using a γ-secretase inhibitor. RIP140 crosstalk with the Notch signaling pathway is tightly related to the level of activation of the Notch pathway and to the level of HES1 expression. At low Notch activity, RIP140 is a negative target of NICD and exerts a positive effect on HES1 gene transcription which involves, at least partly, the RBPJ/NICD complex. When the Notch pathway is fully activated, RIP140 becomes a positive target of HES1 and exerts a negative effect on HES1 gene transcription by contributing to the HES1 negative feedback loop. Interestingly, as it is the case for HES1, RIP140 has a strong impact on different cellular parameters. Indeed, we found that RIP140, not only decreases intestinal cell proliferation, but also increases KLF4 gene expression and Goblet cell differentiation. In line with the strong crosstalk between RIP140 and the Notch/HES1 pathway, we then showed that HES1 and RIP140 mutually inhibit their effects on cell differentiation and proliferation. Altogether, our data demonstrated the existence of a feed-back loop involving RIP140 and the Notch/HES1 pathway in CRC cells. Indeed, the RIP140 gene is both a target and a regulator of the Notch/HES1 signaling pathway. A high level of Notch/HES1 activity switches the regulation of HES1 gene expression by RIP140 from a positive to a negative effect through the HES1 negative feedback loop. Moreover, this strong link between RIP140 and HES1 has an impact on cell differentiation and proliferation. It would be however interesting to demonstrate the recruitment of each factor on target promoters and to validate the impact of this strong crosstalk, in vivo, using the newly mouse model that I developed with a conditional knock-out of the Rip140 gene in the intestinal epithelium.

Les tumeurs locales de la prostate sont associées à une évolution lente et une bonne survie, alors que les stades plus avancés révèlent dans 80% des cas des métastases osseuses incurables. La découverte de gènes de fusion issus de remaniements chromosomiques, tel que TMPRSS2:ERG dans plus de 50% des cas, a ouvert une nouvelle voie dans la compréhension du processus de cancérisation de la prostate. La présence de ce gène de fusion peut être associée à un mauvais pronostic dans de nombreuses études cliniques. Cependant, son rôle précis au cours de la cancérisation et de la progression du cancer de la prostate reste à déterminer. Le gène Erg (Ets related gene) code un facteur de transcription dont l’expression est notamment associée à la mise en place du cartilage, et plus largement du squelette. Ceci suggère un rôle potentiel du gène de fusion impliquant ce facteur, et de ses gènes cibles, dans la formation des métastases osseuses du cancer de la prostate.Pour notre étude, nous avons utilisé des lignées de cellules tumorales prostatiques PC3 et PC3c, exprimant stablement le gène de fusion TMPRSS2:ERG et précédemment établies au laboratoire. Dans un premier temps, en utilisant un modèle d’injections intratibiales chez les souris SCID, nous avons démontré que l’expression ectopique de la fusion améliore la capacité d’induction de lésions ostéocondensantes en inhibant l’ostéolyse dans le modèle PC3 ostéolytique, et en stimulant l’ostéoformation dans le modèle PC3c mixte (ostéolytique et ostéocondensant). Cette expression ectopique de la fusion augmente également l’ostéomimétisme dans les deux modèles cellulaires, c’est-à-dire l’acquisition d’un phénotype semblable aux cellules osseuses leur conférant des avantages de survie et de propagation dans la moelle osseuse. En outre, trois nouveaux gènes cibles de TMPRSS2:ERG ont été mis en évidence : ET-1 (Endothelin-1), stimulant la différenciation ostéoblastique et inhibant la résorption osseuse ostéoclastique, ALPL (Alkaline Phosphatase Liver/Bone/Kidney), marqueur de différenciation des ostéoblastes, et COL1A1 (Collagen Type 1 Alpha 1), composant de la matrice osseuse, témoignant d’un rôle du gène de fusion dans la formation de métastases ostéocondensantes du cancer de la prostate.Par ailleurs, deux autres gènes ont été étudiés, codant soit une protéine impliquée dans la stabilisation de structures particulières appelées invadopodes, soit