Diss. (sammanfattning) Stockholm : Karol. inst., 2006. / Härtill 4 uppsatser.

Thesis (Ph.D. (Physiology)) -- Mahidol University, 1978.

Orientador: Luis Carlos Spolidório / Resumo: Hormônios esteroides sexuais participam de diversos eventos celulares e moleculares, e exercem influência sobre o epitélio e tecido conjuntivo do periodonto. A testosterona (T), principal hormônio androgênico, pode ser convertida em estradiol (E2) pela ação da enzima aromatase, ou em di-hidrotestosterona (DHT) pela ação da enzima 5α-redutase. Para elucidar o impacto de andrógenos sobre as células que compõem os tecidos conjuntivo e epitelial, fibroblastos e queratinócitos foram avaliados em relação aos efeitos de diferentes concentrações de T e DHT, além da exposição ao anastrozol (ANA), flutamida (FLU), fulvestranto (FUL), e às associações farmacológicas T+ANA, T+FLU e T+FUL. Os resultados do presente estudo indicaram que, de modo geral, hormônios esteroides androgênicos exercem efeitos opostos sobre eventos celulares de fibroblastos gengivais humano e células epiteliais HaCaT em cultura celular. Enquanto a T e a DHT agem promovendo o aumento da proliferação e atividade de fibroblastos, a exposição de células HaCaT a estes mesmos andrógenos resulta em inibição ou exiguidade do crescimento celular, atividade metabólica ou a capacidade de repovoamento da área de arranhão in vitro. Além disso, o tratamento farmacológico com ANA, FLU, FUL, e suas respectivas associações à T, parece influenciar eventos celulares de fibroblastos gengivais humano e células epiteliais HaCaT in vitro. / Abstract: Sex steroid hormones take part in different cellular and molecular process and exert their functions on the epithelium and connective tissue of the periodontium. Testosterone (T), the main androgenic hormone can be converted to estradiol (E2) through the aromatase enzyme action, or into dihydrotestosterone (DHT) by 5α-reductase activity. To elucidate the impact of androgens on the cells that constitute the connective and epithelial tissues, fibroblasts and keratinocytes were evaluated under the effects of different concentrations of T and DHT, besides to be both exposed to anastrozole (ANA), flutamide (FLU), fulvestrant (FUL), and the pharmacological associations T+ANA, T+FLU and T+FUL. The results of this study indicated that, in general, androgenic steroid hormones exert opposite effects on cellular events of human gingival fibroblasts and epithelial cells. While androgens act stimulating gingival fibroblasts, in HaCaT cells androgens promotes a shortage or inhibition of cell growth and activity. Furthermore, pharmacological treatment with ANA, FLU, FUL, and their associations to T, appears to influence cellular events of human gingival fibroblasts and HaCaT cells in vitro. / Mestre

Orientador: Renata Cunha Matheus Rodrigues-Garcia / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-16T04:43:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Goncalves_ThaisMarquesSimekVega_M.pdf: 1027067 bytes, checksum: 92d491bec7f696929f36bacc93b9a487 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: A maior prevalência de desordens temporomandibulares (DTMs) ocorre especialmente em mulheres durante a fase reprodutiva, sugerindo uma possível influência dos hormônios reprodutivos na etiologia destas desordens. O objetivo do presente trabalho foi avaliar a possível influência das flutuações hormonais ocorridas durante o ciclo menstrual, sobre a força máxima de mordida (FMM) e performance mastigatória (PM) de mulheres com e sem DTM. Foram selecionadas 62 voluntárias: 14 com DTM e usuárias de contraceptivos orais (CO) (idade média: 23,21 ± 3,01 anos); 16 sem DTM e usuárias de CO (controle, idade média: 22,8 ± 3,17 anos); 15 voluntárias com DTM e com ciclos menstruais regulares (idade média: 23,69 ± 5,73 anos) e 17 voluntárias sem DTM e com ciclos menstruais regulares (idade média: 23,9 ± 5,7 anos). A DTM foi diagnosticada por meio do Research Diagnostic Criteria (RDC/TMD) (Eixo I), sendo selecionadas as voluntárias com DTM de origem articular com ausência de sintomatologia dolorosa (deslocamento de disco articular). O índice de massa corporal (IMC) (Kg/m2) foi calculado por meio da