Orientador: Ana Maria Rodrigues Cassiolato / Banca: Luiz Malcolm Mano de Mello / Banca: Marco Eustáquio de Sá / Banca: Diva de Souza Andrade / Banca: Rosilaine Carrenho / Resumo: A atividade dos microrganismos promove a ocorrência de inúmeros processos no solo, auxiliando no desenvolvimento das plantas e na qualidade do solo. O objetivo deste trabalho foi verificar a atividade microbiana do solo (carbono da biomassa microbiana e do CO2 liberado e micorrização) do solo e a produtividade de massa no sistema de integração lavourapecuária, em diferentes sistemas de manejo e seqüências de cultura. O experimento foi conduzido em dois anos agrícolas consecutivos, 2004/05 e 2005/06, na Fazenda de Ensino, Pesquisa e Extensão (FEPE) da UNESP - Ilha Solteira, município de Selvíria-MS, em um LATOSSOLO VERMELHO distrófico. No primeiro ano, a área foi dessecada em novembro para a semeadura direta das culturas da soja e do milho. A colheita foi realizada em março de 2005 e a área permaneceu em pousio para a regeneração da pastagem e, posterior, pastejo. O segundo ano agrícola, o experimento teve início em dezembro, com a dessecação da área e semeadura das culturas em plantio direto, sendo a colheita realizada em abril de 2006. O delineamento experimental foi o de blocos casualizados em esquema de parcelas subdividas (3 x 2 x 2). Os tratamentos das parcelas foram: sem mobilização do solo; cultivo mínimo e preparo convencional e os tratamentos secundários foram quatro seqüências de culturas: sucessão (soja/soja); rotação (soja/milho); sucessão (milho/milho) e rotação (milho/soja). Conclui-se que as características químicas do solo apresentaram pequena redução no decorrer dos dois anos agrícolas sendo que o fósforo apresentou aumento no segundo ano para a cultura de soja em rotação; as variáveis microbiológicas e a produtividade de massa apresentaram valores ligeiramente superiores no segundo ano de plantio de soja em solo sem mobilização; a colonização micorrízica foi maior em...(Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The microorganisms activity promotes the occurrence of numberless processes in the soil, improving the plants development and soil quality. The objective of this study was to evaluate the microbial activity in the soil (carbon from the microbial biomass, from the evoluted CO2 and mycorrhization) and yield of crop-cattle raising integration, under different farming systems and crop sequences of culture. The experiment was carried out in two consecutive years, 2004/05 and 2005/06, at the farm Fazenda de Ensino, Pesquisa e Extensão - (FEPE), UNESP - Ilha Solteira, in Selvíria - MS, in a Typic Hapludox. In the first year, the area was desiccated in November for the no-tillage sowing of soybean and corn. The harvest was in March 2005 and the area was kept under fallow land for the pasture recovery and grazing afterwards. In the second agricultural year, the experiment was established in December; the area was desiccated, the no-tillage sowing was performed and the harvest was in April 2006. The blocks randomized experimental design was used in a split-plot scheme (3 x 2 x 2). The treatments were: no-tillage; minimum-tillage and conventional-tillage and the secondary treatments were four crop sequences: succession (soybean/soybean); rotation (soybean/corn); succession (corn/corn) and rotation (corn/soybean). The conclusions were: the soil chemical characteristics values became slightly lower over the two agricultural years and the phosphorus levels increased in the second year for the soybean crop under rotation; the microbiological variables and the yield showed slightly higher values in the second year of the soybean crop in no-tillage; the mycorrhizal colonization was higher for crops under rotation and the microorganisms activity have indicated improvement of the crop-cattle raising integration system. / Doutor

Orientadora: Maria do Carmo Morelli Damasceno Pavani / Banca: Carlos Alberto Mathias Azania / Banca: Silvano Bianco / Resumo: O presente trabalho foi realizado com o objetivo de avaliar os efeitos de convivência e controle de plantas daninhas sobre a produtividade de soja transgênica. Os efeitos dos períodos de convivência e controle foram avaliados através da determinação do período anterior à interferência (PAI), período total de prevenção à interferência (PTPI) e do período crítico de prevenção à interferência (PCPI). O experimento foi instalado em área experimental pertencente à Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias - UNESP, campus de Jaboticabal. A cultivar de soja utilizada foi M-SOY 8045 RR. Os tratamentos experimentais foram compostos por dois grupos: no primeiro grupo a cultura permaneceu livre da convivência das plantas daninhas por períodos crescentes (0, 15, 30, 40, 50, 60, 70 e 80 dias) e, no segundo grupo, a cultura conviveu com a comunidade desde a emergência até 0, 15, 30, 40, 50, 60 e 70 dias, totalizando 15 tratamentos. O delineamento experimental foi o de blocos casualizados com quatro repetições. Com potencial de infestação médio de 825 sementes m-2. A comunidade infestante foi composta por nove espécies, havendo predominância de Cenchrus echinatus e Acanthospermum hispidum, que apresentaram maiores valores de densidade relativa, dominância relativa e importância relativa (64,77; 60, 40; 41,06; 20,45; 24,59; 24,62 aos 15 DAE e 83,53; 80,23; 64,84; 8,24; 10,04 e 14,39 aos 30 DAE), respectivamente. Tolerando-se 