Na,K-ATPase é uma proteína de membrana que tem como função manter o equilíbrio osmótico nas células pela hidrólise de ATP. A ouabaína (OUA) se liga a Na,K-ATPase e é capaz de ativar cascatas de sinalização. As subunidades a da Na,K-ATPase possuem 4 isoformas que são distribuídas de forma diferenciada nos tecidos. As células da glia são importantes na resposta contra lesões no cérebro e também controlam a inflamação. Dados na literatura mostram que a OUA tem efeito protetor em alguns tipos de dano. O objetivo do estudo é avaliar a função da isoforma a2 na cultura de células da glia em resposta à OUA e ao LPS. Nós investigamos a ação da OUA em diversas concentrações e LPS (1g/mL) na viabilidade celular (LDH) e proliferação celular (MTT). O LPS foi utilizado como modelo de inflamação e uma das perguntas era se o tratamento prévio com OUA, seria capaz de reverter a ativação do fator de transcrição NF-kB que está envolvido com inflamação. O pré-tratamento com OUA diminuiu a ativação do NF-kB induzida pelo LPS. Após, nós silenciamos a isoforma a2 das células da glia com RNAi. Os nossos dados mostram que o pré-tratamento com OUA reverte o efeito na ativação do NF-kB causado pelo LPS. Provavelmente, a isoforma a2 está relacionada com alguma via de sinalização que interage com a via do LPS. / Na,K-ATPase is a conserved membrane protein which maintains the osmotic balance in the cell by the hydrolysis of ATP. Ouabain (OUA) binds to Na,K-ATPase and it can activate signaling pathways. The a subunits of Na,K-ATPase have 4 isoforms which are distributed in a different pattern in the tissues. Glial cells have an important role in the response against injury and they also control inflammation. Some data have reported that OUA can protect against some types of injury. The aim of this study is to evaluate the role of a2 isoform in glial cells in response to OUA and LPS stimulus. We investigated the action of OUA and LPS in cell viability (LDH) and cell proliferation (MTT). LPS was used as a model of inflammation and one of our questions was if the treatment with OUA before LPS was capable of reduce the activation of the transcription factor NF-kB which is involved in inflammation. The pre-treatment with OUA decreased the NF-kB activation induced by LPS. We also silenced the a2 isoform in culture glial cells with iRNA. Taken together our data showed that OUA pretreatment reversed the NF-kB activation induced by LPS in primary cultures of glial cells from mice. Probably,the a2 isoform is related with some signaling pathway that interacts with the LPS pathway.

A trealase solúvel foi purificada a partir do intestino de S. frugiperda. Os pKas dos grupos catalíticos determinados por inativação química são similares aos pKas determinados por analise cinética, indicando que a enzima tem um grupo carboxila que atua como um nucleófilo e um grupo guanidina que atua como doador de prótons. Dietil pirocarbonato não afeta a enzima, exceto na presença de MalfaGlu (inibidor competitivo). A modificação com DPC diminui a atividade enzimática da trealase e muda o valor do pKa do resíduo de Arg, indicando que o resíduo de His modula o pKa do doador de prótons. Trealase tem dois subsítios para a ligação de glicose e baseado na proteção por MalfaGlu durante a modificação química é possível inferir que o subsítio que liga MalfaGlu contém o grupo carboxila, e o outro subsítio possui o resíduo de Arg que atua como grupo catalítico e o resíduo de His. Usando diferentes estratégias nós obtivemos uma seqüência parcial do cDNA que aparentemente codifica para trealase (denominada trealase 1) e clonamos e expressamos a enzima denominada trealase 2. A trealase 2 foi expressa em Bl21 DE3 e purificada, sendo que suas propriedades são similares a enzima solúvel. O cDNA da trealase 1 provavelmente codifica para a trealase de membrana encontrada no intestino de S. frugiperda. A trealase 2 tem 587 aminoácidos, um pepitideo sinal com 23 aminoácidos e seis possíveis sítios para glicosilação. A enzima apresenta alta identidade e similaridade (61% e 76%, respectivamente) com a trealase digestiva de B. mori. Foi determinada a atividade de trealase presente na carcaça, Túbulos de Malpighi, corpo gorduroso, intestino e hemolinfa de Tenebrio molitor, Musca domestica, Spodoptera frugiperda e Diatraea saccharalis na presença e na ausência de ß-glicosideos tóxicos produzidos por plantas. Os glicosídeos usados foram amigdalina, prunasina, florizina e o aglicone mandelonitrila. E a atividade das trealases de T. molitor e S. frugiperda foi determinada também na presença de esculina. Prunasina é o melhor inibidor das trealases de T. molitor, já para as trealases (ligadas a membrana) de D. saccharalis o melhor inibidor é florizina e esculina é o melhor inibidor das trealases de S. frugiperda. Nós alimentamos S. frugiperda com uma dieta contendo 0,1% de esculina e sua presença nós tecidos foi detectada por fluorescência. Esculina foi encontrada no corpo gorduroso, Túbulos de Malpighi e hemolinfa e não foi encontrada na carcaça. A maior quantidade de esculina foi registrada na hemolinfa (0,2 mM) e as larvas alimentadas com uma dieta contendo esculina são 40% menor que as larvas alimentadas numa dieta controle. A inibição das trealases pode ser um dos fatores que leva a diminuição de peso das larvas experimentais. As larvas de S. frugiperda criadas numa dieta com 0,1% de amigdalina apresenta em alguns tecidos um aumento na atividade especifica de trealase o que não é observado quando as larvas são alimentadas com uma dieta com 0,1% de esculina. O aumento na atividade especifica de trealase pode ser uma das razões pela qual o desenvolvimento de S. frugiperda não é afetado pela amigdalina presente na dieta. / A soluble trehalase was purified from Spodoptera frugiperda midgut. The pKas of the catalitical groups determined by chemical inactivation agrees with the ones determined by kinetical analysis, indicating that the enzyme has a