O gênero Partamona compreende 33 espécies, distribuídas do sul do México ao sul do Brasil. O gênero tem sido amplamente estudado em diferentes níveis: citogenético, etológico e morfológico. O presente trabalho teve como objetivo contribuir com dados moleculares para o conhecimento do grupo, realizando estudos populacionais por meio da caracterização do DNA mitocondrial por PCR+RFLP e da análise de regiões de microssatélites do DNA genômico de duas espécies: P. mulata de distribuição restrita ao sul de Mato Grosso e norte do Mato Grosso do Sul, e P. helleri de distribuição mais ampla, do sul da Bahia até Santa Catarina. Foram detectados apenas dois haplótipos em P. mulata, os quais diferiram entre si por apenas um sítio de restrição. As análises estatísticas demonstraram não haver estruturação entre as populações sugerindo que esta espécie possa ter passado por recente afunilamento populacional. Em P. helleri foram observados dez haplótipos sendo alguns exclusivos e outros compartilhados. Análises estatísticas apontaram alta estruturação entre as populações e a distribuição filogeográfica observada sugere um possível isolamento por fragmentação da Mata Atlântica durante o Pleistoceno. A análise dos locos microssatélites mostrou baixa variabilidade genética em ambas espécies e discreta estruturação entre as populações, não relacionada com a distribuição geográfica das mesmas. Isto pode ser conseqüência de migração de machos entre populações visto que as rainhas são filopátricas ou, fragmentação dos habitats pela rápida degradação do cerrado e da Mata Atlântica, ou por alelos nulos causados pelo uso de primers heteroespecíficos. A análise de parentesco entre abelhas de um mesmo ninho apontou a existência de apenas uma patrilínea em P. mulata sugerindo monoandria para esta espécie. Foram encontradas duas patrilíneas em algumas colônias de P. helleri, o que pode ser resultante de fecundação por mais de um macho ou substituição recente da rainha. A caracterização parcial do DNAmt de duas espécies de Partamona poderá contribuir em estudos filogenéticos tanto do gênero quanto de outras espécies de Meliponini. A análise populacional mostrou o status da variabilidade genética das espécies, suas possíveis histórias evolutivas e a possível relação desta com degradação dos ambientes onde estas estão distribuídas. / The Partamona genus comprises 33 species distributed from south Mexico to south Brazil. This genus has been studied at different levels: cytogenetical, ethological and morphological. This work aimed at to contribute with molecular data for the knowledge about the group performing a population study employing the PCR+RFLP of mtDNA, and analysis of microsatellite loci from nuclear DNA of two species, P. mulata which is distributed in south Mato Grosso and north Mato Grosso do Sul, and P. helleri which geographic distribution is wider, from Santa Catarina to southern Bahia. It was detected two haplotypes in 58 colonies of P. mulata, each one differing by one single restriction site. The statistical analyses indicated no differentiation among populations suggesting that the species could have passed through a recent populational bottleneck. It was observed ten haplotypes in 47 colonies of P. helleri, some exclusive and others shared among populations. Statistical analysis pointed high population differentiation and the observed phylogeography distribution suggested a possible recent isolation probably by Atlantic Forest fragmentation during the Pleistocene. The microsatellite analysis showed low genetic variability in both species and discrete population structuring, not related to the geographic distribution. This might be consequence of migration of males, since the queens are highly phylopatric, or habitat fragmentation by degradation of savanna and Atlantic forest areas, or null alleles caused by the use of heterospecific primers. The relatedness investigation revealed only one patriline in nest mates of P. mulata that suggests monoandry for this species. It was found two patrilines in P. helleri that can be resulted from more than one mating or recent queen replacement. The partial characterization of the mtDNA of two Partamona species can contribute to further phylogenetic studies among bees of this genus or among other Meliponini species. The populational analysis showed the genetic variability status of the species, their putative evolutionary histories and the possible relation between the results and the environmental degradation in their distribution areas.

O Complexo Principal de Histocompatibilidade (MHC) é um sistema genético reconhecidamente polimórfico em populações humanas. Em porções específicas dos genes que compõem o MHC de populações humanas também foi evidenciada a ação da seleção natural em nível molecular. Em várias espécies de vertebrados onde estes genes foram estudados diferentes níveis de variação, composição gênica e organização foram detectados, mantendo, entretanto, as características que os tornam tão interessante de ser estudados. Para mamíferos marinhos, as questões sobre a variação no MHC servem de pano de fundo para o entendimento sobre o sistema imunológico destas espécies e suas particularidades em relação ao ambiente marinho e a evolução destes genes em organismos não-modelos. No presente trabalho, duas espécies de cetáceos, a toninha ou franciscana (Pontoporia blainvillei) e a baleia-franca-austral (Eubalaena australis), foram investigadas quanto aos níveis de variação no gene DQB1 do MHC. O segundo exon da cadeia beta do gene DQ foi amplificado em 25 amostras de toninha e 18 amostras de baleia franca. Os fragmentos de 212pb (pares de base) resultantes do processo de amplificação foram clonados e, tiveram analisados por seqüenciamento 171pb correspondentes ao sítio de ligação ao peptídeo antigênico (PBR). Uma amostra de toninha e um par mãe-filhote de baleia-franca-austral foram analisadas quanto à expressão do gene DQB a partir de amostras de pele. A evidência de seleção natural a nível molecular nesta porção do gene é confirmada por um excesso de substituições não sinônimas em relação às substituições sinônimas (em um contexto de neutralidade as substituições sinônimas acumulam-se na mesma taxa de mutações) através da razão dN (não sinônimas) e dS (sinônimas). Para confirmar os desvios da neutralidade (Ho= dN/dS=1), foi usada a