une protéine impliquée dans le métabolisme des lipides. L’ensemble de ces résultats contribue à mieux comprendre les mécanismes de cancérisation et d’évolution métastatique du cancer de la prostate, en particulier l’influence de l’expression du gène de fusion TMPRSS2:ERG dans les métastases osseuses du cancer de la prostate. / Local prostate cancers are associated with slow progression and good survival, while advanced stages reveal incurable bone metastases in 80% of cases. The discovery of fusion genes resulting from chromosomal rearrangements, such as TMPRSS2:ERG in more than 50% of cases, opened a new way in understanding the process of prostate cancer. The presence of this fusion gene may be associated with poor prognosis in many clinical studies. However, its precise role during cancerization and progression of prostate cancer remains to be determined. The Erg gene (Ets related gene) encodes a transcription factor whose expression is associated in particular with embryonic skeleton development. This suggests a potential role of the fusion gene involving this factor, and its target genes, in the formation of prostate cancer bone metastases.In this study, we used prostate cancer cell lines PC3 and PC3c, stably expressing the TMPRSS2:ERG fusion gene and previously established in the laboratory. First, using a model of intratibial injections in SCID mice, we demonstrated that ectopic expression of the fusion enhances the ability to induce osteoblastic lesions by inhibiting osteolysis in the osteolytic PC3 model, and by stimulating osteoformation in the mixed PC3c model (osteolytic and osteoblastic). This ectopic expression of the fusion also increases osteomimicry in both cell models, meaning the acquisition of a bone-cell-like phenotype which gives them advantages of survival and spread in the bone marrow. In addition, three new TMPRSS2:ERG target genes have been described: ET-1 (Endothelin-1), stimulating osteoblastic differentiation and inhibiting osteoclastic bone resorption, ALPL (Alkaline Phosphatase Liver/Bone/Kidney), a marker of the osteoblasts differentiation, and COL1A1 (Collagen Type 1 Alpha 1), a component of the bone matrix, providing novel insights into the role of the fusion gene in the formation of osteoblastic metastases of prostate cancer.In addition, two other genes have been studied, encoding either a protein involved in the stabilization of particular structures called invadopodia, or a protein involved in lipid metabolism.All these results contribute to decipher the mechanisms of cancerization and metastatic progression of prostate cancer, in particular the influence of the expression of TMPRSS2:ERG fusion gene in prostate cancer bone metastases.

L’espèce humaine a développé des fonctions cognitives et des capacités d’interactions sociales très élaborées. La structure la plus importante pour ces fonctions est le néocortex. Une de ses caractéristiques majeures est qu’il a subi une forte expansion et un changement significatif de structure et de fonction durant l’évolution. Les mécanismes moléculaires et cellulaires sous-jacents à cette évolution restent peu connus. Un des éléments clefs semble être la modification de programmes neurodéveloppementaux spécifiques, en particulier au cours de la vie embryonnaire.<p>Durant ce projet, nous avons identifié et caractérisé de nouveaux gènes potentiellement impliqués dans le développement et l’évolution du cortex cérébral humain, par l’analyse du transcriptome du cerveau humain en développement, croisée à des techniques d’analyse computationnelle. Nous avons caractérisé le profil d’expression de « Human Accelerated Region 1 » (HAR1), un gène d’évolution accélérée dans la lignée humaine exprimé dans le cortex cérébral humain en développement. D’autre part, par l’analyse du transcriptome de régions spécifiques du cortex humain en développement, couplée à des analyses computationnelles, nous avons identifié une série de gènes présentant une combinaison unique de profil d’expression et d’évolution spécifiquement humains. Ces gènes pourraient constituer une partie importante des programmes génétiques impliqués dans le développement et l'évolution du cortex dans notre espèce.<p>L’étude approfondie de leurs profils d’expression et de leur fonction pourraient nous permettre de mieux comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires sous-jacents à l’évolution du cortex cérébral humain.<p> / Doctorat en Sciences médicales / info:eu-repo/semantics/nonPublished

