Made available in DSpace on 2015-07-22T20:49:57Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-07-28 / Mucosite oral é complicação comum no tratamento do câncer. A glicina demonstra efeito antiinflamatório, imunomodulador e citoprotetor. Este estudo tem como objetivo avaliar os efeitos da suplementação de glicina na reparação da mucosite oral induzida por 5-fluorouracil em hamster. Os animais foram divididos em dois grupos: grupo experimental (GI; n=20) e grupo controle (GII; n=20) ambos receberam injeção intraperitoneal de 5-fluorouracil no 1° e 3° dia. Os animais tiveram a sua bolsa jugal direita evertida e arranhada superficialmente no dia 3. O Grupo I, foi submetido ao tratamento com glicina a 5% por infusão intraperitoneal durante 7 dias e o Grupo II, recebeu placebo. A mucosa do GI e GII foi avaliada clinicamente, por meio de escore, no D3 e D7. Ao final do experimento a bolsa jugal dos animais de ambos os grupos foi retirada e avaliada segundo parâmetros histopatológicos e bioquímicos. Os grupos I e II apresentaram acentuado processo inflamatório durante o período inicial, segundo a avaliação clínica. No GI houve redução da severidade da mucosite, diminuição do processo inflamatório, cicatrização acelerada e redução da peroxidação lipídica quando comparado ao GII no final do experimento (p < 0,001). A suplementação com glicina demonstrou ser promissor instrumento para tratamento da mucosite, devido aos seus efeitos no processo inflamatório. Palavras chaves: Glicina; Estomatite; Fluoruracila; Cricetulus. / Oral mucositis is common complication in cancer treatment. Glycine shows a anti-inflammatory, immunomodulatory and cytoprotective. This study aims to evaluate the effects of supplementation of glycine in the repair of oral mucositis induced by 5-fluorouracil in hamsters. The animals were divided into two groups: experimental group (GI, n = 20) and control group (GII, n = 20) both received intraperitoneal injection of 5-fluorouracil in the days 1 and 3. The animals had their right pouch everted and scratched the surface on day 3. Group I was treated with glycine 5% by intraperitoneal infusion for 7 days and Group II, not supplemented. The mucosa of the GI and GII was evaluated clinically, by scoring in D3 and D7. At the end , the cheek pouch of animals from both groups was removed and evaluated by histopathological parameters and biochemical . Groups I and II showed marked inflammatory process during the initial period, according to clinical evaluation. In GI decreased the severity of mucositis, reduction of inflammation, accelerated healing and decreased lipid peroxidation when compared to GII at the end of the experiment. Supplementation with glycine proves to be a promising tool for treatment of mucositis due to its effectson the inflammatory process. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

SOUSA, D. O. B. Soyatoxina-2 - uma nova toxina de sementes de soja: aspectos estruturais, do mecanismo de ação e efeitos biológicos. 2006. 160 f. Tese (Doutorado em Bioquímica) Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2006. / Submitted by Francisco Lacerda (lacerda@ufc.br) on 2014-11-25T17:26:09Z No. of bitstreams: 1 2006_tese_dobsousa.pdf: 1161474 bytes, checksum: 270f28e9264a0910e54e2dbf9bc51c3e (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa(jairo@ufc.br) on 2015-01-09T16:49:52Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2006_tese_dobsousa.pdf: 1161474 bytes, checksum: 270f28e9264a0910e54e2dbf9bc51c3e (MD5) / Made available in DSpace on 2015-01-09T16:49:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2006_tese_dobsousa.pdf: 1161474 bytes, checksum: 270f28e9264a0910e54e2dbf9bc51c3e (MD5) Previous issue date: 2006 / Soyatoxin 2 (SYTX-2) is a toxic protein isolated from soybean seeds [Glycine max (L.) Merril], genotype BR-10, lethal to mice upon intraperitoneal injection (LD50 4.5 ± 0.1 mg/Kg body weight). The symptoms observed upon administration were pilloerection, tachycardia, paw and tail extending, diuresis and tonic-clonic convulsions prior to death. The SYTX-2 was purified from soybean crude extract by ammonium sulfate fractionation, ion-exchange (DEAE-cellulose), affinity (Sepharose-4B-trypsin) and gel filtration (Superdex 200HR 10/30) chromatography. Inclusion of 0.005 M dithiothreitol in the extracting and other buffers used during the purification process was crucial to obtain highly homogenous SYTX-2 and to preserve the toxicity. SYTX-2 is not a glycoprotein and has apparent molecular masses of 28.0 and 25.4 kDa as measured by SDS-PAGE