Viele Studien beschreiben Entwicklung und Sekundärmetabolismus des filamentösen Pilzes Aspergillus nidulans, was zu einem besseren Verständnis der Regulation des Sekundärmetabolismus von Pilzen auf molekularer Ebene beisteuert. Dennoch muss ein umfassendes Bild dieser Regulation noch gezeigt werden. Aus diesem Grund geben wir in dieser Arbeit einen ausführlichen Überblick von Transkriptom und Metabolom, welcher die Antworten der lichtabhängigen Entwicklung dieses bodenbürtigen Pilzes aufzeigt. Licht begünstigt die Entwicklung asexueller Sporen und hemmt die Entstehung sexueller Fruchtkörper (Kleistothetien), die bevorzugt im Dunkeln gebildet werden. Insgesamt werden 2.014 Gene, was etwa 20 % dessen Genom entspricht, während unterschiedlicher Entwicklungsphasen in Licht und Dunkelheit differenziell exprimiert und beeinflusst. Licht kontrolliert die Entwicklung, indem es die Genexpression während 24-48 Stunden der Entwicklung erheblich induziert. Die gezielte Repression von Lichtsensor-Komplexen in der frühen sexuellen Entwicklung könnte die Genexpression und schließlich die Differenzierung des Pilzes verzögern. Die erhöhte Anzahl verzögerter Gene während der sexuellen Differenzierung zeigt eine zeitliche Übereinstimmung mit der sekundär induzierten und verzögerten Bildung von Konidien bei sexueller Entwicklung. Interessanterweise zeigen die Transkriptome vom vegetativen Wachstum und der frühen sexuellen Entwicklung ähnliche Expressionsmuster auf, was sich in den äußerst ähnlichen Phänotypen beider Phasen widerspiegelt. Ein charakteristisches Merkmal während der späten Phase asexueller Sporenbildung im Licht stellt die Expression von Genen für die Antwort auf Stress dar. Dadurch könnten Resistenzen gegenüber verschiedensten abiotischen Stressbedingungen, einschließlich UV-Bestrahlung and daraus entstehende reaktive Sauerstoffspezies, in den luftverbreiteten Konidien gebildet werden. Die Entwicklung der Pilze ist von psi (precocious sexual inducer) Faktoren, welche Prostaglandin verwandte Oxylipin-Hormone sind, abhängig. PsiC1(5,8-DiHOE) erscheint spezifisch während der frühen sexuellen Entwicklung in Dunkelheit. Im Laufe der sexuellen Entwicklung aktiviert A. nidulans viele Gene für den Zellwandabbau, einschließlich Gene für den Abbau von Pflanzen- und Bakterienzellwand sowie für die Hydrolyse von Polysacchariden. Dadurch könnten Energie und die Grundbausteine für die erfolgreiche Fertigstellung sexueller Fruchtkörper während Nährstoffmangelbedingungen mobilisiert wird. Während der späten sexuellen Entwicklung sind Sekundärmetaboliten vorhanden, welche den Schutz der Fruchtkörper und Askosporen z. B. gegen Fressfeinde gewährleisten und daher den Askosporen beim Keimen in Anwesenheit einer geringeren Anzahl von Mitstreitern unterstützt. Das Emericellamide C Metabolit wird ausgeschieden bevor die Reifung der Kleistothecien und die sexuelle Entwicklung abgeschlossen sind. Viele herunter regulierte Gene für die Synthese von Aminosäuren und die geringe Anreicherung zellulärer Aminosäuren in der späten sexuellen Entwicklung spiegeln einen Ruhezustand wider, bei welchem die Translation aufgrund des Mangels an Aminosäuren gestoppt wurde. Der Pilz initiiert den programmierten Zelltod in der späten sexuellen Entwicklung durch die Expression von Apoptose-Genen, welche mit einem Alterungsprozess einhergeht. Unsere Ergebnisse zeigen, dass während der lichtabhängigen Entwicklung des Pilzes ein beachtlicher Teil des Genoms (20 %) durch das Lichtsignal beeinflusst wird. Dieses führt zu verschiedenen Antworten einschließlich der Produktion von Sekundärmetaboliten und anderen Anpassungen, welche es zusammengenommen dem Pilz ermöglichen sich anzupassen und in den vorherrschenden Umweltbedingungen zu überleben.

