Submitted by Aline Aparecida Silva Stella null (alineasstella@hotmail.com) on 2017-06-20T12:30:27Z No. of bitstreams: 1 DEFESA Aline Stella.pdf: 1152999 bytes, checksum: c574962c67c5ff1a6f1d0fe076226c04 (MD5) / Approved for entry into archive by Luiz Galeffi (luizgaleffi@gmail.com) on 2017-06-21T13:44:37Z (GMT) No. of bitstreams: 1 stella_aas_me_jabo.pdf: 1152999 bytes, checksum: c574962c67c5ff1a6f1d0fe076226c04 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-21T13:44:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 stella_aas_me_jabo.pdf: 1152999 bytes, checksum: c574962c67c5ff1a6f1d0fe076226c04 (MD5) Previous issue date: 2017-05-23 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A mastite é a principal doença que acomete os rebanhos leiteiros e promove grandes perdas na produção devido a alterações na composição do leite e prejuízos na saúde do animal, aumentando assim os custos de produção. Caracteriza-se pela resposta inflamatória da glândula mamária a agentes infecciosos, alterando sua fisiologia e metabolismo. Estudo de expressão gênica vem sendo empregado em vários organismos com a finalidade de identificar genes relacionados com características economicamente importantes como resistência a doenças. Com o objetivo de compreender melhor os mecanismos de resposta imune envolvidos no fenótipo de resistência/susceptibilidade à mastite, foi realizada a quantificação da expressão relativa dos genes do Fator Estimulador de Colônias de Granulócitos 3 (CSF3) e Lactoperoxidase (LPO), em leite de búfalas mestiças saudáveis e com mastite, por meio da técnica de PCR quantitativa em tempo real (qRT-PCR). Para isso, foi realizada a extração de RNA total, com Trizol, de células somáticas do leite de doze animais diagnosticados com mastite e de doze animais livres da infecção. Foram realizadas análises de qualidade e quantificação do RNA total e das contaminações por DNA genômico para garantir a integridade das amostras. A quantificação da expressão gênica foi realizada por meio do método do Delta Delta Ct. Os genes GAPH, HPRT1, EEF1A1 e RPLP0, foram selecionados na literatura, e testados como genes de referência. As análises referentes às quantificações foram realizadas com os valores de Ct obtidos para cada gene. O gene CSF3 foi significativamente mais expresso em animais com mastite em comparação com animais sem mastite (P<0,001) e 5,14 vezes mais expresso na amostra alvo do que na amostra de referência. O CSF3 é uma citocina naturalmente produzidas e secretadas por uma grande variedade de células pertencentes ou não ao sistema imune. Desempenham importante papel na defesa do hospedeiro, já que regulam parte da atividade das células que participam da imunidade inata e específica, o que demonstra importância no seu uso no diagnóstico e prognóstico das mastites. O gene LPO expressa uma proteína sintetizada na glândula mamária por íons tiocianato (SCN-), originados por metabolismo hepático e peróxido de hidrogênio (H2O2), derivado da atividade dos leucócitos e outras células, para gerar produtos reativos com intensa atividade antimicrobiana. Esse foi 2,41 vezes mais expresso em animais com mastite em relação a animais sem mastite (p-valor = 0,097), não havendo diferença significativa, porém a mastite é uma doença multifatorial e afetada por muitos genes, sendo necessário mais estudos com animais em diferentes fases de infecção e incluindo outros genes para compreender o mecanismo de resposta imune relacionado a mastite.

Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2016-03-31T15:35:54Z No. of bitstreams: 1 eduardoferreiradeoliveira.pdf: 786209 bytes, checksum: 0c39ed35a120253c3f4e0eab5dc08de5 (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2016-04-24T02:59:11Z (GMT) No. of bitstreams: 1 eduardoferreiradeoliveira.pdf: 786209 bytes, checksum: 0c39ed35a120253c3f4e0eab5dc08de5 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-24T02:59:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 eduardoferreiradeoliveira.pdf: 786209 bytes, checksum: 0c39ed35a120253c3f4e0eab5dc08de5 (MD5) Previous issue date: 2013-07-05 / A mastite continua a ser um grande desafio para cadeia do leite e causa grandes prejuízos como a perda de produção, o descarte precoce de animais, os custos de tratamento e interferência na qualidade do leite. Os patógenos contagiosos são causadores de grande parte deste problema, com isso, os índices de mastite subclínica aumentam, levando consequentemente, ao aumento da contagem de células somáticas (CCS). Os principais patógenos contagiosos são Staphylococcus aureus e Streptococcus agalactiae. A CCS é utilizada em todo mundo como um indicador para avaliar e monitorar a saúde da glândula mamária e auxilia em programas de controle e prevenção de mastite. O conhecimento gerado a partir de estudos epidemiológicos específicos, sobre o padrão de infecção, prevalência de patógenos contagiosos da mastite em rebanhos bovinos leiteiros, distribuição temporal e espacial de agentes contagiosos da mastite e análise econômica de medidas sanitárias em nível de rebanho e região podem ser utilizados no aprimoramento dos programas de controle e prevenção da mastite. A epidemiologia espacial auxilia o entendimento da distribuição geográfica de dados ocorridos no tempo e espaço, e permite analisar de maneira abrangente a dinâmica de uma doença, indicando formas de atuações frente ao problema em nível de região. O objetivo deste estudo foi avaliar a relação entre análise espacial da contagem de células somáticas e prevalência de patógenos contagiosos da mastite entre os rebanhos bovinos leiteiros. Em uma população de 112 rebanhos, foram coletadas amostras para isolamento de S. aureus e S. agalactiae e para realização de CCS. A dependência espacial para CCS foi avaliada por meio de semivariogramas e, quando identificada dependência espacial, por meio do método de Krigagem foi criado o mapa de isolinhas para a CCS. Rebanhos com isolamento de S. aureus e S. agalactiae tiveram 9,3 vezes mais chances de apresentar valores superiores a 400.000 células/mL. Foi observada alta prevalência (89,0 a 100,0%) e distribuição homogênea entre as regiões para o S. aureus, no entanto não foi observada distribuição homogênea para S. agalactiae, cuja prevalência variou de média a alta (16 a 93%) entre