and gel filtration in Superdex 200HR 10/30 column, respectively, and a molar extinction coefficient (ε1% 1cm) of 16.9. Its NH2-terminal sequence shows 75% identity with a class III acidic endochitinase from soybean seeds. Therefore, besides to its toxic properties, SYTX-2 presented chitinase activity of 1.34 nKat/mgP. This toxin, when in contact with the sciatic nerve of rats was able to increase the peak-to-peak amplitude, confirming its neurotoxic action. Moreover, SYTX-2 presented pro-inflammatory activity, inducing neutrophil migration into the peritoneal cavity of rats which peaked at 8 h after administration. Evaluation of its physiological role showed that SYTX-2 exerted negative effect on the development of the cowpea pest insect Callosobruchus maculates, particularly on adult emergence and in the mean larval development time. Additionally, SYTX-2 was toxic to Dysdercus peruvianus nymphs, as it caused reduction of both the body weight gain and survival rate. SYTX-2 also acted negatively on the root-knot nematode Meloidogyne incognita by hindering its mobility. On the other hand, SYTX-2 did not inhibit neither the spore germination nor the hyphal development of the phytopathogenic fungi Colletotrichum lindemuthianum, C. gloesporioides, Rhizoctonia solani, Cercospora kikuchii, Fusarium solani, F. oxysporum and Aspergillus niger, under the assay conditions carried out in this present work. In summary this study presents, for the first time, data on a neurotoxin protein with additional unusual chitinase activity, whose physiological role is likely related to the plant defense mechanisms. Accordingly, SYTX-2 possesses potential biotechnological application as a novel plant defensive agent against insect pests and parasitic nematodes. / Soyatoxina 2 (SYTX-2) é uma proteína tóxica isolada de sementes de soja [Glycine max (L.) Merril], genótipo BR-10, sendo letal para camundongos quando administrada por via intraperitoneal (DL50 4,5 ± 0,1 mg/Kg de peso corpóreo). Os sintomas observados após sua administração foram piloereção, taquicardia, estiramento de patas e da cauda, diurese e convulsões tônico-clônicas, que precederam a morte do animal. A SYTX-2 foi purificada do extrato bruto de soja por fracionamento com sulfato de amônio, cromatografias de troca iônica (DEAE-celulose), de afinidade (Sepharose-4B-tripsina) e de filtração em gel (Superdex 200HR 10/30). A inclusão de ditiotreitol 0,005 M no tampão de extração e em outros tampões utilizados durante o processo de purificação foi crucial para obtenção da SYTX-2 num estado altamente homogêneo e preservação da toxicidade. A SYTX-2 não é uma glicoproteína e apresenta massa molecular aparente de 28,0 e 25,4 kDa, quando avaliada por PAGE-SDS e filtração em gel em coluna de Superdex 200HR 10/30, respectivamente, e coeficiente de extinção molar (ε1%1cm) de 16,9. Sua seqüência NH2-terminal exibiu uma identidade de 75%, quando relacionada com aquela de uma endoquitinase acídica da classe III de sementes de soja. Ao lado de sua atividade tóxica, a SYTX-2 apresentou atividade quitinásica de 1,34 nKat/mgP. Essa toxina, quando em contato com o nervo ciático de ratos foi capaz de aumentar a amplitude pico-a-pico, comprovando sua ação neurotóxica. A SYTX-2 também mostrou atividade pró-inflamatória, induzindo migração de neutrófilos para a cavidade peritoneal de ratos, cujo pico se deu 8 h após sua administração. Avaliação de seu papel fisiológico, mostrou que a SYTX-2 exerceu efeitos negativos sobre o desenvolvimento do inseto-peste de feijão-de-corda Callosobruchus maculatus, particularmente na emergência do adulto e no tempo médio de desenvolvimento larval. Adicionalmente, SYTX-2 foi tóxica para ninfas de Dysdercus peruvianus, causando redução no ganho de peso corpóreo e na taxa de sobrevivência. A SYTX-2 também atuou negativamente sobre o nematóide Meloidogyne incognita, impedindo sua mobilidade. Por outro lado, a SYTX-2 não foi capaz de inibir a germinação de esporos e nem o desenvolvimento de hifas dos fungos Colletotrichum lindemuthianum, C. gloesporioides, Rhizoctonia solani, Cercospora kikuchii, Fusarium solani, F. oxysporum e Aspergillus niger, nas condições de ensaio realizadas no presente trabalho. Em resumo, este trabalho apresenta, pela primeira vez, dados de uma proteína neurotóxica contendo uma atividade quitinásica não usual, cujo papel parece estar relacionado aos mecanismos de defesa da planta. Nesse contexto, SYTX-2 possui potencial para aplicação biotecnológica como um novo agente de defesa vegetal contra insetos-peste e nematóide-parasitas.

