Phakopsora pachyrhizi Syd.& P.Syd. est le plus important fléau du soja (Glycine max (L.) Merrill). Introduit au Brésil dans les années 2000, ce champignon s’est rapidement répandu sur les deux continents Américains. Seule l’utilisation de fongicides associée à des pratiques culturales strictes permet de maintenir le niveau de production. L’utilisation répétitive de ces fongicides ainsi que la plasticité génétique de ce champignon ont rapidement entraîné une diminution d’efficacité de certaines molécules. Par ailleurs, la plupart des résistances verticales identifiées dans les ressources naturelles du soja restent inefficaces contre certains isolats du champignon. La compréhension des mécanismes de l’immunité des plantes permet de proposer des solutions biotechnologiques pour le contrôle des maladies. L’utilisation antérieure du système barnase/barstar induisant une mort cellulaire artificielle, a permis de générer des pommes de terre résistantes à Phytophtora infestans. Cette technologie est basée sur l’expression de la barnase une ribonucléase toxique pour les cellules, et la barstar un inhibiteur de la barnase. Il a été proposé d’évaluer ce système pour le contrôle de P. pachyrhizi. Le point critique de cette approche est de trouver le bon rapport de l’expression des gènes barnase/barstar. Pour ce faire la barnase sera placée sous le contrôle d’un promoteur induit par le pathogène, permettant une régulation spatiotemporelle. La recherche de tels promoteurs a été effectuée en utilisant des données transcriptomiques et bibliographiques. Des sojas stables exprimant les différentes fusions promoteur:GFP ont été créées afin d’étudier l’ expression spatiotemporelle de ces promoteurs en présence du champignon. Les promoteurs pGmCHIT1 (de G. max) et pgst1 (de Solanum tuberosum) contrôlant respectivement l’expression d’une chitinase et d’une glutathione-S-transférase ont été identifiés comme induits par le pathogène. L’impact de différents stress sur ces deux promoteurs a été évalué. Les constructions génétiques « barnase/barstar » comprenant les différentes combinaisons des promoteurs ont été générées. Nicotiana benthamiana a été utilisé pour exprimer transitoirement les construits et évaluer leur phytotoxicité en absence du pathogène. Un seul construit contenant le promoteur gst1 s’est avéré non phytotoxique. Il a été transféré avec succès dans le soja. Ces sojas n’ont pas montré de gain de tolérance à la rouille. Une proposition d’amélioration du système barnase/barstar est discutée afin de mieux cerner les possibilités et les limites de ce système pour le contrôle de la rouille du soja / Phakopsora pachyrhizi Syd.& P.Syd, the fungus responsible for Asian soybean rust, is the most devastating soybean (Glycine max (L.) Merrill) pathogen. First observed in the 2000s in Latin America, the pathogen has spread throughout the Americas. The control of this pathogen depends on the use of fungicides and strict agricultural practices. The repetitive use of the 3 classes of fungicides and the genome plasticity of the pathogen have led to a decreased efficacy of certain molecules. Although vertical resistance genes have been mapped in the soybean germplasm, most of them are not effective against all Asian soybean rust isolates. A deeper understanding of plant immunity facilitates the development of biotechnological approaches for plant disease control. Artificial cell death was previously developed to control Phytophthora infestans development in potato. The technology was based on a barnase ribonuclease that is highly toxic to the plant cell and that consequently needed to be expressed only in the presence of the pathogen. The lethal expression of barnase was counterbalanced by barstar, a highly specific inhibitor of barnase. We propose to evaluate this technology in soybean to control P. pachyrhizi. The key objective is the modulation of the ratio of barnase/barstar based on the identification of an adequate inducible promoter