O VEGF é um fator mitogênico específico de células endoteliais que promove diferenciação celular materno-fetal placentária quando ligado a seus receptores (Flt-1 e KDR). Sua expressão é controlada por mecanismos autócrinos e parácrinos e está associada ao desenvolvimento da placenta. A placenta bovina foi utilizada como modelo de estudo por apresentar a facilidade de se avaliar os componentes do sistema VEGF em diferentes fases gestacionais. Como objetivo este estudo buscou analisar o fator de crescimento vascular endotelial (VEGF) e seus receptores através da técnica de PCR em tempo real no início, meio e fim de gestação. Para tanto, amostras de placentomas, região interplacentomal e corpo lúteo foram coletadas em diferentes fases gestacionais. Foram utilizados placentomas de animais clonados obtidos apenas aos 270 dias de gestação e estas amostras foram comparadas aos animais não clonados na mesma fase. A expressão do VEGF no placentoma apresentou um decréscimo (p < 0.05) no final da gestação (270 dias) em relação à expressão do VEGF aos 90 dias. A expressão do Flt-1 e do KDR na região interplacentomal foi semelhante desde os 45 até 90 dias de gestação e apresentou um aumento significativo (p < 0.05) aos 150 dias. No corpo lúteo gestacional, a expressão do VEGF aos 210 dias foi maior (p ≤ 0.05) em relação a 90 e 150 dias; observou-se também baixa expressão do KDR aos 90 dias de gestação (p < 0.05) em relação aos 210 dias. Pode-se concluir que a regulação da expressão do VEGF variou em relação aos seus receptores nos três tecidos avaliados. Placentomas de bovinos clonados não apresentaram diferenças significativas em relação à expressão do sistema VEGF se comparados aos placentomas de animais não clonados sugerindo ser esta expressão equivalente em placentas de animais clonados que vieram a termo. / The VEGF is a specific endothelial mitogenic factor that promotes feto-maternal cell differentiation in placenta through binding to its receptors (Flt-1 and KDR). Their expression is controlled by autocrine and paracrine mechanisms that are associated to placenta development. The bovine placenta was used in this study as a model due to easiness of evaluation of VEGF system components in different phases of pregnancy. The objective of this study was to analyze the vascular endothelial growth factor (VEGF) and its receptors expression using the real time PCR technique in the beginning, half and end of pregnancy. Furthermore, placentome samples, interplacentomal areas and corpus luteum were collected in different gestational phases for comparative studies. Placentome of cloned animals were analyzed at 270 days of pregnancy and compared to non-cloned animals in the same phase. The expression of VEGF in the placentome presented a decrease of expression (p < 0.05) in the end of the gestation (270 days) in relation to 90 days. The expression of Flt-1 and of KDR in interplacentomal area was similar from 45 to 90 days of pregnancy with a significant increase (p <0.05) observed at 150 days. In the gestational corpus luteum, the expression of VEGF at 210 days was higher (p ≤ 0.05) in comparison to 90 and 150 days. In the same tissue KDR expression at 90 days was lower (p < 0.05) in relation to 210 days. In conclusion the regulation VEGF varied in relation to its receptors expression in all three studied tissues. Cloned placentomes showed no significant differences in VEGF system expression compared to the placentome of non-cloned animals, suggesting there is an equivalent expression in placentas from cloned animals that came to term.