O cultivo de anteras de soja [Glycine max (L.) Merrill, 2n=40] iniciou na década de 1970 visando à obtenção de plantas androgenéticas haplóides e duplo-haplóides. Contudo, foram raras as ocasiões em que as condições de cultivo favoreceram o desenvolvimento embriogênico até a regeneração de plantas. No presente trabalho, pelo cultivo de anteras heterozigotas para um marcador molecular codominante, foi registrado que alguns genótipos segregantes originaram estruturas embriogênicas tanto a partir dos micrósporos quanto a partir dos tecidos diplóides da antera. Subseqüentemente, por meio de análises histológicas, foram registradas calogênese e embriogênese a partir do tecido conectivo, das camadas médias e da epiderme em anteras de quatro cultivares, sob as condições de cultivo até então recomendadas para desencadear androgênese. Estes eventos foram favorecidos pela presença do ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) e pela indução na luz. A constatação do potencial embriogênico do conectivo levantou a possibilidade de usar tecidos estaminais como uma nova fonte de explantes, a partir de indivíduos que já alcançaram a fase reprodutiva, quando a resposta morfogênica é considerada sem sucesso em soja. A formação de grãos de pólen multinucleados não foi uma resposta exclusiva ao cultivo: tanto o cultivo de anteras quanto o tratamento a 4oC aumentaram as freqüências de núcleos simétricos e extranumerários em grãos de pólen, incluindo núcleos com formato fragmentado. De forma geral, os resultados comprovaram que, nas condições recomendadas, o cultivo de anteras é um sistema limitado para desencadear androgênese em soja. Por isso, uma seqüência de testes foi conduzida para o estabelecimento in vitro de micrósporos isolados. Foi desenvolvida uma técnica de isolamento que permitiu a obtenção de suspensões de micrósporos viáveis com densidade adequada e, em seguida, o estabelecimento de cultivos. Nestes cultivos, foram testados os efeitos de meios nutritivos e de genótipos. A técnica desenvolvida será útil para futuros testes visando identificar fatores que desencadeiam androgênese em soja. Neste trabalho, foram identificadas limitações e potencialidades morfogênicas do cultivo de anteras de soja. Em conseqüência, é proposta uma nova abordagem ao estudo da androgênese, pelo cultivo de micrósporos e grãos de pólen isolados. / Soybean [Glycine max (L.) Merrill, 2n=40] anther culture began in the 1970’s in order to obtain haploids and double-haploids androgenic plants. However, only in rare occasions, culture conditions allowed embryogenic development to proceed as far as plant regeneration. In the present study, culturing heterozygous anthers to a codominant molecular marker, it was recorded that some segregating genotypes originated embryo-like structures from either microspores or anther diploid tissues. Subsequently, through histological analysis, it was recorded callogenesis and somatic embryogenesis from the connective, middle layer and epidermis in cultured anthers of four soybean cultivars, under culture conditions known to trigger an androgenic response. Morphogenic responses from anther walls and connective tissue was favoured by 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) and induction under light. Embryogenic potential of the connective tissue provided the possibility of using staminal tissue as a new source of explants, from individuals that have reached the reproductive phase, when the morphogenic response has been considered unsuccessful in soybean. Multinucleate pollen grains formation was not an exclusive response to culture: both anther culture and 4oC treatment increased symmetrical and extra nuclei frequencies in pollen grains, including atypical extra nuclei with a fragmented shape. On the whole, results indicated that, under recommended conditions, anther culture is a limited system to trigger androgenesis in soybean. Thus, a sequence of tests was carried out aiming to establish isolated microspores in vitro. It was developed a technique that allowed to obtain viable microspores suspensions at appropriate density and, subsequently, to establish cultures. The effects of medium constitution and genotypes were tested. This technique may be useful for further studies aiming to identify factors that are important to stimulate soybean androgenesis. In this study, morphogenic limitations and potentialities of soybean anther culture were identified. In consequence, it is proposed a new approach to study androgenesis, through the culture of isolated microspores and pollen grains.

A atividade antiviral de compostos flavonoídicos tem sido amplamente investigada nos últimos anos. Nesse contexto, a primeira etapa da presente tese teve por objetivo avaliar a atividade anti-herpética in vitro dos principais isoflavonóides de Glycine max (soja): genisteína, daidzeína, gliciteína e cumestrol. Dentre os isoflavonóides investigados, a genisteína e o cumestrol mostraram uma interessante atividade frente aos vírus HSV-1 (cepa KOS e 29R, sensível e resistente ao aciclovir, respectivamente) e HSV-2 (cepa 333), interferindo em diferentes etapas do ciclo de replicação dos vírus. Devido à reduzida hidrossolubilidade desses isoflavonóides, foi proposta a sua incorporação em nanoemulsões de uso tópico. As formulações foram otimizadas através de um experimento fatorial completo do tipo 23 . O efeito dos fatores tipo de óleo (óleo de rícino ou miristato de isopropila), co-tensoativo iônico (oleilamina ou ácido olêico) e fosfolipídeo (DSPC ou DOPC) sobre as propriedades das nanoemulsões e a retenção da genisteína na pele de orelha suína foi investigado. Nanoemulsões compostas de miristato de isopropila/ oleilamina/DOPC apresentaram um menor diâmetro de gotícula e uma maior retenção de genisteína na pele de orelha suína enquanto que a combinação miristato de isopropila/oleilamina/DSPC mostrou o menor índice de polidispersão. A viscosidade das formulações selecionadas foi ajustada através do uso de hidroxietilcelulose visando à obtenção de produtos de uso tópico, obtendo-se hidrogéis de comportamento pseudoplástico. Na sequência, um conjunto de resultados obtidos demonstrou que a composição das formulações (especialmente o fosfolipídeo DOPC e o agente espessante hidroxietil celulose) pode influenciar a liberação e a retenção dos isoflavonóides em mucosa esofágica suína. A integridade da mucosa também desempenha um papel no aumento da permeação/retenção do cumestrol, conforme ilustrado nas imagens de microscopia confocal, utilizando vermelho do Nilo como marcador fluorescente. De maneira geral, a incorporação dos isoflavonóides nas nanoemulsões aumenta a atividade anti-herpética desses compostos in vitro. O conjunto dos resultados demonstra que as formulações desenvolvidas são potenciais carreadores de uso tópico para genisteína e cumestrol no tratamento das infecções herpéticas. / The antiviral activity of flavonoid compounds has been extensively investigated in recent years. In this context, the first step of this study was to evaluate the antiherpes activity in vitro of the main isoflavonoids of Glycine max (soybean): genistein, daidzein, glycitein and coumestrol. Among the investigated isoflavonoids, genistein and coumestrol showed interesting activity against HSV-1 (KOS and 29R strains, which are acyclovir-sensitive and acyclovir–resistant strains, respectively) and HSV-2 (333 strain), interfering at different stages of the virus replication cycle. Due to the low hydrosolubility of these isoflavonoids, their incorporation into topical nanoemulsions was proposed in this study. The formulations were optimized through a 23 full factorial design. The factors effect of oil type (castor oil or isopropyl myristate), ionic co-surfactant (oleylamine or oleic acid) and phospholipid type (DSPC or DOPC) on physicochemical properties and genistein retention into porcine ear skin was investigated. Nanoemulsions composed of isopropyl myristate/ DOPC/oleylamine showed the smaller particle size and higher genistein retention into skin, whereas the formulation composed of isopropyl myristate/DSPC/oleylamine exhibited the lower polydispersity index. The viscosity of selected formulations was adjusted with hydroxyethyl cellulose to obtain topical products, which showed nonNewtonian behavior. In sequence, a set of results showed that formulations composition (especially the phospholipid DOPC and the thickening agent hydroxyethyl cellulose) could influence the release and retention of isoflavonoids in porcine esophagus mucosa. The integrity of mucosa plays a role on the increase of coumestrol permeation/retention, according to confocal microscopy images, using Red Nile as fluorescent label. In general terms, the incorporation of isoflavonoids into nanoemulsions increases the antiherpes activity of these compounds in vitro. The overall results show that the formulations developed in this study are potential topical carriers for genistein and coumestrol in the treatment of herpes infections.