to control the expression of barnase. The previous literature and transcriptomic data were used to identify candidate promoters for barnase expression. Stable transgenic soybean expressing the different promoter:GFP fusions were generated to test the spatiotemporal activity of the promoters in the presence of the pathogen. pGmCHIT1 (from G. max) and pgst1 (from Solanum tuberosum) promoters controlling a chitinase and a glutathione-Stransferase, respectively, were identified as induced by soybean rust. The impacts of different stresses on these promoters were evaluated. Molecular constructs with different promoters driving the barnase and barstar gene combination were generated. Nicotiana benthamiana was used to evaluate construct toxicity in the absence of the pathogen. One single construct containing the promoter pgst1 was shown to be non-phytotoxic. This construct was successfully introduced in soybean plants. The generated soybeans were challenged with rust, but no protection was observed. Based on these results, we discuss how to improve the barnase/barstar system to control soybean rust

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Die Zapfenphotorezeptoren (ZPR) sind verantwortlich für das Scharf- und Farbensehen. Ein totaler Funktionsverlust der ZPR, welcher beim Menschen zur Achromatopsie führt, hat eine Degeneration der ZPR zur Folge. Die pathologischen Vorgänge, die zur Degeneration der ZPR führen sind noch nicht restlos entschlüsselt worden. Zur Analyse der ZPR-Degeneration werden Tiermodelle genutzt, wobei bisher nur wenige Tiermodelle vorhanden sind. Ziel dieser Arbeit ist die Untersuchung und Charakterisierung von Mausmodellen, die Mutationen in funktionell bedeutsamen Genen der ZPR tragen. Hierbei handelt es sich entweder um ein weiteres potentielles Kandidatengen für ZPR-Dystrophien, das SLC24A2 Gen, oder um das PDE6C Gen, welches als ursächlich für Achromatopsie identifiziert wurde. Die Tiere der verschiedenen Mauslinien wurden anhand ihrer Ohrkennung genotypisiert und für die verschiedenen molekularbiologischen Verfahren euthanasiert. Von den Augen wurde entweder das gesamte Auge, das eye cup, oder die Netzhaut weiterverarbeitet. Es wurde eine Methode zur Anrei¬cherung der ZPR mit fluorescence activated cell sorting (FACS) erarbeitet. Des Weiteren kamen Techniken auf der DNA-, RNA- und Protein- Ebene (PCR, RT-PCR, Klonieren, Western blot) sowie histologische und immunhistologische Techniken zur Anwendung. Die Tiere wurden in vivo mithilfe von bildgebenden Verfahren (Scanning Laser Ophthalmology (SLO)) untersucht und funktionell durch die Elektroretinographie (ERG) charakterisiert. Für diese Studie wurde die Cone-GFP (die grünes fluoreszierendes Protein in den ZPR produziert) Mauslinie zur Entwicklung der ZPR-Anreicherung eingesetzt und analysiert. Die slc24a2ENU-Maus¬mutante wurde extern hergestellt, wobei durch eine ENU-induzierte Mutagenese eine Punktmutation im slc24a2-Gen, welches für den NCKX2 Austauscher kodiert, an Position 1722 (c.1722g>t) gene¬riert wurde. Als weiteres Mausmodell wird die spontan aufgetretene Mausmutante cpfl1 (cone photo¬receptor function loss 1) untersucht, die zwei unterschiedliche Mutationen im pde6c-Gen besitzt. Durch Kreuzen dieser Mauslinien untereinander und mit der Trα -/- Mauslinie (knock-out Mutation der Stäbchen Transducin α-Untereinheit) wurden die Doppelmutanten Linien slc24a2ENUxCone-GFP, slc24a2ENUxTrα-/- und cpfl1xCone-GFP hergestellt und untersucht. Bei Cone-GFP Mäusen konnten ZPR mittels FACS angereichert und gezielt untersucht werden. In der angereicherten ZPR-Population wurde bei RT-PCR Analysen zum einen nur eine Spleißvariante des NCKX2-Austauschers detektiert, während bei RT-PCR Analysen von ganzen Augen mehrere Spleißvarianten des NCKX2-Austauschers gefunden wurden. Zum Zweiten wurden weitere Mitglie¬der der NCKX-Familie in der angereicherten ZPR-Population (NCKX-1, 4) detektiert. Bei der slc24a2ENU-Mausmutante konnte die Mutation im