Sabe-se há algum tempo que a expressão de glicanas muda de acordo com a condição celular. A alteração do processo de glicosilação de proteínas é um processo comum em vários estados fisiopatológicos, sendo observado como um evento frequente em processos alérgicos e em células tumorais. O principal alérgeno do gato, a proteína Fel d 1, é um dímero composto de duas subunidades, sendo cada subunidade composta por uma cadeia α e β. A proteína possui um sítio de N-glicosilação em cada uma de suas subunidades, sendo preenchidos por diferentes glicoformas. Além disso, estudos cristalográficos detectaram três possíveis sítios de ligação a Ca2+ em sua estrutura. Diversos tipos de tumores apresentam expressão aumentada de GTs, dentre estas a FUT8 e a C2GnT-L. A FUT8 é uma β-1,6-fucosiltransferase, que transfere uma Fuc do substrato doador (GDP-β-L-fucose) à primeira GlcNAc do núcleo pentassacarídico de uma N-glicana. Esta enzima apresenta expressão aumentada em câncer de pulmão, gástrico e de cólon, além de estar envolvida em outros processos patológicos. A C2GnT-L transfere um resíduo de GlcNAc, em ligação β-1,6, ao núcleo 2 (Core 2) de glicanas O-ligadas, sendo superexpressa em câncer de pulmão, próstata e colorretal e relacionada com progressão tumoral e metástase. Considerando o papel da glicosilação e dos sítios ligadores de Ca2+ nos processos alérgicos, assim como a presença das GTs mencionadas em alta quantidade em processos tumorais, bem como a inexistência de dados estruturais e conformacionais destas proteínas e das estruturas sacarídicas em solução, o trabalho tem como objetivo contribuir na caracterização da glicobiologia estrutural destas proteínas. Para tal, foram estudados diversos sistemas da proteína Fel d 1 (PDBID 2ejn) e das enzimas FUT8 (PDBID 2de0) e C2GnT-L (PDBIDs 2gak e 2gam) por DM em solução aquosa em diferentes condições. Após os experimentos, pode-se observar que, para Fel d 1, apenas o íon Ca2+ central está ligado à proteína, enquanto os laterais ficam livres. A Fel d 1 com glicosilação reduzida apresentou um aumento de flexibilidade em duas hélices em uma das subunidades da Fel d 1, devido a desenovelamento das mesmas. Já a proteína completamente glicosilada apresentou uma redução no tamanho da cavidade de uma das subunidades. No estudo da FUT8, observou-se que o domínio N-terminal é o principal componente da flexibilidade proteica desta proteína. Ainda, foi possível caracterizar, através de atracamento molecular, a região de interação da FUT8 com sua glicana-alvo e com uma de suas proteínas-alvo, a integrina α5β1. Os resultados para C2GnT-L demonstraram que o sítio caracterizado para o substrato aceptor pode na verdade estar ocupado pelo substrato doador desta enzima, já que este permanece no local durante a DM, ao contrário do substrato aceptor. Espera-se que este trabalho contribua na compreensão do funcionamento destas proteínas, possibilitando futuros estudos acerca de seus papéis em enfermidades e, consequentemente, para novas estratégias terapêuticas. / We know for a while that glycan expression varies according to the cellular condition. Alterations in protein glycosylation is a common process in several physical and pathological processes, and are frequently observed in allergy and tumorous cells. The major cat allergen, Fel d 1, is a dimer composed by two subunits, each subunit containing one α and β chain. This protein contains one N-glycosylation site in each subunit, which are filled by different glycoforms. In addition, crystallographic studies detected three possible Ca2+ binding sites in its structure. Several types of tumors have higher expression of GTs, like FUT8 and C2GnT-L. FUT8 is an β-1,6-fucosyltransferase, transferring one Fuc from GDP-b-L-fucose to the inner most GlcNAc in the pentassaccharidic core of an N-glycan. This enzyme is highly expressed in lung, gastric and colon cancer and is involved in other pathological processes. C2GnT-L transfers a GlcNAc residue, in a β-1,6 linkage, to the Core 2 of O-linked glycans and is overexpressed in lung, prostate and colon-rectal cancer, related to tumoral progression and metastasis. Considering the role of glycosylation and Ca2+ binding sites in allergy, and considering the presence of the GTs mentioned above in high amounts in tumoral processes, as well as the inexistence of structural data concerning these proteins in solution, this study intents to contribute in characterizing the structural glycobiology of these proteins. In this matter, we studied several systems containing Fel d 1 (PDBID 2ejn), FUT8 (PDBID 2de0) and C2GnT-L (PDBID 2gak and 2gam) by MD in aqueous solution, under different conditions. We were able to observe, after the experiments, that in Fel d 1, only the central Ca2+ ion is bound to the protein, while the lateral ions are free. Fel d 1 containing reduced glycosylation form presented larger flexibility in two helices, in one of the subunits, due to their unfolding. Fully glycosylated Fel d 1 presented reduced cavity size in one of the subunits. In FUT8 study, we observed that the N-terminal domain is the principal component of protein flexibility. We were also able to characterize, using molecular docking, the sites of interaction of FUT8 with its target glycan and one of its target protein, integrin α5β1. Results for C2GnT-L showed that the characterized acceptor substrate site might, in fact, be occupied by the donor substrate, since the donor substrate remains in the site during MD, and the acceptor substrate does not. We expect that the refinement of these crystallographic structures, by introducing the saccharidic information, will contribute in comprehending the proteins functioning, and will further possibilitate studies into its roles in infirmities and, in this matter, to new therapeutic strategies.