5% de perda o PAI foi de 28 dias, o PTPI foi de 14 dias e o PCPI foi de 14 a 28 dias. Houve redução de 100% na produtividade da soja quando a cultura conviveu com a comunidade durante todo o ciclo. / Abstract: This work aimed to determine the weed community interference on transgenic soybean yield. Weed interference effects were evaluated determining the period previous to interference (PPI), total prevention period to interference (TPPI) and the critical prevention period to interference (CPPI). The trial was conducted at experimental area of FCAV-UNESP, Jaboticabal, utilizing the M-SOY 8045 RR soybean cultivar. Experimental treatments were shared in two groups: in the first group, the crop remained weed-free from seedling emergence until 0, 15, 30, 40, 50, 60, 70 and 80 days after emergency. In the second, the crop coexisted with weed community from 0, 15, 30, 40, 50, 60 and 70 days after emergency. The experimental design was randomized blocks with four repetitions. The potential of infestation were verified with 825 seed m-2. Nine different species composed the weed community, with predominance of Cenchrus echinatus and Acanthospermum hispidum. These species showed higher values of relative density, relative dominance and concernment value (64,77; 60, 40; 41,06; 20,45; 24,59; 24,62 at 15 DAE and 83,53; 80,23; 64,84; 8,24; 10,04, 14,39 at 30 DAE). Considering 5% tolerance in soybean yield reduction the PPI were 28 DAE, the TPPI were 14 DAE and CPPI between 14 and 28 days. When soybean and weed coexisted during all crop cycle the yield reduction was 100%. / Mestre

Resumo: O emprego de procedimentos adequados para avaliar o vigor de sementes é fundamental dentro do programa de controle de qualidade de sementes. O objetivo dessa pesquisa foi verificar a influência dos fungos Colletotrichum dematium var. truncata, Phomopsis sojae e Diaporthe phaseolorum f. sp. meridionalis na qualidade fisiológica de sementes de soja determinada pelo índice de velocidade de emergência (IVE), germinação (TG), teste de frio (TF) e condutividade elétrica (CE). A pesquisa foi realizada em condições de laboratório com a cultivar Embrapa 48 e em condições de campo com as cultivares Embrapa 48, Goiânia e Emgopa 313. Em condições de laboratório, as sementes foram inoculadas por sobreposição em meio de cultura BDA sem e com restrição hídrica (-1 Mpa, pelo uso de Manitol) com crescimento micelial dos fungos em estudo pelo período de 20 horas. Após a inoculação, as sementes foram secas naturalmente e realizaram-se os testes de sanidade e de vigor. Para a condutividade elétrica determinou-se também a concentração de Potássio (K), Cálcio (Ca) e Magnésio (Mg) na água de embebição das sementes. Em condições de campo as plantas das cultivares Embrapa 48, Goiânia e Emgopa 313 foram inoculadas com os fungos a partir do florescimento por três vezes durante seu desenvolvimento. A colheita foi realizada separadamente para cada cultivar e cada tratamento. Foram realizados os mesmos testes feitos com as sementes inoculadas artificialmente. Pelos resultados encontrados no experimento de inoculação em laboratório verifica-se que o método de inoculação das sementes para a cultivar Embrapa 48 com os fungos em estudos foi eficiente, encontrando-se infecção de 50% para Colletotrichum dematium var. truncata e Phomopsis sojae, e, 25% para Diaporthe phaseolorum f. sp. meridionalis. Todos os fungos afetaram a germinação e o vigor das sementes, ...(Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The use of adequate procedures for evaluate the vigor of seeds is fundamental into the quality control of seeds. The objective of this research was to verify the influence of the fungi Colletotrichum dematium var. truncata and Phomopsis sojae, and, for Diaporthe phaseolorum f. sp. meridionalis in the physiological quality of soybean seeds determined for the emergence speed index, germination, cold test and electrical conductivity test. The research was carried in laboratory conditions with cultivar Embrapa 48 and in field conditions with cultivars Embrapa 48, Goiânia and Emgopa 313. In laboratory conditions, the seeds had been inoculated by contact culture medium BDA without and with hydric restriction (-1 Mpa, using Manitol) with micelial growth fungi for the period of 20 hours. After the inoculation, the seeds had been droughts and the vigor and health tests were done. For the electrical conductivity the Potassium (K), Calcium (Ca) and Magnesium (Mg) concentration was also determined, in the water of imbibibtion of the seeds. In field conditions the plants of cultivars Embrapa 48, Goiânia and Emgopa 313 had been inoculated with the fungi from the bloom for three times during the plant growth. The harvest was carried through separately each to cultivate and each fungi inoculated. The same tests of the seeds inoculated artificially had been carried through. For the results in the inoculation in laboratory it as verified that the method of inoculation of the seeds with the fungi per contact was efficient, wih infection of 50% for Colletotrichum dematium var. truncata and Phomopsis sojae, and 25%, for Diaporthe phaseolorum f. sp. meridionalis. All the fungi had affected the germination and vigor of the seeds, for emergency speed index, the cold test and accelerated aging. The use of Manitol for hydric restriction did not modify the results of the vigor tests ...(Complete abstract, click electronic access below) / Orientadora: Rita de Cássia Panizzi / Coorientadora: Margarete Camargo / Banca: Juliana Altafin Galli / Banca: Ester Wickert / Mestre