slc24a2-Gen sowohl auf DNA- als auch auf RNA- Ebene nachgewiesen werden, jedoch nicht auf Proteinebene. Sowohl bei morphologischen (SLO und Histologie) als auch funktionellen (ERG) Untersuchungen wurden keine Unterschiede zwischen Wildtyp und Mutante in der Retina erkannt. Mithilfe der SLO wurde bei allen Tieren eine verlängerte Persistenz der arteria hyaloidea beobachtet. Das ERG war bei der slc24a2xTrα-/- Dop¬pelmutanten gegenüber der reinen Trα-/- ohne Veränderung. Bei den slc24a2ENUxCone GFP Mäusen und den reinen Cone-GFP Mäusen konnte im Alter von einem Jahr keine Amplitude mehr im ERG gemessen werden. Bei der SLO (bei beiden Doppelmutanten) wurden bei einigen Mäusen autofluo¬reszierende Punkte, so genannte „AF-dots“ beobachtet. Eine Ursache hierfür konnte nicht erbracht werden. Vergleichende genomische DNA-Untersuchungen von Intron 4 des pde6c Gens zwischen der cpfl1-Maus und dem Wildtyp C57Bl/6 zeigten bei der cpfl1-Maus eine im Vorfeld bereits auf RNA-Ebene beschriebene 116bp Insertion als Anteil einer 1522bp großen genomischen Insertion ist. Zusätzlich wurde eine 1bp Deletion im Exon 7 des pde6c Gens bei der cpfl1-Maus detektiert (c.1042delT). Beide Mutationen bedingen eine Verschiebung des Leserasters (frame shift), das wiederum zu einem verfrühten Stopcodon führt (p.E289fsX297 und p.L348fsX362). Vergleichende RT-PCR Untersu¬chungen der pde6c Transkripte zwischen der cpfl1-Maus mit ihrem Parentalstamm BALB/c erbrach¬ten, dass beide die 116bp Insertion tragen. Bei der ERG Untersuchung der cpfl1-Maus (im Alter von drei und sechs Wochen) konnte keine ZPR-Antwort registriert werden. Bei einer vergleichenden SLO-Verlaufsstudie (3., 4., 6. und 8. Lebenswoche) zwischen der Cone-GFP und der Doppelmutanten cpfl1xCone-GFP Maus zeigte sich, dass die Anzahl der ZPR zu Beginn der Studie gleich sind, im weiteren Verlauf bei der Doppelmutante immer stärker abnehmen und mit 8 Wochen nur noch im ventralen Bereich vorhanden sind. Es konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die Cone-GFP Maus ein potentiell sehr wichtiges Mausmodell werden kann, um weiterführende Grund-lagenforschung an ZPR zu ermöglichen. Zum einen können ZPR durch FACS angereichert werden und zum anderen ist eine eindeutige und einfache Darstellung der ZPR in vivo durch die SLO-Technik möglich. Jedoch ist es wichtig, den Untersuchungszeitpunkt innerhalb der ersten 2 Monate anzusetzen, da die ZPR der Cone-GFP Maus danach fortschreitend degenerieren. Aufgrund der RT-PCR Untersuchung der NCKX-Familie in der angereicherten ZPR-Population der Cone-GFP Maus konnten weitere Mitglieder der NCKX Austauscher Familie in den ZPR identifiziert werden, wodurch die Aussage, dass der NCKX2-Austauscher die einzige Möglichkeit darstellt, um Ca2+-Ionen aus dem Außensegment der ZPR zu schleusen, relativiert werden muss. Die Slc24a2ENU-Mausmutante zeigt keinen offensichtlichen degenerativen retinalen Phänotyp. Die einzige Besonderheit stellt die sporadisch auftretende persistierende Arteria hyaloidea dar. Der bei einigen doppelmutanten Tieren auftretende retinale Phänotyp, der „AF-dots“-Phänotyp, ist möglich¬erweise auf den Stammhintergrund (C3H) zurückzuführen. Weitere Untersuchungen sind zur Klärung dieser Frage notwendig. Die cpfl1-Maus ist das erste Modell für Achromatopsie, bei dem die Pathologie durch Mutationen im pde6c-Gen ausgelöst wird. Das cpfl1-Allel besitzt zwei unterschiedliche Mutationen, die beide zu einem verfrühten Abbruch der Proteinsynthese führen. Durch RNA-Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass die cpfl1-Maus sich nur in der 1 bp Deletion von dem Parentalstamm BALB/c unterscheidet. Jedoch scheinen beide Mutationen einen Anteil an der Herausbildung des Phänotyps der cpfl1-Maus zu haben. Im Rahmen der vergleichenden Verlaufsstudie mit Doppelmutanten cpfl1xCone-GFP wurde als pathologischer Vorgang eine Degeneration und keine Aplasie der ZPR nachgewiesen, da im Alter von 3 Wochen noch eine normale Anzahl an ZPR vorhanden ist.

