Dietary inclusion of sufficient lysine is very critical for optimizing pig’s growth performance. The objectives of this project were to study the effects of dietary lysine at different concentrations on (1) the growth performance and carcass characteristics, (2) the muscle gene expression profile and the possible alterations to the metabolic and signaling pathways, (3) the muscle fatty acid profile, and (4) the plasma concentrations of growth-related hormones of late-stage finishing pigs. Nine crossbred barrows were assigned to 3 dietary treatments (lysine-deficient, equate, and -excess diets) according to a completely randomized experimental design. During the 5-week feeding trial, pigs were allowed ad libitum access to experimental diets and water. All pigs and experimental diets were weighed individually each week during feeding trial to determine growth performance. After harvest, the carcass characteristics were determined and muscle samples were collected from longissimus dorsi for mRNA and fatty acid profiling, while the jugular vein blood was collected at the end of four weeks for analyses of three growth-related hormones. While the average daily gain showed a quadratic relationship, the dressing percentage and total lean cut weight both increased linearly with dietary lysine concentrations. Results of muscle gene expression data showed that dietary lysine deficiency may lead to decreased protein synthesis, increased protein degradation and lipid accumulation, while dietary lysine excess may lead to decreased protein degradation and increased lipid biosynthesis. Fatty acid (FA) composition data showed that different dietary lysine concentrations altered the intramuscular fat (IMF) content and FA composition, especially the unsaturated FAs. In particular, dietary lysine deficiency increased the IMF content and the proportion of mono-unsaturated FAs. Hormone analyses showed that the plasma concentrations of insulin and growth hormone were not affected by dietary lysine, whereas the concentration of insulin-like growth factor 1 was decreased by either dietary lysine deficiency or excess. Collectively, lysine may function as a signaling molecule to regulate the expression of genes related to protein turnover and lipid metabolism in the muscle of finishing pigs, causing differences in growth performance, carcass characteristics, and FA composition. IGF-1 may be a controlling growth factor that is sensitive to dietary lysine.

O hepatoblastoma é uma neoplasia embrionária hepática que ocorre na faixa pediátrica, rara, sendo bastante heterogênea devido aos seus diferentes componentes epiteliais e mesenquimais. Pouco ainda se sabe a respeito de sua patogênese. Utilizando um microscópio de captura a laser foram dissecadas áreas de componente epitelial do hepatoblastoma e áreas de tecido hepático adjacente não acometido. Destas amostras obtidas de pacientes não submetidos ao tratamento prévio, foram extraídos RNA e confeccionados cDNA microarrays, para análise comparativa da expressão gênica, seguida de validação por método imunohistoquímico de alguns genes selecionados. Comparando neoplasia e tecido hepático em duas amostras criopreservadas foram identificados 70 genes diferencialmente expressos, sendo 19 hiperexpressos e 51 hipoexpressos no tumor. A maioria dos genes encontrados foi mapeada nos cromossomos 1 e 2. Dos genes selecionados para validação por método imuno-histoquímico, destacaram-se o receptor de Insulina e o TFE3 (genes hipoexpressos no cDNA microarray). A imunomarcação para o receptor de insulina foi positiva tanto no tecido hepático não acometido quanto no componente epitelial fetal do hepatoblastoma , mas foi consistentemente negativa nas amostras de componente embrionário (9/9). A imunomarcação para o TFE3 foi positiva no tecido hepático não acometido, e nos componentes epitelial fetal e embrionário, em proporção variável das células com expressão mais intensa no componente embrionário. As reações imuno-histoquímicas para os outros genes selecionados não permitiram interpretação conclusiva. A alta proporção dos genes diferencialmente expressos localizados nos cromossomos 1 e 2 reflete os achados citogenéticos relatados na literatura relacionada ao hepatoblastoma . Achados de imunoexpressão de proteínas relacionadas aos genes TFE3 e receptor de insulina no tecido hepático e nos diferentes componentes do hepatoblastoma são inéditos e sugerem participação da via sinalizadora da insulina na patogênese destes tumores / Hepatoblastoma is a rare tumor, and little is known about its pathogenesis and genetic alterations. Using a laser capture microdissection microscope we sampled areas of epithelial component of hepatoblastoma prior chemotherapy and their normal liver counterpart in order to perform the comparative gene expression analysis followed by the validation of selected genes by immunohistochemistry. Comparing tumor and non-diseased liver in two frozen samples, 70 differentially expressed genes were found, 19 overexpressed and 51 underexpressed in the tumor. Most of the genes were located at chromosomes 1 and 2. Of the genes selected for validation by immunohistochemistry, the most interesting findings came from Insulin receptor and TFE3 (both underexpressed genes). Insulin receptor was positive in non diseased liver and in the fetal component of the Hepatoblastoma but was consistently negative in the embryonal component (9/9 cases). The TFE3 staining was positive in the normal liver and fetal and embryonal components of the tumor in variable proportion of the cells, more marked in the embryonal component. The higher proportion of genes located at chromosomes 1 and 2 corroborates the cytogenetics findings reported in the literature related to Hepatoblastoma . The immunohistochemistry findings of different expression of insulin receptor in the fetal and embryonal components of Hepatoblastoma and the positivity of TFE3 in normal liver and in the tumors epithelial components deserves further investigation regarding the role of these genes to the pathogenesis of Hepatoblastoma