as regiões estudadas. Foi observada dependência espacial moderada (GD=37,6; r2=0,31) para a CCS entre os rebanhos. Foi observada associação entre a prevalência de S. agalactiae e a CCS de acordo com as regiões avaliadas em função dos resultados da análise espacial. Rebanhos na área de CCS têm até 5,5 vezes mais chances de terem S. agalactiae isolado nas amostras de leite de tanque. A análise espacial da CCS de rebanhos pode ser uma ferramenta para auxiliar os envolvidos na tomada de decisão em nível de região no que se refere a adoção de medidas de controle e prevenção da mastite. / Mastitis continues to be a major challenge for the milk chain and cause great losses as loss of production, the early disposal of animals, treatment costs and interference in the quality of the milk. The contagious pathogens are causing much of the problem, with this, the contents of subclinical mastitis increases, therefore leading to increased somatic cell count (SCC). The main contagious pathogens are Staphylococcus aureus and Streptococcus agalactiae. The SCC is used throughout the world as an indicator to evaluate and monitor the health of the mammary glands and assists control programs and prevention of mastitis. The knowledge generated from specific epidemiological studies, on the pattern of infection, prevalence of contagious pathogens of mastitis in dairy cattle herds, temporal and spatial distribution of contagious mastitis agents and economic analysis of sanitary and herd-level region can be used in the improvement of control and prevention of mastitis. Spatial epidemiology helps the understanding of the geographical distribution of data occurring in time and space, and allows comprehensively examine the dynamics of disease, indicating forms of the actuations problem region level. The objective of this study was to evaluate the relationship between spatial analysis of somatic cell counts and prevalence of contagious mastitis pathogens between dairy cattle herds. In a population of 112 herds, samples were collected for isolation of S. aureus and S. agalactiae and for SCC. Spatial dependence for SCC was evaluated by means of semivariograms and, when identified spatial dependency, using the Kriging method was created the map of isolines for SCC. Herds with isolation of S. aureus and S. agalactiae had 9.3 times more chances to present values above 400,000 cells/mL. High prevalence was observed (89.0 to 100.0%) and homogeneous distribution among the regions for S. aureus, however homogeneous distribution was not observed for S. agalactiae, whose prevalence ranged from medium to high (16 to 93%) among the regions studied. Moderate spatial dependence (GD = 37.6; r2= 0.31) was observed for SCC between herds. Association between the prevalence of S. agalactiae and SCC was observed in accordance with regions evaluated in accordance with the results of spatial analysis. Herds in the area of SCC have up to 5.5 times more likely to have isolated S. agalactiae of tank milk samples. The spatial analysis of the SCC of herds can be a tool to assist those involved in decision-making at the level of the region as regards the adoption of control measures and prevention of mastitis.

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2017-01-17T17:57:50Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 926248 bytes, checksum: 689f34fba92e568be53e3f913e0cee98 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-17T17:57:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 926248 bytes, checksum: 689f34fba92e568be53e3f913e0cee98 (MD5) Previous issue date: 2016-07-28 / Este trabalho foi desenvolvido com o objetivo de estudar o efeito dos níveis de desempenho durante a recria de animais cruzados Holandês: Gir (H:G) sobre o desenvolvimento da glândula mamária; validar a técnica de ultrassom como ferramenta de monitoramento instantâneo e não-invasivo dos tecidos que compões o parênquima mamário; descrever o procedimento cirúrgico indicado para obtenção de amostras do tecido parenquimal da glândula mamária de novilhas em crescimento. O trabalho foi conduzido no Departamento de Zootecnia da Universidade Federal de Viçosa, Viçosa-MG. Dezoito novilhas mestiças (H: G) com peso inicial médio (102,2 ± 3,4kg) e idade entre 3 e 4 meses foram avaliadas ao longo de 84 dias. As novilhas foram, igualmente, distribuídas (n = 6) entre os tratamentos alto ganho (AG; 1,0 kg/dia), baixo ganho (BG; 0,5 kg/dia) e mantença (MA). A diferença de ganho de peso entre os tratamentos foi alcançada através da quantidade de alimento ofertada de uma mesma dieta a base de silagem de milho, farelo de soja, farelo de soja By pass e minerais com relação volumoso: concentrado de 60:40. O escore de condição corporal (ECC), a amostragem do volumoso e das sobras foram realizadas semanalmente. O peso das novilhas e as avaliação ultrassonográficas da glândula mamária foram realizadas em intervalos de 14 dias. As medidas corporais, as coletas de sangue e o ultrassom na carcaça foram realizadas em intervalos de 28 dias. Paralelamente, foi realizado uma biópsia na glândula mamária de 3 novilhas de cada tratamento no início e meio do experimento para se obter amostras representativas do tecido parenquimal. Ao final do experimento todas as novilhas foram abatidas e em sequência análises bioquímicas, histológicas e de expressão gênica foram realizadas na glândula mamária de cada animal. O consumo de matéria seca e demais nutrientes foi maior para os animais do AG em relação ao BG e este, por sua vez, maior do que MA, confirmando assim a efetividade dos tratamentos propostos. O ganho de peso apresentou comportamento semelhante ao consumo, sendo 0,90 kg/dia para AG, 0,50 kg/dia para BG e 0,10 kg/dia para MA. Novilhas do tratamento AG apresentaram maior ECC, espessura de gordura subcutânea (EGS) e área de olho de lombo (AOL) em avaliações ultrassonográficas da carcaça quando comparado aos demais tratamentos. Nas avaliações ultrassonográficas da glândula mamária houve maior concentração de pixels no parênquima mamário do AG em relação ao BG e MA, os quais não diferiram entre si. Novilhas do tratamento AG apresentaram maior peso de gordura extra-parenquimal e maior concentração de extrato etéreo no parênquima em relação ao tratamento BG e MA. Estes resultados