L'adaptation d'une bactérie aux changements de son environnement est contrôlée par un réseau de régulation large et complexe, faisant intervenir de nombreux acteurs et modules différents. Dans ce travail, nous avons étudiés un module de régulation spécifique, contrôlant l'adaptation de la bactérie Escherichia coli à un changement de sources de carbone. Dans un milieu contenant du glucose et de l'acétate, la croissance est divisée en deux phases : les bactéries utilisent préférentiellement le glucose et commencent à métaboliser l'acétate qu'après l'épuisement du glucose. En effet, la présence du glucose réprime la transcription d'un gène nécessaire à la croissance sur acétate, le gène acs (codant pour l'acétyl-CoA synthétase). Le mécanisme régulateur fait intervenir le facteur de transcription Crp-AMPc et le système de transfert de phosphate (PTS), qui permet l'import du glucose. Plusieurs modèles décrivent en détail la cascade de réactions moléculaires à l'origine de cette « répression catabolique ». Cependant, certaines de nos observations expérimentales ne sont pas correctement prédites par les modèles actuels. Ces modèles doivent être révisés ou complétés. L'outil majeur que nous employons pour les expériences est la fusion transcriptionnelle : une région promotrice fusionnée en amont d'un gène rapporteur (GFP, luciferase). Avec ces constructions, nous mesurons la dynamique de l'expression génique dans différentes souches (mutants) et différentes conditions environnementales. Les observations à l'échelle de la population sont corroborées par des mesures similaires à l'échelle de la cellule unique. Nous utilisons cette même technologie pour construire de petits systèmes synthétiques qui sondent davantage le phénomène de répression catabolique. Nous avons ainsi créé un interrupteur génétique dont le fonctionnement est contrôlé par le flux glycolytique et nous avons construit un petit système de communication intercellulaire basé sur la molécule AMPc. Enfin, nous proposons une manière originale de mesurer l'état métabolique des cellules en utilisant la dépendance énergétique de la luciferase. / The adaptation of bacteria to changes in their environment is controlled by a large and complex regulatory network involving many different actors and modules. In this work, we have studied a specific module controlling the adaptation of Escherichia coli to a change in carbon sources. In a medium containing glucose and acetate, growth is divided into two phases : the bacteria preferentially use glucose and start to metabolize acetate only after glucose exhaustion. Indeed, the presence of glucose represses the transcription of a gene needed for growth on acetate : the acs gene (coding for acetyl-CoA synthetase). The regulatory mechanism involves the Crp-cAMP regulator and the phosphate transfer system (PTS), which is responsible for glucose import. Several models describe the cascade of molecular reactions responsible for this « catabolite repression ». However, our work shows that many of our experimental observations are incorrectly predicted by current models. These models have to be amended.We use transcriptional fusion, i.e., the fusion of a promoter region upstream of a reporter gene (GFP, luciferase), to measure the dynamics of gene expression in different genetic backgrounds and environmental conditions. Observations at the population level are corroborated by similar measurements at the single cell level. We use this same technology to construct small synthetic systems that probe further aspects of the phenomenon of catabolite repression. We have thus created a genetic toggle switch controlled by the glycolytic flux and we have built an inter-cellular communication system mediated by cAMP. Finally, we propose a novel way to measure the metabolic state of cells by using the energy dependence of the luciferase enzyme.