O hepatoblastoma é uma neoplasia embrionária hepática que ocorre na faixa pediátrica, rara, sendo bastante heterogênea devido aos seus diferentes componentes epiteliais e mesenquimais. Pouco ainda se sabe a respeito de sua patogênese. Utilizando um microscópio de captura a laser foram dissecadas áreas de componente epitelial do hepatoblastoma e áreas de tecido hepático adjacente não acometido. Destas amostras obtidas de pacientes não submetidos ao tratamento prévio, foram extraídos RNA e confeccionados cDNA microarrays, para análise comparativa da expressão gênica, seguida de validação por método imunohistoquímico de alguns genes selecionados. Comparando neoplasia e tecido hepático em duas amostras criopreservadas foram identificados 70 genes diferencialmente expressos, sendo 19 hiperexpressos e 51 hipoexpressos no tumor. A maioria dos genes encontrados foi mapeada nos cromossomos 1 e 2. Dos genes selecionados para validação por método imuno-histoquímico, destacaram-se o receptor de Insulina e o TFE3 (genes hipoexpressos no cDNA microarray). A imunomarcação para o receptor de insulina foi positiva tanto no tecido hepático não acometido quanto no componente epitelial fetal do hepatoblastoma , mas foi consistentemente negativa nas amostras de componente embrionário (9/9). A imunomarcação para o TFE3 foi positiva no tecido hepático não acometido, e nos componentes epitelial fetal e embrionário, em proporção variável das células com expressão mais intensa no componente embrionário. As reações imuno-histoquímicas para os outros genes selecionados não permitiram interpretação conclusiva. A alta proporção dos genes diferencialmente expressos localizados nos cromossomos 1 e 2 reflete os achados citogenéticos relatados na literatura relacionada ao hepatoblastoma . Achados de imunoexpressão de proteínas relacionadas aos genes TFE3 e receptor de insulina no tecido hepático e nos diferentes componentes do hepatoblastoma são inéditos e sugerem participação da via sinalizadora da insulina na patogênese destes tumores / Hepatoblastoma is a rare tumor, and little is known about its pathogenesis and genetic alterations. Using a laser capture microdissection microscope we sampled areas of epithelial component of hepatoblastoma prior chemotherapy and their normal liver counterpart in order to perform the comparative gene expression analysis followed by the validation of selected genes by immunohistochemistry. Comparing tumor and non-diseased liver in two frozen samples, 70 differentially expressed genes were found, 19 overexpressed and 51 underexpressed in the tumor. Most of the genes were located at chromosomes 1 and 2. Of the genes selected for validation by immunohistochemistry, the most interesting findings came from Insulin receptor and TFE3 (both underexpressed genes). Insulin receptor was positive in non diseased liver and in the fetal component of the Hepatoblastoma but was consistently negative in the embryonal component (9/9 cases). The TFE3 staining was positive in the normal liver and fetal and embryonal components of the tumor in variable proportion of the cells, more marked in the embryonal component. The higher proportion of genes located at chromosomes 1 and 2 corroborates the cytogenetics findings reported in the literature related to Hepatoblastoma . The immunohistochemistry findings of different expression of insulin receptor in the fetal and embryonal components of Hepatoblastoma and the positivity of TFE3 in normal liver and in the tumors epithelial components deserves further investigation regarding the role of these genes to the pathogenesis of Hepatoblastoma

INTRODUÇÃO: Recentemente, a classificação molecular do câncer gástrico (CG) emergiu como opção promissora para definir subgrupos prognósticos, distinguir o comportamento biológico, além de permitir a identificação de potenciais alvos terapêuticos para drogas específicas. Por meio de técnicas moleculares, o CG foi dividido em 4 subtipos: instabilidade de microssatélites (MSI), vírus Epstein-Barr (EBV)-positivo, genomicamente estável (GS) e instabilidade cromossômica (CIN). Os custos associados à complexidade técnica das metodologias moleculares são ainda um obstáculo para sua implantação na prática de rotina. OBJETIVOS: Determinar os grupos da classificação molecular por meio da expressão proteica de marcadores associados a cada subtipo. Comparar as diferentes classificações moleculares existentes e propor um novo modelo. MÉTODOS: Foram avaliados, retrospectivamente, 287 pacientes com CG submetidos à gastrectomia-D2 curativa, por meio da construção de tissue microarray. A expressão das proteínas de reparo do DNA, E-caderina e p53 foram avaliadas por imuno-histoquímica (IH), determinando os grupos MSI, GS e CIN, respectivamente. O EBV foi detectado por hibridização in situ (ISH). RESULTADOS: Após avaliação histopatológica, 179 (62,4%) pacientes foram classificados como CIN, 58 (20,2%) MSI, 30 (10,5%) EBV e 20 (7%) como GS. Os subtipos associaram-se com características distintas, tais como: gênero masculino (EBV, p=0.101); idade avançada (MSI, p=0,017), menor relação neutrófilo-linfócito (CIN, p=0,029), gastrectomia total (EBV, p < 0,001), localização distal (MSI, p=0,004), Laurén difuso (GS, p < 0,001), e estádio avançado (GS, p=0,014). O subtipo MSI apresentou melhor sobrevida livre de doença (SLD) (82,8%), seguido pelo EBV e CIN (ambos com 70%) e GS (50%) (p=0.005). A sobrevida global (SG) foi maior nos tumores MSI (75,9%), seguido pelo EBV (73,3%), CIN (65.4%) e GS (45%, mediana de 25 meses) (p=0.007). Em análise multivariada, gastrectomia total, pT, pN e os subtipos tumorais foram fatores significativos associados à SLD (MSI p=0,012; EBV p=0,037; CIN p=0,018; GS referência). Do mesmo modo, o tipo de cirurgia, pT, e os subtipos tumorais foram fatores independentes associados a SG (MSI p=0,010; EBV p=0,006; CIN p=0,025; GS referência). Com base no risco de recidiva dos pacientes do estudo, nova classificação, que inclui 5 subtipos, foi proposta. Evidenciou-se que a classificação por risco e cluster tiveram melhor acurácia para identificar recidivas e óbitos respectivamente. CONCLUSÃO: A análise IH/ISH foi capaz de determinar subtipos de CG com características clinicopatológicas e prognósticos distintos, reproduzindo os subtipos obtidos pela classificação molecular / BACKGROUND: Recently, the molecular classification of gastric cancer (CG) emerged as a promising option to define prognostic subgroups, to distinguish biological behavior, and to identify potential therapeutic targets for specific drugs. Through molecular techniques, GC was divided into 4 subtypes: microsatellite instability (MSI), Epstein-Barr virus (EBV) positive, genomically stable (GS) and chromosomal instability (CIN). The costs associated with the technical complexity of the molecular methodologies are still an obstacle to its implementation in routine practice. OBJECTIVES: To determine molecular classification groups by means of protein expression of markers associated with each subtype. To compare the different existing molecular classifications and propose a new model. METHODS: We retrospectively evaluated 287 CG patients submitted to curative D2-gastrectomy through the construction of tissue microarray. Expression of the DNA repair proteins, E-cadherin and p53 were evaluated by immunohistochemistry (IH), determining the MSI, GS and CIN subtypes, respectively. EBV was detected by in situ hybridization (ISH). RESULTS: After the histopathological evaluation, 179 (62.4%) patients were classified as CIN, 58 (20.2%) MSI, 30 (10.5%) EBV and 20 GS (7%) as GS. The subtypes presented associations with distinct characteristics, such as: male gender (EBV, p=0.101); advanced age (MSI, p=0.017), Laurén diffuse type (GS, p < 0.001), lower neutrophil-lymphocyte ratio (CIN, p=0.029), total gastrectomy (EBV, p < 0.001), distal location (MSI, p=0.004), and advanced stage (GS, p=0.014). The MSI subtype presented better disease-free survival (DFS) (82.8%), followed by the EBV and CIN subtypes (both with 70%) and GS (50%) (p=0.005). Overall survival (OS) was higher in MSI tumors (75.9%), followed by EBV (73.3%), CIN (65.4%) and GS (45%, median of 25 months) (p=0.007). In multivariate analysis, total gastrectomy, tumor invasion, lymph node metastasis, and tumor subtypes were significant factors associated with SLD (MSI p=0.012, EBV p=0.037, CIN p=0.018, GS reference). Likewise, type of surgery, pT, and tumor subtypes were independent factors associated with OS (p=0.010, p=0.010, EBV p=0.006, CIN p=0.025, GS reference). Based on the risk of recurrence, a new classification including 5 subtypes was proposed. It was evidenced that the risk classification and cluster had better accuracy to identify recurrences and deaths respectively. CONCLUSION: The IH / ISH analysis was able to determine CG groups with clinicopathological characteristics and distinct prognoses, reproducing the subtypes obtained by the molecular classification

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:22:21Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-08-19Bitstream added on 2014-06-13T19:07:44Z : No. of bitstreams: 1 oliveira_lhb_me_arafcf.pdf: 553720 bytes, checksum: b0f8f04b07802f8bf467e43259c87fba (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / A maior expressão de alvos transcricionais e componentes da via NFkB é uma característica distintiva das células-tronco hematopoéticas (CTH) CD34+ de sangue de cordão umbilical (SCU) comparadas às CTH CD34+ de medula óssea (MO) e pode estar relacionada com o estado mais primitivo das CTH dos neonatos. No entanto, as células CD34+ são um grupo heterogêneo de célulastronco (CT) e progenitoras em diferentes estágios de maturação e diferenças na composição celular entre MO e SCU poderiam contribuir para os resultados mencionados. Estudos recentes têm identificado o marcador de superfície CD133, como um marcador de CT mais primitivas, expresso em uma subpopulação de células CD34bright, com um sugestivo potencial de hemangioblasto. Com o objetivo de caracterizar a composição celular de MO e SCU e identificar mecanismos moleculares envolvidos com a maior primitividade das células CD133+, propusemos avaliar o perfis imunofenotípico (quanto à expressão de CD34 e CD133) por citometria de fluxo e de expressão gênica de células CD34+ e células CD133+ selecionadas imunomagneticamente, de ambas as fontes, pelas técnicas de microarray e PCR em