L’allogreffe de cellules souches hématopoïétiques (CSH) reste à l’heure actuelle la seule thérapie curative de nombreuses hémopathies malignes. Les lymphocytes T (LT) du donneur constituent une immunothérapie contre les cellules de la leucémie (ou lymphome) appelé effet « GVL » pour « Graft versus Leukemia ». Malheureusement cet effet est intimement lié à la maladie du greffon contre l’hôte appelée « GVH » pour « Graft versus Host » (destruction des cellules saines du receveur par les LT du donneur). L’allogreffe de CSH est de plus en plus souvent réalisées avec des greffons mobilisés par du G-CSF. Quelques publications identifient des cellules immunosuppressives avec un phénotype peu précis CD11b+ Gr1+ induites par le G-CSF pouvant regrouper plusieurs sous-types cellulaires et sans trouver de contre-partie humaine ou avec un mécanisme d’action peu clair. Nous avons démontré que le G-CSF mobilise chez l’homme, dans la fraction CD34+ du greffon, une population monocytaire. Lorsqu’elle représente plus de 12% des CD34+, les receveurs ont une incidence moindre de la GVH aiguë. Cette même population est phénotypiquement et fonctionnellement conservée chez la souris. En réponse à l’IFN-γ relargué par les LT allogéniques, elle produit de l’Oxyde Nitrique capable d’induire l’apoptose de ces LT in vitro. In vivo, nous avons pu décortiquer (chez la souris uniquement) les mécanismes de régulation de la GVH aiguë. Les LT apoptotiques phagocytés par les macrophages capables alors de devenir tolérogènes en produisant du TGF-β et ainsi d’induire des LT régulateurs. Dans le modèle murin d’allogreffe de CSH, le transfert adoptif de cette population purifiée protège le receveur de la GVH aiguë. Nous pensons que si cette population peut être cultivée et expandue ex vivo, elle pourrait être une thérapie cellulaire préventive contre la GVH. / Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplantation (Allo-HSCT) is the most effective immunotherapy for acute leukemia, due to the development of graft-versus-leukemia (GVL) effect mediated by alloreactive donor T cells. However, donor T cells specific for recipient alloantigens are also responsible for graft-versus-host disease (GVHD), a life-threatening complication that frequently occurs after allo-HSCT. The administration of Granulocyte colony stimulating factor (G-CSF) is routinely performed to collect Peripheral Blood Stem Cells (PBSC) from healthy donors for allo-HSCT. Few studies identified that G-CSF can induce myeloid suppressive cells in mice (CD11b+ Gr1+) with no human counterpart. We demonstrated in our study that G-CSF can induce a new population named CD34+Monocyte. The cumulative incidence of acute grade II to IV GVHD following allo-HSCT was lower in patients receiving grafts containing CD34+ monocyte frequencies above 12% of the CD34+ population. In mice, we demonstrated that G-CSF mobilized a highly conserved CD34+ monocyte population. CD34+Monocytes require T cell-mediated IFN-γ to produce Nitric Oxide that inhibits T cell activation and proliferation. In vivo, we report that CD34+ monocyte-derived NO regulates the alloreactive response by inducing T cell apoptosis and subsequently, the induction of regulatory T cells. In fact, uptake of apoptotic T cells by macrophages triggers them to produce high levels of TGF-β that drives the expansion of Tregs and induces immune tolerance. Such tolerogenic monocytes could represent a good candidate for the development of novel immunoregulatory and therapeutic cellular therapies.