Soja, uma cultura conhecida por sua importância econômica e nutricional, tem sido objeto de vários estudos que avaliam o impacto e as respostas efetivas das plantas aos estresses abióticos. O estresse salino é um dos principais estresses ambientais e afeta negativamente o crescimento e o rendimento das culturas, incluindo a soja. A edição de RNA é um processo pelo qual as sequências de nucleotídeos podem ser alteradas, revertendo mutações que podem mudar as sequências de proteínas para manter suas funções conservadas. As proteínas pentatricopeptide repeat (PPRs) são trans-elementos de edição caracterizados por reconhecer cis-elementos específicos de RNA e realizar a reação de edição. Vários estudos descreveram estes trans-elementos e seus sítios de edição cognatos, mas nem todas as proteínas que compõem o complexo de edição foram identificadas. A perda de eventos de edição de plastídios, resultante de mutações em fatores de edição de RNA ou através de interferência por estresse, leva a alterações de desenvolvimento, de fisiologia e da fotossíntese. O objetivo do presente trabalho é caracterizar os sítios de edição e os fatores associados à edição de RNA em Glycine max e a influência de estresses abióticos no processo de edição de RNA em cloroplastos. No capítulo 1, um método é apresentado para triar a edição de RNA de cloroplasto usando bibliotecas públicas de sRNAs de Arabidopsis, soja e arroz. Entre os sítios de edição previstos, 40,57, 34,78 e 25,31% foram confirmados utilizando sRNAs de Arabidopsis, soja e arroz, respectivamente. A análise de SNPs revelou alterações de C-to-U de 58,2, 43,9 e 37,5% nas respectivas espécies e identificou conhecidas e possíveis novas edições de RNA de adenosina para inosina (A-to-I) em tRNAs. O método e os dados revelam o potencial do uso de sRNA como uma fonte confiável para identificar novos e confirmar sítios de edição conhecidos. No capítulo 2, o processo de edição de RNA foi avaliado em cloroplastos de plantas de soja sob estresse salino. A abordagem de bioinformática utilizando bibliotecas de sRNAs e mRNAs foi empregada para detectar sítios específicos que mostram diferenças na taxa de edição. RT-qPCR foi usado para medir a taxa de edição nos sítios selecionados. Observamos diferenças nas taxas de edição nos transcritos dos genes ndhA, ndhB, rps14 e rps16 ao comparar os dados das bibliotecas controle e das tratadas com NaCl. Os ensaios de RT-qPCR 9 demonstraram um aumento na edição dos genes selecionados. Esses aumentos podem ser uma resposta para manter a homeostase das funções das proteínas do cloroplasto em resposta ao estresse salino. No capítulo 3, para identificar os fatores relacionados aos sítios de edição analisados, sondas biotiniladas de RNA foram projetadas com base nos sítios de edição de RNA de plastídio de soja para realizar um isolamento proteico específico do fator de edição. Proteínas que interagiram com as sondas foram isoladas através da ligação das sondas à biotina e foram identificadas utilizando espectrometria de massa. Entre os peptídeos detectados, cinco corresponderam a proteínas PPR. A comparação dos genes de Arabidopsis com as proteínas PPR da soja permitiu a identificação dos homólogos mais próximos. O presente estudo representa a primeira identificação do conjunto de sítios de edição de RNA, de fatores associados aos sítios de edição de RNA e a caracterização dos efeitos do estresse abiótico na edição de RNA em Glycine max. / Soybean, a crop known by its economic and nutritional importance, has been the subject of several studies that assess the impact and the effective plant responses to abiotic stresses. Salt stress is one of the main environmental stresses and negatively impacts crop growth and yield. RNA editing is a process whereby nucleotide sequences can be altered, reverting mutations that could change protein sequences to maintain their conserved functions. Pentatricopeptide repeat proteins are editing trans-elements characterized by recognize specific RNA cis-elements and perform the editing reaction. Several studies have described these trans-elements and their cognate editing sites, but not all proteins that compose the editing complex were identified. The loss of plastid editing events, resulting from mutations in RNA editing factors or through stress interference, leads to developmental, physiological and photosynthetic alterations. The aim of the present work is to characterize the editing sites and factors associated with RNA editing in Glycine max and the influence of abiotic stresses on the process of RNA editing in chloroplasts. In chapter 1, a method is presented to screen chloroplast RNA editing using public sRNA libraries from Arabidopsis, soybean and rice. Among the predicted editing sites, 40.57, 34.78, and 25.31% were confirmed using sRNAs from Arabidopsis, soybean and rice, respectively. SNP analysis revealed 58.2, 43.9, and 37.5% new C-to-U changes in the respective species and identified known and new putative adenosine to inosine (A-to-I) RNA editing in tRNAs. The method and data reveal the potential of sRNA as a reliable source to identify new and confirm known editing sites. In chapter 2, RNA editing process was evaluated in the chloroplast of soybean plants under salt stress. Bioinformatics approach using sRNA and mRNA libraries was employed to detect specific sites showing differences in editing efficiency. RT-qPCR was used to measure editing efficiency at selected sites. We observed differences in ndhA, ndhB, rps14 and