A adrenoleucodistrofia ligada ao X (X-ALD) é a doença peroxissomal mais freqüente, com uma incidência de 1:20.000 homens na população geral, sendo identificada em todos os grupos étnicos. O gene envolvido na X-ALD é o gene ABCD1 (ATP-Binding Cassette transporter subfamily D member 1), que codifica uma proteína de membrana peroxissomal, ALDP. Mutações nesse gene são relacionadas ao acúmulo de ácidos graxos de cadeia muito longa (very long chain fatty acids – VLCFA) em todos os tecidos e fluidos corporais, especialmente no sistema nervoso e glândulas adrenais. Até o momento, mais de 1200 mutações já foram descritas neste gene. Três fenótipos principais são claramente identificados entre homens afetados: a forma cerebral (CALD), caracterizada por resposta inflamatória no SNC, a forma não inflamatória, AMN e a insuficiência adrenal isolada, também chamada de Addison-only. Não há correlação entre o tipo de mutação e o fenótipo clínico e uma possível explicação para essa alta variabilidade fenotípica poderia ser a ação de fatores ambientais e genes modificadores. Nesta tese está descrita, provavelmente, a primeira série de casos de pacientes sul-americanos com X-ALD. Foram avaliados aspectos moleculares da X-ALD em uma série de 38 famílias procedentes desde a Argentina até o Amazonas, relacionando-os com dados epidemiológicos e com a avaliação da taxa de sensibilidade e especificidade da análise de VLCFA em mulheres; e foi realizada a busca por potenciais genes modificadores que atuem, por CNV, na variabilidade fenotípica da X-ALD. Encontraram-se 36 mutações diferentes: apenas uma delas recorreu em 3 famílias. Doze destas mutações foram novas: a sua morbidade foi sustentada principalmente pelos graves rearranjos ou códons de parada prematuros por elas produzidos (p.Pro623Leu, p.Glu577X, p.Tyr33_Pro34fsX34, p.Arg538fs, p.Ala232fsX64, p.Trp137fsX57, p.Leu628Glu, p.Ile481Phe, p.Ala95fsX11, p.Gln55X, p.Arg401Gly e p.Ser358fsX42). Quatro situações (ou 10% da série) foram documentadas como mutações de novo. Como era de se esperar, não foi possível determinar nenhuma correlação entre genótipos e fenótipos. Uma das famílias foi identificada a partir de uma menina com CALD e desvio completo da inativação do X. Através da curva de Kaplan-Meyer, descrevemos a idade média de início das três formas principais nos homens: o início do Addison–only foi em média (IC de 95%) aos 7,4 (5,4-9,4) anos, da CALD, aos 10,9 (9,1-12,7) anos, e da AMN, aos 26,4 (20,3-32,5) anos. Descrevemos também a sobrevida média da CALD como de 24,7 (19,8-29,6) anos. Na presente série, 54 dos 87 afetados (ou 62%) apresentavam o fenótipo CALD, uma taxa maior do que a descrita na literatura (de 45 a 57%). Procuramos alguma evidência que vinculasse esse aparente excesso de formas desmielinizantes com a latitude de origem dos casos, à semelhança da esclerose múltipla: nossos resultados foram negativos. Em um subgrupo de famílias foi possível comparar o status genético final de 50 mulheres (heterozigotas versus normais) decorrente da investigação molecular, com os diagnósticos prévios levantados pela investigação bioquímica dos VLCFA. Encontramos uma elevada taxa de casos VLCFA falso-negativos, de 72,5%, muito maior do que a descrita na literatura (20%) e encontramos também dois casos de mulheres com VLCFA falso-positivos. Concluímos que o uso dos VLCFA deve ser evitado no aconselhamento genético. Finalmente, voltamos aos hemizigotos, em busca de genes candidatos a modificadores de fenótipos, através da associação dos mesmos com específicas variações no número de cópias (copy number variation - CNV) em 29 genes selecionados por seu papel na inflamação, metabolismo dos lipídios ou regeneração do sistema nervoso. A estratégia foi investigar CNVs destes genes através da técnica da Multiple Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) em um grupo de 85 pacientes espanhóis e brasileiros: 39 com AMN e 46 com CALD. Conseguimos identificar CNVs em nove destes genes. Interações potenciais entre estes genes foram inferidas a partir da ferramenta da web Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins (STRING) versão 9. A análise das redes criadas identificou três nódulos principais, com a POMC (Proopiomelanocortina) sendo a proteína central. Nós então sugerimos estes genes e a própria POMC como genes candidatos a modificadores do fenótipo X-ALD. / The X-ALD is the most frequent peroxisomal disease with a pan-ethnic incidence of 1:20,000 males in the general population. The gene involved in X-ALD is the ABCD1, which encodes a protein of the peroxisomal membrane, ALDP. Mutations in this gene are related to the accumulation of VLCFA in all tissues and body fluids, especially in the nervous system and adrenal glands. To date, more than 1200 mutations have been described in the gene. Three phenotypes are clearly identified among affected men: the cerebral form (CALD), characterized by inflammation in the CNS, the non-inflammatory form, adrenomyeloneuropathy (AMN), and Addison-only. There is no genotype-phenotype correlation, in spite of the high phenotypic variability observed in affected relatives. This thesis probably describes the first case series of South American patients with X-ALD. We have evaluated the molecular features of X-ALD, correlating them with epidemiological data in a series of 38 South American families. We have also evaluated the sensitivity and specificity of VLCFA in women, and have searched potential modifier genes that may act by CNV in the male phenotypic variability of X-ALD. We found 36 different mutations, only one recurring in three families. Twelve were new mutations: its morbidity was sustained mainly by major rearrangements or stop codons produced by them (p.Pro623Leu, p.Glu577X, p.Tyr33_Pro34fsX34, p.Arg538fs, p.Ala232fsX64, p.Trp137fsX57, p.Leu628Glu, p.Ile481Phe, p.Ala95fsX11, p.Gln55X, p.Arg401Gly and p.Ser358fsX42). Four (or 10% of the series) were documented as de novo mutations. As was expected, no genotype-phenotype correlation was found. One family was identified from a girl with CALD and complete deviation of X inactivation. By Kaplan-Meyer analysis, we have described the onset of the three main forms in men: the mean (95% CI) age at onset of Addison-only was 7.4 (5.4 - 9.4) years, of CALD, 10.9 (9.1 - 12.7) years, and of AMN, 26.4 (20.3 - 32.5) years. We have also estimated the survival of CALD as 24.7 (19.8 to 29.6) years. In this