razão entre o peso corporal (Kg) e o quadrado da altura (m). A avaliação da FMM foi realizada por meio de sensores instalados bilateralmente na região dos dentes molares, solicitando à voluntária que ocluísse com máxima força durante sete segundos, e permitido um intervalo de cinco minutos entre as duas mensurações realizadas. A PM foi avaliada por meio da mastigação de material teste artificial Optosil® e a separação do material triturado pelo fracionamento em peneiras acopladas a um agitador, expressando o valor da PM segundo o tamanho médio das partículas (X50). As variáveis foram mensuradas em todas as fases do ciclo menstrual, identificadas com auxílio de teste preditor de ovulação, sendo avaliados três ciclos menstruais completos. A homogeneidade da amostra segundo a idade e o IMC foi avaliada por meio do teste de variância um fator. Os valores de FMM e PM foram submetidos ao teste de esfericidade de Mauchly, e aplicado o procedimento PROC MIXED para medidas repetidas do programa estatístico SAS. Comparações múltiplas foram realizadas pelo teste de Tukey-Kramer com nível de significância de 5%. Não foram verificadas diferenças entre os grupos em relação à idade (p=0,92) e IMC (p=0,86), revelando a homogeneidade da amostra. Comparações entre as fases do ciclo menstrual não revelaram diferenças nos valores de FMM (p=0,5716). Independente do uso de CO, as voluntárias com DTM apresentaram os menores valores de FMM (p?0,05). Não houve diferença significante na FMM dentre as voluntárias que faziam ou não uso de CO (p=0,1522). Com relação à PM não houve diferenças entre voluntárias com e sem DTM (p>0,05), assim como entre as fases do ciclo menstrual (p=0,1177) e entre aquelas que faziam ou não uso de CO (p=0,3422). Desta forma, conclui-se que a flutuação hormonal feminina não influenciou a FMM e PM. A presença de DTM, mesmo na ausência de sintomatologia dolorosa, reduziu a FMM, entretanto, a PM não foi influenciada / Abstract: The higher prevalence of temporomandibular disorders (TMD) among women occurs during reproductive age suggesting that female reproductive hormones may play a role in TMD. The aim of the present study was to evaluate the possible influence of hormonal fluctuation at the menstrual cycle, on maximum bite force (MBF) and masticatory performance (MP) in women with or without TMD. Sixty two volunteers were selected: 14 women with TMD and taking oral contraceptives (OC) (mean age = 23.21 ± 3.01 years); 16 without TMD taking OC controls (mean age = 22.8 ± 3.17 years); 15 normally cycling women with TMD (mean age = 23.69 ± 5.73 years) and 17 normally cycling without TMD (mean age = 23.9 ± 5.7 years). TMD diagnosis was performed by Research Diagnostic Criteria (RDC/TMD) (Axis I) application, being selected those volunteers that presented articular TMD diagnosis without pain (joint disk displacement). Body mass index (BMI) was calculated by the ratio between the weight in kilograms (Kg) and the height in meters (m) squared (Kg/m2). MBF evaluation was performed through sensor in bilateral way at molar teeth area, requesting the volunteer to occlude with maximum force during seven second, allowed an interval of five minutes among the two measurements. MP was evaluated by chewing artificial test material Optosil®, and separation of chewed material at sieve system coupled an agitator, expressing MP value according to medium particle size (X50). The variables were evaluated in all menstrual cycle phases, identified with the aim of an ovulation test, and three complete menstrual cycles were analyzed. The sample homogenate according to age and BMI was analyzed by one way ANOVA. MBF an MP data were submitted to Mauchly's sphericity test and PROC MIXED procedure of SAS statistical program was applied for repeated measures. Multiple comparisons were accomplished by Tukey-Kramer test with significance level of 5%. No differences were found between the volunteers for age (p=0.92) or BMI (p=0.86), showing the homogeneity of the sample. Comparisons among menstrual cycle phases showed no difference in MBF values (p=0.5716). Independently of OC use, TMD volunteers presented the smallest MBF values (p?0.05). No differences on MBF were found between volunteers using or not OC (p=0.1522). In relation to MP, no differences were noticed among the volunteers with or without TMD (p>0.05), as well as between menstrual cycle phases (p=0.1177) or between groups taking or not OC (p=0.3422). This way, it can be concluded that feminine hormonal fluctuation did not influence MBF and MP. The presence of TMD, even without pain symptoms, reduced MBF, however, MP were not influenced / Mestrado / Protese Dental / Mestre em Clínica Odontológica