rps16 editing rates between control and salt-treated libraries. RT-qPCR assays demonstrated an increase in editing efficiency of selected genes. These increases can be a response to keep the homeostasis of chloroplast protein functions in response to NaCl stress. In chapter 3, to identify the trans-acting factors of editing sites analyzed, we have designed RNA biotinylated probes based in soybean plastid RNA editing sites to perform 11 specific isolation of proteins associated to editosomes. Proteins that interacted with the probes were isolated by binding the probes to biotin and were identified using mass spectrometry. Among the detected peptides, five corresponded to PPR proteins. Comparison of Arabidopsis genes to the soybean PPR proteins allow identification of the closest related homologs. The present study represents the first identification of RNA editing sites set, associated factors to RNA editing sites and characterization of effects from abiotic stress in RNA editing in Glycine max.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:26:03Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-12-17Bitstream added on 2014-06-13T20:53:58Z : No. of bitstreams: 1 martin_lc_me_botib.pdf: 1513851 bytes, checksum: b337e010131dce6a4e203f7b96730b8f (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Estresses abióticos, como a seca, podem reduzir significativamente os rendimentos no cultivo de espécies comercialmente importantes, tais como o eucalipto na produção de celulose e papel. Quando submetidas às condições de déficit hídrico, as plantas desenvolvem alguns mecanismos de defesa. As betaínas participam destes mecanismos, sendo seu soluto mais comum a glicina betaína. Esta é uma amina quaternária distribuída extensamente em diversas espécies de plantas superiores, sintetizada em elevadas taxas, tendo como função, manter a turgescência celular. A identificação e estudo de genes relacionados à tolerância à seca são importantes para os programas de melhoramento florestal. Este estudo teve por objetivo identificar SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) no gene colina monooxigenase relacionado ao metabolismo da glicina betaína em Eucalyptus. A sequência do gene em estudo foi encontrada em genomas de plantas modelos através do banco de dados GenBank, sendo as mesmas, utilizadas para a procura de similaridades no banco de dados de ESTs de eucalipto FORESTs – FAPESP. Após a constatação de homologia no banco de dados de eucalipto, foram confeccionados oito pares de “primers” para flanquear essas regiões, sendo estes, avaliados, amplificando fragmentos únicos. Depois de realizado o seqüenciamento do gene colina monooxigenase, foi utilizado a ferramenta BLAST no GenBank, confirmando com sucesso a identidade da sequência. Em seguida, as sequências foram alinhadas e os SNPs encontrados. No total, foram identificados 49 SNPs, sendo 12 em regiões codificantes e 37 em regiões UTRs e íntrons. Somente os SNPs localizados nas regiões codificantes foram utilizados neste trabalho, sendo 83,3% deles possuindo mutações sinônimas e 16,7% não-sinônimas. Em seguida, foi utilizada uma população mais abrangente composta de E. grandis... / Abiotic stress, such as drought, can reduce significantly the yield in the important commercially species crop, such as the eucalyptus in the cellulose and paper. When submitted to the water stress conditions, the plants develop some defense mechanisms. The betaines are part of these mechanisms , being their solute more common to the glycine betaine. This is a quaternary amine extensively distributed in several species of higher plants synthesized in high taxes with the function of maintaining the cellular turgescence. Identifying and studying the genes related to the drought tolerance are important for the forest improvement programs. This work aimed at identifying SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) in choline monooxygenase related to the glycine betaine in Eucalyptus. The gene sequence was found in model plants genomes through the databank GenBank, being used for searching similarities in the databank ESTs of eucalyptus FORESTs – FAPESP. After noticing homology in the eucalyptus databank, eight pairs of primers were made to amplify these regions, being evaluated, amplifying unique fragments. After the choline monooxygenase sequencing was performed, it was used the BLAST in the GenBank, confirming successfully the sequence identity. Then, the sequences were aligned and the SNPs were found. In the total, 49 SNPs were identified, being 12 in coding regions and 37 in UTRs and intron regions. Only the SNPs located in coding regions were used in this work, being 83.3% of the SNPs with synonymous mutation and 16.7% non-synonymous. Following, it was used a wider population made up of de E. grandis, E. Urophylla and the hybrid “Urograndis” to perform the SNPs genotyping, establishing the formation of 18 haplotypes and 16 possible haplotypical combinations which revealed that some genotypes were exclusive for the species E. grandis and E. urophylla. With the objective of decreasing costs... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:26:08Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-07-25Bitstream added on 2014-06-13T20:54:10Z : No. of bitstreams: 1 demore_ps_me_jabo.pdf: 1002271 bytes, checksum: a27ac944079c717a8ba5366fe7e35456 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O oídio em soja, trata-se de uma doença praticamente presente em todos os paises produtores. Os marcadores moleculares microssatélites ou SSR (Simple Sequence Repeat) têm sido amplamente utilizados no processo de seleção assistida de genótipos de soja. Assim, o objetivo deste estudo foi obter marcadores microssatélites próximos ao gene de resistência ao oídio em soja. O estudo foi realizado em duas populações F2, oriundas de cruzamentos entre parentais contrastantes quanto à resistência ao oídio. Para o estudo, foram selecionados marcadores microssatélites a uma distância de até 42 cM ao redor do gene Rmd (resistência ao oídio). Utilizou-se o método de BSA (Bulked Segregant Analysis) na avaliação dos marcadores, para a comparação com a análise fenotípica das populações. Na análise foram utilizados dez iniciadores SSRs para as duas populações, sendo identificados quatro marcadores polimórficos para o cruzamento 1 (MGBR95-20937 x IAC-Foscarin 31) e três para o cruzamento 2 (MGBR 46/Conquista x EMBRAPA 48). Pela análise de Qui-quadrado da avaliação fenotípica, confirmou-se à segregação esperada (3:1) de um gene dominante condicionando a resistência. Os marcadores polimórficos também segregaram conforme o esperado (1:2:1) já que possuem natureza codominante. Para as populações 1 e 2, os melhores resultados foram obtidos com os marcadores Sat_366 e Sat_393, respectivamente, localizando-se a 9,41 e 12,45 cM de distância do gene, sendo considerados promissores na seleção assistida para resistência ao oidio em soja. / Powdery mildew in soybeans, it is a disease present in virtually all producing countries. The molecular markers microsatellites or SSR (Simple Sequence Repeat) have been widely used in the assisted selection of soybean genotypes. The objective of this study was to obtain microsatellites markers near the gene for resistance to powdery mildew in soybeans. The study was conducted in two populations F2, from crosses between contrasting parents about the resistance to powdery mildew. For the study, were selected microsatellites markers at a distance of 42 cM around the gene Rmd (resistance to powdery mildew). It was used the method of BSA (Bulked Segregant Analysis) in the evaluation of markers, for comparison with the phenotypic analysis of populations. In the analysis were used in ten initiators SSRs for the two populations, and identified four polymorphic markers for the crossing 1 (MGBR95-20937 x-IAC Foscarin 31) and three for the crossing 2 (EMBRAPA MGBR 46/Conquista x 48). For the analysis of chi-square of the phenotypic evaluation, it is confirmed the segregation expected (3:1) of a dominant gene conditioning the resistance. The polymorphic markers also segregation as expected (1:2:1) that have already codominante nature. For the populations 1 and 2, the best results were obtained with the markers Sat_366 and Sat_393, respectively, finding itself to 9.41 and 12.45 cM distance of the gene and are considered promising in assisted selection for resistance to soybean in powdery mildew.

A soja é uma das espécies cultivadas de maior importância econômica para o Brasil, atualmente o segundo maior produtor mundial deste grão. Contudo, doenças causadas por fungos são um dos principais problemas enfrentados pelos produtores de soja, o que leva a grandes perdas. Uma das alternativas para superar este problema é a utilização de cultivares com resistência genética. Com este objetivo, foram realizados quatro experimentos independentes de transformação genética de soja, em que o gene chit1, que codifica uma quitinase, enzima capaz de degradar paredes fúngicas, foi transferido para culturas embriogênicas, através da metodologia de biobalística. O gene marcador hpt, que confere resistência ao antibiótico higromicina, também foi utilizado. Em três dos experimentos realizados, uma nova metodologia foi testada, em que sequências desnecessárias, presentes nos vetores de transformação, não são colocadas na planta, e sim apenas os cassetes gênicos, contendo regiões regulatórias e codificadoras. No 1° Experimento realizado, foram obtidas plantas transgênicas transformadas com plasmídeos, mas estas não produziram sementes. No 2° Experimento, foi obtida uma linhagem transgênica, oriunda da transformação com plasmídeos. Foi confirmada a presença e a expressão do gene de quitinase em uma planta T0. Esta planta gerou uma progênie de 16 plântulas. Destas, 10 foram analisadas por PCR e foi confirmada a transmissão do transgene marcador para seis plantas T1. Análises moleculares complementares são necessárias para a determinação do padrão de herança dos transgenes. Como resultado do 3º Experimento realizado, foram obtidos 3.298 embriões histodiferenciados da cultivar Bragg (2.804 oriundos da transformação com plasmídeos e 494 da transformação com cassetes) e 2.286 para a cultivar IAS (759 com plasmídeos e 1.527 com cassetes). Do 4º Experimento realizado, foram obtidos 1.339 embriões histodiferenciados da cultivar Bragg (1.312 oriundos da transformação com plasmídeos e 27 da transformação com cassetes) e 1.035 para a cultivar IAS5 (851 com plasmídeos e 184 com cassetes). Mesmo considerando a possibilidade de alguns dos embriões obtidos serem escapes à seleção, a resistência ao antibiótico é um forte indício de transformação estável. Já foram obtidos embriões germinados oriundos da transformação com cassetes, resultantes dos 3° e 4° Experimentos. Com a condição transgênica comprovada, será realizada uma comparação dos padrões de integração gerados por transformação com plasmídeos e cassetes gênicos. / Soybean is one of the