series, 54 of the 87 affected male (or 62%) had the phenotype CALD, a rate higher than that described in the literature (45-57%). We look for any evidence that relates the apparent excess of demyelinating forms with latitude of origin of cases, like multiple sclerosis: the results were negative. In a subgroup of families, the molecular analyses allowed us to compare the genetic status of 50 women (heterozygous versus normal) with the previous biochemical diagnoses raised up by VLCFA. A high rate of false negative VLCFA was disclosed, of 72.5%, significantly greater than the 20% described in literature. We have also found two false positives VLCFA results in females. We conclude that the use of VLCFA should be avoided in genetic counseling. Finally, we turned to hemizygotes, in search of candidate genes that could modify the X-ALD phenotype, chosen by for their role in inflammation, lipid metabolism or in the regeneration of the nervous system. The strategy was to investigate CNVs of these genes through the technique of Multiple Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) in a group of 85 Spanish and Brazilian patients: 39 with AMN and 46 with CALD. We have identified nine CNVs in these genes. Potential interactions between these genes were inferred from the tool Web Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes / Proteins (STRING) version 9. The analysis of network nodes identified three key created, with POMC (proopiomelanocortin) being the core protein. We then suggested they own and POMC genes as candidate genes modifying the phenotype of X-ALD.

Em trigo, os genes de tolerância ao alumínio tóxico (Al3+) tem sido identificada no cromossomo 4DL, incluindo o gene presente em BH1146, o mais estudado dos genótipos tolerantes brasileiros. Embora Toropi tenha sido identificado como um genótipo altamente tolerante ao Al3+, a genética e a singularidade dessa fonte nunca tinha sido investigada. Os objetivos desse estudo foram investigar a genética da tolerância ao Al3+ em Toropi e verificar se o gene é o mesmo presente em BH1146; mapear quantitative trait loci (QTLs) associados à tolerância ao alumínio em Toropi e investigar suas localizações no genoma de trigo e desenvolver uma biblioteca de subtração de Toropi objetivando identificar genes candidatos regulados por estresse de alumínio. Duas populações de linhagens recombinates (recombinant inbred line – RIL), uma F7 de Toropi (tolerante) por Anahuac (sensível) e outra F6 RIL de Toropi por BH1146 foram avaliadas quanto à tolerância ao alumínio, avaliando a taxa de crescimento da raiz após tratamento com alumínio em solução hidropônica. A segregação genética indica a presença de um gene principal para tolerância ao Al3+, denominado AltTp, que difere do gene presente em BH1146. AltTp está a 21cM do marcador microssatélite Xgdm129, previamente mapeado no cromossomo 4DS. Linhagens nulitetrassômicas e ditelossômicas foram utilizadas para confirmar a posição do AltTp no braço curto do cromossomo 4D de trigo. Este é o primeiro estudo reportando a presença de um gene para tolerância ao Al3+ em trigo no cromossomo 4DS, confirmando a singularidade de Toropi como fonte de genes para essa característica. Outros QTLs foram identificados nesse estudo, incluindo um presente no cromossomo 3B de trigo que corresponde ao cromossomo 1 de arroz, onde foram identificados os maiores QTLs para a tolerância ao Al3+ nessa espécie. Cento e nove sequências foram obtidas pela análise de Supression Subtractive Hybridization (SSH), sendo 99 sequências únicas. Análises de seqüências revelaram genes envolvidos em diversas vias metabólicas incluindo metabolismo de ácidos orgânicos e carboidratos, transdução de sinais, fatores de transcrição, biossíntese de proteínas, proteínas envolvidas na aliviação de estresse oxidativo, estrutura de membrana e outras funções. É possível que AltTp seja o gatilho para uma cascata de resposta ao estresse de Al3+ que envolve vias de sinalização e metabólicas complicadas. Esses genes de resposta ao estresse de trigo fornecem uma visão sobre o mecanismo de tolerância ao Al3+ em plantas. / In wheat most of the of aluminum tolerance genes have been identified on chromosome 4DL, including one present in BH1146, the most studied wheat Brazilian tolerant genotype. Although Toropi has been identified as a highly tolerant genotype to Al3+, the genetics and uniqueness of this source has never been investigated. The objectives of this study were to investigate the genetics of Toropi aluminum tolerance and its uniqueness compared to AltBH gene present in BH1146; to map the quantitative trait loci (QTLs) associated to Toropi aluminum tolerance and investigate their genome locations in wheat; and to develop a differential library from Toropi aiming to identify candidate genes regulated by aluminum stress. Two recombinant inbreed line populations (RILs), one F7 from Toropi (tolerant) by Anahuac (sensitive) and another F6 RIL from Toropi by BH1146, were screened for Al-tolerance by mensuring root growth rate following Al treatment in hidroponic solution. Genetic segregations indicated the presence of a major gene for aluminum tolerance in Toropi, named as AltTp, which differs from the one present in BH1146. AltTp is 21cM from Xgdm129 SSR marker, which has been previously mapped on chromosome 4DS. Nulitetrasomic and ditelosomic lines were used to confirm AltTp position on the wheat short arm of chromosome 4D. This is the first study to report a gene for aluminum tolerance in wheat on chromosome 4DS, confirming the uniqueness of Toropi as a genetic source for this trait. Other QTLs were identified in this study, including one present on wheat chromosome 3B which corresponds to rice chromosome 1, where most of aluminum tolerance QTLs have been identified in that species. One-hundred and nine sequences were obtained by the analysis of Supression Subtractive Hybridization (SSH), being 99 unique ones. Sequence analysis has revealed genes involved in several metabolic pathways including organic acid and carbohydrates metabolism, signal transduction, transcription factors, protein biosynthesis, oxidative stress alleviation, membrane structure and other functions. It is possible that AltTp triggers a cascade of responses to aluminum stress, which involves complex signaling and metabolic pathways. These wheat response stress genes provide new insights about Al-tolerant mechanisms in plants.

Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2013-11-04T12:15:31Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Mestrado Felipe Leprevost.pdf: 8130365 bytes, checksum: 2af7aa9ac89832c8e4c552a4d889c5e9 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-11-04T12:15:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação Mestrado Felipe Leprevost.pdf: 8130365 bytes, checksum: 2af7aa9ac89832c8e4c552a4d889c5e9 (MD5) Previous issue date: 2009 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Atualmente novas abordagens e metodologias de pesquisa nos permitem iniciar projetos de caracterização de um conjunto de proteínas de um determinado organismo em escalas superiores aos realizados há algum tempo. Novas tecnologias para seqüenciamento, clonagem e expressão protéica permitem a geração de uma quantidade grande de novas informações numa fração de tempo relativamente curta. Organismos como o Trypanosoma cruzi, que possuem praticamente metade de seu genoma sem função conhecida, necessitam que estudos sejam realizados para que se consiga atribuir às proteínas de função desconhecida características funcionais. Em um esforço para se conhecer melhor os genes de função desconhecida deste parasita, um grupo de 10 genes foi selecionado com base na sua expressão diferencial durante a metaciclogênese, consistindo de genes anotados como ‘proteína hipotética’ em banco de dados públicos, com domínio identificado pelo banco de famílias protéicas PFAM e com ortólogos em outros organismos. Os 10 genes selecionados foram amplificados e clonados na plataforma de clonagem Gateway e as proteínas recombinantes foram expressas em Escherichia coli. Dos 10 genes destinados à expressão protéica, 8 expressaram proteínas insolúveis as quais foram utilizadas para obtenção de soro policlonal. Os soros obtidos foram utilizados em ensaios de Western Blot para averiguação da expressão protéica ao longo da metaciclogênese do parasita e ensaios de localização celular por microscopia ótica e eletrônica. Foram realizados também ensaios de transfecção em T. cruzi para a expressão das proteínas fusionadas com GFP, visando à determinação da localização celular, utilizando um vetor compatível com a plataforma Gateway, e foram realizados ensaios de imunoprecipitação para todas as 8 proteínas expressas. Os resultados obtidos no presente trabalho auxiliam na atribuição de informações experimentais a genes e proteínas anotados como ‘proteína hipotética de função desconhecida’ e avaliam a possibilidade de implementação de um estudo sistemático com este para uma aplicação em média/larga escala / Recent research approaches and methodologies allow us to develop projects for the characterization of proteins of a given organism in scales greater than possible some time ago. New technologies for sequencing, cloning and protein expression allow the generation of large amounts of new information in relatively short time. Organisms such as Trypanosoma cruzi, which have nearly half of its genome with no known function, require studies to assign functions to proteins of unknown function. In an effort to characterize the genes of unknown function of this parasite, a group of 10 genes was selected based on their differential expression during metacyclogenesis. The genes were annotated as 'hypothetical protein' in public databases, with domains identified in the PFAM database and with orthologs in other organisms. The 10 selected genes were amplified and cloned in Gateway cloning platform and the recombinant proteins were expressed in Escherichia coli. Eight of the 10 genes expressed insoluble proteins which were used to obtain polyclonal serum. The sera were used in Western Blot analysis to verify protein expression throughout the parasite metacyclogenesis as well as cellular localization by optical and electron microscopy. To determine cellular localization, transfection experiments were conducted in T. cruzi for the expression of proteins fused with GFP using a vector compatible with the Gateway platform. Immunoprecipitation assays were also performed for the 8 expressed proteins. The results obtained in this work uncover experimental information of genes annotated as 'hypothetical protein of unknown function' and assess the possibility of implementing a systematic approach with this methodology in medium to large scale

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-05-11T16:26:55Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 586343 bytes, checksum: 12f3ff8364bb8a6ecd1ecdbde832b873 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-11T16:26:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 586343 bytes, checksum: 12f3ff8364bb8a6ecd1ecdbde832b873 (MD5) Previous issue date: 2002-11-11 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A análise do genoma de variedades de soja por hibridização com sondas RFLP (Random Fragment Length Polymorphism) revelou um grande número de bandas monomórficas e de algumas bandas polimórficas de pequeno número de cópias, sendo estas últimas utilizadas normalmente na construção de mapas de ligação. Dentre as sondas que apresentaram polimorfismo, algumas revelaram um grande número de bandas de DNA que eram altamente polimórficas entre diferentes cultivares, mapeando regiões hipervariáveis do genoma. Neste presente trabalho um fragmento de 295 pb (A5309-295), oriundo da amplificação de uma destas sondas (A53-09) com “primers” específicos e que apresenta homologia com genes de resistência a doenças em plantas, foi utilizado para escrutinar uma biblioteca de cDNA de soja. Quatro clones positivos foram obtidos e denominados A5309-28, A5309-41, A5309-48 e A5309-54 foram isolados. Estes clones, com 1,4, 1,7, 2,0 e 1,6 kb, respectivamente, foram seqüenciados e as seqüências de aminoácidos predita de cada um dos clones foram comparadas com outras depositadas no “GenBanK”. O clone A5309-28 apresentou homologia com uma proteína de interação com bomba de prótons de Arabidopsis viiithaliana, e poderia atuar na resposta de defesa das plantas. Durante a resposta de defesa estas enzimas mediam o influxo de prótons através da membrana após a elicitação celular, levando à alcalinização do meio extracelular e acidificação do citosol. Estes são passos importantes durante a durante a resposta de defesa. O clone A5309- 41 apresentou homologia com um transportador de membrana dependente de ATP (transportador ABC) de Populus nigra. Estes transportadores estão freqüentemente envolvidos nos processos de detoxificação durante a resposta de resistência. O clone A5309-48 apresentou homologia com uma proteína lipoxigenase expressa em folhas de tabaco após indução por jasmonato, e poderia participar na resposta de resistência por gerar moléculas sinalizadoras como ácido jasmônico, metil-jasmonato ou peróxidos lipídicos, oriundas da peroxidação lipídica, ou ainda pela formação de metabólitos secundários que podem inibir a proliferação do patógeno. O clone A5309-54 apresentou homologia com a proteína cinase PK12, membro da família LAMMER cinases, expressa em folhas de tabaco após indução por etileno. Para determinar se os quatro clones são expressos, “primers” que flanqueiam