Orientador: Renata Cunha Matheus Rodrigues Garcia / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-18T19:59:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Oliveira_JonasAlvesde_D.pdf: 1670128 bytes, checksum: 578dc0d51fde913279b576735cdfeac0 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: A natureza multifatorial e os dados epidemiológicos envolvendo gênero sugerem que as Desordens Temporomandibulares (DTM) tenham como um dos componentes etiológico e de manutenção, os hormônios reprodutivos femininos. Este estudo avaliou a influência da flutuação hormonal nas fases menstrual, folicular, ovulatória, e lútea, sobre o padrão de movimento mandibular mastigatório de mulheres com e sem deslocamento de disco articular (DD). O deslocamento de disco articular com ausência de sintomatologia dolorosa foi diagnosticado por meio do Research Diagnostic Criteria for Temporomandibular Disordes (RDC/TMD). Foram selecionadas 57 voluntárias (idade média de 23,3 anos ±3,9) e distribuídas da seguinte forma: grupo (1): 13 portadoras de deslocamento de disco articular e ciclo menstrual regular; grupo (2): 15 com deslocamento de disco articular e que faziam uso de contraceptivo oral; grupo (3): 16 sem deslocamento de disco articular e com ciclo menstrual regular; e grupo (4)-controle: 13 com ausência de deslocamento de disco articular e que faziam uso de contraceptivo oral. Todas tiveram o índice de massa corporal (IMC) (Kg/m2) calculado por meio da razão entre o peso corporal (Kg) e o quadrado da altura (m). Foram feitas 12 avaliações do movimento mastigatório por voluntária em três ciclos menstruais completos. Os traçados dos movimentos mandibulares foram registrados durante a mastigação de silicone Optosil®, utilizando o equipamento cinesiógrafo (K6-I Diagnostic System, Myotronics Research. Inc) nos planos frontal e sagital, avaliando-se as amplitudes (mm) vertical, lateral e ântero-posterior, área total (mm2) frontal e sagital do ciclo mastigatório, e velocidade (mm/s) de abertura e fechamento da boca. A homogeneidade entre os grupos, segundo a idade e o IMC, foi avaliada por meio do teste de variância de um fator. Sendo medidas repetidas no tempo, foi aplicado o teste de esfericidade de Mauchly com análise multivariada de modelo misto de três critérios, e o teste de Tukey (?= 0,05) nas comparações múltiplas (Statistic v 5.1). Os grupos foram homogêneos quanto à idade (p= 0,793) e ao índice de massa corporal (p= 0,927). Dentre as variáveis mensuradas, somente a área total do ciclo mastigatório no plano frontal (p= 0,011) e sagital (p= 0,035) apresentaram diferença significante para as fases do ciclo menstrual, em que a fase lútea (4a mensuração) foi maior para mulheres que faziam ou não uso de contraceptivo oral. A amplitude lateral apresentou diferença significante para o uso ou não de contraceptivo oral (p= 0,049), em que os grupos com uso tiveram maiores valores, mas sem diferença para as fases do ciclo (p=0,063). Não houve diferença estatística entre os grupos com e sem DD. Pode se concluir que a flutuação hormonal feminina não teve efeito no padrão de movimento mandibular mastigatório / Abstract: The multifactor nature and epidemiological data involving gender suggest that temporomandibular disorders (TMD) have as etiological and maintenance component the female reproductive hormones. The influence of hormonal fluctuation during menstrual, follicular, ovulation and luteal phases on the pattern of mandibular movement of women with and without articular disc displacement (DD) was investigated. The articular disc displacement with absence of pain was diagnosed using the Research Diagnostic Criteria for Temporomandibular Disorder (RDC / TMD). Fifty seven