La photochimiothérapie extracorporelle (PCE) est une thérapie cellulaire prometteuse utilisée avec succès dans le traitement de pathologies impliquant des lymphocytes T (LT) telles que les lymphomes T cutanés et la GvHD. Contrairement aux immunosuppresseurs, la PCE semble induire une immunomodulation dirigée spécifiquement à l'encontre des LT « pathogènes » sans immunosuppression généralisée, cependant son mode d'action reste inconnu. Afin de comprendre ces mécanismes d'action, nous avons caractérisé dans un premier temps l'effet de la PCE sur la fonctionnalité des monocytes présents en forte proportion dans l'échantillon traité. Ils entrent en apoptose lente et les cellules encore vivantes conservent leur propriétés fonctionnelles. Dans la GvHD, nous avons montré qu'après PCE, les LT « pathogènes » activés entraient plus rapidement en apoptose que les LT « normaux » au repos. L'apoptose des LT activés est immunogène et induit la maturation des cellules dendritiques, leur conférant des propriétés de stimulation T plus fortes tout en diminuant la proportion de T régulateurs induits. Nous développons un modèle in vitro afin de mettre en évidence l'induction d'une réponse anti-clonotypique fortement suggérée par nos résultats. Enfin, en collaborant avec des pédiatres oncologues, nous avons participé au développement d'un modèle in vitro pré-clinique validant un protocole allégé de la technique pour le traitement de la GvHD en pédiatrie, conduisant à l'ouverture d'un essai clinique. Nos travaux constituent une étape clé dans la compréhension des mécanismes d'action de la PCE et contribuent à l'amélioration des pratiques cliniques et ainsi de la qualité de vie des patients.

Aujourd’hui, il est clairement établi que les lymphocytes T (LT) du donneur stimulés chroniquement par les antigènes mineurs (mHAgs) du receveur sont responsables du développement de la maladie du greffon contre l’hôte (GVHD). Il devient dès lors primordial de mettre au point des mécanismes permettant de contrôler l’activité et la fonctionnalité des LT du donneur soumis à une stimulation antigénique persistante. Nous avons montré dans un modèle in vivo de GVHD chronique qu’il est possible de réguler par deux mécanismes différents l’activité des LT du donneur stimulés chroniquement par un mHAg du receveur. Premièrement, la stimulation chronique des LT CD4+ du donneur par l’mHAg modifie fortement leurs fonctions. Ceux-ci s’adaptent à la présence de l’mHAg et y deviennent insensibles. Les LT CD4+ adaptés se caractérisent par un nombre élevé d’ARNm ainsi qu’une importante augmentation à leur surface de l’expression du récepteur inhibiteur PD-1. Nous avons montré que le blocage de la voie de costimulation négative PD-1/PD-L1 inverse et supprime l’adaptation des LT CD4+, stimule fortement leur production d’IFN-γ, entraînant le développement d’une maladie sévère. Le blocage de la voie de costimulation négative PD-1/PD-L1 aggrave aussi le choc toxique causé par l’injection de Lipopolysaccharide (LPS) et active la réaction immunitaire responsable du rejet de peaux mâles greffées sur des souris contenant des LT CD4+ adaptés. Ces résultats suggèrent que les LT CD4+ s’adaptent à la persistance de l’antigène en élevant leur seuil d’activation via la voie de costimulation négative PD-1/PD-L1. D’un autre côté, nos résultats soulignent la capacité que possèdent les cellules NK du receveur à contrôler l’activité ainsi que la prolifération des LT CD4+ du donneur soumis à une stimulation antigénique persistante. Cette faculté de régulation que détiennent les cellules NK préserve le receveur du développement d’une GVHD chronique. La régulation de la prolifération et de l’activité des LT CD4+ par les cellules NK s’effectue via NKG2D, un récepteur activateur présent à la surface de ces cellules. En effet, l’expression de certains ligands de NKG2D est augmentée dans les LT CD4+ activés. L’injection d’anticorps bloquant NKG2D inhibe l’activité régulatrice des cellules NK. Celle-ci semble s’effectuer par un mécanisme indépendant de la perforine. Nos résultats montrent que la voie de costimulation négative PD-1/PD-L1 est le mécanisme moléculaire utilisé par les LT CD4+ adaptés à l’mHAg pour calibrer leurs activités et leurs fonctionnalités en réponse à une stimulation antigénique persistante. Ils soulignent aussi le rôle des cellules NK dans le contrôle de l’activité et de la prolifération des LT CD4+ responsables du développement de la GVHD chronique.