tempo real. Nossos resultados revelaram que enquanto a maioria das células CD133+ são CD34+, independente da fonte, as células CD34+ de SCU possuem uma porcentagem significativamente maior de células CD133+ do que às células CD34+ de MO. A análise de clusterização revelou que as células CD133+ de MO se agrupam com as células de SCU (CD34+ e CD133+), enquanto as CD34+ de MO aparecem como um grupo distinto. A comparação dos perfis de expressão gênica entre as células CD133+ e as células CD34+, revelou a hiper-expressão... / A higher expression of transcription targets and components of the NF-kB pathway is a distinctive feature of umbilical cord blood (UCB) CD34+ hematopoietic stem cells (HSC) when compared to bone marrow (BM) CD34+ HSC and this could be related to the more primitive state of the newborn’s HSC. However, CD34+ cells represent a heterogeneous group of cells composed by stem and progenitors cells in different developmental stages, and differences in cellular composition between both sources could contribute for these finding. The surface marker CD133 has been identified as a very primitive marker, expressed in a subpopulation of CD34bright, with a proposal hemangioblast potential. Thus, in attempt to better characterize the cellular composition of UCB and BM and to identify molecular mechanisms related to the more primitive characteristics of CD133+ cells, we proposed to evaluate the immunophenotypic profile (expression of CD34 and CD133) by flow-cytometry and the gene expression profiles of immunomagnetically selected CD34+ and CD133+ cells, from both sources, by microarray and Real time PCR. Our results highlighted that, while almost all CD133+ cells are CD34+ independently of the evaluated source, the UCB CD34+ cells showed a significantly higher proportion of CD133 expression, compared to BM CD34+ cells. After obtaining the expression profiles from distinct HSC pooled samples generated by microarrays, cluster analysis showed that BM CD133+ cells preferentially grouped with UCB cells (CD34+ and CD133+) instead of BM CD34+ cells, which appeared as a very distinct profile The comparison between CD133+ and CD34+ samples revealed the over-expression of 47 transcriptional factors (TF) in CD133+ cells, many of them well-known and related... (Complete abstract click electronic access below)

L'infertilité affecte environ 15% des couples et l'étiologie est masculine dans la moitié des cas.Cette thèse étudie trois facteurs de l'infertilité masculine et se divise en deux parties décrites ci-dessous. Dans la première partie,l'équipement chromosomique et la fragmentation de I'ADN spermatique dans les gamètes d'hommes infertiles ont été étudiés par la technique FISH et TUNEL. Chez 4 patients présentant une mosaïque gonosomique, un taux élevé de gamètes aneuploïdes et de fragmentation de I'ADN spermatique a été observé. Concernant les l3 patients ayant une anomalie chromosomique de structure, l'équipement chromosomique et l'état de I'ADN spermatique ont été analysés dans chaque gamète. Les résultats montrent que les gamètes chromosomiquement déséquilibrés ont un ADN plus fragmenté que ceux dont l'équipement chromosomique est normal ou équilibré. Dans la deuxième partie, la mise au point d'une technique d'étude du transcriptome dans les spermatozoïdes a été faite sur des échantillons de sperme frais et congelé. La combinaison d'un gradient de densités discontinues et d'une lyse des cellules somatiques permet d'éliminer complètement des cellules somatiques en récupérant le maximum possible de spermatozoïdes dans le sperme. Le kit NucleoSpin RNA XS (Macherey Nagel) est plus adapté pour I'extraction d'ARN spermatiques que le kit d'extraction d'ARN de chez Qiagen. La pureté des ARN spermatiques est vérifiée par RT-PCR et le Bioanalyzer 2700. Ces deux méthodes donnent des résultats similaires et concordants. L'analyse de microarray montre que les spermatozoïdes frais ne partagent pas le même profil d'expression génétique que les spermatozoïdes congelés. / Infertility affects about 15% of couples with male factor found in half of the cases. This Ph.D thesisinvestigates three causes of male infertility including chromosomal abnormality, genetic disorderand factors related to alterations in sperm DNA quality. The thesis is organized into two parts.In the first part, the chromosomal equipment and sperm DNA fragmentation in gametes of infertilemen were assessed by FISH and TUNEL. On the one hand, a high rate of aneuploid gametes andsperm DNA fragmentation were observed in four patients with gonosomal mosaicism. On the otherhand, analysis of chromosomal equipment and sperm nuclear DNA in each gamete from 13 patientswith structural chromosome abnormalities showed that unbalanced gametes have more fragmentedDNA than normal or balanced ones.In the second part, a technique for analysing the transcriptome in spermatozoa was developed onfresh and frozen semen. In fact, the combination of a discontinuous density gradient and a somaticcell lysis solution makes it possible to completely eliminate somatic cells and to recover as manysperms in the semen as possible. The XS NucleoSpin RNA kit (Macherey Nagel) was found to bemore suitable for RNA extraction than the RNA extraction kit from Qiagen. The purity of sperm RNA was verified by both RT-PCR and the Bíoanalyzer 2100. These two methods have yieldedsimilar and consistent results. The microarray analysis showed that fresh sperms do not share thesame gene expression profile than frozen ones.