LOBO, Marina Duarte Pinto. Análise proteômica de plasma de pacientes com câncer de mama utilizando lectinas vegetais e label-free LC-MSE. 2016. 158 f. Tese (doutorado em bioquímica)- Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2016. / Submitted by Elineudson Ribeiro (elineudsonr@gmail.com) on 2016-03-22T18:19:32Z No. of bitstreams: 1 2016_tese_mdplobo.pdf: 3396858 bytes, checksum: 435f82cac31daba0ee12e7449cc2f46a (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2016-05-18T18:29:19Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_tese_mdplobo.pdf: 3396858 bytes, checksum: 435f82cac31daba0ee12e7449cc2f46a (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-18T18:29:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_tese_mdplobo.pdf: 3396858 bytes, checksum: 435f82cac31daba0ee12e7449cc2f46a (MD5) Previous issue date: 2016 / The breast cancer presents one of the most commonly diagnosed types of cancer among women worldwide and in Brazil, after nonmelanoma skin cancer. It’s a clinically and biologically heterogeneous disease. Therefore, early detection of breast cancer, a reliable characterization of the disease and an accurate diagnosis are crucial to reducing mortality. The aim of this work was perform a qualitative and quantitative analyzes of plasma proteins from healthy women and from women with ductal breast cancer in different stages. For this, initially, plasma samples were depleted of IgG and albumin and then pooled into samples representative for each study group. The pools were then fractionated by immobilized plant lectins (frutalin and DAL)-affinity chromatography. Subsequently, the pools and chromatographic fractions were digested and submited to and data-independent label-free mass spectrometric analysis. The use of affinity chromatography with plant lectins prior to analysis by mass spectrometry was essential to reduce sample complexity and extend the dynamic range of proteins, and frutalin showed the best results from fractionation. A sum of all analyzes performed revealed the identification of about 445,000 peptides and more than 30,000 proteins, with redundancy between isoforms of the same group and between groups. Furthermore, in addition to fractionation, the chromatography of affinity with plant lectins were effective in isolating specific glycoforms that reflect an altered glycosylation pattern associated with the disease. Several differentially expressed proteins, some of which changes in glycosylation were identified, such as apolipoprotein A2, apolipoprotein C3, complement factors (C3, C4b and C4A), clusterin, 1-2-α-acid glycoprotein, haptoglobin, hemopexin, serum paraoxonase arylesterase, plasma retinol binding protein, plasminogen and vitronectin. Among the proteins identified, some are related to the breakdown of the extracellular matrix, lipid metabolism, oxidative stress and other characterized as acute phase proteins. Finally, the data of differential expression and possible changes in the glycosylation patterns of proteins contributes to the development of a protein profile, subject to later validation, presenting an association with the development and characterization of breast cancer in its different stages. / O câncer de mama representa o tipo de câncer mais comum entre as mulheres no mundo e no Brasil, depois do câncer de pele não melanoma. Caracterizando-se como uma doença clínica e biologicamente heterogênea, a detecção precoce do câncer de mama, uma caracterização fidedigna da doença e um diagnóstico preciso são de fundamental importância para redução da mortalidade. Assim, o objetivo do presente trabalho foi realizar análises qualitativas e quantitativas de proteínas plasmáticas de mulheres saudáveis e mulheres com câncer de mama tipo ductal, em diferentes estágios. Para isso, inicialmente, as amostras de plasma foram depletadas de albumina e IgG e depois reunidas em pools representativos para cada grupo em estudo. Os pools foram então fracionados por meio de cromatografias de afinidade em matrizes de Sepharose 4B imobilizadas com as lectinas vegetais α-galactose-ligante de Artocarpus incisa - Frutalina e glucose/manose-ligante de Dioclea altíssima – DAL. Posteriormente, tantos os pools como as frações cromatográficas obtidas foram digeridas e submetidas à análise independente de dados (MSE) e quantificadas (label-free) por espectrometria de massas. A utilização das cromatografias de afinidade com lectinas vegetais a priori da análise por espectrometria de massas foi fundamental para reduzir a complexidade das amostras e estender o intervalo dinâmico de proteínas, e frutalina apresentou os melhores resultados de fracionamento. Um somatório de todas as análises realizadas revelou a identificação de cerca de 445.000 peptídeos e mais de 30.000 proteínas, com redundância entre isoformas do mesmo grupo e entre grupos. Ademais, além de fracionar, as cromatografias de afinidade com lectinas vegetais foram eficientes em isolar glicoformas específicas que refletem um padrão de glicosilação alterado associado à doença. Diversas proteínas diferencialmente expressas, algumas delas com mudanças na glicosilação, foram identificadas, tais como apolipoproteína A2, apolipoproteína C3, fatores do sistema complemento (C3, C4b e C4A), clusterina, α-1-2-ácido glicoproteína, haptoglobina, hemopexina, paraoxonase arilesterase sérica, proteína plasmática de ligação ao retinol, plasminogênio e vitronectina. Dentre as proteínas identificadas, algumas estão relacionadas com a decomposição da matriz extracelular, metabolismo lipídico, estresse oxidativo e outras caracterizam-se como proteínas de fase aguda. Finalmente, os dados de expressão diferencial e possíveis alterações de glicosilação das proteínas contribuem para o desenvolvimento de um perfil protéico, alvo para posterior validação, que apresenta uma associação com o desenvolvimento e a caracterização do câncer de mama em seus diferentes estágios.