Made available in DSpace on 2015-04-20T12:31:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 jonathan.pdf: 3096267 bytes, checksum: 8d8efe41b3d0eaa2b1ee28e28f9ebb5e (MD5) Previous issue date: 2012-09-21 / Plasmids are extrachromosomal genetic elements that generally are not essential for survival of the bacteria , however , provide unique advantages ( as resistance to antibiotics) for the organism. For genetic engineering, naturally occurring plasmids have been modified extensively for the production of vectors with the desired characteristics. Promoters are elements of a vector which may have a profound effect on the strength and duration of transcription and, consequently, the protein yield . The mRNA synthesis starts when RNA polymerase binds the promoter sequence adjacent to the target gene. Sigma factors are proteins that regulate transcription in bacteria , and they can be activated in different environmental conditions . The sigma factor ( S ) is seen as a master regulator of the general stress response , encoded from the gene RpoS in late stationary phase . This factor is the primary regulator of the genes stationary phase . Prosecutors based metabolic regulators of stationary phase represent a class of promoters metabolically controlled and can be exploited for the design of expression vectors . This project were developed three expression cassettes for construction of expression vectors , which have promoters with affinity for sigma factor S , in order to evaluate the expression profile of recombinant proteins in Escherichia coli . To evaluate the strength of promoters and expression profiling , we used the green fluorescent protein ( GFP ) as a reporter gene . The three vectors constructed, which were named p26 , p53 and PFS expressed GFP in the correct formation of the fluorophore , and the vector p26 and p53 showed overexpression of the recombinant protein when compared to the vector pGS21a . Furthermore , it was observed that the vectors constructed here are contributing to the reduction in the rate of growth and filamentation of E. coli. This gives the morphological plasticity bacterium higher storage capacity of the recombinant protein expressed . / Plasmídeos são elementos genéticos extracromossomais, que no geral não são essenciais para a sobrevivência da bactéria, entretanto, conferem vantagens peculiares (como resistência à antibióticos) para o organismo. Para engenharia genética, plasmídeos de ocorrência natural têm sido modificados extensivamente para produção de vetores com as características desejadas. Promotores são elementos de um vetor que podem ter um profundo efeito na força e duração da transcrição, e consequentemente, no rendimento proteico. A síntese de mRNA inicia quando a RNA polimerase se liga a sequência promotora , adjacente ao gene alvo. Fatores sigma são proteínas que regulam a transcrição em bactérias, e os mesmos podem ser ativados em diferentes condições ambientais. O fator sigma (S) é visto como um regulador mestre de resposta ao estresse geral, codificado a partir do gene RpoS na fase estacionária tardia. Este fator é o regulador primário dos genes de fase estacionária. Promotores baseados em reguladores metabólicos de fase estacionária representam uma classe de promotores controlados metabolicamente e que podem ser explorados para o design de vetores de expressão. Neste projeto foram desenvolvidos três cassetes de expressão para a construção de vetores de expressão, os quais possuem promotores com afinidade pelo fator sigma S, com o objetivo de avaliar o perfil de expressão de proteínas recombinantes em Escherichia coli. Para a avaliação da força dos promotores e do perfil de expressão, utilizou-se a proteína verde fluorescente (GFP) como gene repórter. Os três vetores construídos, os quais foram denominados de p26, p53 e pFS expressaram a GFP com a correta formação do fluoróforo, sendo que os vetores p26 e p53 apresentaram superexpressão da proteína recombinante, quando comparados ao vetor pGS21a. Ademais, observou-se que os vetores aqui construídos estão contribuindo para a redução da taxa de crescimento e filamentação da E. coli. Esta plasticidade morfológica confere à bactéria maior capacidade de armazenamento da proteína recombinante expressa.

Catharanthus roseus est une plante tropicale de la famille des Apocynacées d’intérêt thérapeutique en raison de sa capacité à synthétiser des alcaloïdes indoliques monoterpéniques (AIM) utilisés en chimiothérapie anticancéreuse. La teneur en AIM in planta est très faible notamment en raison d’une haute compartimentalisation cellulaire et subcellulaire de la voie de biosynthèse. Si la compartimentalisation cellulaire était bien caractérisée, très peu de données de localisation subcellulaire in situ étaient disponibles au début de cette thèse. Une connaissance fine de cette compartimentalisation est cependant nécessaire pour identifier les transports inter-compartiment de métabolites intermédiaires, limitant potentiellement le flux métabolique, afin d’améliorer ensuite le rendement de biosynthèse des AIM par ingénierie métabolique. Dans ce contexte nous avons réalisé une étude exhaustive de la localisation subcellulaire des enzymes de cette voie par imagerie GFP dans des cellules de C. roseus transformées par biolistique permettant d’établir un nouveau modèle intégré d’organisation cellulaire et subcellulaire de la biosynthèse des AIM. / Catharanthus roseus is a tropical plant from the Apocynaceae family with a great therapeutic value due to its ability to synthesize monoterpene indole alkaloids (MIA) used in cancer treatment. The yields of these molecules in planta are very low due to a very high level of compartmentation of the biosynthetic pathway at both cellular and subcellular levels. While the cellular compartmentation was widely characterized, very few in situ subcellular localization data were available at the beginning of this PhD. An accurate knowledge of this compartmentation is necessary to identify intermediate metabolites transport events from one compartment to another one, in order to increase the MIA biosynthesis yield by metabolic engineering approaches. In this context we have proceed to the exhaustive study of the subcellular localization of these enzymes by in vivo GFP imaging in C. roseus cells transformed by biolistic. Potential interprotein interactions of these enzymes have also been studied by BiFC. Altogether, our results enabled us to draw an integrated model of the cellular and subcellular organization of MIA biosynthesis in situ.