L'oxyde de graphène (GO) a attiré un intérêt croissant comme vecteur potentiel pour la délivrance de gènes, en particulier pour l’inhibition de gènes spécifiques. Le but principal de ce travail est le développement de nouvelles plateformes complexant de petits ARN interférents (siRNA) et la rationalisation des interactions supramoléculaires entre la surface du GO et l'ARN double brin. L'étude s'est concentrée d'abord sur la synthèse de GO avec divers groupes oxygénés, puis sur la fonctionnalisation covalente du GO avec des amines et des polymères. De plus, j'ai étudié les facteurs qui pourraient affecter la structure double hélice du siRNA. Enfin, la question que je me suis posé: « l’oxyde de graphène peut-il devenir une plateforme appropriée pour la complexation d’acides nucléiques ?» a été résolue à l’aide d’expériences biologiques prouvant la capacité du GO à délivrer du siRNA dans les cellules. / Graphene oxide (GO) has attracted increasing interest as a prominent potential vector in gene delivery and in particular in gene silencing. The main goal of this work is to develop novel platforms to complex small interfering RNA (siRNA) molecules and to rationalize the supramolecular interactions between GO surface and the double strand RNA. The study focused first on the synthesis of GO with various oxygenated groups, subsequently chemically covalently modified with amines and polymers. Moreover, I investigated on the factors that could affect the double helix siRNA structure. Finally, the question of the thesis, « Can graphene oxide be a suitable platform for complexation of nucleic acids? » could be answered from the biological tests proving the ability of graphene derivatives as a carrier of siRNA into the cells.

Le récepteur nucléaire HNF4α est un facteur de transcription qui contrôle l’expression des gènes au niveau de l’épithélium de l’intestin et du côlon. Récemment associé au cancer colorectal, HNF4α pourrait réguler des processus importants pour la survie des cellules cancéreuses. Son rôle dans le cancer colorectal est toutefois controversé, ce qui compromet son utilisation en tant que cible thérapeutique. Par contre, les fonctions de HNF4α au côlon sont accomplies par deux différentes classes d’isoformes (P1 et P2) qui ont été très peu caractérisées jusqu’à présent. Pour clarifier le rôle de HNF4α, nous avons donc évalué les fonctions spécifiques de ses isoformes P1 et P2 dans le cancer colorectal. Nous avons observé que l’expression des isoformes P1 de HNF4α est localisée dans la région supérieure différenciée des cryptes du côlon alors que celle des isoformes P2 dans la région inférieure proliférative. Au cours du cancer colorectal, l’expression des isoformes P1 est inhibée au niveau de leur ARNm par l’activation de la β-caténine alors que l’expression des isoformes P2 est maintenue. Pour vérifier si ces isoformes ont des fonctions spécifiques dans le cancer colorectal, nous avons déterminé par ChIP-seq et RNA-seq leur gènes cibles spécifiques chez les Caco2/15. Les résultats suggèrent que les isoformes de HNF4α régulent des réseaux de gènes distincts permettant aux isoformes P1 d’influencer le métabolisme énergétique et aux isoformes P2 les mécanismes moléculaires associés au développement du cancer colorectal. De plus, plusieurs des partenaires protéiques des isoformes P2 identifiés par GFP-Trap et BioID chez les cellules cancéreuses sont associés aux mécanismes de réparation des dommages à l’ADN suggérant un nouveau rôle pour HNF4α. Notre étude suggère donc que les isoformes P1 et P2 de HNF4α régulent des réseaux de gènes différents dans le cancer colorectal. L’inhibition des isoformes P1 par la β-caténine pourrait permettre d’adapter le métabolisme aux besoins des cellules cancéreuses alors que le maintien de l’expression des isoformes P2, favoriser l’activité des voies oncogéniques et contribuer à la réponse aux dommages à l’ADN.