carboxyl group that acts as a nucleophile and a guanidine group that is the proton donor. Diethyl pyrocarbonate (DPC) does not affect to the enzyme, except in the presence of MalphaGlu (a competitive inhibitor). DPC modification decreases trehalase activity and changes the pKa value of the catalytical Arg residue, indicating that pKa of the proton donor His residue modulates. Trehalase has two subsites for glucose binding and based on the protection by MalphaGlu against chemical modification it is possible to infer that the subsite that binds MalphaGlu contains the catalytic carboxyl, whereas the other has the catalytical Arg residue and the His residue. Using different strategies we succeeded in obtaining a partial sequence of a cDNA that apparently codes for trehalase (called trehalase 1) and in molecular cloning and expressing the enzyme named trehalase 2. Trehalase 2, expressed in Bl21 DE3 cells was purified and its properties are similar to the soluble enzyme. Trehalase 1 cDNA probably codes for a membrane-bound trehalase found in S. frugiperda midgut. Trehalase 2 has 587 amino acids, a signal peptide with 23 amino acids and six possible sites for glycosilation. The enzyme present higher identity and similarity (61% and 76%, respectively) to digestive trehalase of Bombyx mori. Trehalase from body wall, Malpighian tubules, fat body, midgut and haemolymph from Tenebrio molitor, Musca. domestica, Spodoptera frugiperda and Diatraea saccharalis were assayed with and without the presence of toxic glucosides produced by plants. The glucosides used were amygdalin, prunasin, phlorizin and the aglycone mandelonitrile. In addition, T. molitor and S. frugiperda trehalases were assayed with esculin. Prunasin is the best inhibitor in T. molitor and M. domestica, phlorizin in D. saccharalis (only membrane-bound activity) and esculin in S. frugiperda. We fed S. frugiperda with a diet containing 0.1 % esculin and followed its fate by fluorescence. Esculin is recovered from fat body, Malpighian tubules and haemolymph. No esculin was found in body wall. The majority of esculin was recovered in haemolymph (0.2 mM) and larvae fed on esculin-containing diet weigh 40 % less than control ones. Trehalase inhibition by esculin may account for at least part of the observed decrease in larval weight. S. frugiperda larvae reared in 0.1% amygdalin-containing diet present higher trehalase activities in several tissues than the larvae reared in 0.1% esculin-containing diet. Higher trehalase activity should be the reason why S. frugiperda development is affected by esculin, but is not impaired by amygdalin present in the diet.

A busca por substâncias benéficas à saúde humana tem impulsionado o desenvolvimento de pesquisas visando o estudo de enzimas e seus produtos através da otimização de bioprocessos. Um dos principais componentes utilizados como base para a indústria de alimentos funcionais são carboidratos denominados frutooligossacarídeos (FOS) derivados da sacarose. Estes são sintetizados por enzimas denominadas frutosiltransferases que podem ser encontradas em plantas, bactérias e fungos. Os FOS têm atraído grande interesse da indústria, devido às suas características fisiológicas e biomoduladoras. Por serem polissacarídeos prebióticos não-digeríveis, têm a capacidade de estimular seletivamente o crescimento de bifidobactérias e lactobacilos, auxiliando na prevenção da cárie dentária e câncer de cólon em humanos. Podem também contribuir na diminuição do colesterol total e triglicerídeos no sangue, promover a reabsorção de cálcio e magnésio e serem utilizados em dietas com restrições alimentares, por serem açúcares de baixo valor calórico e elevado valor nutricional. Tendo em vista a existência de diferentes formas de FOS sintetizados por diferentes mecanismos, o presente trabalho buscou realizar a caracterização estrutural e funcional de um conjunto de 13 frutosiltransferases de bactérias e fungos. Os genes alvo foram clonados e as enzimas expressas e purificadas. Ensaios estruturais e de atividade enzimática, incluindo de hidrólise e polimerização da sacarose, foram conduzidos para a melhor compreensão das bases moleculares envolvidas no reconhecimento do substrato. Oito enzimas, duas β-frutofuranosidases de B. adolescentis, três sucrose-6-phosphate hydrolase de B. licheniformis e L. gasseri e uma invertase de A.niger foram cristalizadas e as enzimas de B. adolescentis e de L. gasseri tiveram suas estruturas resolvidas e seus sítios catalíticos mapeados. Estas apresentam em sua estrutura uma região β-propeller, local identificado como sítio catalítico, conectada à um módulo β-sanduíche. Ambas as enzimas apresentaram atividade hidrolítica da sacarose e a enzima de L. gasseri apresentou a formação dos FOS nistose e 1-cestose com concentrações de 1 M de sacarose bem como em tempos de 8 e 12 horas de incubação. Estes estudos, somados às análises das outras enzimas, permitirão o melhoramento na produção em larga escala, além da otimização e o controle destes processos de obtenção de FOS. / The search for beneficial substances to human health has driven the development of researches on the study of enzymes and their products through bioprocess optimization. One of the main components used as a basis for functional food industry are carbohydrates called fructooligosaccharides (FOS) derived from sucrose. These are synthesized by enzymes called fructosyltransferases which can be found in plants, bacteria and fungi. The FOS has attracted great interest of the industry due to its physiological and biomodulator properties. Because it is non-digestible polysaccharides prebiotics, have the ability to selectively stimulate the growth of bifidobacteria and lactobacilli, assisting in the prevention of tooth decay and colon cancer in humans. They can also contribute to decrease total cholesterol and triglycerides in the blood, to promote the absorption of calcium and magnesium and can be used in diets