A divisão celular nas bactérias requer a formação do divisomo, um complexo protéico que tem como o primeira etapa a polimerização da proteína FtsZ, seguida pela associação de 15 outras proteínas conhecidas. Os mecanismos envolvidos na regulação espacial do divisomo são bem caracterizados, mas o controle temporal da divisão celular em relação a outros eventos do ciclo, como a replicação do cromossomo, segue controversa. Neste trabalho, aplicamos a metodologia de microscopia de série temporal para estudar duas questões fundamentais do processo de divisão: a montagem do complexo que executa a divisão e a possibilidade da oscilação periódica na expressão de um ou mais genes envolvidos em divisão possa participar do controle temporal da montagem do divisomo. Para investigar se há oscilação da expressão gênica, construímos inicialmente variantes instáveis GFP através da adição de sequências peptídicas C-terminais que encaminham para a degradação em B. subtilis e utilizamos estes repórteres para criar fusões transcricionais sob o controle de promotores de genes centrais do processo de divisão. Depois de otimizar as condições de microscopia de série temporal com fusões transcricionais usando a variante instável GFPAISV, observamos que a autofluorescência de B. subtilis interferia nas nossas quantificações. Como forma de contornar a autofluorescência, construímos então fusões transcricionais com duas variantes de YFP (proteína fluorescente amarela) e optamos por trabalhar com Ypet-AISV. A análise de filmes de células individuais, tanto com fusões a GFPAISV como a Ypet-AISV, indicou que apenas o promotor do operon ftsL-pbpB apresentava um padrão de oscilação significativamente diferente de um promotor artificial usado como controle negativo. Esta hipótese, no entanto, não foi confirmada por medidas estáticas de populações de células nas quais correlacionamos intensidade de fluorescência com posição no ciclo celular. Portanto, nossos dados não foram capazes de evidenciar flutuações na expressão dos genes ftsL-pbpB, minCD, ftsZ, ftsA e zapA ao longo do ciclo celular. Para estudar a cinética de montagem divisomo foram realizados experimentos de microscopia de série temporal de FtsZ-mCherry e Pbp2B-GFP, onde observamos que a associação de Pbp2B ao divisomo ocorre 3 minutos após a formação do anel de FtsZ em meio rico e 4 minutos em meio mínimo. Também realizamos experimentos de microscopia de série temporal com uma cepa contendo FtsZ-YFP e DivIVA-CFP, determinando que DivIVA é incorporado ao divisomo 16 minutos após a formação do anel de FtsZ em meio rico e 20 minutos em meio mínimo. Estes dados confirmam que a montagem do divisomo ocorre em três etapas, e não duas, como anteriormente proposto. / Cell division in bacteria requires the formation of the divisome, a protein complex that has as the first step polymerization of FtsZ, followed by the assembly of 15 other known proteins. The mechanisms that underlie spatial regulation of divisome assembly have been largely elucidated, but the temporal control that ties the timing of cell division to other cell cycle events, such as chromosomal replication, remains surrounded by controversy. In this work, we use time-lapse microscopy to address two issues in B. subtilis cell division: the timing of divisome assembly, and the possibility that a periodic oscillation in expression of one or more genes essential for divisome assembly may play a role in defining the timing of cell division. To study the possibility of oscilation in gene expression, we have first built unstable variants of GFP by adding to its C-terminus peptide sequences that target the protein for degradation and used those variants to build transcriptional fusions to access the promoter activity of core cell division genes. After optimizing time-lapse conditions with transcriptional fusions to cell divison genes with the unstable GFPAISV, we observed that B. subtilis autofluorescence was an issue to our quantifications. To improve our signal-to-noise ratio, we built transcriptional fusions with two variants of YFP (Yellow Fluorescent Protein), and decided to work with Ypet. In our single-cell analysis for GFPAISV and for Ypet-AISV, only the ftsL operon promoter presented an oscilating pattern different from our negative control. This was not confirmed, however, when we attempted to correlate fluorescence signal with cell cycle position in static single-cell measurements. Thus, we conclude that that there are no fluctuations in ftsL, pbpB, minCD, ftsZ, ftsA or zapA gene expression throughout the cell cycle. To study divisome assembly we performed time-lapse microscopy of FtsZ-mCherry and Pbp2B-GFP, and determined that the association of Pbp2B occurs 3 minutes after FtsZ polymerization in rich medium and 4 minutes in minimal medium. We also performed time-lapse microscopy with FtsZ-YFP and DivIVA-CFP, determining that DivIVA is incorporated to the divisome in 16 minutes after FtsZ polymerization in rich medium and 20 minutes in minimal medium. This data confirms the assembly of the divisome in three steps rather than two, as previously proposed.