A recuperação de partes deficientes do corpo humano por substitutos funcionais, tem suscitado questionamentos por parte de profissionais cirurgiões e pesquisadores da área de cirurgia e traumatologia Bucomaxilofacial. Na tentativa de recuperar o contorno anatômico natural e restaurar a função de áreas com deficiência de tecido ósseo, optou-se inicialmente pela utilização de enxertos ósseos autógenos. Apesar de suas inúmeras vantagens, o uso de enxertos autógenos na reconstrução da face apresenta certos inconvenientes, como a necessidade de hospitalização, intervenção em outra área do organismo, morbidade da área doadora, maior período de convalescença, susceptibilidade a infecções, e ainda, uma possível reabsorção progressiva e constante. Um questionamento ainda maior gira em torno das cirurgias para enxerto ósseo na face já que os ossos da face são curtos e não justifica a morbidade de uma outra região do organismo para suprir sua necessidade. Na tentativa de substituir o uso de enxertos autógenos, cirurgiões começaram a optar por materiais sintéticos ou similares orgânicos, associadas com o uso das proteínas ósseas morfogenéticas, que são fatores de crescimento responsáveis pela indução da formação óssea no organismo humano desde sua fase fetal até a idade madura. A proposta deste estudo é fazer uma avaliação sobre o conhecimento e o uso clínico pelos cirurgiões buco-maxilo-faciais, no Brasil, de proteínas ósseas morfogenéticas no auxílio à reparos de defeitos ósseos da face. / The use of alloplastic materials for bone replacement has been extensively debated lately by surgeons and researchers in the Oral and Maxillofacial field. In the attempt to reconstruct bone defects anatomically and functionally autogenous bone grafts have been the preferred option. Although being considered the gold standard in craniofacial reconstruction, there are some inconveniences in the use of bone autografts. Among them the need of hospitalization, the need of a donor site usually in a different area than the bone defect, donor area morbidity, longer recovery time, increased risk of infection, and the possibility of bone resorption over time. When the face is operated the use of autogenous bone is even more questionable. Usually small amounts of bone grafts are necessary in the face, and might not justify the morbidity of the donor site. In an attempt to avoid the use of bone autografts, allografts and alloplastic materials have been advertised, in association with bone morphogenetic proteins. These proteins are growth factors involved in the osteogenesis in humans from the fetus up to the adult age. The aim of this study is to evaluate the knowledge and the clinical use of bone morphogenetic proteins in the repair of facial bone defects by Brazilian Oral and Maxillofacial surgeons.

Modificações bioquímicas de topografias complexas de Ti permitem o desenvolvimento de novas superfícies de implantes funcionalizadas com moléculas bioativas, visando a promover a osteogênese de contato e a osseointegração. O objetivo do presente estudo foi avaliar o desenvolvimento do fenótipo osteogênico in vitro sobre diferentes nanotopografias de titânio (Ti) funcionalizadas com o fator de crescimento GDF-5. Células osteogênicas derivadas de calvária de ratos recém-nascidos foram plaqueadas e cultivadas por até 14 dias sobre superfícies de discos de Ti: 1) Controle (usinada e polida); 2) 30′ (com nanotopografia de nanoporos menores, obtida por condicionamento em solução de H2SO4/H2O2 por 30 min); 3) 30′+GDF-5 (nanotopografia de 30′, pré-adsorvida com GDF-5 a 200 ng/mL); 4) 4h (com nanotopografia de nanoporos maiores, obtida por condicionamento em H2SO4/H2O2 por 4 h); 5) 4h+GDF-5 (nanotopografia de 4h, pré-adsorvida com GDF-5 a 200 ng/mL). A adsorção de GDF-5 foi realizada a 4 ºC por 12 h no dia anterior ao plaqueamento das células. Os resultados mostraram que não houve diferenças estatisticamente significantes entre os grupos para a viabilidade celular em 1, 3 e 7 dias. Em 3 dias, as células estavam aderidas e espraiadas sobre todas as superfícies e acúmulos extracelulares extensos de OPN foram encontrados apenas sobre superfícies com nanotopografia de 4h e de 30′+GDF-5. A expressão de RNAm para RUNX2 e ALP foi maior em 7 dias se comparada a 10 dias, sendo os menores valores encontrados para o grupo 4h+GDF-5. A expressão de OPN aumentou de 7 para 10 dias, exceto para 30′+GDF-5, que se manteve inalterada. Enquanto que os níveis de RNAm para BSP aumentaram de 7 para 10 dias no Controle, redução significativa foi observada para os demais grupos, exceto para 30′, em que se manteve constante. Culturas