were selected (mean age 23.3 years ± 3.9) and distributed in groups as follows: Group 1: Thirteen women diagnosed with articular disc displacement and regular menstrual cycle; Group 2: Fifteen with articular disc displacement and who were using oral contraceptive; Group 3: Sixteen without articular disc displacement and with regular menstrual cycles; and Group 4 (Control Group): Thirteen without articular disc displacement and who were using oral contraceptive. The body mass index (BMI) (kg/m2) was calculated using the ratio of body weight (kg) and squared height (m). Twelve assessments for each volunteer were taken (three full menstrual cycles). The tracings of mandibular movements were recorded during chewing of silicone Optosil® using a kinesiographic device (K6-I Diagnostic System, Myotronics Research. Inc) on frontal and sagittal planes, evaluating vertical, lateral and anteroposterior amplitudes (mm), total area (mm2), frontal and sagittal masticatory cycle, and speed (mm/s) of opening and closing. The homogeneity between groups according to age and BMI was evaluated through one-way analysis of variance. Mauchly's Sphericity Test with a mixed multivariate analysis of three criteria was used to validate repeated measures. In addition, Tukey's test was carried (? = 0.05) in multiple comparisons (Statistica v 5.1). The groups were homogeneous in age (p = 0.793) and body mass index (p = 0.927). There was no statistical difference between groups with and without DD. Among the variables measured, only the total area of the chewing cycle in the frontal (p=0.011) and sagittal planes (p=0.035) showed significant difference for the female sexual cycle stages in which the luteal phase (4th measurement) was highest for women who did or did not use oral contraceptive. The lateral amplitude was significantly lower for non-use of oral contraceptive (p = 0.049), and the other groups showed highest values for contraceptive use, but no difference for cycle phases (p = 0.063) was found. There were no differences between groups with and without DD. It can be concluded that hormonal fluctuation on women had no effect on the pattern of jaw masticatory movement / Doutorado / Protese Dental / Doutor em Clínica Odontológica

Orientador: Lúcia Helena Simões da Costa Paiva / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-19T17:10:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Leao_RogeriodeBarrosFerreira_M.pdf: 2600347 bytes, checksum: 3c70f4a08f6a98df16d66375a85ccd5f (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Introdução: O tamoxifeno é utilizado no tratamento do câncer de mama receptor de estrogênio positivo. Seu mecanismo de ação está na inibição do crescimento das células malignas por antagonismo competitivo com estrógenos pelos receptores estrogênicos. A ação do tamoxifeno nestes receptores é variável e, dependendo do tecido, pode ter ação antagonista ou agonista. Em mulheres menopausadas usuárias de tamoxifeno, observa-se uma maior incidência de patologias endometriais, sendo o pólipo endometrial a alteração mais frequente. Sua patogênese não está bem estabelecida, mas parece estar relacionada a fatores hormonais. Objetivos: Comparar a expressão de receptor de estrógeno (RE) e de receptor de progesterona (RP) em pólipos endometriais de usuárias de tamoxifeno com pólipos endometriais e endométrio atrófico de não usuárias na pós-menopausa. Material e métodos: Entre mulheres submetidas à histeroscopia cirúrgica no Hospital da Mulher Prof. Dr. Aristodemo Pinotti - CAISM/UNICAMP de janeiro de 1998 a dezembro de 2008, foram selecionadas 84 mulheres na pós-menopausa usuárias de tamoxifeno, com pólipo endometrial benigno. Esse grupo foi comparado a 84 amostras de endométrio atrófico e 252 pólipos benignos de mulheres na pós-menopausa não usuárias de tamoxifeno e sem antecedente de terapia hormonal. As expressões de RE e RP foram avaliadas através de imuno-histoquímica segundo a porcentagem de células coradas, intensidade da coloração nuclear e escore final. A expressão de RE e RP no epitélio glandular e no estroma dos pólipos de usuárias de tamoxifeno foi comparada com o endométrio atrófico e os pólipos de não usuárias separadamente, utilizando