No presente estudo, a diversidade bacteriana endofítica fixadora de nitrogênio foi pesquisada utilizando métodos microbiológicos e moleculares. Isolaram-se microrganismos de raiz, caule e folha de cana-de-açúcar. Análises por seqüenciamento do 16S rDNA identificaram 150 endófitos. No total, foram identificados 18 gêneros. Destes, apenas 4 estavam presentes em cana-de-açúcar submetida aos 3 tratamentos. A maior diversidade de gêneros foi encontrada em cana sob adubação orgânica: 10 gêneros, em cana sob adubação inorgânica foram 11 gêneros e 8 em cana sem adubação. A maior parte dos gêneros pertence à família Enterobacteriaceae, como Klebsiella, Pantoea e Enterobacter. A enzima endoglicanase foi produzida por 82% dos isolados de cana sob adubação orgânica, (54%) inorgânica e (48%) sem adubação. Quanto à atividade de pectinase: 42%, 60% e 36% foram apresentadas por isolados de cana orgânica, inorgânica e sem adubação, respectivamente. A capacidade de solubilizar fosfatos inorgânicos foi detectada em 76,6% dos isolados, sendo a maior capacidade de solubilização de fosfatos encontrada em bactérias isoladas de cana-de-açúcar sob adubação orgânica (71%), de cana submetida a adubação convencional (78%) e sem adubação (88%). Foram realizados estudos de colonização em plântulas de cana-de-açúcar com 4 endofitos geneticamente modificados (EGMs) capazes de expressar os genes gfp e dsred. A avaliação da colonização na cana pela microscopia de fluorescência, mostrou que os (EGMs) gfp e dsred colonizaram as raízes e caules das plantas inoculadas, sem causar qualquer sintoma de doença. / In the present study, endophytic bacterial diversity has been searched using both microbiologic and molecular methods. Microorganisms were isolated from sugarcane root, shoot and leaf. 150 isolates were identified by 16S rDNA sequencing. 18 genera were found and only 4 were present in sugarcane submitted to the three treatments. The greatest genera diversity was found in sugarcane submited to organic fertlization: 10 genera in sugarcane submitted to inorganic fertilization were found 11 genera and 8 genera in sugarcane without fertilization. Great part of the found genera belongs to the Enterobacteriaceae family: Klebsiella, Pantoea and Enterobacter. Some physiological characteristics were determined in the isolates. Endoglucanase was produced by 82% of the isolates from sugarcane submitted to organic fertilization. Lower activities were found in bacteria isolated from inorganic fertilization and no fertilization, respectively 54% and 48%. As far as pectinase activity is concerned, a percentage of 42%, 60% and 36% was presented by the isolates from organic fertilization, inorganic fertilization and no fertilization, respectively. The hability of phosphate solubilization was detected in 76.6% of the isolates. In sugarcane under organic fertilization a percentage of 71% was found, in bacteria from inorganic fertilization, 78%, and without fertilization, 88%. Plant colonization was determined using sugarcane plantlets inoculated with four genetically modified bactéria (GMEs), able to express the genes gfp and dsred. The colonization was evaluated by fluorescence microscopy, which showed that the endophytic bacteria expressing gfp and dsred genes had invaded roots and shoots from inoculated plants, without causing any disease symptom.