crescidas sobre nanotopografias funcionalizadas com GDF-5 exibiram os maiores valores de atividade de ALP em 10 dias e de áreas de matriz mineralizada/acúmulos de cálcio em 14 dias. Em conclusão, a funcionalização de nanotopografias de Ti com GDF-5 pode acelerar e/ou aumentar a expressão do fenótipo osteogênico in vitro. / Surface functionalization of metallic surfaces with bioactive molecules has been developed aiming to promote specific cellular responses at the biomaterial-tissue interface. The present study evaluated the development of the osteogenic phenotype in vitro on titanium (Ti) surface nanotopographies functionalized with growth and differentiation factor-5 (GDF-5). Osteogenic cells were obtained by enzymatic digestion of newborn rat calvarial bone and grown for periods of up to 14 days on the following Ti disc surfaces: 1) Machined; 2) 30′ Nanotopography created by a mixture of H2SO4/H2O2 for 30 min; 3) 30′+GDF-5 Nanotopography created by a mixture of H2SO4/H2O2 for 30 min and then adsorbed with 200 ng/mL GDF-5 (overnight at 4 °C); 4) 4h Nanotopography created by a mixture of H2SO4/H2O2 for 4 h; 5) 4h+GDF-5 Nanotopography created by a mixture of H2SO4/H2O2 for 4 h and then adsorbed with 200 ng/mL GDF-5 (overnight at 4 °C). At 4 h, nanotopographies adsorbed with GDF-5 exhibited a significantly lower proportion of spread cells. At days 1, 3 and 7 no major differences in terms of cell viability were detected among groups. At day 3, epifluorescence revealed large extracellular OPN accumulation only for 30′+GDF-5, 4h and 4h+GDF-5. Real time PCR analysis showed for GDF-5 groups: i) lower mRNA levels for RUNX2, ALP e BSP at day 10; ii) higher RUNX2 and ALP expression at day 7 compared with day 10, with the lowest levels for 4h+GDF-5; iii) increased OPN levels from day 7 to day 10, except for 30′+GDF-5, which remained unaltered. Cultures grown on nanotopographies adsorbed with GDF-5 exhibited significantly higher values for ALP activity at 10 days and enhanced mineralized matrix formation at day 14. In conclusion, surface functionalization of Ti nanotopographies with GDF-5 can accelerate and/or increase the expression of the osteogenic phenotype in vitro.

A cartilagem do processo condilar (PC) e a sincondrose basiesfenoidal (SB) participam do processo de crescimento e desenvolvimento craniofacial que são determinados pelo aporte protéico, pela ação hormonal e por fatores de crescimento, sendo o IGF-I o principal deles. Objetivou-se correlacionar as alterações morfológicas no PC e na SB provenientes da subnutrição protéica. Os grupos experimentais foram formados por animais heterogêneos (n=5) com 60 dias de vida, de acordo com o teor de caseína contida nas rações, protéica (20%) ou hipoprotéica (5%), formando, respectivamente, os grupos nutrido (N) e subnutrido (S). Na microscopia de luz foi observado que a subnutrição não alterou as espessuras das camadas do PC e da SB, enquanto que através da imunohistoquímica o número de IGF-I e IGF-IR diminuiu em ambos os tecidos (N&ne;S; p<0,05). No PC, o colágeno do tipo I passou a ser do tipo II no grupo S, enquanto que na SB, o do tipo II foi destacado em ambos os grupos. A matriz extracelular do PC apresentou-se densa e com coloração homogênea nos nutridos, contrastando com o aspecto difuso dos subnutridos. Na SB, tanto no grupo N quanto no S, a MEC manteve-se com aspecto uniforme na distribuição e na homogeneidade da coloração. / The cartilage of the condylar process (CP) and the basiesfenoidal synchondrosis (BS) participate in the process of craniofacial growth and development that are determined by the protein content, the hormonal and growth factors, being the IGF-I main one. This study aimed to correlate the morphological changes in PC and SB from protein malnutrition. The experimental groups were formed by heterogeneous animals (n = 5) at 60 days of life, according to the casein contained in the feed, proteic (20%) or hypoproteic (5%), constituting respectively the nourished (N) and undernourished (U) groups. Under light microscopy it was observed that undernourished did not change the thickness of the layers of CP and BS by immunohistochemical while the number of IGFI and IGF-IR decreased in both tissues (N&ne;S; p<0,05). On the PC, the type I collagen became type II at the U group, while in the SB the type II was noted in both groups. The extracellular matrix (ECM) of the PC presented dense and homogenous coloration in the nourished, contrasting with the diffuse aspect of the undernourished. In SB, both in the N group as U, the ECM remained uniform in appearance and the distribution and uniformity of staining.