o Teste de Mann-Whitney, corrigido pelo método de Bonferroni, teste exato de Fisher ou Qui-quadrado. Resultados: os pólipos de usuárias de tamoxifeno apresentaram maior expressão de RE e RP no epitélio glandular e estroma, em relação ao endométrio atrófico (p<0,0001). Em relação aos pólipos de não usuárias, as usuárias apresentaram maior expressão de RP no epitélio glandular (p=0,0014) e estroma (p=0,0056), não apresentando diferença significativa em relação ao RE. A maioria dos pólipos das usuárias e não usuárias de tamoxifeno apresentavam RE/RP positivos enquanto a maioria dos endométrios atróficos era RE/RP negativos. Conclusões: Os pólipos apresentam aumento frequente de RE, independentemente do uso do tamoxifeno. Por outro lado, os altos níveis de RP parecem consistentes com os efeitos agonistas da droga / Abstract: Introduction: Tamoxifen has been used for the treatment of strogen receptor-positive breast cancer. The effect of tamoxifen in breast cancer is the it inhibition cancer cell growth by competitive antagonism with strogen for strogen receptor (ER). The mechanism of action of tamoxifen in this receptor varies among different tissues, with antagonist effect (e.g. in breast) ou agonist (e.g. in endometrium). Thus, in menopausal women who use tamoxifen, a higher incidence of endometrial alterations is observed and endometrial polyps are the most common. The pathophysiology of endometrial polyp is still not definitely established but it seems to be related to hormone influence. Objectives: To compare the expression of estrogen receptors (ER) and progesterone receptors (PR) in endometrial polyps of tamoxifen users to atrophic endometrium and endometrial polyps of postmenopausal nonusers of tamoxifen. Material and methods: Among women undergoing surgical hysteroscopy in Hospital da Mulher Prof. Dr. Aristodemo Pinotti - CAISM/UNICAMP, from January 1998 to December 2008, 84 tamoxifen users with benign endometrial polyp were selected. This group was compared to 84 samples of atrophic endometrium and 252 benign polyps of postmenopausal women who were non-users of tamoxifen and no previous history of hormone therapy use. ER/PR expression was assessed by immunohistochemistry study according to the percentage of stained cells, intensity of nuclear color and final score. The expression ER and PR in the glandular epithelium and stroma of polyp tissue from tamoxifen users was compared to atrophic endometrium and polyps from non-users separately, using the Mann-Whitney test corrected by the Bonferroni method, Fisher's exct test or Chi-square test. Results: Polyps of tamoxifen users had a higher expression of ER and PR in the glandular epithelium and stroma, in relation to the atrophic endometrium (p<0.0001). Regarding polyps of women not treated with tamoxifen, users had a higher PR expression in the epithelium (p=0.0014) and stroma (p=0.0056), without any difference in ER expression. Most of polipys expressed ER/PR positives while atrophic endometrium were ER/PR negatives. Conclusions: Polyps frequently exhibit increase in ER expression, independent of the use of tamoxifen. High levels of PR seem to be consistent with agonist effects of the drug / Mestrado / Fisiopatologia Ginecológica / Mestre em Ciências da Saúde

Prenatal ethanol (E) exposure has marked effects on development of the hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) and -gonadal (HPG) axes. E rats show HPA hyperresponsiveness to stressors and altered reproductive function in adulthood. Importantly, prenatal ethanol differentially alters stress responsiveness in adult males and females, raising the possibility that gonadal hormones play a role in mediating ethanol effects on HPA function. To address this possibility, two studies were conducted to test the hypothesis that the differential alterations in HPA activity observed in E compared to control males are mediated, at least in part, by ethanol-induced changes in HPG effects on HPA regulation. The first study compared the effects of gonadectomy (GDX) on HPA and HPG activity in adult male offspring from prenatal E, pair-fed (PF) and ad libitum-fed control (C) dams. There were no differences among groups in