estatística z. Os valores de dN/dS para toninha e baleia-franca-austral foram, respectivamente, dN/dS = 2,32 (p=0,014) e dN/dS =3,75 (p= 0,001). Estes valores, as características das seqüências e a evidência de expressão desses genes na pele de cetáceos estão de acordo com os pressupostos de seleção positiva para esta região do gene e sugerem funcionalidade para estes genes nestas duas espécies. Há evidências de mais de uma cópia do gene para baleia-franca-austral. Foram descritos 6 alelos para toninha e 17 alelos para baleia-franca-austral sendo que um dos alelos é compartilhado entre as duas espécies, sugerindo que essa linhagem alélica é anterior à divergência entre odontocetos e misticetos. Paralelamente a este trabalho, o cariótipo de toninha foi descrito através de um processo de cultivo celular a partir da córnea de dois exemplares recém-mortos. Seu número cromossômico 2n=44 corrobora a estabilidade cariotípica descrita para cetáceos. / The Major Histocompatibility Complex is a highly polimorphic genetic system described to human populations. It is clear that a particular region from these genes is under natural selection which results in different patterns of variation from those expected under neutrality. In other vertebrates these genes were studied, these special characteristics seems to be preserved despite specific genomic organization and variation levels. In marine mammals, questions adressed to MHC molecular variation are focused in questions concerned on environmental restrictions and molecular evolution in non-model organisms. In the present study, two marine mammal species were surveyed concerning genetic variability using the gene DQB exon 2. Samples from 25 franciscana dolphins (Pontoporia blainvillei) and 18 southern right whales (Eubalaena australis) were used to amplify a 212bp (base pair) fragment from DQB exon 2. The 171bp resulting fragment was sequenced and analized in relation to the molecular level evidence of selection. Rates of nonsynonymous (dN) and synonymous (dS) base pair substitution and departures from neutrality for dN/dS (z statistics) were calculated. For both species examined, molecular evidence of selection was confirmed. The dN/dS ratios to franciscana and southern right whale were 2.32 (p=0.014) and 3.75 (p=0.001), respectively. These values, combined to data on DQB gene expression in franciscana and southern right whale skin and less restrictive aminoacid usage in both species, suggest a functional signature to sequences cetacean derived. Additionally, 6 alleles were described to franciscana dolphins and 17 to southern right whales. One more evidence of selection acting in this particular genomic region is provided from the fact that both species share one allele, suggesting that this allelic lineage was present before the splitting between mysticeti and odontoceti. To provide addtional information on franciscana dolphins the karyotype of P. blainvillei is presented. The karyotype was obtained from corneal culture of two dead animals. The diploid number 44 confirms the clear prevalence of this pattern among cetaceans.

Os microssatélites ou Short Tandem Repeats (STRs) são marcadores moleculares que caracterizam-se por altos níveis de heterozigozidade, dispersão uniforme, alto nível de reprodutividade, codominância e possibilidade de genotipagem por métodos rápidos e simples. Devido a estas características, estes marcadores têm sido amplamente utilizados em genética de populações, estudos evolutivos e análises forenses. Na presente tese, foram utilizados STRs autossômicos e de cromossomos sexuais (X e Y) para a avaliação da estrutura genética da população do Rio Grande do Sul (RS). Grupos ameríndios brasileiros foram também investigados, como uma das populações parentais importantes para a formação da atual população do RS. Para tanto, foram avaliados os sistemas D2S1338, D3S1358, D5S818, D7S820, D8S1179, D13S317, D16S539, D18S51, D19S433, D21S11, FGA, vWA, CSF1PO, TPOX e TH01 (autossômicos); DXS9895, DXS7132, DXS6800, DXS9898, DXS6789, DXS7133, DXS7130, HPRTB, GATA31E08, DXS7423 e DXS10011 (do cromossomo X) e DYS19, DYS389I/II, DYS390, DYS391, DYS392, DYS393, DYS437, DYS438, DYS439, e DYS385 (do cromossomo Y). As amostras utilizadas foram amplificadas através da técnica de reação em cadeia da polimerase, a partir de primers com fluorórofos incorporados. Os produtos de amplificação foram posteriormente determinados por intermédio de separação em eletroforese capilar. Os resultados obtidos a partir de STRs autossômicos demonstraram a ausência de subestruturação quando a população do Rio Grande do Sul foi comparada com populações 6 de outras regiões do país. As análises de mistura racial exibiram um padrão caracterizado pela predominância da contribuição européia, seguida por ameríndia e africana. As estimativas de miscigenação por regiões do Estado revelaram que a porção oeste do Rio Grande do Sul exibiu os maiores níveis de contribuição ameríndia, se comparados com o restante do Estado. As análises de relacionamento genético, obtidas a partir de dados produzidos na presente tese e também de outras populações, demonstraram que a população do Rio Grande do Sul apresenta maior proximidade genética com a Argentina do que com alguns Estados brasileiros. Em relação às análises realizadas a partir de microssatélites do cromossomo Y, nossos resultados, corroborando estudos prévios, demonstraram uma forte predominância da contribuição européia para a população do Estado, seguida por níveis insignificantes de contribuição africana e ausência de contribuição ameríndia. Os resultados obtidos por intermédio dos marcadores de cromossomo X, para amostras do Rio Grande do Sul e de um pool de amostras de ameríndios, revelaram maiores níveis de desequilíbrio de ligação para o grupo ameríndio, sendo provavelmente reflexos da estruturação populacional relacionada à ação de gargalo de garrafa e à deriva genética. Os níveis de desequilíbrio de ligação encontrados para a amostra sulina foram de menor intensidade, e provavelmente correlacionados à miscigenação. Outrossim, as análises realizadas a partir destes marcadores demonstraram ainda uma maior proximidade das distribuições alélicas da amostra do Rio Grande do Sul com populações européias; enquanto que, para o grupo ameríndio, os resultados revelaram uma maior similaridade com as populações