As pesquisas em lesão medular tiveram um avanço significativo nas últimas duas décadas. Várias substâncias têm sido testadas, dentre elas, os fatores neurotróficos que são proteínas que auxiliam na maturação e desenvolvimento do sistema nervoso. O objetivo deste estudo foi conduzir testes que propiciem a análise dos efeitos da recuperação funcional locomotora e regeneração axonal em ratos submetidos a testes experimentais com a utilização da substância neurotropina-4. O estudo consistiu de 30 ratos adultos jovens, da raça Wistar, que foram submetidos à lesão medular ao nível de TX, provocado por um aparelho denominado NYU impactor. Os ratos foram divididos em dois grupos de 15 ratos cada, denominados de grupo controle e grupo tratamento, que receberam aplicação de água destilada e 1g de neurotropina-4, respectivamente. Estes foram avaliados funcionalmente pela escala BBB e submetidos à análise histológica. Concluiu-se que a neurotropina-4 promove a recuperação locomotora funcional e diminui os efeitos secundários da lesão medular, comparativamente ao grupo controle / Research into spinal cord injury has advanced significantly over the past two decades. Many substances have been tested, including the neurotrophics factors, which are proteins that aid in the maturation and development of the nervous system. The objective of this study was to conduct tests that provide the analysis of the effects of the locomotor functional recovery and axonal regeneration in rats subjected to experimental tests with the use of the substance neurotrophin-4. The study consisted of thirty young adult rats, Wistar race, which received TX level of spinal cord injury through a device called NYU impactor. The rats were divided into two groups of fifteen rats each, called the control group and treatment group, which received application of distilled water and 1 g Neurotrophin-4, respectively. They were evaluated functionally by the BBB scale and submitted to the histological analysis. It was concluded that the Nt-4 promotes the recuperation of the locomotor function and reduces the side effects of spinal cord injury, compared to the control group

Orientadores: Lília Freire Rodrigues de Souza Li, Marcelo Ananias Teocchi / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-26T06:18:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ferreira_AnaErikaDias_M.pdf: 2703005 bytes, checksum: 3e71e1e36f3b90f6651557533137b593 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Epilepsia do lobo temporal (ELT) é a forma mais comum de epilepsia em adultos. O processo de epileptogênese inclui a morte neuronal, brotamento axonal, inflamação, neurogênese, estresse oxidativo e gliose. No entanto, os mecanismos moleculares subjacentes não são totalmente compreendidos. Os fatores de crescimento de fibroblastos (FGFs) são uma família de proteínas com várias funções no organismo, especialmente no sistema nervoso central. No entanto, o funcionamento dos FGFs no cérebro humano não é totalmente compreendido. O FGF2 é o membro mais estudado dessa família e seu papel na fisiopatologia da epilepsia é controversa. Na tentativa de esclarecer o envolvimento da via de FGF na ELT, nós quantificamos a expressão hipocampal dos seguintes genes: FGF2, FGF8, FGF22, FGFR1, FGFR2, FGFR3, ITPR3, PIK3R3 e PIK3R5 em 10 pacientes resistentes a fármacos e quatro controles post mortem. Além disso, avaliamos a expressão da proteína de FGF2 por imunofluorescência indireta. Apenas para o FGF2, houve aumento do RNAm no hipocampo dos pacientes para os dois genes de referência testados, HPRT1 e ENO2 + TBP em combinação (P = 0,002 e P = 0,036; respectivamente). A porcentagem de células imunomarcadas para FGF2 no giro dentado foi maior nos pacientes do que nos controles (P <0,05), mas nenhuma alteração significativa foi encontrada no Corno de Ammon. O FGF2 pode preservar os neurônios após lesão e atua como um poderoso fator para a proliferação de células-tronco neurais. Assim, o FGF2 poderia aliviar os danos induzidos pelas crises, intensificar a reparação e reduzir a epileptogênese no hipocampo. Por outro lado, evidências