indicam, conjuntamente, uma maior concentração de tecido adiposo no parênquima de animais sob elevado ganho de peso. Com relação às avalições histológicas foi observado maior porcentagem de área ocupada por tecido epitelial no parênquima mamário das novilhas do tratamento BG em relação ao AG e MA. Não foi observado diferença na expressão gênica do IGF-1 entre os tratamentos AG e BG, porém houve maior expressão do TGFR βI no tratamento AG. Dessa forma, conclui-se que novilhas alimentadas para elevado ganho de peso, mesmo com adequado nível de proteína na dieta, acumularam mais gordura na glândula mamária e apresentaram maior expressão de genes que reduzem o crescimento epitelial. No segundo trabalho foi realizado uma análise de regressão da concentração de pixels da região parenquimal da glândula mamária (efeito fixo) em função das medidas de porcentagem de extrato etéreo no parênquima (PAR), porcentagem de proteína no PAR, área ocupada pelo tecido epitelial no PAR, número de adipócitos no PAR, peso da gordura extra-parenquimal e peso do parênquima (efeito aleatório) para estudar a relação entre as variáveis. Em seguida foi realizado uma análise de sensitividade para determinar a acurácia e precisão das equações encontradas. Dentre as variáveis testadas apenas peso de PAR não foi correlacionado com os valores de pixels na região parenquimal. Para as variáveis com correlação significativa foi observado alta acurácia e de média a alta precisão. Imagens de ultrassom permitiram identificar diferentes padrões de crescimento do tecido parenquimal mamário influenciadas pelo nível de desempenho das novilhas. Por fim, foi feito uma descrição dos procedimentos empregados para obtenção de amostras do tecido parenquimal mamário de novilhas em crescimento. Após a amostragem do tecido PAR procedeu-se a extração do RNA e DNA de cada amostra. A integridade das amostras foi comprovada pela relação de absorção entre oRNA (260 nm) e de proteínas (280 nm) acima de 1,80, indicado a qualidade do RNA obtido. / This work was designed to study the effect of performance levels during rearing on the mammary gland development of Holstein: Gyr (H: G) crossbred heifers; validate the ultrasound technique as a feasible tool to monitor instantaneously and non-invasive the parenchymal composition of mammary gland; describe surgical procedure for obtaining the parenchymal tissue samples from mammary glands of growing heifers.The work was performed in the Animal Science Department of Universidade Federal de Viçosa, Viçosa- MG. Eighteen crossbred heifers (H:G) with initial weight (102.2 ± 3,4kg) and aged between 3 and 4 months were evaluated over 84 days. Heifers were equally distributed (n = 6) between the high-gain treatments (HG, 1.0 kg / day), low gain (LG, 0.5 kg / day) and maintenance (MA).The difference in weight gain between treatments was achieved by the amount of feed offered using a single diet based on corn silage, soybean meal, soybean meal and minerals By Pass with roughage: concentrate ratio of 60:40.The body condition score (BCS), sampling of silage and leftovers were taken weekly. The heifer’s weight and ultrasonographic evaluation of the mammary gland were performed in 14 days intervals. The biometric measurements, blood samples and ultrasound on carcass were performed in 28 days intervals.In parallel, a biopsy was performed in mammary glands of heifers (3/treatment) at the beginning and middle of the experiment to obtain representative samples from the parenchymal tissue. At the end of the trial, all heifers were slaughtered and following biochemical, histological and gene expression analysis were performed in the mammary gland of each animal.The dry matter intake and other nutrients was higher for HG heifers when compared with LG and this, in turn, higher than MA, confirming the effectiveness of proposed treatments. Weight gain behaved similarly to intake, being highest gain for HG heifers (0.90 kg/d), 0.50 kg/d for BG and 0.10 kg/day MA.HG heifers showed higher BCS, subcutaneous fat thickness (SFT) and ribeye area (REA) in carcass evaluation when compared to other treatments. In ultrasonographic evaluation of the mammary gland there was a higher pixels concentration in HG mammary parenchyma than BG and MA, which did not differ from each other. HG heifers showed higher extra-parenchymal fat weight and higher concentration of ether extract in the parenchyma than BG and MA heifers. These results indicate, together, a higher concentration of fat in the parenchyma of animals under high weight gain. Regarding to histological evaluations in mammary parenchyma was observed higher percentage of area occupied by epithelial tissue in LG treatment than HG and MA. There was no difference in gene expression of IGF-1 between HG and LG treatments, but there was a greater expression of TGFR βI in HG.Thus, we concluded that heifers fed to show high weight gain, even with adequate level of protein in diet, accumulated more fat in mammary gland and had greater expression of genes that reduce epithelial growth.In the second study was conducted a regression analysis of pixels concentration in mammary parenchyma (fixed effect) in function of ether extract percentage in parenchyma (PAR), protein percentage in PAR, area occupied by epithelial tissue in PAR, number of adipocytes in the PAR, weight of extra-parenchymal fat and weight of parenchyma (random effect) to study the relationship between variables.At sequence, a sensitivity analysis was performed to determine the accuracy and precision of the equations found. Among the variables tested only PAR weight was not correlated with the pixel values in the parenchymal region. Between variables with significant correlation was observed high accuracy and from middle to high precision. Ultrasound images allowed identifying different growth patterns of mammary parenchymal tissue influenced by the level of performance of the heifers.Finally, it was described the procedures used to obtain samples of mammary parenchymal tissue in growing heifers. After sampling was carried out the RNA and DNA extraction from each PAR.Relation between RNA absorption (260 nm) and protein absorption (280 nm) analyzed the integrity of samples. The ratio greater than 1.80 indicated the quality of the RNA obtained.