Six isoflavones derived from Millettia griffoniana namely, 4’-methoxy-7-O-[(E)-3-methyl-7hydroxymethyl-2,6 octadienyl]isoflavone (7-O-DHF), Griffonianone C (Griff C), 7-O-geranylformononetin (7-O-GF), 3’,4’-dihydroxy-7-O-[(E)-3,7-dimethyl-2,6-octadienyl]isoflavone (7-O-GISO), Griffonianone E (Griff E), 4’-O-geranylisoliquiritigenin (4-O-GIQ) were tested for potential oestrogenic activities in three different oestrogen receptor alpha (ERα) dependent assays, namely a recombinant yeast assay, a reporter gene assay based on stably transfected MCF-7 cells (MVLN cells) and the induction of alkaline phosphatase in Ishikawa cells. The oestrogenic activities of isoflavones from Millettia griffoniana could be completely suppressed by the pure oestrogen antagonist, fulvestrant. The expression of Ki-67, proliferating cell nuclear antigen (PCNA) and cyclin D1 (CD1) mRNA used as indicator of cell proliferation in MCF-7 cells was assayed. Based on these in vitro results, Griff C was further tested in vivo. The main objective of this part of the work was to study the mechanistic basis of the oestrogenicity Three different doses of Griff C (2, 10, or 20 mg/kg BW) of Griff C in ovariectomised Wistar rats. 17β-oestradiol (E2: 10 µg/kg BW) was used as positive control. They were treated daily for three consecutive days and sacrificed 24 hours after receiving the last dose. The whole uterus was removed and weight. Liver and vena cava fragments were also collected and stored together with uteri in liquid nitrogen for subsequent real-time PCR to evaluate the effects of Griff C on the regulation of some relevant oestrogen–responsive genes in the uterus, the liver and the vena cava. The role of Griff C in apoptosis or in cell survival, through mediation of the phosphatidylinositol 3 kinase-Akt (PI3K-Akt) signaling pathway, was also investigated. Western blot analysis revealed that Griff C slightly increased the phosphorylation of Akt at its serine 473 residue. In this work, oestrogenic properties of the isoflavones derived from Millettia griffoniana are described using reporter gene assays and the oestrogen-inducible alkaline phosphatase Ishikawa model for the first time. These in vitro data were verified in vivo showing the regulation of the expression of various relevant oestrogen-responsive genes by Griff C. The spectrum of its activity was clearly similar to that of 17β-oestradiol on uterine hepatic and vena cava tissues of ovariectomised rats except for the proliferative response. However Griff C remained 100 to 1000 times less effective than oestradiol. These findings confirmed that some of the biological effects attributed to Millettia griffoniana are closely related to oestrogen-mediated action.

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Six isoflavones derived from Millettia griffoniana namely, 4’-methoxy-7-O-[(E)-3-methyl-7hydroxymethyl-2,6 octadienyl]isoflavone (7-O-DHF), Griffonianone C (Griff C), 7-O-geranylformononetin (7-O-GF), 3’,4’-dihydroxy-7-O-[(E)-3,7-dimethyl-2,6-octadienyl]isoflavone (7-O-GISO), Griffonianone E (Griff E), 4’-O-geranylisoliquiritigenin (4-O-GIQ) were tested for potential oestrogenic activities in three different oestrogen receptor alpha (ERα) dependent assays, namely a recombinant yeast assay, a reporter gene assay based on stably transfected MCF-7 cells (MVLN cells) and the induction of alkaline phosphatase in Ishikawa cells. The oestrogenic activities of isoflavones from Millettia griffoniana could be completely suppressed by the pure oestrogen antagonist, fulvestrant. The expression of Ki-67, proliferating cell nuclear antigen (PCNA) and cyclin D1 (CD1) mRNA used as indicator of cell proliferation in MCF-7 cells was assayed. Based on these in vitro results, Griff C was further tested in vivo. The main objective of this part of the work was to study the mechanistic basis of the oestrogenicity Three different doses of Griff C (2, 10, or 20 mg/kg BW) of Griff C in ovariectomised Wistar rats. 17β-oestradiol (E2: 10 µg/kg BW) was used as positive control. They were treated daily for three consecutive days and sacrificed 24 hours after receiving the last dose. The whole uterus was removed and weight. Liver and vena cava fragments were also collected and stored together with uteri in liquid nitrogen for subsequent real-time PCR to evaluate the effects of Griff C on the regulation of some relevant oestrogen–responsive genes in the uterus, the liver and the vena cava. The role of Griff C in apoptosis or in cell survival, through mediation of the phosphatidylinositol 3 kinase-Akt (PI3K-Akt) signaling pathway, was also investigated. Western blot analysis revealed that Griff C slightly increased the phosphorylation of Akt at its serine 473 residue. In this work, oestrogenic properties of the isoflavones derived from Millettia griffoniana are described using reporter gene assays and the oestrogen-inducible alkaline phosphatase Ishikawa model for the first time. These in vitro data were verified in vivo showing the regulation of the expression of various relevant oestrogen-responsive genes by Griff C. The spectrum of its activity was clearly similar to that of 17β-oestradiol on uterine hepatic and vena cava tissues of ovariectomised rats except for the proliferative response. However Griff C remained 100 to 1000 times less effective than oestradiol. These findings confirmed that some of the biological effects attributed to Millettia griffoniana are closely related to oestrogen-mediated action.