têm demonstrado o envolvimento do FGF2 em mecanismos epileptogênicos, como brotamento de fibras musgosas e neurogênese. Nossos resultados sugerem a participação do FGF2 na fisiopatologia da ELT e o indica como um importante alvo para estudos farmacológicos / Abstract: Temporal lobe epilepsy (TLE) is the most common form of epilepsy in adults. The process of epileptogenesis includes neuronal death, axonal sprouting, inflammation, neurogenesis, oxidative stress and gliosis. However, the molecular mechanisms behind them are not fully understood. Fibroblast growth factor (FGF) gene family encodes proteins with several functions in the organism, especially in the central nervous system. FGF family member functions in the human brain are unclear. To shed light on the involvement of the FGF pathway in TLE, we quantified the hippocampal expression of the following genes: FGF2, FGF8, FGF22, FGFR1, FGFR2, FGFR3, ITPR3, PIK3R3 and PIK3R5 in 10 pharmacoresistant patients and four post mortem controls. We also assessed the FGF2 protein expression by indirect immunofluorescence. Only for FGF2, was the mRNA level markedly increased in patients¿ hippocampi for the two reference genes tested, HPRT1 and ENO2+TBP in combination (P = 0.002 and P = 0.036, respectively). The percentage of FGF2 immunostained cells in the dentate gyrus was higher in patients than in the controls (P <0.05), but no significant alteration was found in the Ammon¿s horn. FGF2 preserves neurons from ongoing injury and acts as a powerful proliferation factor for neural stem cells. It could potentially alleviate seizure-induced damage and intensify repair and reduce epileptogenesis in the hippocampus. On the other hand, evidence has shown FGF2¿s involvement in epileptogenic mechanisms, such as axonal sprouting and neurogenesis. Our results clearly suggest the FGF2 participation in TLE physiopathology and point it out as an important target for pharmacological studies / Mestrado / Saude da Criança e do Adolescente / Mestra em Ciências

O estabelecimento e perfeito funcionamento da placenta são fatores dependentes da intensa vascularização ocorrida no órgão. Os processos de vasculogênese e angiogênese placentária são modulados por diversos fatores, incluindo o VEGF (fator de crescimento vascular endotelial) e bFGF (fator de crescimento fibroblástico básico). Apesar da importância do VEGF e bFGF durante a vascularização estar estabelecida, vários estudos indicam a participação desses fatores de crescimento como moduladores locais em outras funções fisiológicas, como por exemplo o controle da produção hormonal em tecidos esteroidogênicos. Animais clonados podem apresentar alterações na expressão de determinados genes durante seu desenvolvimento, o que pode alterar a função placentária. Os objetivos deste estudo são determinar a localização tecidual do VEGF, bFGF e seus receptores na placenta bovina e avaliar a influência destes fatores de crescimento sobre a produção de progesterona placentária em bovinos não clonados e clonados. Placentomas de 90, 150 e 210 dias de gestação foram obtidos em abatedouro e placentônios de gestações aos 270 dias provenientes de bovinos clonados e não clonados foram coletados após cesarianas. As amostras foram fixadas em formol tamponado 4%, desidratadas e incluídas em parafina. Cortes foram submetidos a imuno-histoquímica para posterior localização das proteínas do VEGF, bFGF e seus receptores. Sob condições assépticas, as células foram mecanicamente dispersas e cultivadas em placas de 96 cavidades. Os fatores foram adicionados em concentrações de 10 e 50 &#951;g/ml de bFGF e VEGF, respectivamente. Amostras de meio de cultura e as células dos grupos controle, bFGF, VEGF e VEGF mais bFGF foram coletadas 24, 48 e 96 horas após a adição dos fatores. A progesterona foi dosada por radioimunoensaio e o conteúdo protéico pelo método de Lowry. Os dados foram analisados utilizando-se o programa estatístico SAS (Statistical Analysis System), as diferenças estatísticas encontradas foram comparadas pelo teste de variação múltipla de Duncan. O VEGF, bFGF e seus receptores foram localizados