asiáticas. Os dados obtidos na presente Tese confirmam alguns resultados encontrados a partir de análises com outras populações brasileiras, mas também trazem novas informações, que devem ser investigadas em outras amostras populacionais, a fim de que se estabeleça o seu real significado. / Microsatelites or Short Tandem Repeats (STR) are molecular markers characterized by high levels of heterozygozity, uniform dispersal among the human genome, codominance and possibility of genotyping by fast and simple laboratory methods. Due to these characteristics, these markers have been widely used in population genetics, evolution studies and forensic genetics. In the present work, we used autosomes, as well as X-STRs and Y-STRs, to evaluate the genetic structure of the Rio Grande do Sul (RS) population. Amerindian groups were also investigated, due to their importance, as a parental group, for the formation of the present RS population. For this purpose, markers D2S1338, D3S1358, D5S818, D7S820, D8S1179, D13S317, D16S539, D18S51, D19S433, D21S11, FGA, vWA, CSF1PO, TPOX and TH01 (autosomic); DXS9895, DXS7132, DXS6800, DXS9898, DXS6789, DXS7133, DXS7130, HPRTB, GATA31E08, DXS7423 and DXS10011 (from the X chromosome) and DYS19, DYS389I/II, DYS390, DYS391, DYS392, DYS393, DYS437, DYS438, DYS439, and DYS385 (from the Y chromosome ) were used. The samples were amplified by PCR with fluorescent primers, and the PCR products were then analyzed by capillary electrophoresis. Regarding the autosomic STR results, no substructuring was observed between Rio Grande do Sul and other Brazilian regions. The admixture analysis revealed a pattern characterized by the predominance of European, followed by Amerindian and African contributions. The admixture estimates from the western region of Rio Grande do Sul 8 showed a higher Amerindian contribution, if compared with the rest of the state. Genetic relationship analyses, undertaken from the comparisons of the data obtained herein and from other populations, demonstrated that Rio Grande do Sul inhabitants are genetically closer to Argentineans than to other Brazilians. The Y-STR analysis, as in previous studies, showed a higher predominance of European contribution for the patrilineages from Rio Grande do Sul, followed by negligible levels of African contribution and absence of Amerindian contribution. The X-STR results, obtained for a sample from Rio Grande do Sul and another composed by a pool of Amerindian tribes, revealed higher levels of linkage disequilibrium for the latter, probably determined by population structure, derived from bottleneck events and random genetic drift. The levels of linkage disequilibrium found for the RS sample are probably determined by admixture events. Moreover, the X-STR analysis demonstrated a higher proximity from the allelic distributions of the RS population with European populations; whereas, for the Amerindians, our results revealed a closer similarity with the allelic distributions of Asian populations, as expected. The data obtained in the present work corroborate previous results found in other Brazilian populations. However, they also bring new information, which should be investigated in other samples, to verify its real significance.

As origens das populações e o processo de povoamento das Américas são questões bastante controversas e, por isso, têm sido amplamente estudadas. O gene LDLR (low density lipoprotein receptor), que está localizado no braço curto do cromossomo 19 (p13.1-p13.3) e possui 18 éxons, bem como uma porção 3’UTR onde ocorrem dois elementos Alu completos (chamados de U e D) e um parcial, foi escolhido para esclarecer esses e outros problemas de evolução e variação genética humana. O objetivo geral deste trabalho foi verificar o que esta região hipervariável, especificamente na sua porção U, nos indicaria sobre a história evolutiva das populações ameríndias. Para este trabalho foram analisadas amostras de DNA de indivíduos nativos da Mongólia (n=24), da Sibéria (n=26), das Américas do Norte (n=11), Central (n=26) e do Sul (n=16), totalizando 14 populações e 103 indivíduos. Essas amostras foram amplificadas pela técnica de PCR (polymerase chain reaction), utilizando-se primers específicos para o segmento hipervariável U e, posteriormente, foram elas seqüenciadas automaticamente. Quatorze sítios polimórficos foram encontrados, classificáveis em sete haplótipos, sendo que o sítio 3809 apresentou uma transversão de C para G não descrita na literatura. A estimativa geral de diversidade nucleotídica (π) foi de 0.62%, considerada alta para um marcador autossômico. Verificou-se uma certa uniformidade haplotípica entre a Ásia e a América, mas com a diferenciação maior ocorrendo entre a Mongólia e a América+Sibéria. Não foi detectada diferenciação significativa entre nativos sul e centro-americanos. De um modo geral, o estudo desse marcador confirmou uma provável origem asiática para as populações ameríndias e apoiou a hipótese de uma única onda de migração no processo de povoamento pré-histórico das Américas.

A Doença de Machado-Joseph (DMJ) ou Ataxia Espinocerebelar 3 (SCA3) é uma doença neurodegenerativa, herdada de modo autossômico dominante. Está associada a uma expansão (CAG)n na região codificadora do gene MJD1, localizado na região cromossômica 14q32.1. A idade de início dos sintomas, entre pacientes brasileiros, ocorre em média aos 32 (12) anos, geralmente após o início da vida reprodutiva; deste modo, a maioria dos portadores tem sua prole antes de manifestarem os sintomas da doença. Para avaliar a capacidade de um determinado genótipo em produzir descendência, criou-se o conceito de valor adaptativo genético, que é uma medida simples de sucesso reprodutivo. Quanto maior a prole de um genótipo, mais fácil seria a sua manutenção no pool gênico da população. O objetivo deste trabalho foi analisar o valor adaptativo genético das famílias com DMJ e compará-lo com dados obtidos a partir do Censo de 2000 do Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE). A amostra estudada compreendeu 828 indivíduos (415 afetados) de 82 famílias com diagnóstico molecular de DMJ, originárias do Rio Grande do Sul (RS), com história reprodutiva conhecida e nascidos a partir de 1903. A prevalência estimada da doença foi de 3,5:100.000 habitantes na nossa região. O número médio de filhos das mulheres