There is a lack of low toxicity, specific anticancer therapies and in many cancer types there are limited effective treatments. Enhancer RNAs are noncoding RNA transcripts transcribed from enhancer regions. Increasing evidence of the function of eRNA in gene regulation suggests the possibility of eRNA involvement in cancer development. This report examines literature on enhancer RNA as a potent component in transcription control specifically in cancer development. Therefore, I conducted a systematic literature review to further clarify the involvement of eRNAs in cancer. There is strong evidence of eRNA upregulating oncogenes. For instance, the eRNA (CCAT1) upregulates the oncogene MYC in colorectal cancer. Other eRNAs were also found to be required for p53-dependent cell-cycle arrest and tumour inhibition. A study showed the interplay of a long noncoding RNA with eRNAs in p53-regulated enhancers, while another showed p53-bound enhancer regions transcribing an eRNA which mediates G1 arrest, DNA repair, and tumorigenesis through its interaction with the (BRCA2) gene. Finally, a study across numerous cancer patient samples revealed a cancer/lineage specificity of eRNAs and explored the clinical feasibility of eRNA-targeted therapy. These studies demonstrate how eRNAs can be a link in cancer signalling pathways both as a regulator of oncogenes and tumour suppressor genes, as well as suggest a promising future of eRNA-targeted cancer therapy.

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Die Aufklärung der Mechanismen zur Kontrolle der Genexpression ist eines der wichtigsten Probleme der modernen Molekularbiologie. Detaillierte experimentelle Untersuchungen sind enorm aufwändig aufgrund der komplexen und kombinatorischen Wechselbeziehungen der beteiligten Moleküle. Infolgedessen sind bioinformatische Methoden unverzichtbar. Diese Dissertation stellt drei Methoden vor, die die Vorhersage der regulatorischen Elementen der Gentranskription verbessern. Der erste Ansatz findet Bindungsstellen, die von den Transkriptionsfaktoren erkannt werden. Dieser sucht statistisch überrepräsentierte kurze Motive in einer Menge von Promotersequenzen und wird erfolgreich auf das Genom der Bäckerhefe angewandt. Die Analyse der Genregulation in höheren Eukaryoten benötigt jedoch fortgeschrittenere Techniken. In verschiedenen Datenbanken liegen Hunderte von Profilen vor, die von den Transkriptionsfaktoren erkannt werden. Die Ähnlichkeit zwischen ihnen resultiert in mehrfachen Vorhersagen einer einzigen Bindestelle, was im nachhinein korrigiert werden muss. Es wird eine Methode vorgestellt, die eine Möglichkeit zur Reduktion der Anzahl von Profilen bietet, indem sie die Ähnlichkeiten zwischen ihnen identifiziert. Die komplexe Natur der Wechselbeziehung zwischen den Transkriptionsfaktoren macht jedoch die Vorhersage von Bindestellen schwierig. Auch mit einer Verringerung der zu suchenden Profile sind die Resultate der Vorhersagen noch immer stark fehlerbehafted. Die Zuhilfenahme der unabhängigen Informationsressourcen reduziert die Häufigkeit der Falschprognosen. Die dritte beschriebene Methode schlägt einen neuen Ansatz vor, die die Gen-Anotation mit der Regulierung von multiplen Transkriptionsfaktoren und den von ihnen erkannten Bindestellen assoziiert. Der Nutzen dieser Methode wird anhand von verschiedenen wohlbekannten Sätzen von Transkriptionsfaktoren demonstriert. / Understanding the mechanisms which control gene expression is one of the fundamental problems of molecular biology. Detailed experimental studies of regulation are laborious due to the complex and combinatorial nature of interactions among involved molecules. Therefore, computational techniques are used to suggest candidate mechanisms for further investigation. This thesis presents three methods improving the predictions of regulation of gene transcription. The first approach finds binding sites recognized by a transcription factor based on statistical over-representation of short motifs in a set of promoter sequences. A succesful application of this method to several gene families of yeast is shown. More advanced techniques are needed for the analysis of gene regulation in higher eukaryotes. Hundreds of profiles recognized by transcription factors are provided by libraries. Dependencies between them result in multiple predictions of the same binding sites which need later to be filtered out. The second method presented here offers a way to reduce the number of profiles by identifying similarities between them. Still, the complex nature of interaction between transcription factors makes reliable predictions of binding sites difficult. Exploiting independent sources of information reduces the false predictions rate. The third method proposes a novel approach associating gene annotations with regulation of multiple transcription factors and binding sites recognized by them. The utility of the method is demonstrated on several well-known sets of transcription factors. RNA interference provides a way of efficient down-regulation of gene expression. Difficulties in predicting efficient siRNA sequences motivated the development of a library containing siRNA sequences and related experimental details described in the literature. This library, presented in the last chapter, is publicly available at http://www.human-sirna-database.net