A sinalização da matriz extracelular (MEC) é essencial para a determinação do destino e comportamento de células epiteliais da glândula mamária. Entretanto, pouco é conhecido sobre os mecanismos moleculares envolvidos nesse processo. A via Hippo, uma cascata de sinalização que participa da regulação de diversos comportamentos celulares, incluindo o tamanho de órgãos, parece ser uma importante candidata a mediadora sinalização da MEC. Resultados preliminares do laboratório indicam que a arquitetura tecidual e a membrana basal, componente da MEC de epitélios e outros tecidos, influenciam a localização, concentração e atividade de YAP, uma proteína efetora da via Hippo, em células epiteliais mamárias. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi identificar as proteínas que interagem com Yap (ortólogo de YAP em camundongo) nas células epiteliais da glândula mamária em resposta à membrana basal. Foram utilizadas células EpH4, uma linhagem mamária não-tumoral murina, como modelo de diferenciação funcional e formação de ácinos em um ensaio de cultura tridimensional (3D). O tratamento de estruturas multicelulares 3D pré-formadas em placas nãoadesiva com uma matriz rica em laminina (lrECM) alterou a localização e o padrão subcelular de Yap, assim como a expressão gênica de membros da via Hippo e dos alvos de Yap, mas não alterou a expressão das proteínas da via em nível de proteína. O ensaio de co-imunoprecipitação (CoIP) seguida de análise por espectrometria de massas identificou um conjunto diferencial de proteínas que interagem com Yap na fração citoplasmática de células EpH4 cultivadas na ausência ou na presença de lrECM em um modelo de ECM-overlay. Uma análise realizada junto à database KEGG Pathways revelou que os possíveis interagentes Yap nas células cultivadas não-tratadas com lrECM participam de processos relacionados à proteólise mediada por ubiquitina, enquanto nas células expostas à lrECM os possíveis interagentes estão associados a processos metabólicos e são especialmente proteínas-chave do metabolismo de lipídios. A busca na plataforma de redes de interação STRING não identificou trabalhos que destaquem a interação de Yap com estas proteínas. A plataforma Vizit indica a participação de Yap em processos relacionados à síntese e atividade de lipídios e hormônios, o que reforça as evidências de que está pode ser uma nova função de Yap ainda não explorada em detalhes. A fim de se obter resultados complementares à CoIP, padronizamos o ensaio de identificação por biotinilação dependente de proximidade (BioID) em células embrionárias de rim humano da linhagem 293FT. As proteínas isoladas por pulldown foram identificadas por espectrometria de massas e uma análise junto à database Gene Ontology indicou que os possíveis interagentes de Yap nestas células são em sua maioria proteínas relacionadas à via Hippo, o que reforça a robustez do ensaio. Nós pretendemos transpor este sistema para as células EpH4. A expectativa é que, em conjunto, estes resultados nos orientem em projetos futuros para compreender os mecanismos de sinalização da MEC na morfogênese e diferenciação da glândula mamária. / Extracellular matrix (ECM)-signaling is crucial for determination of epithelial cell fate and behavior in the mammary gland. However, little is known about the molecular mechanisms involved in these processes. The Hippo pathway, a signaling cascade involved in the regulation of several cellular processes, including organ size, seems to be an important candidate as a mediator of this signaling. Our preliminary results indicate that the tissue architecture and the basement membrane, an ECM component of epithelia and other tissues, influence the location, level and activity of YAP, an effector of the Hippo pathway. In this context, the goal of this work was to identify the proteins that interact with Yap (ortholog of YAP in mouse) in mammary epithelial cells in response to the basement membrane. We used EpH4 cells, a nontumoral murine mammary cell, in a functional differentiation and acini-forming in tridimensional (3D) culture assay. Treatment of 3D multicellular structures pre-formed on nonadhesive plates with a laminin-rich extracellular matrix (lrECM) altered the subcellular localization and pattern of Yap, as well as gene expression of Hippo pathway proteins and Yap targets, but did not altered the expression of the pathway members at the protein level. Coimmunoprecipitation (CoIP) followed by mass spectrometry analysis identified a differential set of proteins interacting with Yap in cytoplasmic fractions of EpH4 cells in the absence or presence of lrECM in an ECM-overlay culture model. An analysis performed with the KEGG Pathways database revealed that putative Yap interactors in non-treated cells participate in processes related to ubiquitin-mediated proteolysis, whereas in cells exposed to lrECM Yap interactors are associated to metabolic processes and are mainly key-proteins of metabolism of lipids and carbohydrates. A search in interaction networks platform STRING did not identify previous works that showing the interaction of Yap with these proteins. Vizit platform indicated the participation of Yap in processes related to the synthesis and activity of lipids and hormones, which reinforces the evidences that Yap can play a novel poorly explored role. To obtain complementary results to CoIP, we devised the proximity-dependent biotinylation identification (BioID) assay on embryonic renal cells of 293FT cell line. Pulldown-isolated proteins were identified by mass spectrometry and an analysis performed with Gene Ontology database revealed that putative Yap interactors are Hippo pathway-related proteins, which reinforces the robustness of the assay. We intend to transpose this system to the EpH4 cells. We expect that, together, these results will guide us in future projects to understand the signaling mechanisms of ECM in mammary gland morphogenesis and differentiation.