Le traitement et la gestion de la douleur sont depuis toujours une priorité pour le corps médical. Malgré leur importance pour la qualité de vie, les analgésiques couramment utilisés possèdent un ratio bénéfice/risque faible. La recherche de nouveaux concepts thérapeutiques pour lutter contre la douleur est donc une priorité. Afin de répondre à ce besoin, il faut d'abord comprendre les mécanismes de la perception de la douleur ainsi que, plus globalement, ceux permettant de percevoir son environnement. Dans ce contexte, de nombreuses études ont mis en évidence l'implication du canal calcique à bas seuil Cav3.2 dans les voies de la transmission de l'information douloureuse. Il représente donc une cible de choix pour le traitement de la douleur mais l'identité des neurones exprimant ces canaux ainsi que la fonction de Cav3.2 dans la physiologie des neurones sensoriels étaient jusqu'à présent inconnues. Au cours de cette thèse nous avons dans un premier temps décrit un nouvel inhibiteur des canaux calciques à bas seuil : le TTA-A2. Nous avons ainsi démontré que le TTA-A2 est un inhibiteur spécifique des canaux Cav3.1, Cav3.2, et Cav3.3. Il permet de diminuer l'excitabilité des neurones sensoriels exprimant Cav3.2, ce qui provoque une analgésie sur des animaux sains et pathologiques. Dans un deuxième temps nous nous sommes servis de ce nouvel outil en parallèle d'un nouveau modèle murin possédant une étiquette fluorescente (Knock in GFP) sur le canal Cav3.2 pour explorer la localisation et la fonction de Cav3.2 dans les neurones sensoriels. Nous avons ainsi découvert que Cav3.2 est exprimé dans des mécanorécepteurs à bas seuil impliqués dans la perception des stimuli mécaniques et thermiques nocifs ou non-nocifs. Le canal en lui-même se trouve aux endroits clés de la genèse et de la propagation du message nerveux périphérique, et module le seuil et la vitesse de conduction des potentiels d'action. Replacé dans le contexte de la bibliographie, l'ensemble de nos résultats montre que Cav3.2 permet de donner la modalité à bas seuil aux neurones l'exprimant. / Pain management and treatment have always been a priority for life quality. Despite this fact, analgesics commonly used present a bad benefice/risk ratio. Discovery of new therapeutic concepts to fight pain is highly required. To complete this task, we first need to better understand pain perception mechanisms, and more globally, mechanisms involved in the perception of our environment. In this context, numerous studies have shown that low threshold calcium channels Cav3.2 are involved in pain information transmission. Thus, it represents a good target for the treatment of pain. However, neuronal identity of Cav3.2-expressing sensory neurons and Cav3.2 functions in neuronal physiology are unknown. During this PhD we first described a new low voltage activated channel antagonist named TTA-A2. We demonstrated that TTA-A2 is a powerful nanomolar specific agonist of Cav3.1, Cav3.2 and Cav3.3. This molecule is able to reduce excitability in sensory neurons expressing Cav3.2, and is able to generate a strong analgesic effect on naive and pathologic animals. In the other part of this PhD, we used this new tool combined to a new transgenic mouse that expressed Cav3.2 tagged with a fluorescent protein (Knock-in GFP). With these new tools we discovered that Cav3.2 is expressed in low threshold mechanoreceptors involved in detection of painful and non painful mechanical and thermal stimuli. Cav3.2 itself is expressed at key localisations that allow action potential generation and propagation, and modulate threshold and speed conduction of action potential. Taken together, these results show that Cav3.2 gives the “low threshold” modality to neurons.