da população do RS e das mulheres com DMJ, em 2000, foi 1,90 e 2,93 ± 2,3, respectivamente, e esta diferença foi estatisticamente significativa (p<0,001). Se o valor adaptativo da população for considerado 1,0, o da DMJ seria de 1,54. Entretanto, a melhor alternativa para analisar o valor adaptativo é a que avalia o número médio de filhos das mulheres eméritas – com mais de 45 anos ou já falecidas – pois essas já completaram seu período reprodutivo. Embora o número médio de filhos das eméritas com DMJ fosse de 3,89±2,52 e o das mulheres eméritas da população geral fosse de 3,52 filhos, essa diferença não foi significante. Ao contrário, quando se comparou o número médio de filhos das mulheres afetadas com o de suas parentes assintomáticas, houve diferença estatisticamente significativa (p<0,001): tanto na comparação independentemente da idade – 2,93±2,3 e 1,66±1,6, respectivamente – quanto entre as mulheres eméritas – 3,89±2,5 e 2,68±2,0,respectivamente. Se o valor adaptativo das consangüíneas assintomáticas, aos 45 anos, for considerado 1,0, o das portadoras de DMJ, aos 45 anos, seria de 1,45. Esses resultados demonstram um aumento no valor adaptativo genético dos pacientes com DMJ, tanto quando comparados com a população do estado do RS, como com seus parentes assintomáticos. A ausência de significância estatística na comparação entre as mulheres eméritas com DMJ e as da população pode ter decorrido do pequeno tamanho amostral no grupo de doentes (n=112); ou pode indicar um aumento da fecundidade no início da vida reprodutiva das DMJ, característica que desapareceria posteriormente. O aumento da fecundidade encontrado em pacientes com DMJ foi semelhante ao já descrito anteriormente nas portadoras de Doença de Huntington (DH) e na Ataxia Espinocerebelar 1 (SCA1), também doenças neurodegenerativas, quando foram comparadas às suas parentes não portadoras. Especulamos a possibilidade de haver pleiotropismo antagonístico nos genes envolvidos por essas mutações. Esse conceito sugere que um gene pode conferir efeitos benéficos no início da vida (desenvolvimento e maturação sexual rápidos, com aumento da fecundidade e do valor adaptativo do indivíduo que o porta), trazendo efeitos deletérios em fases mais tardias (como os sintomas de uma doença neurodegenerativa e a apoptose neuronal). Em conclusão, a presença da mutação DMJ conferiu um valor adaptativo aumentado às suas portadoras eméritas, quando comparadas às suas parentes não portadoras eméritas, a mesma tendência aparecendo nas comparações feitas com a população geral. / Machado-Joseph Disease (MJD), also known as Spinocerebellar Ataxia 3 (SCA3) is an autosomal dominant neurodegenerative disorder. MJD is associated to a (CAG)n expansion at the MJD1 gene coding region, located at chromosome region 14q32.1. The average age of onset is 32 (12) years among Brazilian patients, usually after the start of their reproductive period, so that most carriers have their offspring before the disease starts. In order to evaluate the capacity of a determined genotype in producing descendants, the genetic fitness concept was created, which is a simple measure of reproductive success. The larger the offspring of a genotype, the easier it would be to maintain itself in the genic pool of a certain population. The aim of the present work was to analyze the genetic fitness of MJD families and to compare it to data obtained from the 2000 Brazilian Census, provided by the Brazilian Institute of Geography and Statistics (IBGE). 824 individuals (415 affected) were studied, belonging to 82 families with a molecular diagnosis of MJD, and proceeding from the state of Rio Grande do Sul (RS). Only individuals with known reproductive history, and born after 1903 were included. From the obtained data, the disease prevalence was estimated at 3.5:100,000 inhabitants in our region. The average number of children (NC) from the women’s population in RS and MJD families, in 2000, were of 1.90 and 2.93 ± 2.3, respectively, with a statistically significant difference (p<0.001). If the population fitness is considered as 1,0, MJD fitness would be 1.54. However, the best alternative to analyze fitness is by evaluating the average NC from emeritus women, with more than 45 years or deceased: in other words, from individuals who have already completed their reproductive period. Although the average NC of emeritus women with MJD was 3.89±2.52 and of emeritus women from the population was 3.52 children, this difference was not significant. In contrast, when the mean NC from affected women was compared with the one of their asymptomatic relatives, a statistically significant difference was found (p<0.001), such as in the comparison independent of age: 2.93±2.3 and 1.66±1.6, respectively. Among the emeritus women, the average NC were of 3.89±2.5 and 2.68±2.0, in affected and asymptomatic groups, respectively (p<0.001). If the fitness of the asymptomatic relatives, at 45 years, is considered as 1,0, that of MJD carriers, at the same age, would be 1.45. These results showed an increase in genetic fitness of MJD patients, when compared with their asymptomatic relatives. The absence of statistical significance in a comparison between emeritus, MJD and population women, could have occurred due to the smallness of the sample size from the affected group (n=112), or it could indicate an increased fecundity at the beginning of MJD reproductive life, a characteristic that would disappear later. The increased fitness found in MJD patients was similar to that described before in Huntington Disease (HD) and Spinocerebellar Ataxia 1 (SCA1) carrier women, also neurodegenerative disorders, when compared to their non-carrier relatives. We speculate the possibility of antagonistic pleotropism acting in genes with these mutations. This concept suggests that a gene can, at the beginning of life, confer benefits (fast development and sexual maturation, with a heightened fecundity and fitness of the affected individual), and still bring deleterious effects in more delayed phases (as the symptoms of a neurodegenerative disease and neuronal apoptosis). In conclusion, the presence of the MJD mutation conferred an increased fitness to the emeritus carriers, when compared to their non-carrier relatives, and the same trend appeared in the comparisons made with the population of our State.