with dietary restrictions, because they are low-calorie sugars presenting high nutritional value. Considering there are different forms of FOS synthesized by different mechanisms, the present work attempts to make structural and functional characterization of a set of 13 fructosyltransferases of bacteria and fungi. The target genes were cloned and the enzymes were expressed and purified. Structural testing of X-ray crystallography and enzymatic activity, including sucrose hydrolysis and polymerization were carried out for a better understanding of the molecular basis involved in substrate recognition. Eight enzymes, two β-frutofuranosidases B. adolescentis, three sucrose-6-phosphate hydrolase of B. licheniformis and L. gasseri and A. niger invertase, were crystallized and the enzymes from B. adolescentis and from L. gasseri had their structures determined and their catalytic site mapped. These are similar to each other and present in their structure one β-propeller region which was identified as catalytic site, connected to one β-sandwich module. Both enzymes showed hydrolytic activity of the sucrose and L. gasseri showed the formation of FOS, 1-kestose and nystose with 1 M sucrose concentrations and times of 8 and 12 hours of incubation. These studies together with the analysis of other enzymes will enable the improvement in large-scale production, besides the optimization and control of these processes for the production of FOS.

As hidrolases de glicosídeos (GHs) exercem papéis fundamentais em vários processos biomédicos e aplicações industriais. A maioria destas enzimas possui vários domínios funcionais ligados entre si por peptídeos conhecidos como linkers. Informações sobre organização estrutural destas enzimas e sua mobilidade, posições e orientações mútuas de domínios individuais, bem como mudanças conformacionais introduzidas por ligantes ou por mudanças de condições bioquímicas (pH e T) podem ser muito informativas. Por esse motivo, é muito importante determinar a organização estrutural de GHs em termos de posição e orientação de seus domínios individuais e compreender a interação entre estes domínios em condições próximas às fisiológicas. Entretanto, atualmente, a conformação, dinâmica e função dos GHs com múltiplos domínios ainda não são totalmente compreendidas. Assim, o principal objetivo deste projeto foi conduzir estudos de hidrolases de glicosídeos em solução, usando SAS. Um grande número de GHs foi clonado e expresso em laboratório sob a direção do Prof. Dr. Igor Polikarpov (Grupo de Biotecnologia Molecular, IFSC / USP), seguindo protocolos já estabelecidos na literatura, para sua expressão e purificação. Experimentos SAXS foram realizados em colaboração com o Dr. Evandro Ares de Araújo (USP, São Carlos) e com o Prof. Dr. Mário de Oliveira Neto (UNESP, Botucatu). Para estudar as hidrolases de glicosídeos, foi utilizado o método de espalhamento a baixo ângulo, e em adição ao trabalho experimental, foi desenvolvido um novo pacote de software SAXSMoW2 para processar os dados do SAXS. Este pacote permite obter rapidamente os principais parâmetros estruturais de moléculas de proteínas, calcular o peso molecular e o estado oligomérico. Também foi aperfeiçoado e aplicado o método de acoplamento estatístico (statistical coupling analysis) , para complementar os dados estruturais experimentais, em especial para xiloses isomerases. Este método pode permitir uma melhor compreensão da relação entre as características estruturais evolutivas e sua funcionalidade biológica. Além disso, métodos de bioinformática foram desenvolvidos para complementar e compreender melhor as informações estruturais obtidas nos experimentos de SAXS. O primeiro foi um método para separar sequências de GH7 em duas categorias, exo e endogluconases. É útil analisar cada tipo de proteína dentro da família separadamente e estudar o papel dos loops funcionais - características estruturais que influenciam significativamente a atividade biológica. Outro método foi desenvolvido para encontrar o centro de atividade na nova enzima Xilose Isomerase obtida, usando uma estrutura relacionada, bem conhecida, da mesma família. Este método foi aplicado a enzimas cujas estruturas foram estudadas pela técnica de cristalografia em nosso laboratório no IFSC / USP. Inspirado pelo SCA, um método de detecção de comunidades difusas de aminoácidos em proteínas foi desenvolvido. Essa informação também pode complementar os resultados do SCA, indicando conjuntos fortemente correlacionados de aminoácidos na enzima. Outro novo método desenvolvido é uma estimativa de afinidade nas famílias de enzimas ativas em carboidratos utilizando similaridade dos modelos escondidos de Markov e bancos de dados open access de sequências de proteínas. / The Glycoside Hydrolases (GHs) play a key role in a number of biomedical processes and industrial applications. Most of these enzymes are multidomain proteins composed of different functional domains connected by linker peptides. Thus, it is very important to determine structural organization of glycoside hydrolases in terms of positions and orientations of their individual domains and comprehend the interplay between their multiple domains under close-to physiological conditions. To study the glycoside hydrolases, in this work a small-angle scattering method has been used. Currently, the conformation, dynamics and function of GHs with multiple domains are not fully understood. This is why the information on their structural organization and mobility; mutual position and orientation of the individual domains and conformational changes induced by interaction with the substrates or difference in biochemical conditions might be very informative. A large number of GHs have been cloned and expressed in the lab under direction of Prof. Dr. Igor Polikarpov (Molecular Biotechnology group, IFSC/USP) and we follow already established protocols for their expression and purification. SAXS