Orientador: Dimas Tadeu Covas / Banca: Dimas Tadeu Covas / Banca: Rodrigo Alexandre Panepucci / Banca: Haroldo Wilson Moreira / Resumo: A maior expressão de alvos transcricionais e componentes da via NFkB é uma característica distintiva das células-tronco hematopoéticas (CTH) CD34+ de sangue de cordão umbilical (SCU) comparadas às CTH CD34+ de medula óssea (MO) e pode estar relacionada com o estado mais primitivo das CTH dos neonatos. No entanto, as células CD34+ são um grupo heterogêneo de célulastronco (CT) e progenitoras em diferentes estágios de maturação e diferenças na composição celular entre MO e SCU poderiam contribuir para os resultados mencionados. Estudos recentes têm identificado o marcador de superfície CD133, como um marcador de CT mais primitivas, expresso em uma subpopulação de células CD34bright, com um sugestivo potencial de hemangioblasto. Com o objetivo de caracterizar a composição celular de MO e SCU e identificar mecanismos moleculares envolvidos com a maior primitividade das células CD133+, propusemos avaliar o perfis imunofenotípico (quanto à expressão de CD34 e CD133) por citometria de fluxo e de expressão gênica de células CD34+ e células CD133+ selecionadas imunomagneticamente, de ambas as fontes, pelas técnicas de microarray e PCR em tempo real. Nossos resultados revelaram que enquanto a maioria das células CD133+ são CD34+, independente da fonte, as células CD34+ de SCU possuem uma porcentagem significativamente maior de células CD133+ do que às células CD34+ de MO. A análise de clusterização revelou que as células CD133+ de MO se agrupam com as células de SCU (CD34+ e CD133+), enquanto as CD34+ de MO aparecem como um grupo distinto. A comparação dos perfis de expressão gênica entre as células CD133+ e as células CD34+, revelou a hiper-expressão... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: A higher expression of transcription targets and components of the NF-kB pathway is a distinctive feature of umbilical cord blood (UCB) CD34+ hematopoietic stem cells (HSC) when compared to bone marrow (BM) CD34+ HSC and this could be related to the more primitive state of the newborn's HSC. However, CD34+ cells represent a heterogeneous group of cells composed by stem and progenitors cells in different developmental stages, and differences in cellular composition between both sources could contribute for these finding. The surface marker CD133 has been identified as a very primitive marker, expressed in a subpopulation of CD34bright, with a proposal hemangioblast potential. Thus, in attempt to better characterize the cellular composition of UCB and BM and to identify molecular mechanisms related to the more primitive characteristics of CD133+ cells, we proposed to evaluate the immunophenotypic profile (expression of CD34 and CD133) by flow-cytometry and the gene expression profiles of immunomagnetically selected CD34+ and CD133+ cells, from both sources, by microarray and Real time PCR. Our results highlighted that, while almost all CD133+ cells are CD34+ independently of the evaluated source, the UCB CD34+ cells showed a significantly higher proportion of CD133 expression, compared to BM CD34+ cells. After obtaining the expression profiles from distinct HSC pooled samples generated by microarrays, cluster analysis showed that BM CD133+ cells preferentially grouped with UCB cells (CD34+ and CD133+) instead of BM CD34+ cells, which appeared as a very distinct profile The comparison between CD133+ and CD34+ samples revealed the over-expression of 47 transcriptional factors (TF) in CD133+ cells, many of them well-known and related... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientadores: Carlos Eduardo Steiner, Claudia Vianna Maurer Morelli / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-19T22:10:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Scherrer_DanielZanetti_D.pdf: 3629453 bytes, checksum: 18c59f0316e08a663d1352236ede8f6e (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Cutis laxa autossômica tipo II (CLAR tipo II) é um distúrbio raro do tecido conectivo em que a pele perde sua firmeza, cedendo excessivamente e conferindo ao indivíduo um aspecto envelhecido. Sugere-se que CLAR tipo II seja a mesma entidade descrita como "síndrome da pele enrugada" e gerodermia osteodisplástica. Tal confusão quanto à nomenclatura é, em parte, causada pelo conhecimento limitado de suas bases biológicas. O presente estudo visou analisar três famílias não aparentadas com quadro típico de CLAR tipo II para mutações nos genes ATP6V0A2, SCYL1BP1 e PYCR1. Nenhuma mutação foi identificada nos genes ATP6V0A2 e SCYL1BP1. Por outro lado, a triagem de mutações por sequenciamento direto do DNA no gene PYCR1, que desempenha um papel crítico na biossíntese de prolina, revelou duas novas variantes (p.Q10X e p.A241V), com efeito patogênico predito por análises de bioinformática. Em complementação, foi determinado o perfil de expressão gênica em tecido de pele e fibroblasto a partir de dois indivíduos com CLAR tipo II pela investigação de microarranjos, identificando os genes e as vias metabólicas possivelmente alteradas em tal condição, com a finalidade de entender os mecanismos subjacentes a este tipo de cutis laxa. Foi utilizado o Human Genome U133 Plus 2.0 array (Affymetrix¿), e analisados por meio dos pacotes Affy e RankProd do BioConductor. O perfil transcricional apresentado por pele fresca pela análise de microarranjos nos indivíduos com CLAR tipo II detectou 542 genes diferencialmente expressos em comparação com controles saudáveis pareados por sexo, idade e topografia anatômica. A análise de enriquecimento das categorias de ontologia gênica, utilizando o programa DAVID, incluiu a diferenciação e desenvolvimento epidérmico, ectodérmico e de queratinócitos. As vias de sinalização mais ativadas analisadas por software Ingenuity foram relacionadas a doenças e condições dermatológicas, além de "câncer, desenvolvimento e função do tecido conjuntivo, esquelético e muscular", bem como o metabolismo lipídico. Este é o primeiro