regiões específicas de cada clone foram construídos e utilizados em um RT-PCR (reverse transcription PCR). Em todos os órgãos analisados (raiz, caule, folha e semente) existem seqüências transcritas similares aos clones isolados neste trabalho. A homologia entre a o fragmento utilizado como sonda (A5309-295) e os quatro clones positivos foi analisada pelo alinhamento entre suas seqüências de nucletídeos. Todos os quatro clones apresentaram homologia superior a 30% quando comparados com a sonda A5309-295. A seqüência predita de aminoácidos do fragmento utilizado como sonda (A5309-295) contém uma ORF de 56 aminoácidos e apresenta dois sítios conservados: um sítio de meristoilação, indicando uma provável localização de membrana, e um sítio de fosforilação por uma proteína cinase caseína II. Todos os clones isolados também apresentam um sítio de fosforilação por uma proteína cinase C e por uma proteína cinase caseína. Exceto o clone A5309-28, todos os outros isolados também apresentam sítio de meristoilação. A5309-28 apresenta ainda uma região rica em lisina, enquanto o clone A5309-48 um domínio transmembrana. A potencial presença de tais domínios nas seqüências preditas de aminoácidos dos clones positivos e do fragmento utilizado como sonda (A5309-295), indica uma provável presença de regiões similares tanto na seqüência ixprotéica, como de DNA, que permitam a interação dessas proteínas com a membrana plasmática, além de justificar o isolamento dos clones do banco de cDNA. / Analysis of the cultivated soybean genome by hybridization with RFLP (Random Fragment Length Polymorphism) probes revealed a great number of monomorphic, and some polymorphic loci, with a low copy number in the genome. The latter can be used for the construction of linkage maps. There is also another class of probes that reveals hypervariable and high copy number regions. In this work a fragment of 295 base pairs (A5309-295), part of probe A53-09, which has been shown to be homologous to plant disease resistance genes, was used to screen a soybean cDNA library. Four positive clones named A5309-28, A5309-41, A5309-48 and A5309-54 were isolated. These clones, with 1.4, 1.7, 2.0, and 1.6 kilobase pairs, respectively, were sequenced and the corresponding deduced amino acid sequences were compared to those deposited in the GenBank. Clone A5309-28 was homologous to a proton ATPase from Arabidopsis thaliana, and it could participate in the defense response in the plant. During the defense response these enzymes mediate the influx of protons across the membrane leading to the alcalinization of the extracellular medium and acidification of the cytosol. These are important steps during the defense response. Clone A5309-41 was homologous to an ATP-dependent membrane transporter (ABC transporter) from Populus nigra. These transporters are often involved in the detoxication process during the resistance response. Clone A5309-48 was homologous to the lipoxygenase (LOX) enzyme which is expressed in tobacco leaves after induction by jasmonate. These enzymes also participate in the resistance response by taking part on a route leading the production of jasmonic acid, methyl jasmonate or lipid peroxides, or by producing secondary metabolites that may inhibit the pathogen proliferation. Clone A5309-54 was homologous to the protein kinase PK12, a member of the LAMMER family, which is expressed in tobacco leaves induced by ethylene. To determine if the four clones isolated were expressed, primers flanking specific parts of each clone were designed and used in reverse transcription PCR (RT-PCR) reactions. In all organs tested (root, stem, leaves, and seeds) expressed sequences were detected. The sequence relationship between the 295 bp fragment (probe A5309-295), and the four positive clones was analyzed and homologies greater than 30% were found. The clone from which the probe A5309-295 was isolated contains an ORF that potentially codes for an amino acid sequence with 56 residues with two conserved sites: one for myristoylation, which is indicative of membrane localization, and a phosphorylation site for protein kinase C and casein kinase. All four clones, with the exception of clone A5309-28, also presented the myristoylation site. In addition, clone A5309-28 presented a lysine rich region, and clone A5309-48 presented a transmembrane domain. The presence of these domains in the predicted amino acid sequences of the positive clones and of probe A5309-295 indicates that these putative proteins can interact with the plasma membrane, and the presence of these common domains could also help to explain why these clones hybridized with this specific probe. / Dissertação importada do Alexandria

LIMA, C. N. C.; Determinação de alterações na expressão gênica, fenótipos comportamentais e padrões neurobiológicos em ratos adultos com elevada e baixa atividade exploratória privados de sono paradoxal na adolescência. 2016.186 f. Tese (Doutorado em Farmacologia) - Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2016. / Submitted by Farmacologia Pós-Graduação (posgfarmacologia@gmail.com) on 2017-05-26T14:23:32Z No. of bitstreams: 1 2016_tese_cnclima.pdf: 4350214 bytes, checksum: 8b2239f6c5fb992701c8fda52c8102cd (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2017-05-26T14:32:57Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_tese_cnclima.pdf: 4350214 bytes, checksum: 8b2239f6c5fb992701c8fda52c8102cd (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-26T14:32:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_tese_cnclima.pdf: 4350214 bytes, checksum: 8b2239f6c5fb992701c8fda52c8102cd (MD5) Previous issue date: 2016-12-09 / Temperament can be considered the basis of humor, behavior and personality, they have strong biological basis, early development of the individual. Evidences suggests that temperament and personality traits predispose to the mood disorders. Because of this, it is important to identify biological factors associated with various temperament characteristics, such as differences in gene expression and neurochemical markers to help further evidence related to the etiopathogenesis of mental disorders such as depression and BD. (HE) and low exploratory activity (LE) exposes or not paradoxical sleep deprivation in adolescence. In the evaluation of the neurobiological basis of temperament, HE and LE tests were selected according to their exploratory profile in an open field test, a model of mania induced by temperamental sleep deprivation was used. Behavioral tests for locomotor activity and exploratory analysis, anxiety, cognition, depression, gene expression investigation of the clock genes, oxidative stress and inflammation were evaluated. The results of this study show that as individual behavioral factors, the exploratory patterns can be characterized in rats. By doing a translation for the human being these exploratory patterns reflect temperamental characteristics that influence a variety of behaviors and neurochemical and genetic parameters in response to the environment. Thus, our results for a strong interaction between exploratory patterns in animals and stressful events in