experiments have been carried out in collaboration with Dr. Evandro Ares de Araujo (USP, São Carlos) and Prof. Dr. Mario de Oliveira Neto (UNESP, Botucatu). Additionally to experimental work, a new software package SAXSMoW2 for SAXS data processing has been developed. The software allows to obtain rapidly main structural parameters of the protein molecule, calculate molecular weight and oligomeric state. To supplement an structural data, the method of statistical coupling analysis (SCA) has been significantly improved and applied. The method allows a better understanding of interconnection between evolutionary caused structural features and their biological functionality. Also, various bioinformatic methods were developed to complete and understand better structural information obtained in SAXS experiments. The first one is a method for separating sequences from GH7 into the two bins of exo- and endogluconases. It is helpful to analyze each type of proteins inside the family separately and study the role of functional loops -- structural features that significantly influence on biological activity. Other developed method is for finding of activity center in the new obtained Xylose Isomerase enzyme using related well-known structure from the same family. This method was applied to the enzyme whose structure was studied using crystallography technique in our laboratory at IFSC/USP. Inspired by SCA, a method of aminoacid fuzzy communities detection in proteins has been developed as well. This information also can complete SCA results showing strong correlated sets of aminoacids in the enzyme. Another one new developed method is an estimation of carbohydrate-active family affiliation of unknown proteins using Markov hidden model similarities and open access databanks of protein sequences.

A importância do estudo das celulases não se limita à aquisição de conhecimento científico, mas também ao grande potencial biotecnológico que elas representam. Isso se deve ao fato da celulose ser a molécula mais abundante presente na natureza e prover uma vasta gama de produtos e processos sustentáveis. Muitas famílias de celulases já foram bem caracterizadas, enquanto outras permanecem ainda desconhecidas. Dentre estas últimas, a família 45 das hidrolases de glicosídeos é a família de celulases fúngicas menos caracterizada tanto estruturalmente quanto funcionalmente. Recentemente foi proposta a divisão dessa família em três subfamílias e, até agora, apenas membros da subfamília A tiveram enzimas estruturalmente elucidadas. Nesse trabalho reportamos a estrutura cristalográfica da proteína recombinante endoglucanase de Phanerochaete chrysosporium (PcCel45A), a primeira das hidrolases de glicosídeos da subfamília C, e seu complexo com celobiose a 1,4 Å e 1,7 Å de resolução, respectivamente. A PcCel45A é uma enzima de domínio único, com uma estrutura em β-barril e seu empacotamento geral remete ao formato de âncora. O sítio ativo da enzima forma um longo sulco na superfície da estrutura, sendo que o seu centro catalítico é diferente das outras enzimas publicadas dessa família e o aspartato catalítico, que atua como aceptor de próton na reação de inversão, (Asp10) não é conservado. Adicionalmente, a estrutura cristalográfica dessa enzima apresenta mais similaridades com as β-expansinas (proteínas de plantas) e transglicosilases líticas (proteínas que clivam o peptidoglicano de bactérias) do que com as outras representantes da família 45, o que a torna ainda mais singular. Para entendermos melhor seu funcionamento foram realizadas mutações sítio-dirigidas nos principais resíduos do sítio ativo. O Asp121, conhecido por participar da reação de inversão das outras enzimas da família como doador de próton, mostrou-se essencial para a atividade da enzima, enquanto que outros resíduos conservados como a Tyr25, o Trp161 e o Asp92 afetaram, mas não aniquilaram a atividade da enzima, apresentando aproximadamente 20%, 50% e 10% da atividade da enzima nativa, respectivamente. / The importance of the study of the cellulases is not limited to generating significant scientific knowledge, since these enzymes represents an enormous potential in biotechnology. This is partly because cellulose is the most abundant molecule in nature and provides a wide range of products and sustainable process. Many cellulases families have been well characterized, while others still remain unknown. Among them, the glycoside hydrolase family 45 is the least well characterized both structurally and functionally, between fungal cellulases. It was recently proposed the subdivision of this family into three subfamilies, with structural information available only for subfamily A. In this work, we report the chrystallographic structure of the recombinant endoglucanase from Phanerochaete chrysosporium (PcCel45A), the first GH45 subfamily C and its complex with cellobiose at 1.4 Å and 1.7 Å respectively. The PcCel45A is a single domain enzyme, which has a β-barrel structure with the overall shape resembling an anchor. The active site of the enzyme has a long cleft on the surface, being remarkably different from those members of subfamily A, and the catalytic aspartate responsible for acting as proton acceptor (Asp10) is not present. Additionally, the chrystallographic structure of this enzyme has shown more similarity with β -expansins (plant proteins) and lytic transglycosylase (proteins that cleave the peptidoglycan of bacteria) than others representants of family 45, which makes it more singular. For a better understanding of its function, we perform pontual mutations in the main residues from active site. The Asp121, known for acting as proton acceptor in the inversion reaction of others enzymes, proved to be essential for the enzyme activity, while others conserved residues as Tyr25, Trp161 and Asp92 affected but not annihilated the enzyme activity, leaving approximately 20%, 50% and 10% of the native enzyme activity.