O conhecimento da glicobiologia estrutural se mantém como a parte menos explorada do estudo de estrutras tridimensionais. Considerando que a glicosilação pode estar envolvida em processos biológicos como crescimento celular e inflamação o descrever das bases moleculares da interação proteína-carboidrato pode auxiliar na compreensão destes eventos. Neste sentido considerando o pequeno número de trabalhos avaliando o perfil conformacional de glicoproteínas por simulação de dinâmica molecular e RMN este trabalho demonstrou que o campo de força GROMOS43a1 é capaz de representar adequadamente um conjunto de glicoproteínas tendo como conformação inicial as estrutras determinadas por RMN. O próximo desafio foi simular dissacarídeos isolados em solução e comparar o seu perfil aos estudos anteriores, o que demonstrou que o conjunto de conformações de cada dissacarídeo representa as conformações obtidas em ambos os métodos. Para validar o uso de conformações de dissacarídeos como unidades de construção de glicanas em glicoproteínas foi descrita a forma glicosilada das enzimas Cox-1 e Cox-2, que não possuíam a estrutura da glicosilação, e as conformações das glicanas nestas simulações foram similares as dos dissacarídeos, comprovando que as conformações de dissacarídeos podem ser extrapoláveis para construção de glicoproteínas. Finalmente foi construída a forma glicosilada da AGP humana, uma proteína que possui diferenças funcionais associadas ao perfil das glicanas ligadas. Sabe-se que em casos de resposta inflamatória a concentração plasmática da AGP pode ser aumentada em até cinco vezes a concentração normal e durante este aumento há uma diferença no número de ramificações das glicanas e presença de resíduos de fucose. Foram simuladas três estrutras AGP, sem glicosilação e glicosilada com a presença e ausência de fucoses,. A flexibilidade da estrutura não glicosilada é muito maior que das glicoproteínas, mostrando o papel estrutural da glicosilação. Adicionalmente foi estudada a interação que a AGP com selectinas, proteínas envolvidas nos processos inflamatórios, fornecendo dados preeliminares do papel molecular da interação AGP-selectina. / The knowning of strucutural glycobiology still the less explored area in threedimensional structures. Considering the envolviment of glycosylation in biological process such cellular grown and inflammation describe the molecular basis interactions of protein-carbohidrate may facilitate understanding of these events. In this way considering the small number of works evaluated the conformational profile of glycoproteins by molecular dynamics simulations and NMR this work demonstrate that the GROMOS96 43a1 force field adequately represent a glycoprotein’s conformational ensemble taking as the starting geometries, the NMR determined structures. The next step is simulate isolated disaccharides in solution and compare these proflite with previous work, which demonstrate that the conformational ensamble of disaccharides represents the conformations obtain in both methods. To validate the use of disaccharides conformations such construct units of glycans in glycoproteins, the glycosylated form of Cox-1 and Cox-2 with no previous structure were simulated, and the conformations of glycans were similar to disaccharides, proving that disaccharides conformations can be extrapolated to construct glycoproteins. Finaly it was construct the glycosylated form of human AGP, a protein with functional differentces associated to glycan linked profile. In cases of inflammatory response the the plasma concentration can rise up to fivefold and in this case the glycans differ in the branching and presence of fucose residues. Three structures of AGP were construct, unglycosylated and glycosylated with and without fucoses. The structural flexibility of unglycosylated form was higher than the glycosylated forms, demonstrated the structural role of glycans. Additionally it was study the interaction of AGP with selectins, proteins envolved in inflammatory process, supply preliminary data to molecular role of AGP-selectin interaction.