adolescence contributing to the development of behavioral control type depression or mania in adulthood, showing that a selection of animals based on their exploratory pattern may be an alternative Interesting for conducting research with models with translational validity in psychiatry. / O temperamento pode ser considerado como a base do humor, do comportamento e da personalidade, tem uma base biológica forte, manifesta-se cedo no desenvolvimento do indivíduo, norteia a formação dos hábitos sendo relativamente estável no decorrer do tempo. Evidências sugerem que o temperamento e os traços de personalidade predispõem aos transtornos de humor. Em função disso, é importante identificar fatores biológicos associados às distintas características do temperamento, como diferenças na expressão gênica e marcadores neuroquímicos para ajudar a dar mais evidências relacionadas à etiopatogenia de transtornos mentais como depressão e TAB. Dessa forma, o presente estudo tem como objetivo determinar alterações geno-fenotípicas em ratos adultos com elevada (HE) e baixa atividade exploratória (LE) expostos ou não à privação de sono paradoxal na adolescência. Na avaliação das bases neurobiológicas do temperamento foram selecionados ratos HE e LE de acordo com o seu perfil exploratório em um teste campo aberto, dessa forma foi utilizado um modelo de mania induzido por privação do sono de base temperamental. Foram avaliados testes comportamentais para atividade locomotora e exploratória, ansiedade, cognição, depressão, investigação de expressão gênica dos genes do relógio, estresse oxidativo e inflamação. Os resultados deste estudo mostraram que as diferenças comportamentais individuais, aqui chamadas padrões exploratórios podem ser caracterizadas em ratos. Fazendo uma translação para o ser humano estes padrões exploratórios refletem características temperamentais que influenciam uma variedade de comportamentos e parâmetros neuroquímicos e genéticos em resposta ao meio ambiente. Dessa forma, nossos resultados apontam para uma forte interação entre padrões exploratórios em animais (associados ao temperamento no ser humano) e eventos estressores na adolescência contribuindo para o desenvolvimento de alterações comportamentais tipo depressão ou mania na idade adulta, mostrando que a seleção de animais com base no seu padrão exploratório pode ser uma alternativa interessante para a condução de pesquisas com modelos animais com validade translacional em psiquiatria.

Entre as síndromes hereditárias de predisposição ao câncer colorretal a Síndrome de Lynch é a síndrome mais frequente, sendo causada por mutações germinativas em um dos principais genes envolvidos na via de reparo de mau pareamento do DNA (MMR): MLH1, MSH2, MSH6 e PMS2. Clinicamente, a identificação da síndrome é feita pelos critérios de Amsterdam e Bethesda. Uma de suas características é a idade precoce no diagnóstico de câncer colorretal (~45 anos) assim como de tumores extracolônicos do espectro Lynch. Os genes MLH1 e MSH2 são os mais frequentemente mutados e são associados ao fenótipo clássico da síndrome, enquanto mutações em MSH6 e PMS2 são associadas a um fenótipo atípico. Mutações em MSH6 ocorrem em cerca de 10% dos pacientes, com consideráveis diferenças na frequência entre diferentes populações, e são descritas em famílias com idade mais tardia de aparecimento do câncer colorretal, ocorrência de câncer de endométrio e baixa IMS no tecido tumoral. O objetivo desse trabalho é identificar mutações germinativas pontuais e rearranjos no gene MSH6 em pacientes brasileiros com diagnóstico clínico de Síndrome de Lynch. Para identificação das mutações foram analisadas: a sequência codificadora e as junções éxon-íntron do gene, por PCR seguido de sequenciamento; assim como a presença de rearranjos pela técnica Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification (MLPA). A imunohistoquímica (IHQ) e IMS também foram avaliadas. As amostras de sangue periférico foram coletadas, após a obtenção do consentimento informado, de 68 pacientes com critérios clínicos para a Síndrome de Lynch, 40 pacientes foram classificados pelos critérios de Bethesda e 28 pelos critérios de Amsterdam. / Lynch syndrome is the most common inherited colorectal syndrome, caused by germline mutations in one of the major genes involved in mismatch repair (MMR): MLH1, MSH2, MSH6 and PMS2. Clinically, the family identification of Lynch Syndrome is delineated by Amsterdam or Bethesda criteria. The syndrome is characterized by early onset (~45 years) of colorectal cancer, as well as extra-colonic cancer. MLH1 and MSH2 are the genes most commonly mutated in Lynch syndrome. Mutations in these genes are associated with a classical phenotype, whereas mutations in MSH6 and PMS2 are more frequently associated with an atypical phenotype. The mutations affect MSH6 in about 10% of the patients, with considerable differences between populations, and have been described in families with the frequent occurrence of late onset colorectal cancer, occurrence of endometrial cancer and low degree microsatellite instability (MSI) in tumor tissue. In this study we analyzed the coding sequence and intron-exon boundaries of MSH6 gene by PCR followed by direct sequencing; as well as the presence of rearrangements through Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification (MLPA) to identify MSH6 mutations. Immunohistochemistry (IHQ) and IMS of the tumors also were evaluated. Peripheral blood samples were obtained after informed consent from 68 patients with Lynch Syndrome patients, clinically classified as Bethesda (n=40) and Amsterdam (n=28). A total of twenty-six MSH6 sequence alterations were identified by sequencing: six small deletions (all in intronic regions) and twenty single nucleotide variation (seven synonymous and five non synonymous). Three of these variants (c.2006T>C (found in one patient); c.3772C>G (found in one patient); c.719 G>A (found in two patients)) are not classified in the databases researched: HGMD, NCBI and LOVD. These variants were analyzed by in silico predictors and the result suggest that two of them, c.2006T>C and c.3772C>G, are possibly pathogenic. No rearrangements were detected in MSH6 by MLPA. IHQ shows nuclear absence of MSH6 protein in tumor tissue of 22 patients (32%), and IMS was observed in 19 (61%) patients. Despite the absence of mutations, IHQ analysis showed that the MSH6 protein is absent in a considerable portion of the samples, which indicates that other genes or other processes must be interfering in the MSH6 protein expression. Additional analysis of MSH2 sequence by other group, with the same patients, detected eight pathogenic mutations that can explain 36% of loss in MSH6 protein. These results suggest that sequencing of only MSH6 in cases of loss of MSH6 expression is not sufficient to identify the cause of the IHQ result. Others studies that analyze the MSH6 gene indicate that the prevalence of mutations in this gene seems to be much diversified, despite the small sample size, this results suggests that MSH6 appears to be responsible for a small percentage of Lynch syndrome cases in this population.