most important crops in Brazil, which is nowadays the second world largest producer. However, injuries caused by fungus are one of the main problems faced by the producers, causing great losses. One of the possibilities to deal with this problem is the utilization of cultivars with genetic resistance. With this goal, four independent soybean transformation experiments were performed. A chitinase gene, chit1, which can break fungal cell walls, was transferred to soybean embryogenic cultures, through the use of biolistic. The selection marker gene hpt, which confers hygromycin resistance, was also transferred to the embryos. In three of the performed experiments, a new methodology was tested, where unnecessary sequences, that are part of the transformation vectors, were not introduced into the plant, but only the gene cassettes, which contain regulatory and coding sequences. In the first experiment, transgenic plants were obtained, but they left no progeny. In the second experiment, one transgenic line was obtained from the plasmid transformation. The presence and expression of the chitinase gene in one T0 plant was confirmed. 16 T1 plantlets were obtained. 10 were analyzed by PCR, and the transmission of the marker gene to six T1 plants was confirmed. Further molecular analyses are necessary in order to determine the inheritance pattern of the transgenes. As a result of the 3rd Experiment, 3.298 histodifferentiated embryos of the cultivar Bragg were obtained (2.804 from the plasmid transformation and 494 from the gene cassettes transformation) and 2.286 of the cultivar IAS (759 from the plasmid transformation and 1.527 from the gene cassettes transformation). From the 4th Experiment, 1.339 histodifferentiated embryos were obtained for cultivar Bragg (1.312 from the plasmid transformation and 27 from the cassettes) and 1.035 for IAS (851 from the plasmid transformation and 184 from the cassettes). Even considering the possibility that some of the embryos obtained may have escaped selection, the hygromycin resistance is a great indication of stable transformation. Plants transformed, resulting from the 3rd and 4th experiments, were already obtained with the minimal cassettes. Once their transgenic nature is proved, the patterns of integration of plasmid transformed plants and cassette transformed plants will be compared.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, Programa de Pós-Graduação em Agronomia, 2017. / Submitted by Raquel Almeida (raquel.df13@gmail.com) on 2017-11-29T18:09:48Z No. of bitstreams: 1 2017_FábioPedrodaSilvaBatista.pdf: 5773140 bytes, checksum: b2d7bf2ea006c8c12558b389a5125bf1 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2018-01-23T22:32:28Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_FábioPedrodaSilvaBatista.pdf: 5773140 bytes, checksum: b2d7bf2ea006c8c12558b389a5125bf1 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-01-23T22:32:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_FábioPedrodaSilvaBatista.pdf: 5773140 bytes, checksum: b2d7bf2ea006c8c12558b389a5125bf1 (MD5) Previous issue date: 2018-01-23 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES). / O trigo e soja são plantas com excelente constituição genética e adaptabilidade devido a sua elevada interação genótipo x ambiente, no entanto, o estresse hídrico é um dos fatores que mais limita o desenvolvimento e produtividade dessas plantas no Cerrado. O objetivo deste estudo é avaliar o potencial de tolerância à seca de genótipos de trigo e soja em função do regime hídrico e o efeito do regime hídrico associado ao uso de reguladores de crescimento (Trinexapac-ethyl) e osmótico (K2CO2) na soja. Os três experimentos foram conduzidos na Embrapa Cerrados. No primeiro experimento, realizado com o trigo, o delineamento experimental foi o de blocos ao acaso com parcelas subdivididas, nas parcelas foram alocados os genótipos (Aliança, BR 18, BRS 254, BRS 264, Brilhante, CPAC 0544, PF 0100660, PF 080492, PF 37, PF 62 e a Mistura) e nas subparcelas as lâminas de irrigação (533, 438, 297, 202 e 184 mm). Na soja tratada com o regulador de crescimento (segundo experimento) o delineamento experimental utilizado foi o de blocos ao acaso com parcelas sub subdivididas, tendo por parcelas os genótipos de soja BRS 6980, BRS 7380RR e BRS 7580; as subparcelas, constituídas de aplicações foliares de Trinexapac-ethyl (1,02, 2,04 e 4,08 litros ha-1 e a testemunha) e as sub subparcelas constituídas das lâminas de irrigação (421, 400, 264, 207 e 174 mm). Na soja tratada com potássio via foliar (terceiro experimento) o delineamento utilizado foi o de blocos ao acaso com parcelas sub subdivididas, tendo por parcelas os genótipos BRS 6980, BRS 7380RR e BRS 7580; as subparcelas, constituídas de aplicações foliares de K2CO2 (0,98 litros ha-1, 1,57 litros ha-1 e testemunha) e a sub subparcela constituída das lâminas de irrigação (421, 400, 264, 207 e 174 mm). O regime hídrico afetou o desempenho agronômico e as características morfofisiológicas dos genótipos de trigo e de soja avaliados. O genótipo de trigo PF 080492 apresentou melhor desempenho agronômico (elevada produtividade, peso por hectolitro – PH; e Eficiência do Uso de Água Aplicada – EUAA) em condições de lâminas de irrigação mais elevadas e sob déficit hídrico. O genótipo de soja BRS 6980 apresentou maior produtividade e EUAA em condições de déficit hídrico (no segundo e terceiro experimento). A aplicação do Trinexapac-ethyl na soja elevou o porte, o peso de mil grãos (PMG), os