Made available in DSpace on 2014-11-10T11:09:39Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-04-04Bitstream added on 2014-11-10T11:58:06Z : No. of bitstreams: 1 000785503_20150404.pdf: 497224 bytes, checksum: a459a5b949a60edee526c57ea3fc8d80 (MD5) Bitstreams deleted on 2015-04-13T18:26:26Z: 000785503_20150404.pdf,Bitstream added on 2015-04-13T18:27:06Z : No. of bitstreams: 1 000785503.pdf: 1639502 bytes, checksum: 2fca464d3fcaa51a719adf9dfb1cd8d2 (MD5) / Interferons (IFNs) são pequenas proteínas conhecidas por suas atividades antiproliferativa e imunorregulatória e por seu envolvimento crucial na ação antiviral celular. Os IFNs do tipo I incluem os IFN-α, β e ω e são utilizados terapeuticamente no tratamento de diversos tipos de cânceres e hepatites B e C. Sabe-se que dentre os efeitos adversos causados pelo IFN-α estão as disfunções endócrinas. Pouco se sabe sobre os efeitos dos IFNs na reprodução. Assim, o presente estudo objetivou investigar, em ratos adultos, os efeitos da exposição subcrônica a diferentes doses de IFN-α sobre parâmetros reprodutivos masculinos. No experimento 1, ratos Wistar adultos (90 dias/350-470g) foram distribuídos em três grupos experimentais (n=10), sendo um controle, cujos animais receberam o veículo, e dois tratados, subcutaneamente, com as doses de 5x104 unidades/Kg e 10x104 unidades/Kg, diluídas em salina. Após 30 dias de tratamento os animais foram pesados e eutanasiados para coleta dos órgãos do sistema genital. Testículo e epidídimo direitos, próstata ventral e glândula seminal (sem a glândula coaguladora) de cada animal foram retirados e pesados. Testículos e epidídimos direitos foram utilizados para determinação do número de células germinativas e os epidídimos esquerdos para a coleta de espermatozoides para avaliação da motilidade e morfologia espermática e para serem usados nas inseminações artificiais intrauterinas. Os níveis séricos de testosterona também foram mensurados. No experimento 2, outro lote de animais, seguindo o mesmo design experimental, foi utilizado para a coleta dos testículos e epidídimos esquerdos para avaliações histopatológica e morfométrica. Os pesos corpóreos e dos órgãos reprodutores foram semelhantes entre os grupos, bem como a produção espermática diária, tempo de trânsito espermático através do epidídimo, motilidade e morfologia ... / Interferons (IFNs) are small proteins known their antiproliferative and immunoregulatory activities and their crucial involvement in the cellular antiviral. Type I IFNs include the IFN-α, β e ω and are used therapeutically in the treatment of several kinds of cancers and hepatitis B and C. Endocrine dysfunction is among the adverse side effects of IFN-α. Little is know about the effects of IFNs on reproduction. Therefore, the present study aimed to investigated, in adult rats, the effects of subchronic exposure to different doses of IFN-α on male reproductive parameters. In the experiment 1, adult male Wistar rats (90 days/350-470g) were distributed in three experimental groups (n=10), one control, which received the vehicle, and two treated, subcutaneously, with 5x104 units/Kg e 10x104 units/Kg of IFN-α, diluted in saline. After 30 days of treatment the animals were weighed and euthanized for collection of reproductive organs. Right testis and epididymis, ventral prostate and seminal gland (without coagulating gland) of each animal were removed and weighed. Right testis and epididymis were used for the determination of sperm number and left epididymis for collection of sperm to evaluate of sperm motility and morphology and for intrauterine artificial insemination. The serum testosterone levels were also measured. In the experiment 2, another lot of animals, following the same experimental design, were used for collection of left testis and epididymis for to histopathological and morphometric evaluation. The body and reproductive organ weights were unchanged, as well as the daily sperm production, sperm transit time through the epididymis, sperm motility and morphology and fertility potential of animals. The histopathological and morphometric evaluation did not reveal injuries related to treatment. Thus, our results show that subchronic exposure to IFN-α did not interfere with levels of serum testosterone ...