Cellular therapies rely on the delivery of therapeutic cells into patients, but their safety can be compromised by the manipulation of cells ex vivo or their placement outside of their natural context in vivo. Cell Fate Control Gene Therapy (CFCGT) offers the possibility of establishing pharmacological controls over gene-modified cells (GMCs) with regards to their proliferation, differentiation, or function. In its simplest form, 'suicide' gene therapy (SGT), stable introduction of a 'suicide' gene that can activate a non-toxic prodrug establishes control over the survival of GMCs. Current SGT modalities are sub-optimal in clinical setting. To overcome the many limitation of current strategies, we have developed a next-generation CFCGT approach based on the active site-engineered variants of human deoxyCytidine Kinase (dCK), which enable robust activation of multiple Nucleoside Analogue (NA)-based prodrugs, act early in the pathway enabling rapid accumulation of activated NAs in target cells, and also provide the capabilities for the direct imaging of GMCs. Stable introduction of dCK variants into target cells by means of Lentiviral (LV) gene transfer significantly increases their sensitivity to multiple prodrugs. Our dCK variant with only two active site amino acid substitutions is expected to be non-immunogenic yet capable of specifically activating deoxythymidine- and deoxyuridine-based NAs that are not substrates for the wild-type enzyme, such as bromovinyldeoxyuridine (BVdU) and L-deoxythymidine (LdT). We show here that dCK can be used for controlling the survival of GMCs, in cell lines and primary cells in vitro and in a murine xenogeneic transplant models in vivo. To characterize dCK/prodrug-mediated killing mechanisms in GMCs, we have examined the levels of active metabolites in cells and the cellular pathways they antagonize. We describe here the experimental basis for the application of this novel CFCGT in bone marrow transplantation for management of Graft-versus-Host Disease (GvHD) and in enhancing chemotherapy in direct treatment of tumors. In summary, we have developed a novel and robust strategy for effective CFCGT that addresses the many shortcomings of existing modalities. Future studies will validate this novel system in a variety of primary cells and animal disease models, including models of hematopoietic transplantation and ES/iPS-based cell therapies.

Cellular therapies rely on the delivery of therapeutic cells into patients, but their safety can be compromised by the manipulation of cells ex vivo or their placement outside of their natural context in vivo. Cell Fate Control Gene Therapy (CFCGT) offers the possibility of establishing pharmacological controls over gene-modified cells (GMCs) with regards to their proliferation, differentiation, or function. In its simplest form, 'suicide' gene therapy (SGT), stable introduction of a 'suicide' gene that can activate a non-toxic prodrug establishes control over the survival of GMCs. Current SGT modalities are sub-optimal in clinical setting. To overcome the many limitation of current strategies, we have developed a next-generation CFCGT approach based on the active site-engineered variants of human deoxyCytidine Kinase (dCK), which enable robust activation of multiple Nucleoside Analogue (NA)-based prodrugs, act early in the pathway enabling rapid accumulation of activated NAs in target cells, and also provide the capabilities for the direct imaging of GMCs. Stable introduction of dCK variants into target cells by means of Lentiviral (LV) gene transfer significantly increases their sensitivity to multiple prodrugs. Our dCK variant with only two active site amino acid substitutions is expected to be non-immunogenic yet capable of specifically activating deoxythymidine- and deoxyuridine-based NAs that are not substrates for the wild-type enzyme, such as bromovinyldeoxyuridine (BVdU) and L-deoxythymidine (LdT). We show here that dCK can be used for controlling the survival of GMCs, in cell lines and primary cells in vitro and in a murine xenogeneic transplant models in vivo. To characterize dCK/prodrug-mediated killing mechanisms in GMCs, we have examined the levels of active metabolites in cells and the cellular pathways they antagonize. We describe here the experimental basis for the application of this novel CFCGT in bone marrow transplantation for management of Graft-versus-Host Disease (GvHD) and in enhancing chemotherapy in direct treatment of tumors. In summary, we have developed a novel and robust strategy for effective CFCGT that addresses the many shortcomings of existing modalities. Future studies will validate this novel system in a variety of primary cells and animal disease models, including models of hematopoietic transplantation and ES/iPS-based cell therapies.