Orientador: Raquel Ghini / Banca: Flávia Rodrigues Alves Patrício / Banca: Antônio Carlos Maringoni / Resumo: Os níveis de concentração de CO2 atmosférico estão se elevando nas últimas décadas devido principalmente à queima de combustíveis fósseis. Essa alteração atmosférica, além de intensificar o fenômeno do efeito estufa, pode afetar o comportamento de algumas plantas e microrganismos de interesse agrícola. O CO2, por ser um componente básico da fotossíntese, em alta concentração, pode causar alterações na morfologia e nos processos fisiológicos das plantas, assim como na interação destas com fitopatógenos. Sendo assim, o presente estudo teve por objetivo avaliar o efeito da alta concentração de CO2 atmosférico na severidade do oídio, causado por Microsphaera diffusa, e da ferrugem asiática, causado por Phakopsora pachyrhizi, na soja e também em alguns fatores relacionados ao desenvolvimento da planta que podem exercer influência na doença, como o crescimento, peso da matéria seca e nodulação. Foram realizados três ensaios em estufas de topo aberto com (E+CO2) ou sem (E) injeção de CO2 e sem estufa (T), correspondendo às concentrações de, aproximadamente, 647 ppm, 474 ppm e 453 ppm, respectivamente. No primeiro ensaio, foram avaliadas características de desenvolvimento da planta; no segundo, a severidade da ferrugem asiática, que ocorreu de forma espontânea; e no terceiro, a severidade do oídio em quatro cultivares com diferentes níveis de resistência. As cultivares foram: FT-Estrela, altamente suscetível (AS); Embrapa 48, suscetível (S); FT-Cometa, moderadamente resistente (MR) e FT-5 (Formosa), resistente (R). Nos resultados obtidos, foi verificado um aumento significativo na severidade do oídio, no tratamento com injeção de CO2,em folhas primárias e na planta inteira das cultivares analisadas em conjunto, mas não houve alteração na expressão de resistência das cultivares. Para a ferrugem asiática, houve redução da severidade... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The concentration of atmospheric CO2 is increasing in recent decades, mainly due to burning of fossil fuels. This atmospheric change can intensify the phenomenon of the greenhouse effect, and can affect the behavior of important agricultural plants and microorganisms. The CO2, as a basic component of photosynthesis, in high concentrations, can cause changes in morphological and physiological processes of plants, as well as interaction with plant pathogens. Therefore, this study aimed to assess the effect of high concentrations of atmospheric CO2 on the severity of powdery mildew in soybean, caused by Microsphaera diffusa, and also in some characteristics related to the development of the plant that may influence the disease, such as growth, weight of dry matter and nodulation. Three trials were developed under open-top chambers with (E+CO2) or without (E) injection of CO2 and without greenhouse (T), with the approximate concentrations of 647 ppm, 474 ppm, and 453 ppm, respectively. On the first trial, growth characteristics were evaluated, on the second, the severity of rust, caused by Phakopsora pachyrhizi, which occurred spontaneously; on the third, the severity of powdery mildew on four cultivars with different levels of resistance: FT-Estrela, highly susceptible (AS); Embrapa 48, ...(Complete abstract click electronic access below) / Mestre

A atividade antiviral de compostos flavonoídicos tem sido amplamente investigada nos últimos anos. Nesse contexto, a primeira etapa da presente tese teve por objetivo avaliar a atividade anti-herpética in vitro dos principais isoflavonóides de Glycine max (soja): genisteína, daidzeína, gliciteína e cumestrol. Dentre os isoflavonóides investigados, a genisteína e o cumestrol mostraram uma interessante atividade frente aos vírus HSV-1 (cepa KOS e 29R, sensível e resistente ao aciclovir, respectivamente) e HSV-2 (cepa 333), interferindo em diferentes etapas do ciclo de replicação dos vírus. Devido à reduzida hidrossolubilidade desses isoflavonóides, foi proposta a sua incorporação em nanoemulsões de uso tópico. As formulações foram otimizadas através de um experimento fatorial completo do tipo 23 . O efeito dos fatores tipo de óleo (óleo de rícino ou miristato de isopropila), co-tensoativo iônico (oleilamina ou ácido olêico) e fosfolipídeo (DSPC ou DOPC) sobre as propriedades das nanoemulsões e a retenção da genisteína na pele de orelha suína foi investigado. Nanoemulsões compostas de miristato de isopropila/ oleilamina/DOPC apresentaram um menor diâmetro de gotícula e uma maior retenção de genisteína na pele de orelha suína enquanto que a combinação miristato de isopropila/oleilamina/DSPC mostrou o menor índice de polidispersão. A viscosidade das formulações selecionadas foi ajustada através do uso de hidroxietilcelulose visando à obtenção de produtos de uso tópico, obtendo-se hidrogéis de comportamento pseudoplástico. Na sequência, um conjunto de resultados obtidos demonstrou que a composição das formulações (especialmente o fosfolipídeo DOPC e o agente espessante hidroxietil celulose) pode influenciar a liberação e a retenção dos isoflavonóides em mucosa esofágica suína. A integridade da mucosa também desempenha um papel no aumento da permeação/retenção do cumestrol, conforme ilustrado nas imagens de microscopia