basal testosterone levels under intact conditions. However, E males showed increased adrenocorticotropin but blunted testosterone and luteinizing hormone (LH) responses to restraint stress compared to PF and/or C rats, and no stress-induced elevation in arginine vasopressin (AVP) mRNA levels. GDX eliminated these differences among groups. The second study explored dose-related effects of testosterone on HPA regulation. Testosterone had less of an inhibitory effect on stress-induced CORT and LH increases in E than in PF and C males. Furthermore, testosterone had a reduced effect on central corticotropin-releasing hormone pathways, but an increased effect on central AVP pathways in E compared to PF and/or C males. Importantly, reduced androgen receptor (AR) mRNA levels, possibly reflecting downregulation of AR in key brain areas, may counteract the increased inhibitory AVP signals upstream from the paraventricular nucleus, and thus contribute to the HPA hyperresponsiveness seen in E males. Together these findings suggest that central regulation of both the HPA and HPG axes are altered by prenatal ethanol exposure. The capacity of testosterone to regulate HPA activity is altered in E males, with some effects mediated by the nutritional effects of ethanol. These changes would impair the ability to maintain homeostasis in E animals and have implications for the development of secondary disabilities in children with Fetal Alcohol Spectrum Disorder. / Medicine, Faculty of / Graduate

Effect of Sepsis on Circulating CTRP3 Levels Adam Musick, Madison Shipley, Fei Tu, Chuanfu Li, Valentin Yakubenko, and Jonathan M. Peterson. Adipose tissue is an active endocrine organ which secrets several pro- and anti- inflammatory mediators, collectively called adipokines. Our previous work has identified a novel anti-inflammatory adipokine called C1q TNF Related Protein 3 (CTRP3). Others have previously demonstrated that localized overexpression of CTRP3 protects myocardial tissue from lipopolysaccharide (LPS)-induced sepsis, further supporting the potential protective role of CTRP3. However, endogenous regulation of CTRP3 in response to a sepsis event has not been explored. Further, other adipokines have been identified as diagnostic/prognostic biomarkers for critically ill patients. Therefore, the purpose of this project was to determine the effects of a sepsis event on the circulating CTRP3 levels. METHODS: Gonadal adipose tissue and serum were collected 8 hours after induction of the cecal-puncture and ligation (CLP) model of sepsis or sham control mice. The circulating levels of CTRP3 were quantified by immunoblot analysis. The transcription levels of CTRP3 in adipose tissue were measured by Real-Time PCR. In addition, to explore a potential mechanism for a protective role of CTRP3, thioglycollate-induced peritoneal macrophages were isolated and binding of recombinant CTRP3 was determined by imaging flow cytometry. RESULTS: Circulating CTRP3 levels decreased by approximately 90% compared to sham mice. However, adipose tissue transcription levels of CTRP3 was not difference between CLP and sham mice. Further, imaging flow cytometry demonstrated that CTRP3 binds directly to isolated macrophages. CONCLUSION: The overserved reduction in circulating CTRP3 protein levels and the absence of changes to the CTRP3 transcription, indicate that during sepsis CTRP3 is actively removed from the blood. As CTRP3 binds directly to macrophages and has been previously shown to attenuate LPS-induced macrophage activation these data could indicate that under normal conditions CTRP3 combines with active macrophages to help suppress cytokine overexpression. However, it appears that during sepsis the endogenous CTRP3 levels are quickly depleted. Combine these data support future research to determine if circulating CTRP3 levels are a biomarker indicative of sepsis prognosis and to determine if increasing the circulating levels of CTRP3 could reduce the cytokine storm associated to a sepsis event. Further, as we have demonstrated CTRP3 binds directly to macrophages, future studies are also needed to explore the potential anti-inflammatory mechanism of CTRP3 action on macrophages.