Les cassures double-brin (CDBs) de l'ADN sont décrites comme étant les lésions de l'ADN les plus délétères puisqu'elles conduisent systématiquement à la mort de la cellule si elles ne sont pas réparées. Les CDBs peuvent être réparées par différents mécanismes et notamment par Non-Homologous End-Joining (NHEJ). Chez les eucaryotes, les protéines centrales de la NHEJ, Ku70 et Ku80, forment un hétérodimère capable de se lier aux extrémités de l'ADN générées par la cassure. Par la suite, Ku70 et Ku80 recrutent de nombreuses autres protéines permettant la modification des extrémités et la réparation de la CDB par ligation. La NHEJ a également été caractérisée chez un nombre limité de bactéries chez qui le mécanisme semble moins complexe que chez les eucaryotes. Chez les bactéries, la NHEJ nécessite seulement deux protéines : un homodimère de Ku, et la protéine multifonctionnelle LigD capable de modifier les extrémités et d'effectuer la ligation. La majorité des études faites sur la NHEJ ont été menées chez des bactéries ne possédant qu'une seule paire des gènes ku/ligD. Cependant, de nombreux autres génomes bactériens possèdent plusieurs copies de ces deux gènes et le fonctionnement de la NHEJ chez ces organismes est inconnu. Le génome de la bactérie symbiotique Sinorhizobium meliloti code quatre Ku putatives (ku1-4) et quatre LigD putatives (ligD1-4). A ce jour, une seule étude a été menée chez ce modèle bactérien montrant que chacun des simples mutants ku est plus sensible que la souche sauvage à un traitement aux rayonnements ionisants, suggérant que chacune des Ku joue un rôle dans la réparation des CDBs par NHEJ. Par l'utilisation de différentes approches in vivo, nous avons mené une caractérisation génétique de la NHEJ chez S. meliloti permettant de clarifier les contributions relatives des gènes ku et ligD dans le mécanisme. Pour la première fois chez une bactérie, nous avons pu obtenir des résultats montrant la présence de plusieurs systèmes indépendants de NHEJ chez S. meliloti, et suggérant l'existence d'un possible hétérodimère de Ku. Nous avons également mis en évidence que la NHEJ est activée dans différentes conditions de stress, telles que le stress thermique et la carence nutritive, et qu'une partie de cette réparation est sous le contrôle du régulateur central de la réponse générale au stress RpoE2. Par ailleurs, nous avons montré que la NHEJ, et plus généralement les mécanismes de réparation des CDBs sont impliqués dans la résistance à la dessiccation chez S. meliloti. Enfin, nous avons généré la première preuve expérimentale d'une implication de la NHEJ dans le transfert horizontal de gène chez les bactéries. Dans leur ensemble, ces travaux enrichissent nos connaissances sur les mécanismes de réparation des CDBs chez les bactéries possédant plusieurs orthologues de Ku et LigD. Ils suggèrent également que la NHEJ pourrait contribuer à l'évolution des génomes, en particulier en condition de stress, non seulement en raison du caractère mutagène de ce type de réparation mais également en participant à l'acquisition d'ADN exogène originaire de bactéries distantes. / DNA double-strand breaks (DSBs) are described as the most deleterious DNA damages as they can lead to cell death if they are not repaired. DSBs can be repaired through several mechanisms, including Non-Homologous End-Joining (NHEJ). In eukaryotes, the main NHEJ proteins, Ku70 and Ku80, bind DNA ends as a heterodimer, and then recruit several additional proteins including enzymes which catalyze the processing and ligation of DNA ends. NHEJ has also been characterized in a limited number of bacteria, where the repair mechanism appears to be less complex than in eukaryotes. Indeed, only two proteins are required: a homodimeric Ku protein, and a multifunctional LigD enzyme able to process and ligate the DNA ends. However, most studies were performed on bacterial species encoding a single pair of ku/ligD. Actually, many bacterial species encode multiple copies of these genes, whose relative contributions to NHEJ in vivo are so far unknown. The Sinorhizobium meliloti genome encodes four putative Ku (ku1-4) and four putative LigD (ligD1-4). To date, a single study conducted on this model bacterium showed that every ku single mutant is more sensitive than the wild type strain to ionizing radiations showing that all ku genes are involved in NHEJ repair of DSBs in this organism. Here, using several in vivo approaches, we performed a comprehensive genetic characterization of NHEJ repair in S. meliloti, and clarified the respective contributions of the various ku and ligD genes. For the first time in bacteria, we obtained results showing the presence of several independent NHEJ systems in S. meliloti and suggesting the existence of a putative heterodimeric form of Ku. We also demonstrated that NHEJ repair is activated under various stress conditions, including heat and nutrient starvation, and that part of this repair is under the control of the general stress response regulator RpoE2. We showed that NHEJ and more generally DSB repair mechanisms are involved in desiccation resistance in S. meliloti. Finally, for the first time in bacteria, we provided evidence that NHEJ not only repairs DSBs, but can also erroneously integrate heterologous DNA molecules into the breaks. Altogether, our data provide new insights into the mechanisms of DSB repair in bacteria which encode multiple Ku and LigD orthologues. It also suggest that NHEJ might contribute to the evolution of bacterial genomes under adverse environmental conditions not only through error-prone repair of DSB by its mutagenesis repair characteristic but also by participating in the acquisition of foreign DNA from distantly related organisms during horizontal gene transfer events.