confocal, utilizando vermelho do Nilo como marcador fluorescente. De maneira geral, a incorporação dos isoflavonóides nas nanoemulsões aumenta a atividade anti-herpética desses compostos in vitro. O conjunto dos resultados demonstra que as formulações desenvolvidas são potenciais carreadores de uso tópico para genisteína e cumestrol no tratamento das infecções herpéticas. / The antiviral activity of flavonoid compounds has been extensively investigated in recent years. In this context, the first step of this study was to evaluate the antiherpes activity in vitro of the main isoflavonoids of Glycine max (soybean): genistein, daidzein, glycitein and coumestrol. Among the investigated isoflavonoids, genistein and coumestrol showed interesting activity against HSV-1 (KOS and 29R strains, which are acyclovir-sensitive and acyclovir–resistant strains, respectively) and HSV-2 (333 strain), interfering at different stages of the virus replication cycle. Due to the low hydrosolubility of these isoflavonoids, their incorporation into topical nanoemulsions was proposed in this study. The formulations were optimized through a 23 full factorial design. The factors effect of oil type (castor oil or isopropyl myristate), ionic co-surfactant (oleylamine or oleic acid) and phospholipid type (DSPC or DOPC) on physicochemical properties and genistein retention into porcine ear skin was investigated. Nanoemulsions composed of isopropyl myristate/ DOPC/oleylamine showed the smaller particle size and higher genistein retention into skin, whereas the formulation composed of isopropyl myristate/DSPC/oleylamine exhibited the lower polydispersity index. The viscosity of selected formulations was adjusted with hydroxyethyl cellulose to obtain topical products, which showed nonNewtonian behavior. In sequence, a set of results showed that formulations composition (especially the phospholipid DOPC and the thickening agent hydroxyethyl cellulose) could influence the release and retention of isoflavonoids in porcine esophagus mucosa. The integrity of mucosa plays a role on the increase of coumestrol permeation/retention, according to confocal microscopy images, using Red Nile as fluorescent label. In general terms, the incorporation of isoflavonoids into nanoemulsions increases the antiherpes activity of these compounds in vitro. The overall results show that the formulations developed in this study are potential topical carriers for genistein and coumestrol in the treatment of herpes infections.

O cultivo de anteras de soja [Glycine max (L.) Merrill, 2n=40] iniciou na década de 1970 visando à obtenção de plantas androgenéticas haplóides e duplo-haplóides. Contudo, foram raras as ocasiões em que as condições de cultivo favoreceram o desenvolvimento embriogênico até a regeneração de plantas. No presente trabalho, pelo cultivo de anteras heterozigotas para um marcador molecular codominante, foi registrado que alguns genótipos segregantes originaram estruturas embriogênicas tanto a partir dos micrósporos quanto a partir dos tecidos diplóides da antera. Subseqüentemente, por meio de análises histológicas, foram registradas calogênese e embriogênese a partir do tecido conectivo, das camadas médias e da epiderme em anteras de quatro cultivares, sob as condições de cultivo até então recomendadas para desencadear androgênese. Estes eventos foram favorecidos pela presença do ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) e pela indução na luz. A constatação do potencial embriogênico do conectivo levantou a possibilidade de usar tecidos estaminais como uma nova fonte de explantes, a partir de indivíduos que já alcançaram a fase reprodutiva, quando a resposta morfogênica é considerada sem sucesso em soja. A formação de grãos de pólen multinucleados não foi uma resposta exclusiva ao cultivo: tanto o cultivo de anteras quanto o tratamento a 4oC aumentaram as freqüências de núcleos simétricos e extranumerários em grãos de pólen, incluindo núcleos com formato fragmentado. De forma geral, os resultados comprovaram que, nas condições recomendadas, o cultivo de anteras é um sistema limitado para desencadear androgênese em soja. Por isso, uma seqüência de testes foi conduzida para o estabelecimento in vitro de micrósporos isolados. Foi desenvolvida uma técnica de isolamento que permitiu a obtenção de suspensões de micrósporos viáveis com densidade adequada e, em seguida, o estabelecimento de cultivos. Nestes cultivos, foram testados os efeitos de meios nutritivos e de genótipos. A técnica desenvolvida será útil para futuros testes visando identificar fatores que desencadeiam androgênese em soja. Neste trabalho, foram identificadas limitações e potencialidades morfogênicas do cultivo de anteras de soja. Em conseqüência, é proposta uma nova abordagem ao estudo da androgênese, pelo cultivo de micrósporos e grãos de pólen isolados. / Soybean [Glycine max (L.) Merrill, 2n=40] anther culture began in the 1970’s in order to obtain haploids and double-haploids androgenic plants. However, only in rare occasions, culture conditions allowed embryogenic development to proceed as far as plant regeneration. In the present study, culturing heterozygous anthers to a codominant molecular marker, it was recorded that some segregating genotypes originated embryo-like structures from either microspores or anther diploid tissues. Subsequently, through histological analysis, it was recorded callogenesis and somatic embryogenesis