Para infectar seus hospedeiros artrópodes, Metarhizium anisopliae produz uma série de enzimas hidrolíticas e diversas alterações morfológicas como a formação de estruturas denominadas de apressórios e blastosporos. Estas estruturas de infecção representam estágios cruciais de penetração e disseminação no inseto hospedeiro, respectivamente. Além disso, o apressório é uma estrutura conservada entre fungos entomopatogênicos e fitopatogênicos. O gene emp1 (codifica uma proteína de matriz extracelular de Magnaporthe grisea) parece ter um papel importante na diferenciação do apressório, bem como na patogenicidade e virulência. Um dos nossos objetivos foi avaliar a possível função de um ortólogo do gene emp1 em M. anisopliae pela análise do perfil transcricional e construção de mutantes funcionais por mutagênese insercional utilizando agrotransformação. Foram geradas linhagens transformantes contendo o cassete de inativação do gene emp1 (pPZP::bar::emp1), sendo este construído pela subclonagem das regiões flanqueadoras 5’ (1.515pb) e 3’ (1.513pb), fusionadas a um cassete de expressão do gene bar (3.500pb) que confere resistência a glifosinato de amônia. A freqüência de transformação observada nesta etapa de transformação foi superior a 60%, porém em apenas 1,5% dos transformantes há indícios de recombinação homóloga. Também foi analisado o perfil transcricional de emp1, sob três condições anteriormente padronizadas: células diferenciadas em apressório, hifas (crescimento vegetativo), e blastosporos, sendo observada a presença de transcritos deste gene em todas as condições testadas. Em uma segunda etapa deste trabalho, foi avaliado o perfil transcricional de quitinases putativas de M. anisopliae nos estágios de diferenciação celular de apressório, hifas e blastosporos. Esta classe de proteínas está diretamente envolvida no remodelamento da parede celular fúngica durante a diferenciação celular, como também na degradação da quitina da cutícula do hospedeiro durante a etapa de penetração. Originalmente foram caracterizados três genes para quitinases (chit1, chi2 e chi3), e a análise in silico do genoma revelou outras 20 quitinases putativas de Metarhizium. Essa diversidade pode ser responsável pelas diferentes funções que o conjunto de enzimas quitinolíticas tem na degradação de quitina durante o ciclo de vida e de infecção do fungo. É, portanto importante: (i) validar transcricionalmente as quitinases putativas e (ii) tentar atribuir função a cada uma delas. Para isso, procedemos a análise dos transcritos de cada uma das 23 quitinases putativas sendo sintetizados cDNAs a partir das três condições de diferenciação celular (apressório, hifas e blastosporos). Na condição de diferenciação a apressório dez espécies de transcritos foram detectadas sendo seis do subgrupo A, três do subgrupo B, uma do subgrupo D. Nenhum transcrito de quitinases do subgrupo C foi detectado nas condições testadas. Tanto em crescimento vegetativo quanto em blastosporos foram detectadas sete espécies de transcritos de quitinases do subgrupo A, e uma do subgrupo D. As quitinases do subgrupo B diferiram quanto a sua distribuição nas condições testadas: três espécies de transcritos foram detectadas durante o crescimento vegetativo e seis em blastosporos. O estudo envolvendo os diferentes genes putativos (emp1 e de quitinases) de M. anisopliae, sob as diversas abordagens, representa um importante precursor para nos fornecer indicativos sobre as funções destes genes no ciclo de vida e de infecção de Metarhizium. / To infect their arthropod hosts, Metarhizium anisopliae produces a series of hydrolytic enzymes and several morphological changes, including the formation of structures called appressoria and blastospores. These infective structures represent crucial stages of penetration and dissemination in the insect host, repectively. In addition, the appressorium is a structure conserved among phytopathogenic and entomopathogenic fungi. The emp1 gene (encodes an extracellular matrix protein) from Magnaporthe grisea showed an important role in appressorium differentiation, as well as pathogenicity and virulence. Our goal was evaluate the possible role of an ortholog gene emp1 in M. anisopliae by transcriptional analysis and construction of functional mutants by insertional mutagenesis mediated by agrotransformation. We generated transformants strains containing the gene inactivation cassette of emp1 (pPZP::bar::emp1), which was constructed by subcloning of flanking portions 5’ (1.515bp) and 3’ (1.513bp) fused in a expression cassette of bar gene (resistance to glufosinate ammonium). The frequency of transformation observed in this round was higher than 60%, but only 1,5% of the transformants there is evidence of homologous recombination. We also analysed the transcriptional profile of emp1 under three conditions previously standardized, such as differentiated cells in appressorium, hyphae (vegetative growth) and blastospores. Accordingly, we observed the presence of transcripts of this gene in all growth condition tested. In a second step of this work, we evaluated the transcriptional profile of putative chitinases of the M. anisopliae in those different stages of cellular diferentiation. This class of proteins is directly involved in fungal cell wall remodeling during cellular diferentiation, as well as degradation of chitin in the host cuticle during the penetration stage. Originally we characterized three genes of chitinases (chit1, chi2 and chi3), but apart from these, the in silico analysis of the genome revealed 20 putative chitinases. This diversity may be reponsible for differents functions that the set of chitinases enzymes have in the chitin degradation during the life and infection cycle of the fungus. It is therefore important: (i) validate transcriptionally the putative chitinases and (ii) attemping to assign function to each one of them. Chitinases transcript survey was performed using cDNAs from three cell types: appressorium, vegetative growth and blastospores. In the appressorium condition ten species of transcripts were detected being six from the subgroup A chitinases, three from group B and one from group D. No transcripts of subgroup C chitinases were detected. Both in vegetative growth and blastospores seven species of transcripts of the subgroup A, and one from group D were detected. Chitinases from subgroup B differed - three species of transcripts were detected during vegetative growth and six were detected in blastospores. This study of several putative genes (as emp1 and chitinases) of M. anisopliae, under different approaches, may represent an important preliminary outcome to shed a light in the functions of these genes during life cycle and infection of Metarhizium.