La cryptogéine est un éliciteur protéique des réactions de défense chez le tabac sécrété par l’oomycète Phytophthora cryptogea. Son interaction avec un récepteur encore non identifié de la membrane plasmique déclenche une cascade d’événements de signalisation qui conduisent à une reprogrammation génique, à la diffusion d’un signal conférant une résistance systémique et, ultimement, à la mort des cellules directement exposées à cet éliciteur. Notre équipe avait précédemment mis en évidence une stimulation de la formation de vésicules d’endocytose quelques minutes après l’élicitation. Des études de microscopie électronique et d’inhibition pharmacologique avaient permis d’émettre l’hypothèse que cette endocytose était dépendante de la clathrine (CME). Ce processus essentiel des cellules eucaryotes concoure au maintien de l’homéostasie du plasmalemme. L’endocytose joue également deux rôles aux effets antagonistes lorsqu’elle est induite par un stimulus de l’environnement. Elle permet d’une part la production d’endosomes de signalisation qui vont délivrer le stimulus au cœur de la cellule, et assure d’autre part la désensibilisation de la membrane afin de préparer la cellule à percevoir d’autres stimuli.Mon travail de thèse avait pour objectif de confirmer que l’endocytose induite après traitement de cellules de tabac par la cryptogéine est bien dépendante de la clathrine et d’essayer de déterminer si elle est impliquée, directement ou indirectement, dans la transduction du signal d’élicitation et dans le développement des réactions de défense. Afin de visualiser in vivo la dynamique endocytaire, j’ai établi une suspension cellulaire de tabac exprimant une chaine légère de clathrine fusionnée à la GFP. La caractérisation de cette suspension par des approches biochimiques et par microscopie a confirmé l’induction d’une endocytose dépendante de la clathrine suite à l’élicitation par la cryptogéine. J’ai également développé une stratégie d’inhibition de la CME faisant appel à l’expression d’une version tronquée de la CHC, appelée hub, dont la propriété est d’empêcher la formation du manteau de clathrine à la membrane plasmique. La caractérisation d’une lignée cellulaire co-exprimant le marqueur d’endocytose GFP-CLC et le hub a montré qu’il était possible d’empêcher l’endocytose à clathrine induite par la cryptogéine sans altérer de façon significative l’endocytose constitutive. L’utilisation de cette stratégie d’inhibition sélective a ainsi démontré que des événements précoces induits à la membrane plasmique par la cryptogéine, telles l’alcalinisation du milieu extracellulaire et la production de formes actives de l’oxygène, ne sont pas dépendants de la CME. L’impact de l’invalidation de l’endocytose induite sur le déclenchement des réponses tardives a été étudié sur des cellules en suspension et sur des plants de tabac. Mes travaux ont révélé que l’endocytose contribuait de façon réduite à la reprogrammation du transcriptome et au déclenchement de la mort cellulaire programmée. Des travaux préliminaires effectués sur des plantes exposées à divers pathogènes du tabac ont montré que l’expression du hub affecte la sensibilité des plantes à certains de ces pathogènes. L’ensemble de ces travaux ouvrent la voie à une étude plus intégrative du rôle de l’endocytose dans l’interaction tabac-cryptogéine / Cryptogein, a protein secreted by the oomycete Phytophthora cryptogea, is an elicitor of defense reaction in tobacco. Cryptogein binding to an unidentified receptor of the plasma membrane triggers a signaling cascade that leads to changes in gene expression, production of a systemic acquired resistance signal, and cell death. Our lab previously reported a stimulation of endocytosis a few minutes after elicitation. Electron microscopy and pharmacological studies evidenced that this endocytosis is clathrin-mediated. Clathrin-mediated endocytosis (CME) is a fundamental eukaryotic cell process that ensures plasma membrane homeostasis. It also plays two antagonistic roles in extracellular signal transduction either by producing endosomes that convey the signal into the heart of the cell, or by downregulating plasma membrane receptors to attenuate cellular responsiveness and prepare the cell for subsequent signals.The aim of my thesis was to confirm clathrin dependence of cryptogein-induced endocytosis and to find out whether endocytosis is involved in cryptogein signaling and defense reactions. I established a tobacco cell suspension expressing clathrin light chain fused to GFP to follow CME in living cells. Biochemical and microscopic characterization of the cell suspension confirmed that cryptogein-induced endocytosis is clathrin-mediated. I also developed a dominant-negative strategy to inhibit CME by expressing a truncated form of clathrin heavy chain, the hub domain, which prevents clathrin-coated pit formation at the plasma membrane. Characterization of a cell line co-expressing GFP-CLC and the hub domain showed that it is possible to hinder cryptogein-induced CME without significantly altering constitutive endocytosis. This selective inhibition strategy revealed that cryptogein-induced early signaling events such as alkalinisation of the extracellular medium and reactive oxygen species production are CME-independent.Consequences of induced-CME inhibition on later responses to cryptogein were studied in cell suspension and in tobacco plants. My results showed that endocytosis contributes in a minor way to transcriptome reprogramming and cell death induction. Moreover, preliminary results suggested that hub expression increases the plant’s sensitivity to several pathogens. Altogether these results open up the prospect of addressing the role of CME during tobacco-cryptogein interaction in a more integrative view

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