from the connective, middle layer and epidermis in cultured anthers of four soybean cultivars, under culture conditions known to trigger an androgenic response. Morphogenic responses from anther walls and connective tissue was favoured by 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) and induction under light. Embryogenic potential of the connective tissue provided the possibility of using staminal tissue as a new source of explants, from individuals that have reached the reproductive phase, when the morphogenic response has been considered unsuccessful in soybean. Multinucleate pollen grains formation was not an exclusive response to culture: both anther culture and 4oC treatment increased symmetrical and extra nuclei frequencies in pollen grains, including atypical extra nuclei with a fragmented shape. On the whole, results indicated that, under recommended conditions, anther culture is a limited system to trigger androgenesis in soybean. Thus, a sequence of tests was carried out aiming to establish isolated microspores in vitro. It was developed a technique that allowed to obtain viable microspores suspensions at appropriate density and, subsequently, to establish cultures. The effects of medium constitution and genotypes were tested. This technique may be useful for further studies aiming to identify factors that are important to stimulate soybean androgenesis. In this study, morphogenic limitations and potentialities of soybean anther culture were identified. In consequence, it is proposed a new approach to study androgenesis, through the culture of isolated microspores and pollen grains.

Soja, uma cultura conhecida por sua importância econômica e nutricional, tem sido objeto de vários estudos que avaliam o impacto e as respostas efetivas das plantas aos estresses abióticos. O estresse salino é um dos principais estresses ambientais e afeta negativamente o crescimento e o rendimento das culturas, incluindo a soja. A edição de RNA é um processo pelo qual as sequências de nucleotídeos podem ser alteradas, revertendo mutações que podem mudar as sequências de proteínas para manter suas funções conservadas. As proteínas pentatricopeptide repeat (PPRs) são trans-elementos de edição caracterizados por reconhecer cis-elementos específicos de RNA e realizar a reação de edição. Vários estudos descreveram estes trans-elementos e seus sítios de edição cognatos, mas nem todas as proteínas que compõem o complexo de edição foram identificadas. A perda de eventos de edição de plastídios, resultante de mutações em fatores de edição de RNA ou através de interferência por estresse, leva a alterações de desenvolvimento, de fisiologia e da fotossíntese. O objetivo do presente trabalho é caracterizar os sítios de edição e os fatores associados à edição de RNA em Glycine max e a influência de estresses abióticos no processo de edição de RNA em cloroplastos. No capítulo 1, um método é apresentado para triar a edição de RNA de cloroplasto usando bibliotecas públicas de sRNAs de Arabidopsis, soja e arroz. Entre os sítios de edição previstos, 40,57, 34,78 e 25,31% foram confirmados utilizando sRNAs de Arabidopsis, soja e arroz, respectivamente. A análise de SNPs revelou alterações de C-to-U de 58,2, 43,9 e 37,5% nas respectivas espécies e identificou conhecidas e possíveis novas edições de RNA de adenosina para inosina (A-to-I) em tRNAs. O método e os dados revelam o potencial do uso de sRNA como uma fonte confiável para identificar novos e confirmar sítios de edição conhecidos. No capítulo 2, o processo de edição de RNA foi avaliado em cloroplastos de plantas de soja sob estresse salino. A abordagem de bioinformática utilizando bibliotecas de sRNAs e mRNAs foi empregada para detectar sítios específicos que mostram diferenças na taxa de edição. RT-qPCR foi usado para medir a taxa de edição nos sítios selecionados. Observamos diferenças nas taxas de edição nos transcritos dos genes ndhA, ndhB, rps14 e rps16 ao comparar os dados das bibliotecas controle e das tratadas com NaCl. Os ensaios de RT-qPCR 9 demonstraram um aumento na edição dos genes selecionados. Esses aumentos podem ser uma resposta para manter a homeostase das funções das proteínas do cloroplasto em resposta ao estresse salino. No capítulo 3, para identificar os fatores relacionados aos sítios de edição analisados, sondas biotiniladas de RNA foram projetadas com base nos sítios de edição de RNA de plastídio de soja para realizar um isolamento proteico específico do fator de edição. Proteínas que interagiram com as sondas foram isoladas através da ligação das sondas à biotina e foram identificadas utilizando espectrometria de massa. Entre os peptídeos detectados, cinco corresponderam a proteínas PPR. A comparação dos genes de Arabidopsis com as proteínas PPR da soja permitiu a identificação dos homólogos mais próximos. O presente estudo representa a primeira identificação do conjunto de sítios de edição de RNA, de fatores associados aos sítios de edição de RNA e a caracterização dos efeitos do estresse abiótico na edição de RNA em Glycine max. / Soybean, a crop known by its economic and nutritional importance, has been the subject of several studies that assess the impact and the effective plant responses to abiotic stresses. Salt stress is one of the main environmental stresses and negatively impacts crop growth and yield. RNA editing is a process whereby nucleotide sequences can be altered, reverting mutations