xii, 86 p. : ill. A print copy of this thesis is available through the UO Libraries. Search the library catalog for the location and call number. / My dissertation has focused on identifying functions for non-essential genes in essential process, using the early C. elegans embryo as a model system. The fully sequenced C. elegans genome contains ∼19,800 protein coding genes of which about half have identifiable homologs in humans. Classical forward genetic mutagenesis screens, and more recently, genome-wide RNA interference (RNAi) screens has led to the identification of most essential genes in the genome. Analysis of the phenotypic data from mutants and RNAi screens shows that roughly 15% of the genes are essential and an additional 15% produce some other easily identifiable knockdown phenotype. This leaves about 70% of genes that have no functional information. Genetic modifier screening allows for the identification of roles for genes that do not produce a loss of function phenotype on their own but are able to modify the phenotype of a specific mutant. In my first chapter, I introduce approaches to identifying new gene functions and the usefulness V of C. elegans as a model system in this pursuit. In Chapter II, I describe a type of high-throughput genetic modifier screen that combines the sensitized genetic background of temperature-sensitive (ts) embryonic lethal mutants, and RNAi, to identify genes that either enhance or suppress embryonic lethality seen in the mutant background. I also summarize results from screening four ts mutants using this method. The following two chapters describe the identification and characterization of genetic modifier genes for two different ts embryonic-lethal mutants. Chapter III describes modifiers of rfl-1 , a conserved gene required for proper cytoskeletal regulation in the early C. elegans embryo. Chapter IV describes modifiers of lit-1 , also a conserved gene, that is required for regulation of Wnt signaling and cell fate specification in C. elegans . These findings reveal novel genetic interactions and provide functional information about many conserved but non-essential genes that have had no previous characterization. Conclusions are also made about the effectiveness of ts mutant/RNAi screening in the pursuit of identifying new gene functions. This dissertation contains co-authored material that has been previously published, and material that is currently in review, or is being prepared for publication. / Adviser: Bruce Bowerman

Made available in DSpace on 2016-02-26T13:34:39Z (GMT). No. of bitstreams: 2 melise_silveira_ioc_mest_2014.pdf: 2936486 bytes, checksum: f73183e180b237b1d6dc63c0c0afa155 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2016-02-23 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / O surgimento de bactérias Gram-negativas resistentes à drogas tem sido progressivo e alarmante. Entre os patógenos de particular importância está Pseudomonas aeruginosa multirresistentes à drogas (MDR). Um clone epidêmico de P. aeruginosa MDR produtor da metalo-\03B2-lactamase SPM-1, chamado clone SP (ST277), tem sido encontrado em diferentes estados brasileiros. O gene blaSPM-1 foi descrito em uma estrutura genética chamada ISCR4, responsável pela sua mobilização e expressão. Além do gene blaSPM-1, tem sido descrito, neste clone, a presença de um integron de classe I carreando genes de resistência (In163) e um elemento genético ISCR14 carreando uma metilase de RNAr 16S (rmtD), que confere resistência a altas concentrações de aminoglicosídeos. Este tipo de associação resulta em um perfil de resistência extremamente preocupante. Assim, este estudo teve como objetivo investigar a contexto genético dos genes blaSPM-1 e rmtD, além de caracterizar mutações em genes cromossomais associados a multirresistência a antimicrobianos em amostras de P. aeruginosa pertencentes ao clone ST277, através de Sourthen blot e sequenciamento de nova geração. A partir de 50 amostras de P. aeruginosa MDR isoladas entre 2007 e 2010, foram selecionadas 13 amostras pertencentes ao ST277 (através de MLST) que apresentaram positividade para blaSPM-1 e/ou rmtD e In163 (através de PCR), sendo 12 do clone SP (A) e uma de um clone diferente, M, através de PFGE. Através de restrição do DNA com as enzimas de restrição SpeI e XbaI, e posterior hibridação com sondas dos genes alvos (blaSPM-1, rmtD e In163) foi possível observar que os genes alvos encontravam-se em fragmentos distintos e que a amostra do clone M apresentou um perfil de hibridação diferentes das demais amostras demonstrando a ocorrência de vários rearranjos na mesma, indicando uma maior distância evolutiva A partir destes resultados, selecionamos 6 amostras para sequenciamento total do genoma utilizando a plataforma de sequenciamento MiSeq da Illumina. Através de sucessivas análises - que incluíram os contigs gerados na montagem de novo, montagens por referência e alinhamentos par a par- chegamos a uma região de 239.648pb onde estavam contidos o In163 e o ISCR14 carreando rmtD, inseridos em uma ilha genômica incorporada ao cromossomo bacteriano. O gene blaSPM-1 inserido no ISCR4 foi encontrado em uma região de 13.959pb, que incluía genes relacionados a plasmídios e transposons, contudo ainda não sabemos se esse elemento está incorporado ao cromossomo, ou livre em forma de plasmídio. Através da análise das mutações em genes cromossômicos associados a resistência à antimicrobianos, encontramos mutações nos genes oprD, ampD, mexZ, mexS, mexT, gyrA e parC que foram comuns às 6 amostras sequenciadas do ST277. Isso explicaria o fenótipo MDR nas amostras negativas para rmtD e/ou blaSPM-1. Além disso, como estas amostras foram isoladas