em células do epitélio e estroma maternos e fetais e células endoteliais vasculares em bovinos não clonados e clonados. As células placentárias apresentaram diferentes capacidades de síntese de progesterona ao longo da gestação. Aos 90 e 210 dias de gestação o VEGF estimulou a produção de progesterona, enquanto aos 270 dias de gestação o fator inibiu a produção deste hormônio. O bFGF estimulou a produção de progesterona pelas células placentárias aos 90 dias de gestação. A adição dos dois fatores de crescimento conjuntamente determinou um estímulo na produção de progesterona aos 210 dias de gestação. A produção de progesterona pelas células de bovinos clonados foi semelhante àquela observada em células de bovinos não clonados na mesma idade gestacional e os fatores de crescimento não influenciaram essa produção. Conclui-se que o VEGF e bFGF, atuando localmente no tecido placentário, funcionam como moduladores do processo de esteroidogênese, influenciando de maneira tempo-dependente a produção de progesterona deste órgão. / Placental establishment and function are dependent on intense vascularization. Placental vasculogenesis and angiogenesis are modulated by several factors, including VEGF (vascular endothelial growth factor) and bFGF (basic fibroblast growth factor). Although the role of VEGF and bFGF during vascularization is already well established, some studies have indicated the participation of these growth factors as local modulators in other physiological functions, such as control of hormonal production in steroidogenic tissues. Cloned animals may exhibit alterations in gene expression during development modifying placental function. The aims of this study are to determine the tissue localization of VEGF, bFGF and their receptors in the bovine placenta and to evaluate the influence of bFGF and VEGF on placental progesterone production in non-cloned and cloned bovines. Placentomes from days 90, 150 and 210 of pregnancy were obtained at local slaughterhouse and placentomes from cloned and non-cloned gestations at 270 days were obtained after cesarean sections. Samples were fixed in 4% buffered formol solution, dehydrated and included in paraffin. Sections were subimitted to immunohistochemistry for subsequent localization of VEGF, bFGF and their receptors proteins. Under aseptic conditions, cells were mechanically dispersed and then cultivated in a 96-well plate. Growth factors were added at concentrations of 10 and 50 &#951;g/ml for bFGF and VEGF, respectively. Samples of culture medium and cells from control, bFGF, VEGF and bFGF plus VEGF groups were collected 24, 48 and 96 hours after growth factor addition. Progesterone concentrations were assessed by radioimmunoassay and protein content was measured by Lowry?s method. Data were analyzed by SAS (Statistical Analysis System) program, significant differences were compared by Duncan?s range multiple test. VEGF, bFGF and their receptors were localized in maternal and fetal epithelial and stromal cells and vascular endothelial cells during pregnancy in non-cloned animals and in cloned bovine placenta at 270 days of pregnancy. Bovine placental cells were able to produce different amounts of progesterone during pregnancy. Growth factors were able to influence progesterone production in placental cells only after 24 hours in culture. At 90 and 210 days of pregnancy VEGF stimulated progesterone production, while at 270 days of pregnancy the growth factor inhibited production of this hormone. bFGF stimulated progesterone production in placental cells from 90 days of pregnancy. Both growth factors together determined an increase in progesterone production in placental cells from 210 days of pregnancy. Progesterone production in placental cells from cloned cattle is similar when compared with non-cloned placental cells at the same gestational age and growth factors did not influence progesterone production in these cells. VEGF and bFGF, acting locally in the placental tissue, are modulators of the steroidogenic process, influencing in a time-dependent manner the progesterone production in this organ.