Orientador: Wilma De Gravas Kempinas / Banca: Raquel Fantin Domeniconi / Banca: Estela Saao Cerri / Resumo: Interferons (IFNs) são pequenas proteínas conhecidas por suas atividades antiproliferativa e imunorregulatória e por seu envolvimento crucial na ação antiviral celular. Os IFNs do tipo I incluem os IFN-α, β e ω e são utilizados terapeuticamente no tratamento de diversos tipos de cânceres e hepatites B e C. Sabe-se que dentre os efeitos adversos causados pelo IFN-α estão as disfunções endócrinas. Pouco se sabe sobre os efeitos dos IFNs na reprodução. Assim, o presente estudo objetivou investigar, em ratos adultos, os efeitos da exposição subcrônica a diferentes doses de IFN-α sobre parâmetros reprodutivos masculinos. No experimento 1, ratos Wistar adultos (90 dias/350-470g) foram distribuídos em três grupos experimentais (n=10), sendo um controle, cujos animais receberam o veículo, e dois tratados, subcutaneamente, com as doses de 5x104 unidades/Kg e 10x104 unidades/Kg, diluídas em salina. Após 30 dias de tratamento os animais foram pesados e eutanasiados para coleta dos órgãos do sistema genital. Testículo e epidídimo direitos, próstata ventral e glândula seminal (sem a glândula coaguladora) de cada animal foram retirados e pesados. Testículos e epidídimos direitos foram utilizados para determinação do número de células germinativas e os epidídimos esquerdos para a coleta de espermatozoides para avaliação da motilidade e morfologia espermática e para serem usados nas inseminações artificiais intrauterinas. Os níveis séricos de testosterona também foram mensurados. No experimento 2, outro lote de animais, seguindo o mesmo design experimental, foi utilizado para a coleta dos testículos e epidídimos esquerdos para avaliações histopatológica e morfométrica. Os pesos corpóreos e dos órgãos reprodutores foram semelhantes entre os grupos, bem como a produção espermática diária, tempo de trânsito espermático através do epidídimo, motilidade e morfologia ... / Abstract: Interferons (IFNs) are small proteins known their antiproliferative and immunoregulatory activities and their crucial involvement in the cellular antiviral. Type I IFNs include the IFN-α, β e ω and are used therapeutically in the treatment of several kinds of cancers and hepatitis B and C. Endocrine dysfunction is among the adverse side effects of IFN-α. Little is know about the effects of IFNs on reproduction. Therefore, the present study aimed to investigated, in adult rats, the effects of subchronic exposure to different doses of IFN-α on male reproductive parameters. In the experiment 1, adult male Wistar rats (90 days/350-470g) were distributed in three experimental groups (n=10), one control, which received the vehicle, and two treated, subcutaneously, with 5x104 units/Kg e 10x104 units/Kg of IFN-α, diluted in saline. After 30 days of treatment the animals were weighed and euthanized for collection of reproductive organs. Right testis and epididymis, ventral prostate and seminal gland (without coagulating gland) of each animal were removed and weighed. Right testis and epididymis were used for the determination of sperm number and left epididymis for collection of sperm to evaluate of sperm motility and morphology and for intrauterine artificial insemination. The serum testosterone levels were also measured. In the experiment 2, another lot of animals, following the same experimental design, were used for collection of left testis and epididymis for to histopathological and morphometric evaluation. The body and reproductive organ weights were unchanged, as well as the daily sperm production, sperm transit time through the epididymis, sperm motility and morphology and fertility potential of animals. The histopathological and morphometric evaluation did not reveal injuries related to treatment. Thus, our results show that subchronic exposure to IFN-α did not interfere with levels of serum testosterone ... / Mestre

Orientador: Roberto da Silva / Banca: Maria de Lourdes T.M. Polizeli / Banca: Adalberto Pessoa Júnior / Banca: Rubens Monti / Banca: Mauricio Boscolo / Resumo: Neste trabalho as ß-glicosidases produzidas pelos microrganismos Thermoascus aurantiacus e Aureobasidium pullulans foram purificadas, caracterizadas termodinamicamente, físico-quimicamente e aplicadas em terpenos e isoflavonas. O processo de purificação da enzima do T. aurantiacus apresentou rendimento final de 63,6% e fator de purificação de 46,3 vezes. Após a purificação da enzima do A. pullulans, esta apresentou fator de purificação de 35,5 vezes e rendimento de 19%. A ß-glicosidase do T. aurantiacus apresentou atividade ótima em pH 4,5 a temperatura de 75ºC. Esta manteve-se estável na faixa de pH 4,5 a 6,5 e reteve sua atividade original após 1 hora a 70ºC. A enzima purificada do A. pullulans apresentou maior atividade catalítica nos valores de pH 4,0-4,5 a temperatura de 80ºC. A mesma foi estável em ampla faixa de pH 4,0 a 9,5, e, reteve sua atividade original após 1 hora a 75ºC. A maior termoestabilidade, da enzima produzida pelo microrganismo mesofílico, A. pullulans, foi comprovada pela análise dos parâmetros termodinâmicos. A ß-glicosidase do T. aurantiacus apresentou valores menores de t(1/2), ∆G, ∆H e Ea em todas as temperaturas analisadas. As duas enzimas foram fortemente inibidas por Hg+2 e Ag+, sugerindo que o grupo tiol (SH) é essencial para atividade das mesmas. O pNPßG foi utilizado para a determinação dos parâmetros cinéticos, os valores de Km e Vmax obtidos foram 0,53 mM e 590,8 μmol/ min/mg de proteína para a enzima do T. aurantiacus, e, 0,93 mM e 29,9 μmol/ min/mg de proteína para a enzima do A. pullulans. A presença de etanol no meio de reação ativou a ß-glicosidase do T. aurantiacus, indicando atividade glicosil transferase, o mesmo não foi observado para enzima do A. pullulans. As duas ß-glicosidases atuaram em diferentes substratos glicosídicos, inclusive sobre terpenos e isoflavonas, o que confirma a ampla especificidade das enzimas. / Abstract: In