There is an urgent need for novel preventive and therapeutic strategies for graft versus host disease (GvHD) occurring after allogeneic hematopoietic cell transplantation (allo-HCT). T-cell-based immunotherapies have been developed, however there are still some hurdles for the use of currently availably regulatory T-cells in clinical practice (naturally occurring FOXP3 + nTregs and inducible regulatory T cells), mainly owing to the lack of specific cell surface markers. The hypomethylating agent azacytidine (5-aza-dC) has been shown to generate immunoregulatory T-cells ex vivo. Interestingly, it has been shown that genes other than FOXP3 are responsible for the suppressor function of 5-aza-dC induced T-regs. HLA-G is a surface molecule with potent immunoregulatory functions which is normally expressed during pregnancy protecting the “semi-allogeneic” fetus from maternal immune attack and then is epigenetically repressed. The aim of this study was the induction of HLA-G expression in T-lymphocytes with the use of the demethylating agent 5-Aza-dC and investigation of their possible immunoregulatory properties. Our results showed that short in vitro treatment of peripheral blood T-cells with 5-aza-dC induces HLA-G expression and, more importantly, these induced HLA-G + T-cells could suppress lymphoproliferation when added as third party cells in mixed lymphocyte cultures. This suppression seems to be reduced after HLA-G neutralization and cell-to-cell contact independent. Furthermore, these induced HLA-G + T-cells show a reduced proliferation to allogeneic stimuli. Taken together, our results indicate the ex vivo production of HLA-Gpos T-lymphocytes with immunoregulatory properties. Our long term goal is the use of this population as adoptive cellular therapy for GvHD and other T-cell mediated diseases. / -

Trouver des solutions thérapeutiques permettant de limiter le développement de la maladie du greffon contre l’hôte tout en conservant l’effet GvL est actuellement un des enjeux crucial de la recherche en hématologie. La GvH est la complication majeure chez les patients ayant subit une greffe allogénique de cellules hématopoïétiques (CH). Elle se caractérise par la reconnaissance des organes du patient comme non-soi par le nouveau système immunitaire mis en place. Les lymphocytes T sont les principaux effecteurs de la GvH mais ils permettent aussi la prise de greffe ainsi que l’éradication d’une partie des cellules malignes. Les dommages tissulaires liés au conditionnement préparatoire à la greffe favorisent cette allo-reconnaissance en fournissant aux cellules présentatrices d’antigènes quantité de peptides allogéniques. Les protéines de choc thermique (HSP) ont été très conservées au cours de l’évolution de part leur rôle primordial dans la préservation de l’intégrité cellulaire. Ainsi, elles permettent aux cellules de résister à différents stress (chimio-/radiothérapie, UV, hypoxie…) en protégeant de nombreuses protéines de l’agrégation mais aussi, en bloquant le déclenchement d’une apoptose précoce. Depuis quelques années, les HSP sont de plus en plus décrites comme protectrices de l’organisme. En effet, en cas de stress conduisant à la mort cellulaire, les HSP sont sécrétées dans le milieu extracellulaire où leur interaction avec d’autres cellules telles que les cellules immunitaires permet d’alarmer l’organisme quant au danger potentiellement présent pour lui. Cet effet, bénéfique en cas d’infection par exemple, peut se révéler néfaste dans divers pathologies inflammatoires. Notre équipe étant très spécialisée dans l’étude des HSP, nous avons voulu étudier grâce à un modèle murin mimant le développement de la GvH, le rôle de ces protéines dans ce contexte particulier. Nous avons d’abord voulu savoir si l’inhibition des HSP pouvait moduler le développement de la maladie. L’inhibiteur d’HSP90, 17AAG (17-allylamino-17-demethoxygeldanamycine), en empêchant HSP90 de stabiliser les kinases clés des voies de survie/prolifération induit la mort des lymphocytes T s’activant au contact de l’hôte. Un traitement court permet de prévenir le développement de la maladie dans notre modèle. D’autre part, nous avons pu observer que le conditionnement préparatoire à la greffe favorisait l’expression extracellulaire d’une autre HSP, gp96 (glycosylated protein 96). Cette protéine, en interaction avec le complément C3, agirait comme signal de danger en favorisant la présentation des peptides du receveur aux lymphocytes du donneur via leur présentation par les macrophages. A terme, ces travaux pourraient mener à de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les patients atteints de désordres inflammatoires tels que la GvH ou des pathologies