that could change protein sequences to maintain their conserved functions. Pentatricopeptide repeat proteins are editing trans-elements characterized by recognize specific RNA cis-elements and perform the editing reaction. Several studies have described these trans-elements and their cognate editing sites, but not all proteins that compose the editing complex were identified. The loss of plastid editing events, resulting from mutations in RNA editing factors or through stress interference, leads to developmental, physiological and photosynthetic alterations. The aim of the present work is to characterize the editing sites and factors associated with RNA editing in Glycine max and the influence of abiotic stresses on the process of RNA editing in chloroplasts. In chapter 1, a method is presented to screen chloroplast RNA editing using public sRNA libraries from Arabidopsis, soybean and rice. Among the predicted editing sites, 40.57, 34.78, and 25.31% were confirmed using sRNAs from Arabidopsis, soybean and rice, respectively. SNP analysis revealed 58.2, 43.9, and 37.5% new C-to-U changes in the respective species and identified known and new putative adenosine to inosine (A-to-I) RNA editing in tRNAs. The method and data reveal the potential of sRNA as a reliable source to identify new and confirm known editing sites. In chapter 2, RNA editing process was evaluated in the chloroplast of soybean plants under salt stress. Bioinformatics approach using sRNA and mRNA libraries was employed to detect specific sites showing differences in editing efficiency. RT-qPCR was used to measure editing efficiency at selected sites. We observed differences in ndhA, ndhB, rps14 and rps16 editing rates between control and salt-treated libraries. RT-qPCR assays demonstrated an increase in editing efficiency of selected genes. These increases can be a response to keep the homeostasis of chloroplast protein functions in response to NaCl stress. In chapter 3, to identify the trans-acting factors of editing sites analyzed, we have designed RNA biotinylated probes based in soybean plastid RNA editing sites to perform 11 specific isolation of proteins associated to editosomes. Proteins that interacted with the probes were isolated by binding the probes to biotin and were identified using mass spectrometry. Among the detected peptides, five corresponded to PPR proteins. Comparison of Arabidopsis genes to the soybean PPR proteins allow identification of the closest related homologs. The present study represents the first identification of RNA editing sites set, associated factors to RNA editing sites and characterization of effects from abiotic stress in RNA editing in Glycine max.

O objetivo do presente trabalho foi otimizar o sistema de transformação genética de embriões somáticos de soja [Glycine max (L.) Merr.] utilizando a biolística e o sistema Agrobacterium de maneira integrada. Os antibióticos, adicionados ao meio de cultura para supressão da bactéria após a transferência do transgene, foram o alvo do estudo. Inicialmente, comparou-se o efeito de diferentes tratamentos com antibióticos sobre o tecido embriogênico de soja e sua eficiência na supressão da linhagem LBA4404 de Agrobacterium tumefaciens durante o processo de transformação. A carbenicilina (500 mg/l) apresentou efeitos diferentes sobre o tecido vegetal das duas cultivares testadas. Os tecidos embriogênicos da cv. IAS5 não apresentaram diferenças significativas em relação ao controle, enquanto que a proliferação dos embriões somáticos da cv. Bragg foi três vezes maior com a adição deste antibiótico ao meio de cultura. Contudo, a presença da carbenicilina nas duas concentrações testadas (500 e 1000 mg/l) não foi eficiente para supressão de Agrobacterium. Por outro lado, nos tratamentos com cefotaxima sozinha (350 e 500 mg/l), ou cefotaxima (250 mg/l) + vancomicina (250 mg/l) esta bactéria foi completamente suprimida da superfície dos embriões somáticos após 49 dias de tratamento. No entanto, enquanto a presença de cefotaxima, em qualquer concentração, foi prejudicial à sobrevivência do tecido embriogênico, a combinação de cefotaxima + vancomicina não afetou significativamente os embriões somáticos de soja até os 63 dias de tratamento. Portanto, os resultados indicam que o tratamento com cefotaxima + vancomicina por um período de 49 - 63 dias é o mais adequado para a transformação genética de soja, por suprimir Agrobacterium e apresentar mínimos efeitos sobre o tecido embriogênico. Por fim, conjuntos de embriões somáticos de soja foram transformados e tratados com a combinação recomendada de antibióticos para avaliação da eficiência do método na obtenção de transformantes estáveis. Foram obtidos 48 e 232 clones higromicina-resistentes para Bragg e IAS5, respectivamente. Para cv. Bragg, 26 plantas foram obtidas de um único clone, enquanto 580 plantas foram regeneradas de 105 clones da cv. IAS5. As plantas transgênicas eram férteis e morfologicamente normais. A presença do transgene no genoma destas plantas foi confirmada por análises moleculares. Portanto, a adequação dos antibióticos permitiu o desenvolvimento de um método de transformação altamente eficiente para soja. Os resultados do presente trabalho constituem o primeiro registro (1) do efeito de antibióticos sobre tecidos de soja ou de leguminosas e (2) de obtenção de transformantes estáveis de soja utilizando a biolística e o sistema Agrobacterium de maneira integrada.