Made available in DSpace on 2015-05-14T12:59:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 2299557 bytes, checksum: 01deb75646894a343a19a53f79cf2519 (MD5) Previous issue date: 2012-02-15 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Ouabain (OUA), a potent inhibitor of the Na+,K+-ATPase pump, was identified as an endogenous substance of human plasma. In recent years, ouabain was shown to affect various immunological processes. Mechanisms that involve cellular differentiation, proliferation, activation and migration, as well as inflammatory mediators release, are activated during inflammation and homeostasis is usually reestablished. This study demonstrated the modulatory ability of OUA on inflammatory process. Aim: This study aimed to evaluate ouabain immunomodulatory role on acute inflammatory process using a murine model. Methods: Initially, a dose and time-response curve was performed with OUA (0.10 mg/kg, 0.31 mg/kg and 0.56 mg/kg) intraperitoneally administered on the paw edema induced by zymosan (10 mg/mL). Mice were also intraperitoneally (i.p.) stimulated with zymosan (2 mg/mL). After 4h, the peritoneal fluid was removed for total and differential cell counts. Neutrophils and macrophages population, as well as cell viability, were analyzed using an annexin KIT by flow cytometry. The concentrations of the cytokines IL-1β, TNF-α, IL-6 and IL-10 in peritoneal lavage fluids were assayed using ELISA kit. Ouabain influence in the vascular permeability increase was determined using evans blue dye. OUA, in vitro, influence on nitric oxide (NO) production was also studied. Results: It was observed that OUA 0,56 mg/kg injected for three consecutive days prevented zymosan edema formation . After induction of inflammation, treatment with OUA led to a 42% reduction in the total cell numbers in the peritoneal cavity, as a reflex of the inhibition of polymorphonuclear leukocytes (54%), which was not due to cell apoptosis. Ouabain also decreased zymosan-induced plasma exudation (33%). Furthermore, OUA decreased the levels of TNF-α (64%) and IL-1β (63%), without interference on IL-6 and IL-10 levels. It was also demonstrated, using peritoneal macrophages, that ouabain did not interfere on LPS induced NO production. Conclusion: Ouabain modulated the acute inflammatory response induced by zymosan. However, further studies are necessary to elucidate the mechanisms involved / A ouabaína (OUA), um potente inibidor da Na+/K+-ATPase, foi identificada como uma substância endógena presente no plasma humano. Nos últimos anos, foi evidenciado que a OUA é capaz de interferir em diversos aspectos do sistema imunológico. Durante o processo inflamatório, são ativados mecanismos que envolvem a diferenciação, proliferação, ativação e migração celular, além da liberação de mediadores inflamatórios, e geralmente, ocorre o retorno à homeostasia. Este trabalho demonstrou a capacidade moduladora da OUA no processo inflamatório. Objetivo: Avaliar o papel imunomodulador da OUA na inflamação aguda em modelo murino. Métodos: Inicialmente, foi realizada uma curva de tempo e dose-resposta com a OUA (0,10 mg/kg; 0,31 mg/kg e 0,56 mg/kg) administrada de forma intra-peritoneal (i.p.) no modelo de edema de pata induzido por zimosan (10mg/mL). Os camundongos também foram estimulados com zimosan i.p.(2mg/ml). Após 4h, o fluido peritoneal foi removido para a contagem total e diferencial das células. Foi realizada a análise das populações de neutrófilos e macrófagos, além da viabilidade celular utilizando o kit anexina por citometria de fluxo. As concentrações das citocinas IL-1β, TNF-α, IL-6 e IL-10 no fluido peritoneal foram testadas por ELISA. Foi determinada a interferência do tratamento com a OUA no aumento da permeabilidade vascular. Também foi estudado, in vitro, o efeito de diferentes concentrações de OUA (10 nM, 100 nM e 1000 nM) na produção de óxido nítrico (NO). Resultados: No modelo do edema de pata, observamos que são necessários três dias consecutivos de tratamento na dose de 0,56 mg/kg para que a atividade anti-inflamatória da OUA seja identificada. No modelo de peritonite induzida por zimosan, o pré-tratamento com a OUA reduziu em 42% no número total de células na cavidade peritoneal, como um reflexo da inibição de leucócitos polimorfonucleares (54%). No entanto, este fenômeno não esta associado a apoptose destas células. A OUA também diminuiu o extravasamento de plasma induzido por zimosan (33%) e reduziu os níveis de TNF-α (64%) e IL-1β (63%), sem alterar os níveis de IL-6 e IL-10. Na cultura de macrófagos peritoneais, a OUA não interferiu na produção de NO. Conclusão: Este conjunto de dados sugere que a OUA possui uma atividade anti-inflamatória. No entanto, mais estudos são necessários para elucidar os mecanismos envolvidos.