teores de prolina e estabilizou a razão clorofila a/b dos genótipos. A suplementação foliar com K2CO2 pode minimizar os efeitos do déficit hídrico em genótipos de soja dependendo da interação do genótipo com a dose do produto. / Wheat and soybean are plants with excellent genetic constitution and adaptability due to their high interaction genotype x environment. However, water stress is one of the factors that most limits the development and productivity of these plants in the Cerrado region. The objective of this study was to evaluate the potential of drought tolerance of wheat and soybean genotypes as a function of the water regime and the effect of the water regime associated to the use of growth regulators (Trinexapac-ethyl) and osmotic (K2CO2) in soybean. The three experiments were conducted at Embrapa Cerrados. In the first experiment, with wheat, the experimental design was a randomized complete block with subdivided plots, in the plots the genotypes were allocated (Aliança, BR 18, BRS 254, BRS 264, Brilhante, CPAC 0544, PF 0100660, PF 080492 , PF 37, PF 62 and Mixture) and in the subplots the irrigation regimes (533, 438, 297, 202 and 184 mm). In the second experiment, soybean genotypes BRS 6980, BRS 7380RR and BRS 7580 were plotted in the soybean treated with the growth regulator using a randomized complete block design with sub subdivided plots. The subplots consisted of foliar applications of Trinexapac-ethyl (1.02, 2.04 and 4.08 liters ha-1 and the control) and the sub-plots consisted of irrigation regimes (421, 400, 264, 207 and 174 mm). In the Third experiment, soybean was treated with potassium via leaf, the design was randomized blocks with sub subdivided plots, with the BRS 6980, BRS 7380RR and BRS 7580 genotypes; (0.91 liters ha-1, 1.57 liters ha-1 and control) and the subplot constituted from the irrigation regimes (421, 400, 264, 207 and 174 mm). The water regime affected the agronomic performance and the morphophysiological characteristics of the wheat and soybean genotypes evaluated. The wheat genotype PF 080492 presented better agronomic performance (high productivity, weight per hectolitre - PH and Efficiency of Applied Water Use - USAA) under conditions of higher irrigation levels and under water deficit. The genotype of soybean BRS 6980 showed higher productivity and USAA under conditions of water deficit (in the second and third experiment). The application of Trinexapac-ethyl in soybean increased the size, the weight of a thousand grains (PMG), the contents of proline and stabilized the chlorophyll a/b ratio of the genotypes. Foliar supplementation with K2CO2 can minimize the effects of water deficit on soybean genotypes depending on the interaction of the genotype with the product dose.

O objetivo do presente trabalho foi otimizar o sistema de transformação genética de embriões somáticos de soja [Glycine max (L.) Merr.] utilizando a biolística e o sistema Agrobacterium de maneira integrada. Os antibióticos, adicionados ao meio de cultura para supressão da bactéria após a transferência do transgene, foram o alvo do estudo. Inicialmente, comparou-se o efeito de diferentes tratamentos com antibióticos sobre o tecido embriogênico de soja e sua eficiência na supressão da linhagem LBA4404 de Agrobacterium tumefaciens durante o processo de transformação. A carbenicilina (500 mg/l) apresentou efeitos diferentes sobre o tecido vegetal das duas cultivares testadas. Os tecidos embriogênicos da cv. IAS5 não apresentaram diferenças significativas em relação ao controle, enquanto que a proliferação dos embriões somáticos da cv. Bragg foi três vezes maior com a adição deste antibiótico ao meio de cultura. Contudo, a presença da carbenicilina nas duas concentrações testadas (500 e 1000 mg/l) não foi eficiente para supressão de Agrobacterium. Por outro lado, nos tratamentos com cefotaxima sozinha (350 e 500 mg/l), ou cefotaxima (250 mg/l) + vancomicina (250 mg/l) esta bactéria foi completamente suprimida da superfície dos embriões somáticos após 49 dias de tratamento. No entanto, enquanto a presença de cefotaxima, em qualquer concentração, foi prejudicial à sobrevivência do tecido embriogênico, a combinação de cefotaxima + vancomicina não afetou significativamente os embriões somáticos de soja até os 63 dias de tratamento. Portanto, os resultados indicam que o tratamento com cefotaxima + vancomicina por um período de 49 - 63 dias é o mais adequado para a transformação genética de soja, por suprimir Agrobacterium e apresentar mínimos efeitos sobre o tecido embriogênico. Por fim, conjuntos de embriões somáticos de soja foram transformados e tratados com a combinação recomendada de antibióticos para avaliação da eficiência do método na obtenção de transformantes estáveis. Foram obtidos 48 e 232 clones higromicina-resistentes para Bragg e IAS5, respectivamente. Para cv. Bragg, 26 plantas foram obtidas de um único clone, enquanto 580 plantas foram regeneradas de 105 clones da cv. IAS5. As plantas transgênicas eram férteis e morfologicamente normais. A presença do transgene no genoma destas plantas foi confirmada por análises moleculares. Portanto, a adequação dos antibióticos permitiu o desenvolvimento de um método de transformação altamente eficiente para soja. Os resultados do presente trabalho constituem o primeiro registro (1) do efeito de antibióticos sobre tecidos de soja ou de leguminosas e (2) de obtenção de transformantes estáveis de soja utilizando a biolística e o sistema Agrobacterium de maneira integrada.