A soja é uma das espécies cultivadas de maior importância econômica para o Brasil, atualmente o segundo maior produtor mundial deste grão. Contudo, doenças causadas por fungos são um dos principais problemas enfrentados pelos produtores de soja, o que leva a grandes perdas. Uma das alternativas para superar este problema é a utilização de cultivares com resistência genética. Com este objetivo, foram realizados quatro experimentos independentes de transformação genética de soja, em que o gene chit1, que codifica uma quitinase, enzima capaz de degradar paredes fúngicas, foi transferido para culturas embriogênicas, através da metodologia de biobalística. O gene marcador hpt, que confere resistência ao antibiótico higromicina, também foi utilizado. Em três dos experimentos realizados, uma nova metodologia foi testada, em que sequências desnecessárias, presentes nos vetores de transformação, não são colocadas na planta, e sim apenas os cassetes gênicos, contendo regiões regulatórias e codificadoras. No 1° Experimento realizado, foram obtidas plantas transgênicas transformadas com plasmídeos, mas estas não produziram sementes. No 2° Experimento, foi obtida uma linhagem transgênica, oriunda da transformação com plasmídeos. Foi confirmada a presença e a expressão do gene de quitinase em uma planta T0. Esta planta gerou uma progênie de 16 plântulas. Destas, 10 foram analisadas por PCR e foi confirmada a transmissão do transgene marcador para seis plantas T1. Análises moleculares complementares são necessárias para a determinação do padrão de herança dos transgenes. Como resultado do 3º Experimento realizado, foram obtidos 3.298 embriões histodiferenciados da cultivar Bragg (2.804 oriundos da transformação com plasmídeos e 494 da transformação com cassetes) e 2.286 para a cultivar IAS (759 com plasmídeos e 1.527 com cassetes). Do 4º Experimento realizado, foram obtidos 1.339 embriões histodiferenciados da cultivar Bragg (1.312 oriundos da transformação com plasmídeos e 27 da transformação com cassetes) e 1.035 para a cultivar IAS5 (851 com plasmídeos e 184 com cassetes). Mesmo considerando a possibilidade de alguns dos embriões obtidos serem escapes à seleção, a resistência ao antibiótico é um forte indício de transformação estável. Já foram obtidos embriões germinados oriundos da transformação com cassetes, resultantes dos 3° e 4° Experimentos. Com a condição transgênica comprovada, será realizada uma comparação dos padrões de integração gerados por transformação com plasmídeos e cassetes gênicos. / Soybean is one of the most important crops in Brazil, which is nowadays the second world largest producer. However, injuries caused by fungus are one of the main problems faced by the producers, causing great losses. One of the possibilities to deal with this problem is the utilization of cultivars with genetic resistance. With this goal, four independent soybean transformation experiments were performed. A chitinase gene, chit1, which can break fungal cell walls, was transferred to soybean embryogenic cultures, through the use of biolistic. The selection marker gene hpt, which confers hygromycin resistance, was also transferred to the embryos. In three of the performed experiments, a new methodology was tested, where unnecessary sequences, that are part of the transformation vectors, were not introduced into the plant, but only the gene cassettes, which contain regulatory and coding sequences. In the first experiment, transgenic plants were obtained, but they left no progeny. In the second experiment, one transgenic line was obtained from the plasmid transformation. The presence and expression of the chitinase gene in one T0 plant was confirmed. 16 T1 plantlets were obtained. 10 were analyzed by PCR, and the transmission of the marker gene to six T1 plants was confirmed. Further molecular analyses are necessary in order to determine the inheritance pattern of the transgenes. As a result of the 3rd Experiment, 3.298 histodifferentiated embryos of the cultivar Bragg were obtained (2.804 from the plasmid transformation and 494 from the gene cassettes transformation) and 2.286 of the cultivar IAS (759 from the plasmid transformation and 1.527 from the gene cassettes transformation). From the 4th Experiment, 1.339 histodifferentiated embryos were obtained for cultivar Bragg (1.312 from the plasmid transformation and 27 from the cassettes) and 1.035 for IAS (851 from the plasmid transformation and 184 from the cassettes). Even considering the possibility that some of the embryos obtained may have escaped selection, the hygromycin resistance is a great indication of stable transformation. Plants transformed, resulting from the 3rd and 4th experiments, were already obtained with the minimal cassettes. Once their transgenic nature is proved, the patterns of integration of plasmid transformed plants and cassette transformed plants will be compared.