Os microssatélites ou Short Tandem Repeats (STRs) são marcadores moleculares que caracterizam-se por altos níveis de heterozigozidade, dispersão uniforme, alto nível de reprodutividade, codominância e possibilidade de genotipagem por métodos rápidos e simples. Devido a estas características, estes marcadores têm sido amplamente utilizados em genética de populações, estudos evolutivos e análises forenses. Na presente tese, foram utilizados STRs autossômicos e de cromossomos sexuais (X e Y) para a avaliação da estrutura genética da população do Rio Grande do Sul (RS). Grupos ameríndios brasileiros foram também investigados, como uma das populações parentais importantes para a formação da atual população do RS. Para tanto, foram avaliados os sistemas D2S1338, D3S1358, D5S818, D7S820, D8S1179, D13S317, D16S539, D18S51, D19S433, D21S11, FGA, vWA, CSF1PO, TPOX e TH01 (autossômicos); DXS9895, DXS7132, DXS6800, DXS9898, DXS6789, DXS7133, DXS7130, HPRTB, GATA31E08, DXS7423 e DXS10011 (do cromossomo X) e DYS19, DYS389I/II, DYS390, DYS391, DYS392, DYS393, DYS437, DYS438, DYS439, e DYS385 (do cromossomo Y). As amostras utilizadas foram amplificadas através da técnica de reação em cadeia da polimerase, a partir de primers com fluorórofos incorporados. Os produtos de amplificação foram posteriormente determinados por intermédio de separação em eletroforese capilar. Os resultados obtidos a partir de STRs autossômicos demonstraram a ausência de subestruturação quando a população do Rio Grande do Sul foi comparada com populações 6 de outras regiões do país. As análises de mistura racial exibiram um padrão caracterizado pela predominância da contribuição européia, seguida por ameríndia e africana. As estimativas de miscigenação por regiões do Estado revelaram que a porção oeste do Rio Grande do Sul exibiu os maiores níveis de contribuição ameríndia, se comparados com o restante do Estado. As análises de relacionamento genético, obtidas a partir de dados produzidos na presente tese e também de outras populações, demonstraram que a população do Rio Grande do Sul apresenta maior proximidade genética com a Argentina do que com alguns Estados brasileiros. Em relação às análises realizadas a partir de microssatélites do cromossomo Y, nossos resultados, corroborando estudos prévios, demonstraram uma forte predominância da contribuição européia para a população do Estado, seguida por níveis insignificantes de contribuição africana e ausência de contribuição ameríndia. Os resultados obtidos por intermédio dos marcadores de cromossomo X, para amostras do Rio Grande do Sul e de um pool de amostras de ameríndios, revelaram maiores níveis de desequilíbrio de ligação para o grupo ameríndio, sendo provavelmente reflexos da estruturação populacional relacionada à ação de gargalo de garrafa e à deriva genética. Os níveis de desequilíbrio de ligação encontrados para a amostra sulina foram de menor intensidade, e provavelmente correlacionados à miscigenação. Outrossim, as análises realizadas a partir destes marcadores demonstraram ainda uma maior proximidade das distribuições alélicas da amostra do Rio Grande do Sul com populações européias; enquanto que, para o grupo ameríndio, os resultados revelaram uma maior similaridade com as populações asiáticas. Os dados obtidos na presente Tese confirmam alguns resultados encontrados a partir de análises com outras populações brasileiras, mas também trazem novas informações, que devem ser investigadas em outras amostras populacionais, a fim de que se estabeleça o seu real significado. / Microsatelites or Short Tandem Repeats (STR) are molecular markers characterized by high levels of heterozygozity, uniform dispersal among the human genome, codominance and possibility of genotyping by fast and simple laboratory methods. Due to these characteristics, these markers have been widely used in population genetics, evolution studies and forensic genetics. In the present work, we used autosomes, as well as X-STRs and Y-STRs, to evaluate the genetic structure of the Rio Grande do Sul (RS) population. Amerindian groups were also investigated, due to their importance, as a parental group, for the formation of the present RS population. For this purpose, markers D2S1338, D3S1358, D5S818, D7S820, D8S1179, D13S317, D16S539, D18S51, D19S433, D21S11, FGA, vWA, CSF1PO, TPOX and TH01 (autosomic); DXS9895, DXS7132, DXS6800, DXS9898, DXS6789, DXS7133, DXS7130, HPRTB, GATA31E08, DXS7423 and DXS10011 (from the X chromosome) and DYS19, DYS389I/II, DYS390, DYS391, DYS392, DYS393, DYS437, DYS438, DYS439, and DYS385 (from the Y chromosome ) were used. The samples were amplified by PCR with fluorescent primers, and the PCR products were then analyzed by capillary electrophoresis. Regarding the autosomic STR results, no substructuring was observed between Rio Grande do Sul and other Brazilian regions. The admixture analysis revealed a pattern characterized by the predominance of European, followed by Amerindian and African contributions. The admixture estimates from the western region of Rio Grande do Sul 8 showed a higher Amerindian contribution, if compared with the rest of the state. Genetic relationship analyses, undertaken from the comparisons of the data obtained herein and from other populations, demonstrated that Rio Grande do Sul inhabitants are genetically closer to Argentineans than to other Brazilians. The Y-STR analysis, as in previous studies, showed a higher predominance of European contribution for the patrilineages from Rio Grande do Sul, followed by negligible levels of African contribution and absence of Amerindian contribution. The X-STR results, obtained for a sample from Rio Grande do Sul and another composed by a pool of Amerindian tribes, revealed higher levels of linkage disequilibrium for the latter, probably determined by population structure, derived from bottleneck events and random genetic drift. The levels of linkage disequilibrium found for the RS sample are probably determined by admixture events. Moreover, the X-STR analysis demonstrated a higher proximity from the allelic distributions of the RS population with European populations; whereas, for the Amerindians, our results revealed a closer similarity with the allelic distributions of Asian populations, as expected. The data obtained in the present work corroborate previous results found in other Brazilian populations. However, they also bring new information, which should be investigated in other samples, to verify its real significance.