estudo utilizando investigação de microarranjos na doença CLAR tipo II. Os resultados incluíram duas novas alterações genéticas (p.Q10X e p.A241V), além de fornecer uma visão completa das vias celulares diferencialmente expressas em tal condição. Desta forma, estes resultados contribuem para uma melhor compreensão da CLAR tipo II quanto aos mecanismos moleculares e nosologia / Abstract: Autosomal recessive cutis laxa, type 2 (ARCL2), is a rare disorder of connective tissue in which the skin sags excessively, giving to the individual an aged aspect. It has been suggested that ARCL2 is the same entity described under the denominations of wrinkly skin syndrome and gerodermia osteodysplastica. Such confusion is caused, in part, due to limited knowledge of its molecular basis. In the present study three unrelated families with ARCL2 were analyzed for mutations in ATP6V0A2, SCYL1BP1, and PYCR1. No causative mutations were identified in ATP6V0A2 and SCYL1BP1. However, screening for mutations in PYCR1 revealed two new variant (p.Q10X and p.A241V) by direct DNA sequencing, with predicted pathogenic effect on bioinformatic analysis. In complementation, in order to shed some light into the molecular mechanisms underlying this type of cutis laxa, gene expression profile in skin tissue and fibroblast were studied in two patients with ARCL2 using microarray investigation. This study was performed using the Human Genome U133 Plus 2.0 array (Affymetrix¿), and analyzed using Affy and RankProd packages from Bioconductor. Transcriptional profiling in skin tissue by microarray analysis from ARCL2 patients detected 542 differentially expressed genes compared to healthy controls matched by gender, age, and anatomic region. The top enriched gene ontology categories analyzed by DAVID included the differentiation and development of keratinocytes, epidermis and ectoderm. Among the most activated signaling pathways analyzed by Ingenuity software were related diseases and dermatological conditions and "cancer, connective tissue development and function, skeletal and muscular systems" as well as lipid metabolism. This is the first study using microarray investigation in the ARCL2 disease. Our results include two new genetic alterations (p.Q10X and p.A241V) and also provide a complete view of cellular pathways differentially expressed in such condition. The present study contributed to a better understanding of ARCL2 molecular mechanisms and nosology of this group / Doutorado / Ciencias Biomedicas / Doutor em Ciências Médicas

Introdução: Os mecanismos moleculares que levam ao desenvolvimento de tumores do córtex suprarrenal ainda são pouco compreendidos. Uma alta frequência de carcinomas adrenocorticais na infância tem sido relatada nas regiões sul e sudeste do Brasil, com a presença de uma única mutação germinativa do supressor tumoral p53 (p.R337H) sendo evidenciada em 80- 97% dos casos. Outros fatores implicados na tumorigênese adrenocortical incluem a hiperexpressão das vias IGF2 e Wnt. Os microRNAs, fragmentos de RNA que não codificam proteínas, são capazes de controlar a transcrição gênica exercendo um papel importante no crescimento e proliferação celular. O papel dos microRNA na tumorigênese adrenal ainda não está totalmente elucidado. Objetivos: Avaliar diferenças no perfil de expressão de microRNAs entre tumores benignos e malignos do córtex da suprarrenal da população adulta e pediátrica. Comparar esta expressão entre as amostras caracterizadas pela presença da mutação germinativa p.R337H do supressor tumoral p53, hiperexpressão da via Wnt e da via do IGF2. Métodos: Trinta e seis pacientes não relacionados, adultos e crianças, foram estudados. Os pacientes tiveram avaliação do perfil de produção hormonal e das vias moleculares p53, IGF2 e Wnt. O perfil de expressão de microRNAs foi determinado utilizando-se produto comercial específico TaqMan MicroRNA Human Array (AppliedBiosystems, Forster City, CA, USA). Os dados de expressão foram analisados com o programa Expression Suite (AppliedBiosystems, Forster City, CA, USA) e Realtime Statmainer (Integromics, Granada, Espanha). O estudo de alvos e das redes gênicas afetadas foram estudados com o programa Ingenuity - IPA (Ingenuity, EUA). Resultados: A comparação do perfil de expressão entre adenomas e carcinomas revelou alteração de expressão em 89 e 21 miRNAs em adultos e crianças, respectivamente. Após a correção estatística para múltiplos testes, nove miRNAs mantiveram diferenças significantes em adultos e nenhum em crianças. Dentre os microRNAs com expressão alterada em adultos estavam o miR-483-3p (p=0,011), miR-1290 (p=0,011) e miR-106b (p=0,048). Esses microRNAs foram selecionados para avaliação como biomarcadores por meio de curva ROC. O miR-1290 apresentou o melhor resultado (AUC=1,0; IC 95% 1,0; p=0,003), com valores de expressão de miR-1290 de 10,3 sendo capazes de diferenciar adenomas de carcinomas em adultos com 100% de sensibilidade e especificidade. Na população pediátrica, não foi possível diferenciar adenomas de carcinomas com o uso de microRNAs individuais. A comparação direta entre o perfil de expressão de adenomas da população adulta e pediátrica revelou 38 miRNAs com alteração de expressão. O miR-483-3p e miR-483-5p estavam dentre os mais desregulados e foram os únicos a manter diferença estatística significativa (p=0,009 para ambos), estando hiperexpressos em crianças. A comparação direta do perfil de expressão entre carcinomas da população adulta e pediátrica revelou 26 microRNAs com alteração de expressão, porém sem significância estatística após correção para múltiplos testes. A comparação entre as amostras caracterizadas pela mutação p.R337H do supressor tumoral p53 revelou 53 genes alterados. A comparação entre as amostras caracterizadas por alteração do Wnt revelou 46 genes desregulados. Entretanto, essas alterações não mantiveram significância estatística após correção estatística para múltiplos testes. A comparação entre as amostras caracterizadas por alteração do IGF2 revelou 83 genes alterados, com