O uso de biotecnologias pode ser um método eficaz para melhorar a eficiência da reprodução e aumentar a produção de animais geneticamente superiores. O tratamento superovulatório é uma técnica comum utilizada com o objetivo de difundir o material genético desejado, embora seu uso em búfalos ainda apresente limitações, principalmente relacionada à baixa taxa de recuperação de embriões. O corpo lúteo (CL) é uma glândula reprodutiva transitória que produz progesterona, requerida para o estabelecimento e manutenção da prenhez e regulação do ciclo reprodutivo. O desenvolvimento e as funções do corpo lúteo são afetados pela hiperestimulação ovariana. As células luteínicas de animais superovulados apresentam características compatíveis com alta síntese de proteína. O fator de crescimento vascular endotelial (VEGF) e o fator de crescimento fibroblástico básico (bFGF) são reguladores importantes do desenvolvimento e função do CL, e também são afetados pelo tratamento superovulatorio. Vários estudos sugerem que o LH (hormônio luteinizante) e hCG (gonadotrofina coriônica humana) modulam a expressão dos fatores de crescimento. Este trabalho teve como objetivo avaliar a expressão gênica e protéica dos sistemas VEGF e bFGF em corpo lúteo cíclico de búfalas não tratadas e superovuladas. Foram utilizados vinte corporea lutea (CLL) divididos em 5 grupos de acordo com o estágio do ciclo estral (2, 6, 12, 17 e 26 dias após ovulação p.o.) e o grupo 6 era composto de CLL de animais superovulados no dia 6 p.o. Os CLL foram coletados em abatedouro, dissecados e congelados imediatamente em nitrogênio líquido para posterior extração de proteína e de mRNA. A análise protéica do VEGF, KDR, bFGF, FGFR-2 e FGFR-3 foi determinada por western blotting, enquanto a análise da expressão gênica de VEGF, KDR, Flt-1, bFGF, FGFR-1 a 4, por RT-PCR em tempo real. No CL de búfalas superovuladas observou-se maior expressão protéica dos sistemas VEGF e bFGF, em relação aos animais não tratados (p<0,05). Por outro lado, a expressão do mRNA de todos os genes estudados decresceu (sistema VEGF-A p<0.001, bFGF, FGFR-1 e FGFR-3, p<0.05) ou apresentou tendência a decrescer (FGFR-2 e FGFR-4, p<0.1) nos animais superovulados. Durante o ciclo estral, a expressão protéica do VEGF não variou, apesar da expressão de todas as outras proteínas e mRNA estudados apresetarem variações de acordo com a fase do ciclo estral. Os resultados obtidos sugerem que o tratamento superovulatório aumenta a taxa de tradução dos fatores angiogênicos no CL de búfalas, e que a expressão dos sistemas VEGF e bFGF ao longo do ciclo estral é tempo-dependente, indicando um papel importante destes fatores na regulação das funções do CL. / Biotechniques can be an effective way of improving reproduction efficiency and enhancing the production of genetically superior animals. The superovulatory treatment is a common technique aiming to spread desired genetical material, although its use in buffalos still presents limitations, mainly the low embryo recovery rate. The corpus luteum (CL) is a temporary endocrine gland that produces progesterone (P), which is required to the establishment and maintenance of pregnancy and regulation of reproductive cycle. CL development and function are affected by ovarian hyperestimulation. The luteal cells of superovulated animals are described to show characteristics compatible with higher protein synthesis. The vascular endothelial growth factor (VEGF) and basic fibroblast growth factor (bFGF) are important regulators of CL and are also affected by superovulatory treatment. Several studies suggest that LH (luteinizing hormone) and hCG (human chorionic gonadotropin) modulate expression of growth factors. The aim of this work was to access gene and protein expression of VEGF and bFGF systems in cyclic CL of nontreated and superovulated water buffalos. Twenty water buffaloes corpora lutea (CLL) were divided in five groups according to estrous cycle stage (days 2, 6, 12, 17 and 26 after ovulation - p.o.) and the sixth group was composed by superovulated CLL from day 6 p.o. The CLL were collected at the slaughterhouse, dissected and frozen immediately in liquid nitrogen for posterior protein and mRNA extraction. Protein expression of VEGF and its receptors KDR and Flt-1 as well as bFGF and its receptors FGFR-2 and FGFR-3 was measured by western blotting (WB). For the relative gene expression of VEGF, KDR, Flt-1, bFGF, FGFR-1 to 4, we used real time RT-PCR. VEGF and bFGF systems protein expression showed an increase (p <0.05) in superovulated CLL compared to non-treated CLL on day 6 after p.o. On the other hand, mRNA expression from all studied genes was decreased (VEGF-A system p<0.001, bFGF, FGFR-1 and FGFR-3, p<0.05) or tended to decrease (FGFR-2 and FGFR-4, p<0.1) in superovulated CLL. In estrous cycle CLL VEGF protein did not show a time dependent expression although all other proteins and mRNAs expression were dependent on estrous cycle stage. These results indicate that the superovulatory treatment increased transduction rate of angiogenic factors in CL and that VEGF and bFGF systems are expressed in a time-dependent manner during the estrous cycle, indicating that these growth factors are important regulators of CL function.