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-12-20T12:18:32Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2583076 bytes, checksum: dacaa0fd91859082d6c51b99f78336cf (MD5) / Made available in DSpace on 2017-12-20T12:18:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2583076 bytes, checksum: dacaa0fd91859082d6c51b99f78336cf (MD5) Previous issue date: 2017-08-01 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Juçara é um fruto da Mata Atlântica com elevado conteúdo fenólico. Fatores pré e pós- colheita podem afetar a composição do fruto. O objetivo deste trabalho foi estudar a composição fenólica dos frutos de juçara de diferentes microrregiões dos estados de Minas Gerais e Espírito Santo e investigar os efeitos da irradiação gama e da pasteurização na estabilidade das principais antocianinas do fruto. Os frutos foram coletados em 7 microrregiões (5 microrregiões do estado de Minas Gerais e 2 do Espírito Santo) e despolpado. A composição fenólica foi identificada e quantificada por HPLC-DAD-MS/MS. Os resultados foram analisados por ANOVA seguida pelo teste de Tukey. Tratamentos de conservação (pasteurização e irradiação) foram aplicados na polpa de uma das regiões para avaliar o efeito do processamento e tempo de armazenamento sobre as principais antocianinas da polpa de juçara (cianidina-3- glicosídeo e cianidina-3-rutinosídeo). Para isso, a polpa foi dividida em 6 porções: controle (polpa sem tratamento), polpa irradiada (2, 4, 6, 8 kGy) e, por ultimo, polpa pasteurizada. Os resultados foram analisados por análise de regressão simples e múltipla. As polpas de juçara de todas as regiões revelaram-se ricas em vários tipos de compostos fenólicos, tais como: antocianinas, flavonóis, flavan-3-óis e resveratrol. Foram identificados derivados antocianicos de cianidina, plargonidina e peonidina. Os flavonois foram do tipo quercetina, kaempferol e isoramnetina. Os flavan-3-óis catequina, epicatequina e procianidinas do tipo B foram detectados. Os glicosídeos de resveratrol apareceram em pequenas concentrações. A concentração desses compostos variou entre as regiões de cultivo. O elevado teor de antocianinas e flavonóis foi o principal responsável pela elevada capacidade antioxidante determinada pelos métodos DPPH, ABTS e ORAC. O processo de irradiação teve um efeito prejudicial sobre os as antocianinas e capacidade antioxidante da polpa de juçara durante todo o período de armazenamento a 4 oC. A pasteurização não alterou o teor de cianidina-3-rutinosídeo, cianidina-3-glicosídeo e capacidade antioxidante da polpa quando comparado com o controle, após os 60 dias de armazenamento refrigerado. Logo, os resultados sugerem que a polpa de juçara é uma boa fonte de compostos fenólicos de várias classes, principalmente antocianinas. O processo de pasteurização pode ser aplicado quando se deseja aumentar a vida útil do produto, com prejuízos mínimos à composição fenólica. / Juçara is a fruit from the Atlantic Forest with a high phenolic content. Pre and post factors can affect the fruit composition. The aim of this paper was to study the phenolic composition of the Juçara fruit from different microregions of Minas Gerais and Espírito Santo and investigate the effects of gamma radiation and pasteurization in the stability of the main anthocyanins of the fruit. The fruits were collected in 7 microregions (5 microregions of Minas Gerais and 2 of Espirito Santo) and pulped. The phenolic composition was identified and quantified by HPLC-DAD-MS/MS. The results were analyzed by ANOVA followed by the Tukey test. Conservation treatments (pasteurization and irradiation) were applied to the pulp of one of the regions to assess the effect of processing and storage time over the main anthocyanins of the juçara pulp (cyanidin-3-glycoside and cyanidin-3-rutinoside). For such, the pulp was divided into 6 portions: control (pulp without treatment), irradiated pulp (2, 4, 6, 8 kGy) and, finally, pasteurized pulp. The results were analyzed by simple and multiple regression analysis. Juçara pulps from all regions have been discovered to be rich in various types of phenolic compounds, such as anthocyanins, flavonols, flavan-3-óis, and resveratrol. It has been identified anthocyanic derivatives of cyanidin, plargonidine and peonidine. Flavonoids were quercetin, kaempferol and isoramnetin type. The flavan-3-óis catechin, epicatechin and procyanidins of B type were detected. Resveratrol glycosides appeared in small concentrations. The concentration of these compounds varied between the cultivation regions. The high level of anthocyanins and flavonols was mainly responsible for the high antioxidant capacity determined by the DPPH, ABTS and ORAC methods. The irradiation process had a negative effect on the anthocyanins and antioxidant activity of the juçara pulp throughout the storage period at 4°C. Pasteurization did not change the level of cyanidin-3-rutinoside, cyanidin-3-glycoside and antioxidant capacity of the pulp when compared to the control after 60 days of refrigerated storage. Thus, the results suggest that juçara pulp is a good source of phenolic compounds of several classes, mainly anthocyanins. The pasteurization process can be applied when it is desired to increase the life span of the product, with minimal damages to the phenolic composition.