miR-483-3p (p < 0,001), miR-483-5p (p < 0,001), miR-296-5p (p=0,047) e miR-1290 (p=0,011) mantendo significância estatística após correção para múltiplos testes. O estudo dos potenciais alvos e das redes genicas afetadas pelos miRNAs desregulados observados nesse estudo revelou novas e promissoras vias moleculares que podem ajudar a melhor entender a tumorigenese adrenocortical. Conclusões: Diferenças no perfil de expressão de microRNAs foram observadas entre tumores benignos e malignos do córtex da suprarrenal da população adulta e pediátrica. O ganho de expressão foi o evento mais comum. Os genes miR-483-3p, miR-1290 e miR-106b foram reconhecidos em diversas comparações entre os grupos de interesse e parecem apresentar papel importante na tumorigenese adrenocortical. Além disso, o miR-1290 demonstrou atuar como biomarcador capaz de diferenciar adenomas de carcinomas na população adulta. O estudo de redes gênicas potencialmente afetadas pelos microRNAs que apresentaram alteração de expressão nesse estudo poderá ajudar no melhor entendimento da tumorigênese adrenocortical / Introduction: The molecular mechanisms that lead to the development of tumors of the adrenal cortex are still poorly understood. A high frequency of pediatric adrenocortical carcinomas has been reported in South and Southeast of Brazil, and a single germline mutation of the tumor suppressor p53 (p.R337H) has been identified in 80-97% of cases. In addition, the overexpression of IGF2 and Wnt pathways are also involved in adrenal tumorigenesis. MicroRNAs, a class of small nonconding RNA, are able to control gene transcription regulating cellular growth and proliferation. However, the role of microRNA has not been fully elucidated in adrenal tumorigenesis. Objectives: To evaluate differences in the expression profile of microRNA between adult and pediatric adrenocortical tumors. To compare microRNA expression profile among samples with and without TP53, Wnt and IGF2 abnormalities. Methods: Thirty-six unrelated patients, adults and children, were studied. Patients had comprehensive hormonal evaluation and tumor samples were studied for TP53, Wnt and IGF2. The expression profile of microRNAs were determined using specific commercial product TaqMan MicroRNA Human Array (AppliedBiosystems, Forster City, CA, USA). The expression data were analyzed with the program Expression Suite (AppliedBiosystems, Forster City, CA, USA) and Realtime Statmainer (Integromics, Granada, Spain). The study of gene networks and affected targets genes have been studied with the Ingenuity program - IPA (Ingenuity, USA). Results: Comparing expression profile between adenomas and carcinomas revealed 89 and 21 deregulated miRNAs in adults and children, respectively. After false discovery rate correction, nine microRNA have maintained significant diferences in miRNAs between adults and none in children. Among microRNAs deregulated in adults were miR-483-3p (p = 0.011), miR-1290 (p = 0.011) and miR-106b (p = 0.048). These microRNAs were selected for evaluation as biomarkers through ROC curve. The miR- 1290 presented the best result (AUC = 1.0; IC 95% 1.0; p = 0.003), with values of expression of miR-1290 of 10.3 being able to differentiate adenomas from carcinomas with 100% sensitivity and specificity. It was not possible to differentiate adenomas from carcinomas by using microRNAs. The direct comparison between the expression profile of adult and pediatric adenomas revealed 38 degulated miRNAs. The miR-483-3p and miR-483-5p were hiperexpressed in children and were the only ones that keept a statistically significant difference (p = 0.009 for both). The direct comparison of the expression profile between adult and pediatric carcinomas revealed 26 deregulated microRNAs, but without statistical significance after correction for multiple testing. The comparison between samples characterized by the p.R337H mutation of tumor suppressor p53 revealed 53 genes deregulated. The comparison between samples characterized by alteration of Wnt reveled 46 microRNAs deregulated. However, after statistical correction for false discovery rate none of them maintained significance. The comparison between samples characterized by change in the IGF2 gene revealed 83 deregulated microRNAs, miR-483-3 p (p < 0.001), miR-483-5 p (p < 0.001), miR-296-5 p (p = 0.047) and miR-1290 (p = 0.011) maintaining statistical significance after correction for false discovery rate. The study of potential targets and molecular networks affected by the deregulatad microRNAs showed promising new molecular pathways that may help better understand the adrenocortical tumorigenese. Conclusions: There were changes in the microRNAs expression profile between malignant and benign tumors of the adrenal cortex of adult and pediatric population. Hyperexpression were the most common presentation. MiR-483-3p, miR-1290 and miR-106b were recognized in various comparisons among groups of interest and appear to have an important role in adrenocortical tumorigenese. In addition, the miR- 1290 can act as a biomarker differentiating adenomas from carcinomas in the adult population. The study of molecular networks potentially affected by the microRNAs deregulated culd contribute to better understanding of adrenocortical tumorigenesis