auto-immunes. / Hematopoietic cells transplantation (HCT) is often used as a curative approach for hematopoietic malignancies. Unfortunately, GvHD, for graft versus host disease, is the major lethal complication for patients undergoing HCT. Mature T-cells present in the graft recognize residual malignant cells and therefore decrease the risk of death related to relapse of cancer. This is the graft versus tumor effect. But when GvHD develops, those cells also recognize patient’s organs leading to organ failures. Irradiation and/or chemotherapy used as conditioning regimen also promote GvHD development. In fact, damaged tissues induce the secretion of danger signals, and the presence of apoptotic cells provides big quantities of allogeneic peptides to phagocytes. Therefore, new strategies, allowing the distinction between GvHD and the GvT effect are highly needed. Heat shock proteins (HSPs) have been conserved through evolution because of their crucial role in cell survival. During stressful conditions, (chemo-/radiotherapy, UV, hypoxia, …), they prevent protein aggregation and block untimely apoptosis. HSPs are more and more described as danger signals. Upon lethal stress, HSPs are secreted in the extracellular medium where they interact with immune cells to signal lethal danger to the organism. Although helpful during infection for example, this process could be deleterious during inflammatory pathologies such as GvHD. Our team is competent in studying the role of HSPs in different physio-pathological contexts. Thus we used an in vivo model that mimic GvHD development to determine the role of HSPs in GvHD. First, we tested HSPs inhibitors in our model. We observed that HSP90 inhibitor, 17AAG (17-allylamino-17-demethoxygeldanamycine) treatment, prevents GvHD development. In fact, upon host-reactive T-cells activation, 17AAG is able to block survival/proliferation pathways through destabilization of crucial kinases, client proteins of HSP90. Secondly, we observed that another HSP, gp96 (glycosylated protein 96) acts as a danger signal during GvHD through interaction with complement C3. Moreover, extracellular gp96 provides allogeneic peptides to macrophages that will present them at their surface for T-cell activation. Those results could lead to new therapeutic strategies for patients undergoing inflammatory disorders such as GvHD or auto-immune diseases.

Die Graft-versus-host-Disease (GvHD) zeichnet sich dadurch aus, dass bei einer Gewebetransplantation (Transplantation des Knochenmarks) die transplantierten Zellen des Donors vom Empfänger abgestoßen werden. In der vorliegenden Arbeit wurde ein möglicher gentherapeutischer Ansatz mittels Nutzung von Oligonukleotiden untersucht. Diese beruhen u.a. auf der Inaktivierung reifer T-Zellen des Spenders, welche Gewebe als fremd erkennen und schwere Entzündungen hervorrufen. Die Aktivierung der T-Zellen erfolgt über die Bindung des CD4-Moleküls und des kostimulatorischen Rezeptors CD28 an den MHCII Komplex von antigen-präsentierenden Zellen des Empfängers. Die Inaktivierung der CD4 und CD28 Gene, und somit die Hemmung der T-Zellaktivität des Spenders, erfolgte durch antisense Oligonukleotide (AONs) und durch small interfering RNAs (siRNA). Zur effizienten und sicheren Einschleusung (Transfektion) der Oligonukleotide in die Zielzellen wurden Nanopartikel verwendet. Die Wirkung wurde zunächst in vitro an murinen und humanen Zellen und anschließend in vivo an einem GvHD-Mausmodell (allogen, transgen) untersucht. In den Mausmodellen wurden weiterhin zwei Applikationsschemata gewählt, zum einen die Behandlung der Spenderzellen ex vivo und zum anderen die direkte i.p.Applikation der Oligonukleotide in die Maus. Die Ergebnisse lassen sich wie folgt zusammenfassen: Eine verminderte Expression der Oberflächenmoleküle CD4 und CD28 erfolgte nach Gabe zweier funktioneller AONs mit muriner Sequenz, in vitro. In murinen Milzzellen ließ sich durch diese beiden funktionellen AONs die Produktion der pro-inflammatorischen Zytokine Interferon γ (IFNγ) und Tumornekrosefaktor α (TNFα) hemmen. Zusätzlich bewirkte der Einsatz eines AON und einer siRNA mit einer funktionellen humanen Sequenz eine Hemmung der CD4 Expression in humanen PBMCs. Insbesondere die kombinierte Behandlung mit a-CD4 und a-CD28 AONs zeigte im murinem allogenen GvHD Modell einen signifikant positiven Effekt auf das Überleben sowie die Krankheitssymptome der Versuchstiere. Der positive Effekt konnte ebenso durch eine Reduktion von pro-inflammatorischen Zytokinen und einer verminderten Expression der Oberflächenmoleküle CD4 und CD28 bestätigt werden. Ähnlich wie das allogene Modell zeigte auch das CD4 transgene Modell positive Effekte hinsichtlich des Überlebens und der