Orientador: Helio Langoni / Resumo: A mastite bovina é responsável por grandes perdas econômicas na bovinocultura de leite, além de aspectos de saúde pública que devem também ser considerados. Animais com mastite clínica ou subclínica apresentam diversas alterações reprodutivas. No primeiro artigo da tese, os resultados obtidos demonstraram que a mastite causada por patógenos maiores (20,1%) ou por gram-negativos (15,4%) levaram a queda na taxa de prenhez na primeira inseminação comparado com o grupo controle (32,6%). Foi observado maior taxa de perda gestacional para os grupos de patógenos maiores (22,2%) e gram-negativos (30,1%) comparados com o controle (12,8%). Foi observado diferença entre todos os grupos para o número de dias em aberto. O grupo controle apresentou o menor intervalo (126,5 dias) seguido pelo grupo patógenos menores (162,0 dias) e pelo grupo de patógenos maiores (175,1 dias). Comportamento similar observado para patógenos gram-positivo (172,7 dias) e patógenos gram-negativos (191,1 dias). Portanto, é importante controlar a mastite em rebanhos leiteiros e, para tanto, o diagnóstico é uma etapa importante. Diferentes proteínas de fase aguda foram descritas como bons biomarcadores para o diagnóstico da mastite. No segundo artigo da tese, foi observado que diferentes patógenos podem alterar a liberação de proteínas de fase aguda no leite. Bactérias que causam inflamações mais graves (E. coli e Klebsiella pneumoniae) levaram maior concentração das APP. Patógenos que causam infecções crônica (Str... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Bovine mastitis is responsible for major economic losses in dairy cattle farming, as well as public health aspects that should also be considered. Animals with clinical or subclinical mastitis present several reproductive alterations. In the first article of this thesis, the results showed that mastitis caused by major pathogens (20.1%) or gram-negative (15.4%) led to a decrease in pregnancy rate in the first insemination compared to the control group (32.6%). Higher gestational loss rates were observed for the major (22.2%) and gram-negative (30.1%) pathogen groups compared with the control (12.8%). The difference was observed between all groups for the number of days open. The control group had the shortest interval (126.5 days) followed by the minor pathogens group (162.0 days) and the major pathogens group (175.1 days). Similar behavior observed for gram-positive pathogens (172.7 days) and gram-negative pathogens (191.1 days). Therefore, it is important to control mastitis in dairy herds and, so, diagnosis is a critical step. Different acute phase proteins have been described as good biomarkers for the diagnosis of mastitis. In the second article of this thesis, it was observed that different pathogens may alter the release of acute phase proteins in milk. Bacteria that cause more severe inflammation (E. coli and K. pneumoniae) led to a higher concentration of APP. Pathogens causing chronic infections (Environmental Streptococcus, S. aureus, Mycoplasma spp.) led to interm... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

A identificação e biópsia do primeiro linfonodo a receber a linfa de uma formação neoplásica, ou seja, do linfonodo sentinela, fornecem informações essenciais para o tratamento e prognóstico de pacientes humanos acometidos por neoplasia. Entretanto, em Medicina Veterinária existem poucos estudos sobre a drenagem linfática dos órgãos e o conceito de linfonodo sentinela ainda não é amplamente aplicado ao tratamento oncológico dos animais. Desta forma, nosso objetivo no presente estudo foi estabelecer um protocolo de aquisição cintilográfica linfática, ou linfocintilográfica, capaz de fornecer informações funcionais e topológicas da drenagem linfática mamária, pois, em cadelas, as glândulas mamárias ainda são uns dos principais órgãos acometidos por neoplasias. Neste estudo, a linfocintilografia foi utilizada para caracterização topológica e funcional in vivo da drenagem linfática de glândulas mamárias sadias de 30 fêmeas da espécie canina (Canis familiares), sem raça definida e peso aproximado de 10 Kg. O radiofármaco [99mTc]-dextran70 foi administrado por via intraparenquimatosa mamária em quatro pontos ao redor da papila (0,1 ml cada), na dose de 18,5 MBq. As imagens foram obtidas em duas seqüências de projeções laterais e ventrais, sendo uma logo após a administração do [99m</SUP Tc]-dextran70 e a outra após uma hora. O radiofármaco administrado nas glândulas mamárias torácicas craniais foi drenado pelos linfocentros torácico ventral e axilar, sendo que em duas destas 5 glândulas (40%) o radiofármaco também foi para o linfocentro cervical superficial. Este resultado foi semelhante para as glândulas torácicas caudais, entretanto, em nenhuma das linfocintilografias destas glândulas o linfocentro cervical superficial foi identificado. A drenagem das glândulas abdominais craniais foi realizada exclusivamente pelo linfocentro axilar. Os linfocentros inguinais superficial e profundo drenaram as glândulas abdominais caudais e inguinais, porém, uma das glândulas abdominais caudais foi drenada também pelo linfocentro cervical superficial e outra pelo linfocentro mediastínico. A técnica linfocintilográfica utilizada possibilitou a identificação de comunicações linfáticas entre os linfonodos axilares próprio e acessório, entre o axilar próprio e o cervical superficial e entre os linfonodos inguinais superficial e profundo. O número de linfocentros e linfonodos, a taxa de drenagem dos linfocentros e seu funcionamento variaram entre as glândulas mamárias e entre os animais. Em conclusão, o protocolo de aquisição linfocintilográfica adotado foi simples, rápido e eficaz para a caracterização da drenagem linfática mamária. As informações topológicas e funcionais obtidas neste estudo poderão ser aplicadas nos procedimentos investigativos como a ultra-sonografia e a biópsia dos linfonodos mamários em pacientes acometidos por neoplasias mamárias, uma vez que os vasos linfáticos representam vias de disseminação para células neoplásicas. / The knowledge of lymphatic drainage has prognostic and surgical value for oncological treatment. Once you know the lymph nodes that drain the organ, you can predict the possible neoplasic cell route and avoid or predict metastasis. The lymphoscintigraphy is not common in Veterinary Nuclear Centers, however this technique has high applicability in oncological studies. During this study, the lymphoscintigraphie was used to characterize topological and functional aspects of lymphatic health mammary drainage in 30 adult mongrel female dogs, 10Kg in weigh. Lymphoscintigraphies were performed immediately after 4 intramammary peripapilare injections (0, 1 ml each) of 18,5 MBq of [99mTc]-dextran70 and one hour later. Animals were imaged by lateral and ventral projections. Cranial thoracic glands were drained by ventral thoracic and axillary lymph centers, but we observed the simultaneous participation of superficial cervical lymph center in 40% of these (2 animals). This result was similar for caudal thoracic mammary glands, but not for cervical lymph center drainage, that was not observed in caudal thoracic glands lymphoscintigraphies. Cranial abdominal glands were drained exclusively by the axillary lymph center. Superficial and deep inguinal lymph centers drained caudal abdominal and inguinal mammary glands, but we observed one superficial cervical lymph center participation in a caudal abdominal mammary gland drainage. Our lymphoscintigraphic technique provided image of lymphatic communication between axillary lymph nodes and between superficial and deep inguinal lymph nodes. The number of lymph centers and lymph nodes, the lymph center drainage rate and functional behavior of each lymph nodes were variable. In conclusion, the lymphoscintigraphic protocol performed was simple, quickly and provided the lymphatic drainage characterization. Technique, topologic and functional information provided by the present study can be applied to understand neoplasic mammary cells dissemination routes, which has prognostic and treatment value for patients. Veterinary centers that have no Nuclear Medicine facilities can use these topologic and functional information of the present study in other diagnostic procedures such as the abdominal ultra-sound and lymph node biopsy of patients with mammary neoplasia.