Orientadores: Maricilda Palandi de Mello, Celso Eduardo Benedetti, Fernanda Caroline Soardi / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-15T21:27:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 CunhaJunior_JoseLuizRosenberis_M.pdf: 3002580 bytes, checksum: 1980aba7f72fdfd74e758a924771c055 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: A expressão do gene SRY (Sex Determining Region in chromosome Y) é responsável por desencadear a determinação testicular durante o desenvolvimento embrionário, a partir das gônadas ainda indiferenciadas. Mutações nesse gene são encontradas em muitos casos de anomalias do desenvolvimento gonadal. O projeto teve por objetivo principal a análise funcional do efeito de uma mutação na região promotora do gene SRY, sendo que essa mutação consiste em uma deleção de 3 pares de base em um dos sítios consenso de ligação do fator de transcrição Sp1 ao promotor do gene. O portador dessa mutação é um indivíduo com disgenesia gonadal pura 46,XY, sendo que outros membros da família apresentavam ambiguidade genital e o pai, também portador da mutação, possuía grave hipospadia ao nascimento. Para tentar esclarecer os efeitos desta mutação nos mecanismos moleculares de regulação da expressão do gene SRY, este trabalho primeiramente analisou a interação da proteína Sp1 com os sítios localizados na região promotora de SRY e o efeito da mutação nesta interação, através de ensaios de EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assay). Concluiu-se que os sítios Sp1A e Sp1B se ligam a duas moléculas de Sp1 e que a mutação no Sp1A praticamente abole esta ligação. Possivelmente a ausência dessa ligação impediu a formação de um complexo de transcrição, causando uma diminuição na expressão do gene SRY e levando à ausência de formação dos testículos e reversão sexual completa na paciente. Complementando, foi analisado o efeito dessa mutação na expressão através de ensaio de expressão com gene repórter, no qual o promotor normal se mostrou em média duas vezes mais eficiente na ativação da expressão da luciferase que o promotor mutante. Entretanto, mais experimentos de transfecção, inclusive com outras linhagens celulares, devem ser realizados para confirmação desse resultado. Além disso, foi analisado o efeito de uma nova mutação (localizada na região codificante do gene SRY) na ligação da proteína SRY com o DNA, através de ensaios de EMSA. Concluiu-se que a mutação E89K, associada com disgenesia gonadal pura 46,XY, reduziu em alto nível a atividade de ligação in vitro da proteína SRY mutante ao DNA, o que representa um forte indício de que atividade reduzida da proteína mutante não foi suficiente para desencadear o processo de determinação testicular. Paralelamente, foi feito o rastreamento de mutações no gene SRY e sua região promotora em novos casos de disgenesia gonadal, não tendo sido encontradas, porém, alterações nos pacientes analisados / Abstract: The SRY (Sex Determining Region in chromosome Y) gene expression is responsible for testicular determination during embrionary development. Mutations in SRY are found in many cases of anomalies of gonadal development. This project analyzed the functional effect of a mutation in SRY promoter region; the mutation is a 3-bp deletion in a consensus binding site for Sp1 transcription factor. The patient presented 46,XY pure gonadal dysgenesis, and a family history of relatives with different levels of genital ambiguity. Her father shares the same mutation in the SRY promoter region. In order to investigate the effects of the mutation upon the molecular mechanisms that regulate SRY gene expression, the interaction of the Sp1 transcription factor with normal and mutant binding sites was analyzed by EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assay). Each of Sp1A and Sp1B normal sites binds to a single Sp1 molecule, whereas the 3-bp deletion in Sp1A abolishs the binding to this site. Probably, the lack of Sp1 binding to the Sp1A site prevented the formation of a stable transcription complex, reducing the level of SRY expression and leading to the absence of testicles and complete sex reversal in the patient. Parallely, the effect of the mutation was analyzed by a reporter gene assay, indicating that the normal promoter is almost two times more efficient than the mutant promoter in the activation of luciferase gene expression using HeLa cells. However, further transfection experiments with other cell lineages must be performed to confirm this result. In addition, the effect of a new mutation (E89K, located in the SRY gene coding region) was analyzed by testing the ability