Submitted by Felipe Aoki Goncalves (felipe.aoki.goncalves@gmail.com) on 2018-07-21T23:15:39Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao_FelipeAokiGoncalves.pdf: 4019040 bytes, checksum: f74776a8e1e4eb45c987837446b58d50 (MD5) / Rejected by Adriana Aparecida Puerta null (dripuerta@rc.unesp.br), reason: Prezado Felipe, O documento enviado para a coleção Campus Unesp Rio Claro foi recusado pelo(s) seguinte(s) motivo(s): - As datas da capa e da página de rosto estão diferentes (uma está fevereiro e outra abril/2018) - Na capa, excluir o texto "Dissertação apresentada..." - Na página de rosto falta o cabeçalho da universidade - No Resumo e no Abstract faltam as palavras-chave e Keywords. Em caso de dúvidas entre em contato pelo email repositoriounesp@reitoria.unesp.br. Agradecemos a compreensão e aguardamos o envio do novo arquivo. Atenciosamente, Biblioteca Campus Rio Claro Repositório Institucional UNESP https://repositorio.unesp.br on 2018-07-23T13:48:49Z (GMT) / Submitted by Felipe Aoki Goncalves (felipe.aoki.goncalves@gmail.com) on 2018-07-27T00:34:47Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao_final.pdf: 4850341 bytes, checksum: d57d8babaceaadcbca57c2bb4fd7152e (MD5) / Rejected by Adriana Aparecida Puerta null (dripuerta@rc.unesp.br), reason: Prezado Felipe, O documento enviado para a coleção Campus Unesp Rio Claro foi recusado pelo(s) seguinte(s) motivo(s): - Erro de grafia/digitação no título da capa e na página de rosto. O termo "Tillandsia aeranthos (Lois.)" está sem a letra D. Observe que o arquivo digital deve estar idêntico ao trabalho impresso. Agradecemos a compreensão e aguardamos o envio do novo arquivo. Atenciosamente, Biblioteca Campus Rio Claro Repositório Institucional UNESP https://repositorio.unesp.br on 2018-07-27T16:27:13Z (GMT) / Submitted by Felipe Aoki Goncalves (felipe.aoki.goncalves@gmail.com) on 2018-07-28T08:53:03Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao_final.pdf: 4851233 bytes, checksum: 00282da22e9621485fa889dc2eeab49a (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Paula Santulo Custódio de Medeiros null (asantulo@rc.unesp.br) on 2018-07-30T12:01:24Z (GMT) No. of bitstreams: 1 gonçalves_fa_me_rcla.pdf: 4841253 bytes, checksum: 6c28e380988306df3a38620b31ae18da (MD5) / Made available in DSpace on 2018-07-30T12:01:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 gonçalves_fa_me_rcla.pdf: 4841253 bytes, checksum: 6c28e380988306df3a38620b31ae18da (MD5) Previous issue date: 2018-05-17 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O continente sul-americano é o mais biodiverso da Terra, sendo palco da interação de complexos processos climáticos e geológicos que moldaram sua biota de forma muito heterogênea. Um crescente numero de estudos estudos de filogeografia de especies Sul Americanos tem auxiliado no entendimento das respostas evolutivas envolvidas em tal diversificação. A família Bromeliaceae é caracterizada por extensa radiação adaptativa, apresenta heterogeneidade de estratégias reprodutivas e padrões distintos de fluxo gênico e estrutura genética. Tillandsia aeranthos (Lois.) L.B. Smith é uma bromeliácea epífita que habita matas ciliares por toda região dos Pampas. Sua ocorrência em densas populações ao longo de ambientes geograficamente distintos a torna um bom modelo para a estudos sobre a influência de fatores geoclimáticos e ecológicos no padrão de distribuição da variabilidade genética e decorrentes processos de especiação ou manutenção da integridade da espécie. Esta dissertação foi dividida em dois manuscritos a fim de fornecer dados e análises úteis para a compreensão da evolução desta espécie neotropical. No Capítulo 1 foi realizada a amplificação heteróloga em Tillandsia aeranthos e Tillandsia recurvata de marcadores microssatélites nucleares previamente desenvolvidos para outras espécies de Bromeliaceae. Conjuntos de sete e seis marcadores apresentaram índices satisfatórios de polimorfismos em T. aeranthos e T. recurvata, respectivamente. A análise dos dados em duas populações de 20 indivíduos de cada espécie apresentou resultados compatíveis com sistemas reprodutivos distintos de cada espécie: fecundação cruzada predominante em T. aeranthos e auto-fecundação predominante em T. recurvata. No Capítulo 2 investigamos os padrões de variabilidade e estrutura genética e sistema reprodutivo de Tillandsia aeranthos ao longo da distribuição geográfica da espécie. Um total de 203 indivíduos de 13 localidades foi analisado a partir de sete marcadores microssatélites nucleares; 12 indivíduos tiveram 13 regiões universais plastidiais sequenciadas; e 74 indivíduos com 543 flores foram submetidos a experimentos de polinização manual. Os dados de microssatélites nucleares apontam altos níveis de diversidade genética em T. aeranthos (HE=0,806; HO=0,745) apesar de todas as regiões plastidiais sequenciadas terem sido monomórficas, sem diferenciação haplotípica. Foi observada também baixa diferenciação populacional (FST=0,031) sem correlação significativa entre as distâncias genéticas e geográficas das populações (isolamento-por-distância). Sinais moderados de eventos recentes de gargalo genético foram detectados em somente quatro das 13 populações, indicando que a maior parte das populações apresentou estabilidade demográfica durante o último máximo glacial. Os experimentos de manipulação polínica evidenciaram auto-incompatibilidade total em T. aeranthos. Em conclusão, os resultados demonstram altos níveis de diversidade genética e estabilidade demográfica na espécie, com fluxo gênico ocorrendo sem barreiras geográficas evidentes dentro da área de ocorrência de Tillandsia aeranthos. / South America is the most biodiverse subcontinent of the planet, bearing interactions between complex geoclimatic processes that heterogeneously molded its biota. An increasing number of Phylographic studies in South American species have helped us to understand the evolutionary responses that gradually formed such great biodiversity. Bromeliaceae is a family of herbaceous plants characterized by extreme adaptive radiation, its species present a wide range of reproductive strategies and distinct patterns of gene flow and genetic structure. Tillandsia aeranhos (Lois.) L.B. Smith is an epiphyte that