Maspina é uma proteína supressora de tumor e metástase e sua localização subcelular está relacionada ao prognóstico do câncer de mama. Nosso grupo mostrou em MCF-10A que quando fosforilada maspina se acumula no citoplasma. Porém, esta correlação ainda não foi relatada in vivo. Aqui investigamos a expressão, fosforilação e localização subcelular de maspina ao longo do desenvolvimento da glândula mamária murina. Maspina foi detectada no estágio mais tardio da gestação, na lactação e na involução. Os níveis de fosforilação de maspina são maiores no período de lactação do que na involução. Interessantemente, a porcentagem de células que apresenta maspina no núcleo é maior na fase de involução do que na fase de lactação Estes dados mostram que a correlação entre níveis de fosforilação de maspina e localização subcelular também é observada in vivo e que esses processos são reguladas ao longo do desenvolvimento na glândula mamária murina. / Maspin is a protein with tumor and metastasis suppressing activity and its subcellular localization is related to breast cancer prognosis. Using MCF-10A cells as a model system, our group demonstrated a correlation between maspin phosphorylation and cytoplasmic accumulation. Here we investigated maspin expression, phosphorylation levels and subcellular localization in vivo during the murine mammary gland development. Maspin was detected in late pregnancy, during lactation and involution. Maspin phosphorylation levels is higher during lactation than during involution. Interestingly, the percentage of cells which present nuclear maspin is higher in the involution than in lactation. These data show that the correlation between maspin phosphorylation and subcellular localization is also observed in vivo and these processes are regulated during murine mammary gland development.

Orientador: Renée Laufer Amorim / Coorientador: Andrigo Barboza De Nardi / Coorientador: Geovanni Dantas Cassali / Banca: Geórgia Modé Magalhães / Banca: Rolando André Rios Villacis / Banca: Sabryna Gouveia Calazans / Banca: Letícia Abrahão Anai / Resumo: Os tumores mamários são os principais tumores que acometem as cadelas, sendo também os tumores mais frequentes em mulheres e, entre ambas as espécies, são observadas semelhanças relacionadas ao comportamento biológico e molecular dessa neoplasia. Assim, as cadelas podem ser um excelente modelo comparativo para o entendimento do processo carcinogênico desta neoplasia. A metástase é uma consequência comum e a principal causa de mortalidade em decorrência dessa enfermidade, em ambas as espécies. O perfil de expressão gênica global permite o melhor entendimento do processo de carcinogênese e de metástases, por permitir a identificação de inúmeros genes que possam estar envolvidos com esses processos. Assim, o objetivo desse estudo foi a realização do estudo em larga escala, através da técnica de microarray, em amostras de tecidos mamários caninos, considerando amostras de glândulas mamárias normais, tumores mamários benignos e tumores mamários malignos (carcinomas simples e mistos), além da avaliação de carcinomas mamários metastáticos e não metastáticos, para identificação de genes diferencialmente expressos entre esses grupos e relacionados com a tumorigênese e o desenvolvimento de metástases dos tumores mamários caninos. Observou-se, aproximadamente 1000 genes diferencialmente expressos entre as amostras tumorais e as glândulas mamárias normais e 465 genes diferencialmente expressos entre os tumores mamários benignos e malignos, sendo observados genes relacionados com... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Mammary tumors are the main tumors that affect female dogs, as well as in women and in both species, it is observed similarity related to the biological and molecular behavior of this neoplasia. So, female dogs are considered an excellent model for the understanding of carcinogenesis process from mammary tumors. Metastasis occurs frequently and it is the main responsible for the mortality by this neoplasia in both species. Global gene expression profile allows the better understanding of carcinogenesis and metastasis process by the identification of several genes that may be involved with these processes. Therefore, the aim of study was to perform a large-scale study by microarray technique using samples from canine mammary tissues, as normal mammary gland, benign tumors and malignant tumors (simple and mixed carcinomas), beyond metastatic and non-metastatic mammary carcinomas for the identification of differentially expression genes among these groups and related to canine mammary tumors tumorigenesis and metastasis. It was observed next to 1000 differentially expression genes between tumors and normal mammary glands samples and 465 differentially expression genes between benign and malignant mammary tumors mostly related to cell cycle, mammary gland development and tumor suppressors. Related to metastatic and non-metastatic mammary carcinomas was identified 633 differentially expression genes. ATM and BRCA1, associated with tumor suppressor gene pathway, showed to play an i... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Até recentemente acreditava-se que a tuberculose em caprinos fosse uma enfermidade rara, o que levou ao errôneo conceito de que esses animais fossem resistentes ao Mycobacterium bovis. Este trabalho tem por objetivo verificar se houve processo inflamatório da glândula mamária devido a agentes de mastite ou à presença de Mycobacterium, comparar a frequência de isolamento pelo teste de Zielh-Neelsen nas amostras de leite e dos fragmentos de glândula mamária de caprinos tuberculina positivo e verificar lesões encontradas na glândula mamária com frequência semelhante aos isolados pelo teste de Zielh-Neelsen em caprinos tuberculina positivo. Os animais deste experimento foram provenientes de um surto de tuberculose em caprinos ocorrido numa propriedade localizada em Bueno Brandão (Minas Gerais), totalizando 68 animais. Os resultados encontrados foram obtidos através da análise dos testes de Tamis e California Mastitis Test em relação ao exame microbiológico tanto da glândula mamária quanto do leite. Através