Os fatores de crescimento vascular endotelial (VEGF) e o fibroblástico básico (bFGF) são reguladores importantes do desenvolvimento e função placentária. Os efeitos destes na expressão da enzima esteroidogênica aromatase P450 (P450arom) na placenta bovina em diferentes estágios gestacionais (90 a 270 dias) foram avaliados através de imunocitoquímica. Além disso, comparou-se a influência destes entre células placentárias de bovinos clonados e não clonados aos 270 dias. A aromatase P450 foi localizada exclusivamente no citoplasma das células trofoblásticas gigantes e sua expressão foi menor aos 150 dias de gestação, em relação às demais idades (p<0,05). O VEGF (50 ng/ml) influenciou significativamente a expressão da P450arom aos 150 e 270 dias, enquanto o bFGF (10 ng/ml) foi efetivo em estimular essa expressão particularmente no final da gestação (270 dias). Os dois fatores combinados (bFGF+VEGF) inibiram a expressão da P450arom no terço inicial (90 dias), mas, por outro lado, estimularam-na aos 150 e 270 dias (p<0,05). Nos clones, a expressão da P450arom, nos grupos controle e VEGF, foi semelhante a dos animais não clonados aos 270 dias de gestação, porém, o bFGF e os dois fatores combinados inibiram-na significativamente (p<0,05). Em todos os grupos analisados, a expressão da P450arom apresentou característica ascendente em função dos dias de cultivo, atingindo concentração máxima após 96 horas de incubação. Assim, o presente estudo demonstrou efeitos distintos e estágio-específicos dos fatores de crescimento bFGF e VEGF na secreção de estrógenos na placenta bovina via modulação da expressão da aromatase P450 in vitro. Conclui-se que estes fatores de crescimento agem como potentes moduladores de enzimas esteroidogênicas e que, sob as condições de cultivo estabelecidas, as células placentárias de bovinos clonados apresentam padrão de resposta distinto quando comparadas com células de bovinos não clonados de mesma idade gestacional. / Vascular endothelial growth factor (VEGF) and basic fibroblast growth factor (bFGF) are important regulators of placental development and function. Their effects on the steroidogenic enzyme aromatase P450 (P450arom) expression from bovine placenta at different gestational stages (90 - 270 days) were evaluated by immunocytochemistry. Moreover, we compared the effects of these growth factors on P450arom expression between cloned and non cloned bovine placental cells. P450arom was localized exclusively in trophoblast giant cells cytoplasm, and its expression reached lowest levels at day 150 of gestation in comparison to the remaining evaluated gestational stages. VEGF (50 ng/mL) influenced significantly P450arom expression at days 150 and 270, whereas bFGF (10 ng/mL) was effective in stimulating P450arom expression particularly during late gestation (day 270). The two factors combined (bFGF+VEGF) inhibited P450arom expression during early gestation (day 90), but, in contrast, stimulated it at days 150 and 270 of pregnancy (P<0.05). In cloned bovine placental cells, P450arom expression was similar to non-cloned cells in the control and VEGF groups, however, bFGF and both factors together inhibited it significantly (P<0.05). In all groups analyzed, P450arom expression presented rising pattern over the duration of the culture, reaching maximal values at 96 hours of incubation. Thus, the present study demonstrated distinct and stage-specific effects of these growth factors on bovine placenta P450arom expression in vitro. We concluded that these growth factors act as potent steroidogenic enzymes regulators, and, under the established culture conditions, placental cells from cloned bovines presented distinct answer pattern compared to non cloned placental cells at the same gestational stage.

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