this work, ß-glucosidases produced by the microorganisms Thermoascus aurantiacus and Aureobasidium pullulans were purified, thermodynamically and physical-chemically characterized and applied on terpenes and isoflavones. Purification process of the enzyme from T. aurantiacus exhibited final yield of 63.6% and purification factor of 46.3 -fold. Purification process of the enzyme from A. pullulans resulted in 19% yield and purification factor of 35.5-fold. ßglucosidase from T. aurantiacus exhibited optimum activity at pH 4.5 and at temperature of 75ºC. It remained stable at pH range of 4.5 to 6.5 and maintained its original activity after 1 hour at 70ºC. Purified enzyme from A. pullulans exhibited a higher catalytic activity in pH values of 4.0-4.5 at an optimum temperature of 80ºC. It was stable over a wide pH range, from 4.0 to 9.5, and, maintained its original activity after 1 hour at 75ºC. The higher thermal stability of the enzyme produced by the mesophilic microorganism, A. pullulans, was confirmed by analysis of the thermodynamic parameters. ß-glucosidase from T. aurantiacus exhibited lower values for t(1/2), ∆G, ∆H and Ea in all temperatures tested. Both enzymes were strongly inhibited by Hg+2 and Ag+, suggesting that a thiol group (SH) is essential for their activities. pNPßG was used for the kinetic parameters determination and the values for Km and Vmax were 0.53 mM and 590.8 μmol/ min/mg of protein for the enzyme from T. aurantiacus, and, 0.93 mM and 29.9 μmol/ min/mg of protein for the enzyme from A. pullulans. The presence of ethanol in the reaction mixture activated the ß-glucosidase from T. aurantiacus, indicating glucosil transferase activity, which was not observed for the enzyme from A. pullulans. Both ß-glucosidases exhibited activity on different glucosidic substrates, including terpenes and isoflavones, confirming the broad specificity of the enzymes. / Doutor

O conhecimento da glicobiologia estrutural se mantém como a parte menos explorada do estudo de estrutras tridimensionais. Considerando que a glicosilação pode estar envolvida em processos biológicos como crescimento celular e inflamação o descrever das bases moleculares da interação proteína-carboidrato pode auxiliar na compreensão destes eventos. Neste sentido considerando o pequeno número de trabalhos avaliando o perfil conformacional de glicoproteínas por simulação de dinâmica molecular e RMN este trabalho demonstrou que o campo de força GROMOS43a1 é capaz de representar adequadamente um conjunto de glicoproteínas tendo como conformação inicial as estrutras determinadas por RMN. O próximo desafio foi simular dissacarídeos isolados em solução e comparar o seu perfil aos estudos anteriores, o que demonstrou que o conjunto de conformações de cada dissacarídeo representa as conformações obtidas em ambos os métodos. Para validar o uso de conformações de dissacarídeos como unidades de construção de glicanas em glicoproteínas foi descrita a forma glicosilada das enzimas Cox-1 e Cox-2, que não possuíam a estrutura da glicosilação, e as conformações das glicanas nestas simulações foram similares as dos dissacarídeos, comprovando que as conformações de dissacarídeos podem ser extrapoláveis para construção de glicoproteínas. Finalmente foi construída a forma glicosilada da AGP humana, uma proteína que possui diferenças funcionais associadas ao perfil das glicanas ligadas. Sabe-se que em casos de resposta inflamatória a concentração plasmática da AGP pode ser aumentada em até cinco vezes a concentração normal e durante este aumento há uma diferença no número de ramificações das glicanas e presença de resíduos de fucose. Foram simuladas três estrutras AGP, sem glicosilação e glicosilada com a presença e ausência de fucoses,. A flexibilidade da estrutura não glicosilada é muito maior que das glicoproteínas, mostrando o papel estrutural da glicosilação. Adicionalmente foi estudada a interação que a AGP com selectinas, proteínas envolvidas nos processos inflamatórios, fornecendo dados preeliminares do papel molecular da interação AGP-selectina. / The knowning of strucutural glycobiology still the less explored area in threedimensional structures. Considering the envolviment of glycosylation in biological process such cellular grown and inflammation describe the molecular basis interactions of protein-carbohidrate may facilitate understanding of these events. In this way considering the small number of works evaluated the conformational profile of glycoproteins by molecular dynamics simulations and NMR this work demonstrate that the GROMOS96 43a1 force field adequately represent a glycoprotein’s conformational ensemble taking as the starting geometries, the NMR determined structures. The next step is simulate isolated disaccharides in solution and compare these proflite with previous work, which demonstrate that the conformational ensamble of disaccharides represents the conformations obtain in both methods. To validate the use of disaccharides conformations such construct units of glycans in glycoproteins, the glycosylated form of Cox-1 and Cox-2 with no previous structure were simulated, and the conformations of glycans were similar to disaccharides, proving that disaccharides conformations can be extrapolated to construct glycoproteins. Finaly it was construct the glycosylated form of human AGP, a protein with functional differentces associated to glycan linked profile. In cases of inflammatory response the the plasma concentration can rise up to fivefold and in this case the glycans differ in the branching and presence of fucose residues. Three structures of AGP were construct, unglycosylated and glycosylated with and without fucoses. The structural flexibility of unglycosylated form was higher than the glycosylated forms, demonstrated the structural role of glycans. Additionally it was study the interaction of AGP with selectins, proteins envolved in inflammatory process, supply preliminary data to molecular role of AGP-selectin interaction.