Introdução: A hiperplasia prostática benigna (HPB) é apontada como um dos mais comuns problemas de saúde associado ao envelhecimento dos homens. A incidência da doença começa a aumentar a partir dos 40 anos de idade, e se torna frequente em cerca de 50% dos homens com 50 anos e em quase 90% dos homens após a oitava década. A etiopatogenia da HPB ainda não foi totalmente elucidada, mas sabe-se que alguns fatores aumentam os riscos de aparecimento do problema. Seu melhor entendimento contribuiria substancialmente para o estabelecimento de um consenso terapêutico para a doença. Nesse sentido, os marcadores moleculares têm sido pesquisados na tentativa de auxiliar ou mesmo suplantar a eficiência dos métodos tradicionais. MicroRNAs (miRNAs) são uma classe de pequenos RNA regulatórios (19-25 nucleotídeos), não codificadores que possuem um papel fundamental no controle da expressão gênica. Essas pequenas moléculas estão envolvidas em vários processos celulares fisiológicos e patológicos. Alguns estudos demonstraram que os miRNAs 143 e 145 têm papel fundamental na diferenciação e proliferação celular da musculatura lisa. A ação de miRNAs na HPB ainda foi pouco explorada. Objetivos: Analisar a expressão do miR-143 e de seus genes e proteínas alvo ERK5 e KRAS e do miR-145 e dos seus genes e proteínas alvo MAP3K3 e MAP4K4, em pacientes portadores de HPB e comparar os perfis de expressão destes com parâmetros clínicos dos pacientes. Material e Métodos: Para análise dos miRNAs e dos seus genes alvo, foram estudados 44 pacientes diagnosticados com HPB submetidos à ressecção transuretral da próstata ou prostatectomia aberta. A análise da expressão foi realizada pela técnica de RT-PCR quantitativo. O grupo controle foi composto de tecido prostático normal de dois pacientes jovens doadores de órgãos. A análise proteica foi feita a partir de 38 pacientes, pela técnica de Western Blotting. Resultados: Os miRNA 143 e 145, apresentaram superexpressão em 62,5% e 73,8% dos casos, respectivamente. O gene ERK5 apresentou subexpressão de 59,4%, evidenciando um possível controle negativo por parte do miR-143. O gene MAP4K4 apresentou subexpressão na totalidade das amostras estudadas, demonstrando um possível controle por parte do miR-145. Os genes KRAS e MAP3K3 apresentaram superexpressão de 79,4% e 61,5% das amostras, respectivamente. De acordo com a expressão proteica, encontramos perfis semelhantes aos da expressão gênica. Foi encontrada maior expressão das proteínas KRAS e MAP3K3. Considerando a expressão gênica e proteica comparadas aos parâmetros clínicos, somente a proteína ERK5 apresentou significância (p=0,019), estando mais presente em pacientes com próstatas > 60 gramas. Conclusão: A superexpressão dos miRNAs 143 e 145 encontrada neste estudo pode estar envolvida na etiopatogenia da HPB alterando a homeostase do tecido fibromuscular principalmente, controlando proliferação e diferenciação. A superexpressão gênica e a forte expressão proteica de KRAS também pode estar envolvida na etiopatogenia da HPB, já que esta molécula quando ativada é responsável pelo estímulo de vias que resultam na proliferação, sobrevivência, motilidade celular e tráfego intracelular. A superexpressão do MAP3K3 pode estar sendo responsável pela angiogênese que ocorre em HPB. A subexpressão de MAP4K4, neste caso possivelmente controlada por miR-145, pode estar deixando de regular negativamente mTOR, gerando uma proliferação celular irregular responsável pela HPB. A detecção das proteínas em níveis semelhantes aos que foram encontrados na expressão gênica reforça estas hipóteses. / Introduction: Benign prostatic hyperplasia (BPH) is one of the most common male health problems associated with aging. The incidence of disease starts to increase after 40 years, and compromises half of men in the fifths and almost 90% over 80 years. The pathogenesis of BPH has not been fully elucidated, but it is known that some factors increase the risk of occurrence of the problem. A better understanding of BPH pathogenesis would substantially contribute to the establishment of a therapeutic consensus for the disease. Thus, molecular markers have been investigated attempting to help or even overcome the efficiency of traditional methods. MicroRNAs (miRNAs) are a class of small non-coding regulatory RNA (19-25 nucleotides) that plays a key role in gene expression control. These small molecules are involved in various physiological and pathological cellular processes. Some studies have shown that miRNAs 143 and 145 play a fundamental role in cellular differentiation and proliferation of smooth muscles. The action of miRNAs in BPH has been poorly explored. Objectives: Analyze the expression of miR-143 and its target genes and proteins ERK5 and KRAS and miR-145 and its target genes and proteins MAP3K3 and MAP4K4, in patients with BPH and compare their expression profiles with clinical parameters of patients. Material and Methods: For analysis of miRNAs and its target genes, we studied 44 patients diagnosed with BPH undergoing transurethral resection of the prostate or open prostatectomy. The expression analysis was performed by quantitative RT-PCR. Control group consisted of normal prostate tissue from two young patients organ donors. Protein analysis was done from of 38 patients using Western Blotting technique. Results: miR-143 and 145 presented overexpression in 62.5% and 73.8% of cases, respectively. The ERK5 gene demonstrated underexpression in 59.4%, indicating a possible control by the miR-143. MAP4K4 gene showed underexpression in 100% of samples and could be under a potential control by the miR-145. KRAS and MAP3K3 genes revealed overexpression of 79.4% and 61.5% of cases, respectively. According protein expression, to find similar profiles of gene expression. We found an increased expression of the proteins MAP3K3 and KRAS. Considering the gene expression and protein compared to clinical parameters, only the protein ERK5 showed significance (p = 0.019), being more present in patients with prostates > 60 grams. Conclusions: Overexpression of miRNAs 143 and 145 found in this work may be involved in the pathogenesis of BPH mainly by changing the fibromuscular tissue homeostasis, controlling proliferation and differentiation. Overexpression of KRAS may also be involved in the pathogenesis of BPH, since this molecule when activated can trigger cell proliferation, survival, intracellular trafficking and motility. Overexpression of MAP3K3 can be responsible for BPH angiogenesis. The MAP4K4 underexpression, in this case possibly controlled by miR-145 overexpression, could inhibit mTOR pathway, leading to irregular cell proliferation responsible for disease. Detection of proteins at similar levels to those found in gene expression reinforce our hypothesis.