inhabits mainly riparian forests of the Pampas biome. It occurs in dense populations across distinct habitats and topographic profiles, which makes it a good model species in studies about the influence of geo-climatic and ecologic factors over patterns of genetic variability and structure, as well as subsequent evolutionary processes of speciation or species cohesion maintenance. This dissertation presents two manuscripts aiming to provide data and analysis that will allow a better comprehension of T. aeranthos evolutionary history. In Chapter 1, we performed cross-amplifications of several nuclear microsatellite loci developed for other bromeliad species in Tillandsia aeranthos and T. recurvata. Sets of seven and six markers amplified satisfactorily and were polymorphic in T. aeanthos an T. recurvata respectively. The following analysis were carried in two populations of 20 individuals for each species and results were in accordance to opposite breeding sytems of each species: predominant cross-pollination in T. aeranthos and predominant self-pollination in T. recurvata. In Chapter 2, we investigated patterns of genetic diversity, phylogeographic structure and breeding system in T. aeranthos across most of its geographic distribution. Altogether, 203 individuals were analyzed from seven microsatellite markers; 12 individuals were analyzed from 13 chloroplast regions; and controlled pollinatin experiments were carried in 74 individuals bearing 543 flowers. Nuclear microsatellite data suggests very high levels of genetic diversity (HE=0,806; HO=0,74). Contrastingly, all chloroplast regions were monomorphic, with no haplotype differentiation. Genetic structure was very low (FST=0,031)) and isolation-by-distance hypothesis was refuted. Moderated signs of recent bottleneck events were detected in four out of 13 populations, suggesting that most populations were demographically stable since the last glacial maximum. Controlled pollination experiments showed complete self-incompatibility in T. aeranthos. In conclusion, our results sow high levels of genetic diversity and demographic stability in the species, with gene flow occurring freely without evidence of geographic barriers across the species geographic distribution. / FAPESP: 2016/03777-4 / FAPESP: 2014/15586-6

Considerando a importância do comportamento meiótico e da recombinação para regular os níveis de variabilidade genética, realizamos o primeiro estudo sobre a meiose masculina e feminina de seis membros do grupo da Drosophila willistoni, um dos mais representativos da família Drosophilidae na região Neotropical. Como ponto de partida, foi necessário padronizar condições técnicas para tal, adaptando protocolos pré-existentes e estabelecidos por outros autores para espécies procedentes do Hemisfério Norte, como a cosmopolita Drosophila melanogaster e a D. ananassae. A qualidade dos preparados e a resolução por nós encontradas para as espécies do grupo willistoni, foi muito superior às obtidas para D. melanogaster, sendo comparável com a excelência das figuras meióticas propiciadas pela D. ananassae. Apesar do baixo número de células em divisão (cerca de 45% dos machos, em média) detectadas, conseguimos caracterizar as fases da divisão meiótica em primórdios das gônadas de larvas macho de D. willistoni e o padrão de sinapse do par sexual e dos autossomos. Inicialmente, foi realizada a análise de duas diferentes populações, cuja prole apresenta sinais de instabilidade genética (como hipermutabilidade e atrofia gonadal), sob condições de cultivo em temperaturas fisiológica e restritiva. Em machos de ambas as linhagens (exceto em uma delas, onde observou-se um indivíduo aneuplóide XO), e nos machos da primeira geração de cruzamento entre as duas populações, não foram observadas irregularidades meióticas nem aberrações cromossômicas, tanto sob temperatura fisiológica, quanto restritiva. Análise posterior da população híbrida, mantida em laboratório, entretanto, permitiu a detecção de quebras, de pontes anafásicas, e de figuras compatíveis com quiasmas no segundo par cromossômico No braço esquerdo do cromossomo II (o chamado IIL) nesta população híbrida, segregam três inversões, a IILF (sub-terminal) e as inversões IILD+E, (na região mediana). Analisando paralelamente as configurações dos cromossomos politênicos interfásicos das glândulas salivares larvais e os meióticos dos primórdios das gônadas de cada larva macho individualmente, observou-se que sempre que ocorreram pontes anafásicas, os indivíduos eram heterozigotos para pelo menos a inversão IILF, e que as quebras detectadas no segundo cromossomo ocorreram na região subterminal de um dos braços. Estes achados fazem supor que nestes machos, estaria havendo recombinação dentro da alça de inversão formada em heterozigotos para a inversão IILF, o que necessita ser testado através de dados genéticos, em estudos futuros. Em machos de uma população natural desta espécie, também observou-se figuras compatíveis com quiasmas na parte terminal do mesmo braço esquerdo do segundo cromossomo, onde segrega a inversão IILH. Já a meiose de machos de uma população de cada uma das espécies crípticas D. paulistorum, D. tropicalis, D. equinoxialis, D. insularis e da não críptica D. nebulosa, mostrou-se regular, não sendo encontradas evidências de não-disjunções, quebras e pontes anafásicas, como em D. willistoni, apesar de todas elas apresentarem polimorfismo cromossômico para inversões paracêntricas (embora menor). O estudo futuro de novas populações deverá esclarecer se a D. willistoni suporta ou não, maiores níveis de recombinação em machos do que as outras espécies, e se estes achados podem ser interpretados como uma estratégia da D. willistoni (considerada como ancestral às outras) para manter altos níveis de polimorfismo, sem perdas gaméticas importantes, nem comprometimento da estabilidade de seu sistema genético A meiose de fêmeas de Drosophila willistoni e de D. paulistorum também foi caracterizada em linhagens igualmente polimórficas, de ambas as espécies. A detecção citológica de recombinação, entretanto, não foi possível, devido à peculiaridade dos cromossomos de oócitos, de assumirem a forma de cariossomo, altamente compactada justo nas fases de prófase I.