O conhecimento da glicobiologia estrutural se mantém como a parte menos explorada do estudo de estrutras tridimensionais. Considerando que a glicosilação pode estar envolvida em processos biológicos como crescimento celular e inflamação o descrever das bases moleculares da interação proteína-carboidrato pode auxiliar na compreensão destes eventos. Neste sentido considerando o pequeno número de trabalhos avaliando o perfil conformacional de glicoproteínas por simulação de dinâmica molecular e RMN este trabalho demonstrou que o campo de força GROMOS43a1 é capaz de representar adequadamente um conjunto de glicoproteínas tendo como conformação inicial as estrutras determinadas por RMN. O próximo desafio foi simular dissacarídeos isolados em solução e comparar o seu perfil aos estudos anteriores, o que demonstrou que o conjunto de conformações de cada dissacarídeo representa as conformações obtidas em ambos os métodos. Para validar o uso de conformações de dissacarídeos como unidades de construção de glicanas em glicoproteínas foi descrita a forma glicosilada das enzimas Cox-1 e Cox-2, que não possuíam a estrutura da glicosilação, e as conformações das glicanas nestas simulações foram similares as dos dissacarídeos, comprovando que as conformações de dissacarídeos podem ser extrapoláveis para construção de glicoproteínas. Finalmente foi construída a forma glicosilada da AGP humana, uma proteína que possui diferenças funcionais associadas ao perfil das glicanas ligadas. Sabe-se que em casos de resposta inflamatória a concentração plasmática da AGP pode ser aumentada em até cinco vezes a concentração normal e durante este aumento há uma diferença no número de ramificações das glicanas e presença de resíduos de fucose. Foram simuladas três estrutras AGP, sem glicosilação e glicosilada com a presença e ausência de fucoses,. A flexibilidade da estrutura não glicosilada é muito maior que das glicoproteínas, mostrando o papel estrutural da glicosilação. Adicionalmente foi estudada a interação que a AGP com selectinas, proteínas envolvidas nos processos inflamatórios, fornecendo dados preeliminares do papel molecular da interação AGP-selectina. / The knowning of strucutural glycobiology still the less explored area in threedimensional structures. Considering the envolviment of glycosylation in biological process such cellular grown and inflammation describe the molecular basis interactions of protein-carbohidrate may facilitate understanding of these events. In this way considering the small number of works evaluated the conformational profile of glycoproteins by molecular dynamics simulations and NMR this work demonstrate that the GROMOS96 43a1 force field adequately represent a glycoprotein’s conformational ensemble taking as the starting geometries, the NMR determined structures. The next step is simulate isolated disaccharides in solution and compare these proflite with previous work, which demonstrate that the conformational ensamble of disaccharides represents the conformations obtain in both methods. To validate the use of disaccharides conformations such construct units of glycans in glycoproteins, the glycosylated form of Cox-1 and Cox-2 with no previous structure were simulated, and the conformations of glycans were similar to disaccharides, proving that disaccharides conformations can be extrapolated to construct glycoproteins. Finaly it was construct the glycosylated form of human AGP, a protein with functional differentces associated to glycan linked profile. In cases of inflammatory response the the plasma concentration can rise up to fivefold and in this case the glycans differ in the branching and presence of fucose residues. Three structures of AGP were construct, unglycosylated and glycosylated with and without fucoses. The structural flexibility of unglycosylated form was higher than the glycosylated forms, demonstrated the structural role of glycans. Additionally it was study the interaction of AGP with selectins, proteins envolved in inflammatory process, supply preliminary data to molecular role of AGP-selectin interaction.