do isolamento bacteriológico obteve-se 64 (98,46%) amostras para Staphylococcus ssp e apenas 1 (1,54%) para Corynebacterium ssp. Na glândula mamária, dos seis isolamentos obtidos todos eram Staphylococcus ssp. Com os resultados apresentados pelo isolamento microbiológico da glândula mamária concluiu-se que independente da espécie, o Staphylococcus ssp é o agente de maior frequência entre os isolados sendo o maior responsável pela mastite intramamária em caprinos. Das 116 amostras de leite semeadas nos tubos de Stonebrink e Löwenstein-Jensem, foram isolados 5 (4,31%) de amostras de leite positivas ao teste de Zielh-Neelsen. Dos 60 fragmentos de glândula mamária semeados nos meios de Stonebrink e Löwenstein-Jensem, isolou-se apenas um tubo no meio de Stonebrink, perfazendo um frequência de 1 (1,66%) amostra de glândula mamária, o que é um indicativo que seja M. bovis, pois o meio de Stonebrink é um meio de eleição para o seu crescimento, utilizado para isolar o M. bovis. Estes fragmentos de glândula mamária que foram submetidos à análise histopatológica pelas colorações de hematoxilina-eusina e Zielh-Neelsen, apresentaram lesões na glândula mamária de cabras tuberculina positivo, 7 (11, 66%) de achados de lesões causadas por M. bovis na glândula mamária, e 18 (30,00%) processos de reparo. Pela análise histológica dos fragmentos de glândula mamária todos apresentaram processo inflamatório na região intersticial da glândula, sendo um indício de mastite crônica. Concluiu-se que: o processo inflamatório da glândula mamária não estava associado à presença de Staphylococcus ssp, mas ao estágio de secagem dos animais, pelo resultados do teste de Zielh-Neelsen no leite e nos fragmentos de glândula mamária positivos, pode-se utilizar qualquer um dos métodos para verificar a frequência de isolamento de microrganismos em animais tuberculina positivo, a frequência de processo granulomatoso nas glândulas mamárias dos animais estudados foi semelhante estatisticamente, tanto a frequência do testes de Zielh-Neelsen no leite, quanto nos fragmentos de glândula, porém quando se considerou a frequência do processo de reparo comparada com a frequência do teste de Zielh-Neelsen no leite e no fragmento da glândula houve diferença significante, portanto a frequência de processo na glândula mamária de animais tuberculina positivo é superior a frequência do teste de Zielh-Neelsen no leite e na glândula mamária. / Until recently it was believed that caprine tuberculosis was a rare infirmity leading to the wrong agreement that these animals were resistant to Mycobacterium bovis. This study aims to: verify if there was inflammatory process of the mammary gland caused by mastitis agents or the presence of Mycobacterium; compare the frequency of isolation by the Zielh-Neelsen\'s test in the milk samples and fragments of caprine mammary gland tuberculin positive, verify if the lesions found in the mammary gland present similar frequency to the ones isolated by the Zielh-Neelsen´s test in tuberculin positive caprine. The animals used in this experiment came from an outbreak of tuberculosis in caprine that occurred in a property located at the city of Bueno Brandão (Minas Gerais), totalizing 68 animals affected. The results were obtained through the analysis of the Tamis and California Mastitis Tests in relation to the microbiologic exam of, both, mammary gland and milk. By the bacteriological isolation it was obtained 64 (98,46%) samples for Staphylococcus ssp and only 1 (1,54%) for Corynebacterium sp. Of the 64 (98,46%) identified milk samples, from the genus Staphylococcus ssp.. In the mammary gland, of the 6 isolations obtained all were Staphylococcus ssp.. With the results shown by the microbiological isolation of the mammary gland, it is possible to conclude that, independently of the species, the Staphylococcus ssp is the agent of greater frequency among those which were isolated, being the major responsible for the caprine intramammary mastitis. Of the 116 milk samples cultured in the Stonebrink and Löwenstein-Jensem tubes, were isolated 5 (4,31%) milk Zielh-Neelsen positive samples. Of 60 mammary gland fragmentes cultured, in total, in the Stonebrink and Löwenstein-Jensem media, it was isolated only 1 tube in the Stonebrink medium, accomplishing a frequency of 1 (1,66%) samples of mammary gland, which indicates that it was M. bovis. This conclusion was possible because the Stonebrink medium is a way of selection to its growth, used to isolate the M. bovis. Of the 60 mammary gland fragments which were submitted to the histopathological analysis by the coloration of hematoyilin-eosin and Zielh-Neelsen and that showed mammary gland lesions of caprine tuberculin positive, 7 (11,66%) of the lesions were caused by M. bovis in the mammary gland, and 18 (30,00%) underwent repair process. By the histological analysis of the 60 mammary gland fragments, all presented inflammatory process in the interstitial region of the gland, which indicates cronic mastitis. Of 30 lung fragments, in total, sent to the histopathological diagnostic, it were submitted to hematoxylin-eosin (HE) and Zielh-Neelsen (ZN) colorations, 4 (13,33%) lesions typical tuberculosis lesions. From the results shown above, it is possible to conclude that: the inflammatory process of the mammary gland was not associated to the presence of Staphylococcus ssp (predominant microorganism of the positive culture) but in fact to the drying stage of the animals; from the results of the ZN test in the milk and positive mammary gland fragments, it is possible to use any of the methods to verify the isolation frequency of microorganism turberculin positive animals; the frequency of granulomatosus process in the mammary gland of the studied animals were statistically similar, in ZN tests frenquency in milk as much as the ZN tests\' in the gland fragments, however when considering the frequency of repair with the frequency of the ZN tests in the milk and in the gland fragments there was significant differences, and so, the process frequency in the mammary gland of tuberculin positive animals is greater than the frequency of the ZN tests in the milk and in the mammary gland.