of the SRY mutant protein to bind its DNA consensus sequence. EMSA assays revealed that the E89K mutation, which is associated with 46,XY pure gonadal dysgenesis, strongtly reduced the SRY protein binding activity in vitro. This result is a strong evidence that the reduced activity of SRY mutant protein was not sufficient to trigger the testicular determination in the patient, leading to the pure gonadal dysgenesis phenotype. Screening of mutations in the SRY gene coding and promoter regions was also performed in six diferent patients with 46,XY gonadal dysgenesis. However, other mutations have not been identified / Mestrado / Genetica Animal e Evolução / Mestre em Genética e Biologia Molecular

Introdução: O termo distúrbios do desenvolvimento gonadal (DDG) inclui condições congênitas nas quais o desenvolvimento gonadal é atípico. Estudos feitos em camundongos observaram que alguns genes como o Cbx2 e o Tcf21 interferem na fase inicial do desenvolvimento gonadal, afetando tanto gônadas XX quanto XY. O gene Dhh, por sua vez, codifica o fator de transcrição Dhh, produzido pelas células de Sertoli, que é fundamental para a diferenciação das células de Leydig em gônadas XY. Nos ovários, o gene FOXL2 atua na foliculogênese, sendo fundamental para a formação dos ovários. Objetivos: Analisar clinicamente e pesquisar anormalidades nos genes CBX2, TCF21, DHH e FOXL2 em pacientes portadores de distúrbios do desenvolvimento gonadal 46, XY e 46, XX. Material e Métodos: Foram estudados 60 pacientes (41 com DDG 46, XY e 19 com DDG 46, XX). A análise molecular foi realizada a partir da amplificação gênica por PCR e sequenciamento direto. Resultados: Várias alterações alélicas foram encontradas nos quatro genes, algumas ainda não descritas na literatura. Uma alteração intrônica no gene DHH foi encontrada em um paciente com DDG 46, XY e não foi encontrada em nenhum dos 360 alelos normais estudados (g.IVS2 +29G>A). Estudamos essa variante através da extração do RNA do testículo do paciente afetado, mas não encontramos alteração no RNA; portanto ela parece não ser uma mutação. No gene TCF21, a variante encontrada foi identificada em controles normais. No gene CBX2, das treze alterações encontradas, uma não foi identificada em 206 alelos normais, e há troca de aminoácidos (p.C132R / g.394 T>C). Trata-se de uma variante que pode ter relação com o fenótipo do paciente, portador de DDG 46, XY. No gene FOXL2, das três alterações encontradas, uma não foi identificada em 206 alelos normais; contudo, não há troca de aminoácidos (p.A181A / g.543 C>T). Conclusão: Esse estudo sugere que mutações nos genes CBX2, TCF21, FOXL2 e DHH são causas raras de distúrbios do desenvolvimento gonadal. / Introduction: Congenital disorders of gonadal development (DGD) include conditions whose gonadal development is atypical. Studies in mice found that some genes such as Cbx2 and Tcf21 interfere in the initial phase of gonadal development, affecting both XX and XY gonads. Dhh gene, in turn, encodes the transcription factor Dhh, produced by Sertoli cells, which is essential for the differentiation of Leydig cells in XY gonads. In the ovaries, genes as FOXL2 act in folliculogenesis, fundamental to the development of the ovaries. Objectives: To analyze patients with disorders of gonadal development (DGD) 46, XY and 46, XX and research mutations in CBX2, TCF21, DHH and FOXL2 genes. Methods: We analyzed 60 patients (41 DGD 46, XY patients and 19 DGD 46, XX patients). The whole coding region of CBX2, TCF21, DHH and FOXL2 genes were amplified by PCR and direct sequenced. Results: Several allelic variations have been found in the four genes, some not even described by literature. One intronic variation in DHH was described in one patient with 46, XY DGD and it wasnt found in any of the 360 normal control alleles studied (g.IVS2 +29G>A). We studied this variant through RNA extraction from the affected patients testes, but we didnt find any alteration in the RNA, so it doesnt seem to be a mutation. In TCF21 gene, the single variant that was found was identified in normal controls. In CBX2 gene, among the 13 alterations described, one wasnt identified in 206 normal control alleles, and there is aminoacid change (p.C132R / g.394 T>C). This is a variant that may be a mutation, causing the patients phenotype that had 46, XY DGD. In FOXL2, among the 3 variations described, one wasnt indentified in 206 normal control alleles, but there wasnt amino acid change (p.A181A / g.543 C>T).Conclusion: This study suggests that mutations in CBX2, TCF21, FOXL2 and DHH genes are rarely causes of disorders of gonadal development.