L'athérosclérose est une maladie inflammatoire chronique déclenchée par l'accumulation de lipides et caractérisée par l'infiltration des cellules immunitaires dans la paroi artérielle. Les études de modèles animaux révèlent des résultats paradoxaux concernant l'effet des cellules B (protecteur ou pro-athérogène). Pour avoir une meilleure compréhension de la physiopathologie de l'athérome humain, nous avons caractérisé les LB résidents et leur production d'immunoglobulines.Treize patients subissant une endartériectomie carotidienne ont été examinés et disséqués pour isoler l'intima et l'adventice. Cette dernière est la couche principale de la domiciliation des cellules B qui constituent des infiltrats diffus ou des agrégats. L'analyse par RT-PCR montre la production locale d'IgA chez tous les patients et d'IgG chez la majorité. L'IgM est plus rarement détectée. De plus, les chaînes légères sont majoritairement d'isotype lambda. L'étude du répertoire des récepteurs d'antigènes montre que l'adventice contient un nombre limité de clones B avec une utilisation récurrente de quelques sous familles de VH. Ces lymphocytes secrètent majoritairement des immunoglobulines hypermutées. Ces anticorps ont été reconstruits et montrent une bonne capacité discriminante en reconnaissant des antigènes tissulaires particuliers. D'autre part, l'analyse des séquences suggère une maturation locale sous la pression des antigènes locaux. Des parties variables d'immunoglobulines différentes (H ou L) codent pour le même CDR3 montrant ainsi une maturation convergente. De plus, l'expression de la cytidine déaminase AID est détectée chez quelques patients, ce qui est compatible avec l'observation d'une commutation de classe dans certains clones B adventitiels. La majorité de cellules B de l'adventice artérielle sont des plasmablastes n'exprimant pas le marqueur CD20 et secrétant des cytokines inflammatoires (IL-6, GM-CSF et TNF-alpha). Les marqueurs clonotypiques CDR3 indiquent que l'adventice et la plaque ont des répertoires différents et qu'une population de cellules B circule entre l'adventice et les ganglions. / Atherosclerosis is a chronic inflammatory disease initiated by lipid accumulation and characterized by immune cells infiltration within arterial walls. Animal models suggest that B cells may have contradictory protective or pro-atherogenic effects. To further understand the pathophysiology of human atheroma, we analyzed Ig production and characterized resident B lymphocytes within vascular lesions.Tissue samples from 13 patients undergoing carotid endarterectomy were examined and dissected to isolate intimal plaques and tunica adventitia. This latter is the main site of B cells homing. These lymphocytes constituted diffuse infiltrates or formed small cell clusters. Functional IgA was present in all adventitias while IgG was detected in the majority. IgM transcripts were less abundant or even absent. Most L chain transcripts were of the lambda type. BCR analysis indicated that individual samples contained each a limited number of B cell clones with a bias for the recurrent utilization of some particular V region sub-families. These lymphocytes produced mainly hypermutated immunoglobulins. Engineered reconstructed antibodies were discriminative as recognizing tissue specific antigens. On the other hand, BCR sequence analysis suggests a local maturation and antigen driven evolution. Both intraclonal diversification and convergence of CDR sequences between different B cell clones were observed. Expression of the cytidine deaminase AID was detected in several arterial wall samples, in keeping with the observation of a local H chain class switch. The majority of resident B lymphocytes are CD20 negative plasmablasts that secrete inflammatory cytokines (IL-6, GM-CSF, and TNF-alpha). CDR3 clonotypic markers revealed that plaque and adventitia repertoires were different and indicated that a population of B cells was circulating between adventitia and draining lymph nodes.