em estados e anos distintos, acreditamos que essas mutações sejam características do ST277, o que pode ser um dos fatores associados a distribuição epidêmica deste clone no Brasil / The development of antimicrobial resistance among Gram - negative pathogens has been progressive and relentless. A pathogen of particular concern is multidrug - resistant (MDR) Pseudomonas aeruginosa . An epidemic clone of MDR P. aeruginosa producing the metall o - β - lactamase SPM - 1, named SP clone (ST277), has been found in different Brazilian states. The bla SPM - 1 gene has been described in a genetic structure called ISCR4, responsible for its mobilization and expression. Besides the bla SPM - 1 gene, it has been des cribed in this clone, a classe I integron (In163) carrying resistance genes and the genetic element ISCR14 carrying a 16S rRNA metilase ( rmtD ), that confers resistance to high concentrations of aminoglycosides. This kind of association results in an extrem ely worrisome profile of resistance. Thus, this work aimed to investigate the genetic background of bla SPM - 1 and rmtD genes and to characterize mutations in chromosomal genes associated with multidrug resistance in P. aeruginosa isolates belonging to ST277 clone, using Sourthen blot and next - generation sequencing. From 50 MDR P. aeruginosa isolates recovered from 2007 to 2010,there were selected 13 bla SPM - 1 and /or rmtD - positive isolates (by PCR) belonging to ST277 (by MLST), 12 f rom SP (A) clone and one from a different PFGE clone (M). By DNA digestion with Spe I and Xba I restriction enzymes, and subsequent hybridization with probes for target genes ( bla SPM - 1 , rmtD and In163 ), it was observed that the target genes were in separate fragments, and that the M clone isolate showed a different profile compared with the other isolates, indicating various rearrangements, suggesting a greater evolutionary distance. With these results, 6 isolates were selected for whole genome sequencing by Illumina MiSeq platform. Through successive analyzes – which included de novo assembly contigs, map to reference assemblies and pairwise alignments - we came up to a 239648pb region containing the In163 and ISCR14 inserted into a genomic island incorporated into bacterial chromosome. The bla SPM - 1 gene was inserted into ISCR4, found in a 13950pb region, which included genes related to plasmids and transposons, however we do not know whether this element s chromosomal or plasmidial . Through analysis of chromoso mal genes mutations associated with multidrug resistance, we found mutations in oprD, ampD, mexZ, mexS, mexT, gyrA e parC genes, which were common to the 6 ST277 isolates sequenced. This would explain the MDR phenotype in bla SPM - 1 and/or rmtD negative isol ates. Furthermore, since these microorganisms were isolated in different years and states, we believe these mutations are ST277 characteristic, which may be one of the factors associated with the epidemic characteristics of this clone

Made available in DSpace on 2016-04-07T13:21:46Z (GMT). No. of bitstreams: 2 nelson_filho_ioc_dout_2015.pdf: 18433990 bytes, checksum: 8dd6a2876cb547b6a2d7fe8493822e55 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A inferência de homologia entre organismos é uma atividade da genômica comparativa que possibilita compreender melhor a relação entre os mesmos e, por conseguinte, sua distância evolutiva. Especificamente, a identificação de genes ortólogos, ou seja, aqueles que têm sua origem em um ancestral comum, permite oferecer melhorias na anotação funcional de genes, uma vez que genes ortólogos tendem a ter sua função conservada. Com a crescente disponibilidade de genomas através de técnicas de NGS, a construção e atualização de bases de dados de ortólogos representam um desafio constante, pois demandam o estudo e identificação das relações entre os genes de tais organismos, em um volume de dados cada vez mais extenso e a um custo computacional cada vez mais elevado. Nesta tese propomos a solução para nuvem computacional elastic-OrthoSearch, um workflow científico de genômica comparativa inspirado no OrthoSearch, responsável pela inferência de homologia entre organismos com o uso de abordagem baseada em melhores hits recíprocos e perfis de Markov. Também propomos uma metodologia para criação de bases de ortólogos construída através do reuso do OrthoSearch. Esta metodologia mostrou-se capaz de alavancar a oferta de grupos ortólogos e assim auxiliar, por exemplo, na identificação de alvos de protozoários / Homology inference among organisms is a comparative genomics tasks which allows for a better understanding on how such organisms are related to each other and on their evolutionary distance. Specifically, the identification of orthologous genes – those who share a common ancestor – allows for functional gene annotation improvements, as orthologous genes tend to preserve their functions. The increasing amount of genomic data provided by the NGS techniques makes the orthologous databases’ building and update processes a challenging task. It requires the identification and study of the organisms’ genes relationships, in an extensive data volume and at an increasing computational cost. In this thesis we propose elastic-OrthoSearch, a cloud-enabled comparative genomics scientific workflow, derived from OrthoSearch. It aims at providing homology inference among organisms, in a reciprocal best hits and Markov profiles approach. We also propose an improved orthologous database creation methodology built on top of OrthoSearch. Such methodology has shown means to offer a broader orthologous groups dataset, which could in turn aid on Protozoa target identification.