Memoria para optar al Titulo Profesional de Médico Veterinario / Existe una amplia variedad de patologías que afectan a los gatos domésticos, generando gastos económicos por parte de sus dueños en busca de soluciones y la eventual mejoría de sus mascotas. Dentro de todas éstas, el virus herpes felino tipo 1 (VHF-1) uno de los agentes etiológicos del llamado complejo respiratorio felino, genera múltiples problemas en los gatos domésticos, dejando incluso secuelas importantes que afectan posteriormente su calidad de vida. Además, por ser un patógeno altamente distribuido alrededor del mundo y de fácil transmisión, existe un gran porcentaje de animales infectados y por su característica de patógeno latente, continúa distribuyéndose sin control a través de las poblaciones de gatos. En la clínica de animales pequeños su diagnóstico es en base a los signos clínicos presentados por los gatos afectados, existiendo hasta la fecha en Chile sólo una forma de diagnóstico de laboratorio específico para identificar el agente que no se utiliza rutinariamente en clínica. Por lo anterior, el tratamiento generalmente se basa en el conocimiento y experiencia del médico veterinario tratante, sin confirmación real del agente que está actuando. Por esta razón, en esta memoria de título se propuso implementar un método de diagnóstico molecular alternativo en gatos menores de un año de edad con signología clínica correspondiente a infección con VHF-1. Para ello se realizó la detección del gen de la glicoproteína B del virus a través de la técnica de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) y se determinó el porcentaje de identidad nucleotídica (PIN) del segmento obtenido, comparándolo con datos de la base genómica online Genbank®. De los once gatos analizados, en solo uno de ellos se logró amplificar un segmento correspondiente al gen de la glicoproteína B. El valor de PIN obtenido (96%) validaría que el segmento obtenido corresponde al gen de la glicoproteína B del VHF-1. Se discute la eficiencia del método implementado / PROGRAMA AUCAI 2011

Orientador: Mirela Tinucci Costa / Banca: Aleksandro Schafer da Silva / Banca: Leucio Câmara Alves / Banca: Aureo Evangelista Santana / Banca: Annelise Carla Camplesi / Resumo: O tratamento de cães com leishmaniose visceral no Brasil tem gerado polêmicas discussões entre os diversos segmentos de profissionais da saúde. De um lado os Médicos Veterinários pressionados pelos proprietários dos cães que querem ter o direito de decidir por um tratamento ou pela eutanásia de seus animais; de outro os Ministérios da Saúde e da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA) que se mostram contrários a qualquer tratamento, motivados pelo risco de se criar cepas do parasita resistentes aos fármacos, os quais também podem ser empregados em pacientes humanos. Argumentos científicos que possam embasar essa polêmica devem ser explorados. Uma das possibilidades de se avaliar o desenvolvimento de resistência a fármacos pode ser conseguida por meio da pesquisa da expressão da glicoproteína-P (gp-P) e proteína de resistência a múltiplas drogas (MRP1), que atuam como bombas de efluxo expulsando xenobióticos de células, responsáveis pelo fenótipo MDR (resistência a múltiplas drogas). Avaliamos, pela técnica de imuno-histoquímica, a reatividade da gp-P e MRP1, clone C494 e ABCC1, respectivamente, na pele de 11 cães naturalmente infectados por Leishmania (L.) infantum chagasi antes e após serem submetidos a dois protocolos de tratamento: Alopurinol e vacina inativada (n=4) e Alopurinol, vacina inativada e domperidona (n=7) e quantificamos formas amastigotas na pele pela mesma técnica. Todos os animais após 3 e 6 meses de tratamento tiveram melhora clínica evidente e tiveram contagem negativa de formas amastigotas do parasita. Pele de cães com LV expressaram gp-P e MRP1, antes e após o tratamento, no entanto, este experimento permitiu concluir que a gp-P e MRP1 não foram bons marcadores para avaliar a eficácia terapêutica da LVC e para prever possíveis estados de resistência a fármacos. Todavia, o entendimento sobre a participação de marcadores de resistência a múltiplas drogas na pele de ... / Abstract: The treatment of dogs with visceral leishmaniasis in Brazil has generated controversial debate among various segments of health professionals. On one side, veterinarians pressured by dog owners want to have the right to decide between treatment and euthanasia of their animals. On the other hand, the Ministry of Health and the Ministry of Agriculture, Livestock, and Supply (MAPA) are opposed to treatment because of the risk of creating strains of the parasite resistant to drugs that are also used for human patients. Scientific arguments that can support this controversy should be explored. One possibility for assessing the development of drug resistance can be achieved through research of the expression of Pglycoprotein (P-gp) and multidrug resistance-associated protein (MRP1). These proteins, which are responsible for the MDR phenotype (multiple drug resistance), act as efflux pumps which expel xenobiotics from cells. Using immunohistochemistry, the reactivity of P-gp (clone C494) and MRP1 (clone ABCC1) in the skin of 11 dogs naturally infected by Leishmania (L.) infantum chagasi was analyzed before and after undergoing two treatment protocols: Allopurinol and inactivated vaccine (n=4) and Allopurinol, inactivated vaccine, and domperidone (n=7). Quantification of Leishmania amastigotes in the skin was also achieved via immunohistochemistry. All of the animals after 3 and 6 months of treatment had clinical improvement and tested negative for amastigote forms of the parasite. Yet, the skin of dogs positive for CVL (canine visceral leishmaniasis) expressed P-gp and MRP1 before and after treatment, illustrating that P-gp and MRP1 were neither good markers for evaluating the therapeutic efficacy of CVL nor for predicting the possible states of drug resistance. However, an understanding of the participation of markers for multiple drug resistance in the skin of dogs under treatment for CVL can be of great importance for the development of an ... / Doutor