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:34:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 5413.pdf: 5054395 bytes, checksum: 548268fa8c323c705e97dab18d5569a4 (MD5) Previous issue date: 2013-05-20 / Universidade Federal de Minas Gerais / In this study, we developed a synthetic route for obtaining new class of 1,2,3- triazole compounds. In the synthesis of these compounds were used flexible and modular methodologies, allowing to obtain a large number of compounds with a wide structural diversity. The triazoles were obtained from different saccharides and steroids which were applied as building blocks to prepare a small library of Saponins and digitalis analogues. In the sequence we performed a structural study by x-ray diffraction of series orgonacalcogen 1,2,3-triazole compounds and azide derived from cholesterol, and the interactions that contribute to their supramolecular structures. / No presente trabalho, desenvolveu-se uma rota sintética para obtenção da classe de compostos 1,2,3-triazol. Na síntese destes compostos utilizaram-se metodologias flexíveis e de caráter modular, o que permitiu a obtenção de uma série de compostos com grande diversidade estrutural. Os triazois foram obtidos a partir de diferentes sacarídeos e esteróides que serviram como blocos de construção para preparação de uma pequena biblioteca de Saponinas e análogos Digitálicos. Na sequencia realizamos um estudo estrutural por difração de raio-x de uma série de orgonacalcogentetos triazólicos e da azida derivada do colesterol, das suas interações que contribuem para as suas estruturas supramoleculares.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Stevia rebaudiana is a perennial plant, native to South America; it has natural sweeteners (steviol glycosides) on their leaves free of calories, very sweet and could be replaced by sucrose without presenting problems to diabetic people diet. Stevia cultivation is widespread all over the world under different weather conditions and the environmental factors could affect the stevia yield. The aims of this study were to evaluate dry weight and sweetener concentration in Stevia rebaudiana leaves during different periods in the year to determinate the best time for harvesting and to verify the influence of environmental conditions in the sweeteners yield. The first trial was carried out during 2012/2013 agricultural year. In total 120 plants were selected and divided in six groups with 20 plants each. Twelve harvests were performed and the higher yield was reached in December at the first harvest for groups 3, 4 and 2 (292.4; 285.2 and 206.7 g m-2, respectively). The sweetener concentrations have differentiated between the date of the harvest and the compounds analysed. The highest concentrations of stevioside (12.16% and 11.36%) and rebaudioside C (2.95% e 1.95%) were found during the harvest in January while the sweetener rebaudioside A, the highest concentrations were 7.01%; 6.16% and 6.15% in December, February and March, respectively. The heighest stevioside concentrations (per cent) (12.16% and 11.36%) and rebaudioside C (2.95% and 1.95%) were found to the harvest done in January, whereas to rebaudioside A, the heighest concentration were in December (7.01%); February (6.16%) and March (6.15%). Photoperiod has influenced the number of days for each harvest as well as the sweetener concentration on the leaves. The second trial seven genotypes were tested by plants already established on the field. The higher yield of dry mass was found during the harvest in March and the sweetener concentrations have decreased to the second harvest comparing to the first one. The highest sweetener concentrations of stevioside in the first harvest were with the genotypes C1, C4 and C8 (11.24; 11.14 and 10.32%, respectively) and genotype C6 has presented the highest rebaudioside A and C concentrations (8.94 and 1.96% respectively). / Originária da América do Sul, Stevia rebaudiana é uma planta arbustiva perene que possui edulcorantes naturais (glicosídeos de esteviol) com alto poder adoçante em suas folhas, livre de calorias, podendo substituir a sacarose sem apresentar problemas na dieta de pessoas diabéticas. O cultivo de estévia é difundido em muitos países e os fatores climáticos podem influenciar significativamente o resultado de produtividade desta cultura. Os objetivos deste estudo foram avaliar massa seca e concetração de edulcorantes em folhas de estévia (Stevia rebaudiana) em diferentes períodos do ano para determinar a melhor época para a colheita e, verificar a influência dos fatores climáticos na quantidade dos edulcorantes. Os experimentos foram realizados nos anos agrícolas 2011/2012 e 2012/2013. No primeiro experimento 120 plantas foram divididas em seis grupos de 20 plantas cada. Doze cortes foram realizados, sendo a maior produtividade alcançada no mês de dezembro nos primeiros cortes dos grupos 3, 4 e 2 (292,4; 285,2 e 206,7 g m-2, respectivamente). A concentração dos edulcorantes nas folhas de estévia variou entre os períodos dos cortes e entre os compostos analisados. As concentrações mais altas de esteviosídeo (12,16% e 11,36%) e rebaudiosídeo C (2,95% e 1,95%) foram nas colheitas realizadas em janeiro, enquanto que para o rebaudiosídeo A (7,01%; 6,16% e 6,15%), as maiores porcentagens foram alcançadas nos meses de dezembro, fevereiro e março. O fotoperíodo influenciou o número de dias para o corte realizado bem como a concentração de edulcorantes nas folhas. No segundo experimento foram testados sete genótipos selecionados a partir de plantas já estabelecidas. A maior produtividade de massa seca foi encontrada no corte realizado no mês de março e, as concentrações dos edulcorantes diminuíram no segundo corte em todos os genótipos. As porcentagens mais altas de esteviosídeo no primeiro corte foram nos genótipos C1, C4 e C8 (11,24; 11,14 e 10,32%, respectivamente) e, o genótipo C6 apresentou as maiores concentrações de rebaudiosídeo A e C (8,94 e 1,96% respectivamente).