Les Lymphocytes T auxiliaires sont nécessaires pour la production de cytokines adaptées au type d'infection. Différentes sous-populations ont été décrites, parmi lesquelles les Th1, Th2, et Th17, pro-inflammatoires et les iTregs, anti-inflammatoires, exprimant Foxp3. La décision prise par une cellules T naïve de se différentier en l'une de ces populations est étudiée ici.Des découvertes récentes ont montré que les nutriments peuvent modifier la différentiation, mais elles ont négligé la glutamine en dépit de son importance comme source principale d'azote. Dans cette étude, un manque de glutamine induit une expression ectopique de Foxp3 en cours de différentiation en Th1 mais pas en Th2, tout en altérant la différentiation des Th1 et Th17. Cela suggère que, dans des environnements métaboliquement pauvres comme au sein de tumeurs solides, le manque de glutamine pourrait supporter une réponse anti-inflammatoire et donc néfaste.Dans l'optique de comprendre comment la détection de la glutamine influence le réseau de régulation de la différentiation des lymphocytes auxiliaires, une approche de modélisation mathématique a été suivie, consistant d'équation différentielles, et conçue pour capturer les propriétés de cette différentiation. Pour la phase d'apprentissage du modèle, les cinétiques d'expression des principaux facteurs de transcription et cytokines ont été mesurées in vitro en conditions normales, en présence de glutamine. Ces données ont décelé des retards majeurs en terme de transcription, traduction et sécrétion des cytokines, qui à leur tour façonnent l'ordre des évènements qui décident l'issue de la différentiation. Le modèle a reproduit avec succès la dynamique des différentiation 'canoniques', montrant que celles-ci peuvent être expliquées par un réseau de régulation relativement simple. Cependant, le modèle n'a reproduit qu'une partie des propriétés de plasticité des lymphocytes T, et a besoin d'être affiné. Ce n'est qu'alors qu'il pourra être utilisé pour comparer différentes hypothèses mécanistiques sur l'impact de la glutamine sur la différentiation. / T helper cells are required to produce cytokines adapted to the type of infection. Several subsets have been defined, including pro-inflammatory Th1, Th2, Th17; and anti-inflammatory, Foxp3+ iTreg cells. The fate-determining decision of a naive T cell to differentiate into a defined subset was investigated here.Recent findings showed that metabolic constituents impact T cell differentiation, but so far the influence of glutamine on T cell differentiation has been neglected although being the main source of nitrogen. In this study, deprivation of glutamine induced an abnormal expression of Foxp3 under Th1 but not under Th2 condition, while impairing Th1 and Th17 differentiation. Thus, in poor metabolic micro-environments like solid tumours, a lack of glutamine would initiate a detrimental anti-inflammatory response.A mathematical modelling approach using Ordinary Differential Equations was chosen to capture the properties of T cell differentiation, first in normal conditions with glutamine. In order to train the model, kinetics of the master transcription factors and cytokines expression were measured under different T cell differentiation polarizing conditions. The in vitro data revealed major delays in transcription, translation and secretion of cytokines, which shaped the order of fate decision events. The model could successfully reproduce the dynamics of differentiation, confirming that the 'canonical' differentiation in vitro can be explained by a simple regulatory network. However, it only partially reproduced the plastic behaviour of T cells. The mathematical model will be utilized to compare different mechanistic hypotheses linking glutamine sensing to differentiation.