Dentre os vários fatores que podem influenciar a polarização das respostas imunológicas nos animais destacam-se o tipo do agente agressor envolvido, as células apresentadoras de antígenos atuantes no processo e o microambiente formado pelas citocinas. Diferentes perfis de citocinas podem determinar o curso da doença, uma vez que distúrbios no equilíbrio da produção e liberação destes polipeptídeos têm papel significativo no desencadeamento e agravamento de diversas enfermidades. Vírus podem interferir com as funções das citocinas em vários níveis, influenciando na natureza da resposta imune do hospedeiro. Este desequilíbrio entre a produção de citocinas do tipo Th1 e Th2 é geralmente considerado como uma das causas da cronificação das infecções por retrovírus. O VLB, assim como outros retrovírus, também possui esta capacidade de manipular a resposta imune do hospedeiro a fim de direcionar os estágios alinfocitóticos (AL) e de linfocitose persistente (LP). No entanto, seu efeito diretamente sobre as citocinas no sangue e leite dos animais infectados ainda não foi completamente elucidado. Desta forma, o presente estudo objetivou a avaliação da resposta imune contra o VLB em vacas naturalmente infectadas por meio da quantificação de um perfil abrangente de citocinas presentes tanto no soro sanguíneo como no lácteo minimizados outros aspectos de estimulação que não fossem a presença do próprio vírus in vivo. Para tanto foram coletadas amostras de sangue e leite de 11 animais divididos em seus respectivos grupos experimentais (4, 3 e 4 animais para os grupos negativo, AL e LP, respectivamente) e determinadas as concentrações séricas e lácteas de IL-1&beta;, IL-4, IL-10, TNF-&alpha; e IFN-&gamma;. Para as comparações entre os grupos utilizou-se o teste não paramétrico de Kruskal-Wallis e quando estes apresentaramse significativos aplicou-se \"pós-teste\" para verificar onde tal diferença ocorreu. O nível de significância aplicado nos testes foi de 5 % (P&le;0,05), sempre considerando hipóteses alternativas bicaudais. Verificou-se que não houve diferença nas concentrações das citocinas IL-1&beta;, IL-4, IFN-&gamma; e TNF-&alpha; no sangue dos animais pertencentes aos diferentes grupos experimentais. Quanto às concentrações das citocinas no soro lácteo dos bovinos testados nos diferentes grupos, os resultados demonstraram comportamentos semelhantes aos habitualmente descritos na literatura científica para o sangue periférico, sugerindo que a atuação do VLB sobre a glândula mamária promova interações análogas às observadas sistemicamente. Os resultados obtidos apontam para um envolvimento do VLB sobre o perfil de citocinas da glândula mamária nos animais sororreagentes. / Among the many factors that can influence the polarization of immune responses in animals include the type of the offending agent involved, the antigen-presenting cells active in the process and the microenvironment formed by the cytokine. Different profiles of cytokines may determine the course of the disease, since disturbances in the balance of production and release of these polypeptides play a significant role in triggering and worsening of many diseases. Viruses can interfere with the functions of cytokines at various levels, influencing the nature of the host immune response. This imbalance in cytokine production from Th1 and Th2 is generally regarded as a cause of chronic infections by retroviruses. The BLV, like other retroviruses, also possess this ability to manipulate the host immune response in order to drive the stages non-lymphocytotic and persistent lymphocytosis. However, its effect directly on cytokines in blood and milk of infected animals has not been fully elucidated. Thus, this study aimed at evaluating the immune response against the BLV in cows naturally infected by quantifying a comprehensive profile of cytokines present in both the serum and in whey minimized others aspects of stimulation that was not the presence of the virus itself in vivo. For this purpose, samples of blood and milk of 11 animals divided into their respective experimental groups (4, 3 and 4 animals for groups negative, PL- and PL+, respectively) and certain whey and serum concentrations of IL-1&beta;, IL- 4, IL-10, TNF-&alpha; and IFN-&gamma;. For comparisons between groups used the nonparametric Kruskal-Wallis test and when they showed up was applied to significant \"post test\" to see where this difference occurred. The level of significance in the tests was 5 % (P&le; 0.05), when considering two-tailed alternative hypotheses. There was no difference in the concentrations of IL-1&beta;, IL-4, IFN-&gamma; and TNF-&alpha; in the blood of animals belonging to the different experimental groups. The concentrations of cytokines in the whey of cattle in different groups, the results showed behaviors similar to those usually described in scientific literature to the peripheral blood, suggesting that the action of BLV on the mammary gland promotes interactions similar to those seen systemically. The results indicate an involvement of BLV on the cytokine profile of the mammary gland in animals seropositive.