A importância do estudo das celulases não se limita à aquisição de conhecimento científico, mas também ao grande potencial biotecnológico que elas representam. Isso se deve ao fato da celulose ser a molécula mais abundante presente na natureza e prover uma vasta gama de produtos e processos sustentáveis. Muitas famílias de celulases já foram bem caracterizadas, enquanto outras permanecem ainda desconhecidas. Dentre estas últimas, a família 45 das hidrolases de glicosídeos é a família de celulases fúngicas menos caracterizada tanto estruturalmente quanto funcionalmente. Recentemente foi proposta a divisão dessa família em três subfamílias e, até agora, apenas membros da subfamília A tiveram enzimas estruturalmente elucidadas. Nesse trabalho reportamos a estrutura cristalográfica da proteína recombinante endoglucanase de Phanerochaete chrysosporium (PcCel45A), a primeira das hidrolases de glicosídeos da subfamília C, e seu complexo com celobiose a 1,4 Å e 1,7 Å de resolução, respectivamente. A PcCel45A é uma enzima de domínio único, com uma estrutura em β-barril e seu empacotamento geral remete ao formato de âncora. O sítio ativo da enzima forma um longo sulco na superfície da estrutura, sendo que o seu centro catalítico é diferente das outras enzimas publicadas dessa família e o aspartato catalítico, que atua como aceptor de próton na reação de inversão, (Asp10) não é conservado. Adicionalmente, a estrutura cristalográfica dessa enzima apresenta mais similaridades com as β-expansinas (proteínas de plantas) e transglicosilases líticas (proteínas que clivam o peptidoglicano de bactérias) do que com as outras representantes da família 45, o que a torna ainda mais singular. Para entendermos melhor seu funcionamento foram realizadas mutações sítio-dirigidas nos principais resíduos do sítio ativo. O Asp121, conhecido por participar da reação de inversão das outras enzimas da família como doador de próton, mostrou-se essencial para a atividade da enzima, enquanto que outros resíduos conservados como a Tyr25, o Trp161 e o Asp92 afetaram, mas não aniquilaram a atividade da enzima, apresentando aproximadamente 20%, 50% e 10% da atividade da enzima nativa, respectivamente. / The importance of the study of the cellulases is not limited to generating significant scientific knowledge, since these enzymes represents an enormous potential in biotechnology. This is partly because cellulose is the most abundant molecule in nature and provides a wide range of products and sustainable process. Many cellulases families have been well characterized, while others still remain unknown. Among them, the glycoside hydrolase family 45 is the least well characterized both structurally and functionally, between fungal cellulases. It was recently proposed the subdivision of this family into three subfamilies, with structural information available only for subfamily A. In this work, we report the chrystallographic structure of the recombinant endoglucanase from Phanerochaete chrysosporium (PcCel45A), the first GH45 subfamily C and its complex with cellobiose at 1.4 Å and 1.7 Å respectively. The PcCel45A is a single domain enzyme, which has a β-barrel structure with the overall shape resembling an anchor. The active site of the enzyme has a long cleft on the surface, being remarkably different from those members of subfamily A, and the catalytic aspartate responsible for acting as proton acceptor (Asp10) is not present. Additionally, the chrystallographic structure of this enzyme has shown more similarity with β -expansins (plant proteins) and lytic transglycosylase (proteins that cleave the peptidoglycan of bacteria) than others representants of family 45, which makes it more singular. For a better understanding of its function, we perform pontual mutations in the main residues from active site. The Asp121, known for acting as proton acceptor in the inversion reaction of others enzymes, proved to be essential for the enzyme activity, while others conserved residues as Tyr25, Trp161 and Asp92 affected but not annihilated the enzyme activity, leaving approximately 20%, 50% and 10% of the native enzyme activity.