O cultivo de anteras de soja [Glycine max (L.) Merrill, 2n=40] iniciou na década de 1970 visando à obtenção de plantas androgenéticas haplóides e duplo-haplóides. Contudo, foram raras as ocasiões em que as condições de cultivo favoreceram o desenvolvimento embriogênico até a regeneração de plantas. No presente trabalho, pelo cultivo de anteras heterozigotas para um marcador molecular codominante, foi registrado que alguns genótipos segregantes originaram estruturas embriogênicas tanto a partir dos micrósporos quanto a partir dos tecidos diplóides da antera. Subseqüentemente, por meio de análises histológicas, foram registradas calogênese e embriogênese a partir do tecido conectivo, das camadas médias e da epiderme em anteras de quatro cultivares, sob as condições de cultivo até então recomendadas para desencadear androgênese. Estes eventos foram favorecidos pela presença do ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) e pela indução na luz. A constatação do potencial embriogênico do conectivo levantou a possibilidade de usar tecidos estaminais como uma nova fonte de explantes, a partir de indivíduos que já alcançaram a fase reprodutiva, quando a resposta morfogênica é considerada sem sucesso em soja. A formação de grãos de pólen multinucleados não foi uma resposta exclusiva ao cultivo: tanto o cultivo de anteras quanto o tratamento a 4oC aumentaram as freqüências de núcleos simétricos e extranumerários em grãos de pólen, incluindo núcleos com formato fragmentado. De forma geral, os resultados comprovaram que, nas condições recomendadas, o cultivo de anteras é um sistema limitado para desencadear androgênese em soja. Por isso, uma seqüência de testes foi conduzida para o estabelecimento in vitro de micrósporos isolados. Foi desenvolvida uma técnica de isolamento que permitiu a obtenção de suspensões de micrósporos viáveis com densidade adequada e, em seguida, o estabelecimento de cultivos. Nestes cultivos, foram testados os efeitos de meios nutritivos e de genótipos. A técnica desenvolvida será útil para futuros testes visando identificar fatores que desencadeiam androgênese em soja. Neste trabalho, foram identificadas limitações e potencialidades morfogênicas do cultivo de anteras de soja. Em conseqüência, é proposta uma nova abordagem ao estudo da androgênese, pelo cultivo de micrósporos e grãos de pólen isolados. / Soybean [Glycine max (L.) Merrill, 2n=40] anther culture began in the 1970’s in order to obtain haploids and double-haploids androgenic plants. However, only in rare occasions, culture conditions allowed embryogenic development to proceed as far as plant regeneration. In the present study, culturing heterozygous anthers to a codominant molecular marker, it was recorded that some segregating genotypes originated embryo-like structures from either microspores or anther diploid tissues. Subsequently, through histological analysis, it was recorded callogenesis and somatic embryogenesis from the connective, middle layer and epidermis in cultured anthers of four soybean cultivars, under culture conditions known to trigger an androgenic response. Morphogenic responses from anther walls and connective tissue was favoured by 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) and induction under light. Embryogenic potential of the connective tissue provided the possibility of using staminal tissue as a new source of explants, from individuals that have reached the reproductive phase, when the morphogenic response has been considered unsuccessful in soybean. Multinucleate pollen grains formation was not an exclusive response to culture: both anther culture and 4oC treatment increased symmetrical and extra nuclei frequencies in pollen grains, including atypical extra nuclei with a fragmented shape. On the whole, results indicated that, under recommended conditions, anther culture is a limited system to trigger androgenesis in soybean. Thus, a sequence of tests was carried out aiming to establish isolated microspores in vitro. It was developed a technique that allowed to obtain viable microspores suspensions at appropriate density and, subsequently, to establish cultures. The effects of medium constitution and genotypes were tested. This technique may be useful for further studies aiming to identify factors that are important to stimulate soybean androgenesis. In this study, morphogenic limitations and potentialities of soybean anther culture were identified. In consequence, it is proposed a new approach to study androgenesis, through the culture of isolated microspores and pollen grains.