A apolipoproteína CIII (Apo CIII) participa na regulação do metabolismo das lipoproteínas ricas em triacilgliceróis (TG). Hipertrigliceridemia (HTG) é conhecida como um fator de risco para doença arterial coronariana (DAC). Neste trabalho foi analisada a relação entre o polimorfismo SstI da Apo CIII (genótipos CC, CG, GG) e níveis plasmáticos de TG em 159 indivíduos japoneses que residem no Sul do Brasil. Nós analisamos as concentrações plasmáticas de TG e colesterol total (TC) por método enzimático. Também foram determinadas as concentrações plasmáticas das lipoproteínas HDL-c e LDL-c por método direto. As análises de DNA foram realizadas por reação de cadeia da polimerase (PCR), seguido pela digestão da SstI. Os produtos da PCR digeridos foram visualizados em 5% de gel em agarose usando brometo de etídio. Embora raros os alelos G, foram altamente prevalentes em nosso estudo populacional (0.416), em comparação com os caucasianos (0.00 - 0.11). A distribuição genotípica estava de acordo com o equilíbrio de Hardy - Weinberg.O alelo G foi quase duas vezes mais prevalente no grupo HTG (N = 51) em comparação com o grupo NTG (N = 108) (p <0,001). O nosso estudo demonstra uma significativa associação entre a presença do alelo G a HTG em indivíduos japoneses que residem no Sul do Brasil. / Apolipoprotein CIII (Apo CIII) participates in the regulation of the metabolism of triglyceride-rich lipoproteins. Hypertriglyceridemia (HTG) is a known risk factor coronary artery disease (CAD). In the present study we examined the relationship between Apo CIII SstI polymorphism (CC, CG, GG genotypes) and plasma TG levels in a group of 159 Japanese individuals living in the South of Brazil. We analyzed TG and total cholesterol (TC) levels by enzymatic method. We also determined the lipoprotein HDL and LDL by a direct method. DNA samples were analyzed by polymerase chain reaction (PCR) followed by SstI digestion. Digested PCR products were run on 5% agarose gel and visualized by ethidium bromide staining. Rare G allele was highly prevalent in our study population (0,416) as compared to the Caucasians (0.00 – 0.11). The genotypic distribution was in agreement with Hardy-Weinberg equilibrium. G allele was almost two times more prevalent in the HTG group (N = 51) as compared to NTG group (N = 108) (p < 0,001). Our study shows a significant association between rare G allele and HTG in Japanese individuals living in the South of Brazil.

O Complexo Principal de Histocompatibilidade (MHC) é um sistema genético reconhecidamente polimórfico em populações humanas. Em porções específicas dos genes que compõem o MHC de populações humanas também foi evidenciada a ação da seleção natural em nível molecular. Em várias espécies de vertebrados onde estes genes foram estudados diferentes níveis de variação, composição gênica e organização foram detectados, mantendo, entretanto, as características que os tornam tão interessante de ser estudados. Para mamíferos marinhos, as questões sobre a variação no MHC servem de pano de fundo para o entendimento sobre o sistema imunológico destas espécies e suas particularidades em relação ao ambiente marinho e a evolução destes genes em organismos não-modelos. No presente trabalho, duas espécies de cetáceos, a toninha ou franciscana (Pontoporia blainvillei) e a baleia-franca-austral (Eubalaena australis), foram investigadas quanto aos níveis de variação no gene DQB1 do MHC. O segundo exon da cadeia beta do gene DQ foi amplificado em 25 amostras de toninha e 18 amostras de baleia franca. Os fragmentos de 212pb (pares de base) resultantes do processo de amplificação foram clonados e, tiveram analisados por seqüenciamento 171pb correspondentes ao sítio de ligação ao peptídeo antigênico (PBR). Uma amostra de toninha e um par mãe-filhote de baleia-franca-austral foram analisadas quanto à expressão do gene DQB a partir de amostras de pele. A evidência de seleção natural a nível molecular nesta porção do gene é confirmada por um excesso de substituições não sinônimas em relação às substituições sinônimas (em um contexto de neutralidade as substituições sinônimas acumulam-se na mesma taxa de mutações) através da razão dN (não sinônimas) e dS (sinônimas). Para confirmar os desvios da neutralidade (Ho= dN/dS=1), foi usada a estatística z. Os valores de dN/dS para toninha e baleia-franca-austral foram, respectivamente, dN/dS = 2,32 (p=0,014) e dN/dS =3,75 (p= 0,001). Estes valores, as características das seqüências e a evidência de expressão desses genes na pele de cetáceos estão de acordo com os pressupostos de seleção positiva para esta região do gene e sugerem funcionalidade para estes genes nestas duas espécies. Há evidências de mais de uma cópia do gene para baleia-franca-austral. Foram descritos 6 alelos para toninha e 17 alelos para baleia-franca-austral sendo que um dos alelos é compartilhado entre as duas espécies, sugerindo que essa linhagem alélica é anterior à divergência entre odontocetos e misticetos. Paralelamente a este trabalho, o cariótipo de toninha foi descrito através de um processo de cultivo celular a partir da córnea de dois exemplares recém-mortos. Seu número cromossômico 2n=44 corrobora a estabilidade cariotípica descrita para cetáceos. / The Major Histocompatibility Complex is a highly polimorphic genetic system described to human populations. It is clear that a particular region from these genes is under natural selection which results in different patterns of variation from those expected under neutrality. In other vertebrates these genes were studied, these special characteristics seems to be preserved despite specific genomic organization and variation levels. In marine mammals, questions adressed to MHC molecular variation are focused in questions concerned on environmental restrictions and molecular evolution in non-model organisms. In the present study, two marine mammal species were surveyed concerning genetic variability using the gene DQB exon 2. Samples from 25 franciscana dolphins (Pontoporia blainvillei) and 18 southern right whales (Eubalaena australis) were used to amplify a 212bp (base pair) fragment from DQB exon 2. The 171bp resulting fragment was sequenced and analized in relation to the molecular level evidence of selection. Rates of nonsynonymous (dN) and synonymous (dS) base pair substitution and departures from neutrality for dN/dS (z statistics) were calculated. For both species examined, molecular evidence of selection was confirmed. The dN/dS ratios to franciscana and southern right whale were 2.32 (p=0.014) and 3.75 (p=0.001), respectively. These values, combined to data on DQB gene expression in franciscana and southern right whale skin and less restrictive aminoacid usage in both species, suggest a functional signature to sequences cetacean derived. Additionally, 6 alleles were described to franciscana dolphins and 17 to southern right whales. One more evidence of selection acting in this particular genomic region is provided from the fact that both species share one allele, suggesting that this allelic lineage was present before the splitting between mysticeti and odontoceti. To provide addtional information on franciscana dolphins the karyotype of P. blainvillei is presented. The karyotype was obtained from corneal culture of two dead animals. The diploid number 44 confirms the clear prevalence of this pattern among cetaceans.