Herunterreglierung pro-inflammatorischer Zytokine. Anschließend erfolgten Studien zur Lokalisation (Biodistribution) der Nanopartikel-Nukleinsäure-Komplexe und die Untersuchung der Seren auf allgemeine Leber- und Nieren-toxische Schäden. Sie führten zu folgenden Ergebnissen: Unabhängig von der Applikationsart (i.p. und i.v.) befanden sich nach 24h die Komplexe hauptsächlich in der Lunge. Ebenfalls ließen sich relevante Mengen im Knochenmark und im Dünndarm der transplantierten Tiere nachweisen. Diese beiden Gewebe sind besonders interessant für therapeutische Ansätze zur Behandlung einer aufkommenden GvHD. Unabhängig von der Art der Komplexierung (AON ± PEI) wurde ein Anstieg Anstieg der Aspartat-Aminotransferase (lebertoxischer Parameter) und Glukose beobachtet. Generell scheint die Behandlung der GvHD mittels Oligonukleotide erfolgreich zu sein, neben der geigneten funktionellen Sequenz muss jedoch die chemische Modifikation der Oligonukleotide und die zielgerichtete Biodistribution in vivo evaluiert werden.:Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis ......................................................................................... iii 1 Einleitung ................................................................................................ 1 1.1 Prinzipien der Gentherapie ................................................................. 1 1.1.1 Mechanismen der Gentherapie ....................................................... 2 1.1.2 Methoden des Transfers therapeutischer Nukleinsäuren ................ 8 1.2 Graft-versus-Host-Disease .................................................................. 11 1.2.1 Pathologie ....................................................................................... 11 1.2.2 Klinik und Methoden zur Behandlung der GvHD ............................. 14 1.2.3 GvHD-Modelle ................................................................................. 17 1.3 Zielstellung........................................................................................... 19 2 Material & Methoden ................................................................................ 20 2.1 Design funktioneller Oligonukleotide .................................................... 20 2.2 In vitro Zellkultur .................................................................................. 21 2.2.1 Zelllinien und primäre Immunzellen ................................................. 21 2.2.2 Stimulation und Transfektion ........................................................... 23 2.3 In vivo GvHD Modell ............................................................................ 24 2.3.1 Zeitlicher Ablauf und Durchführung ................................................. 25 2.3.2 Begleitendes klinisches Monitoring & Probenentnahme ................. 29 2.4 Funktionellen Messungen .................................................................... 30 2.4.1 Quantitative mRNA Expression ....................................................... 30 2.4.2 Proliferationstest ............................................................................. 33 2.4.3 Differentialblutbild ............................................................................ 34 2.4.4 Histologie ........................................................................................ 35 2.4.5 Serummessung ............................................................................... 36 2.4.6 Durchflußzytometrie ........................................................................ 37 2.5 Statistik ................................................................................................ 39 3 Ergebnisse ............................................................................................... 40 3.1 Anwendung funktioneller Oligonukleotide in vitro ................................ 40 3.2 Anwendung funktioneller Oligonukleotide in vivo ................................. 49 3.2.1 Indirekte ex vivo Applikation ............................................................ 50 3.2.2 Direkte in vivo Applikation im murinem allogenen Modell ............... 69 3.3 Pharmakologie in vivo applizierter Nukleinsäure-Komplexe ............ 77 3.3.1 Biodistribution .................................................................................. 77 3.3.2 Toxikologie ...................................................................................... 81 4 Diskussion ............................................................................................... 85 4.1 Anwendung funktioneller Oligonukleotide in vitro ................................ 85 ii 4.2 Indirekte ex vivo Applikation zur Prävention der GvHD ....................... 89 4.2.1 allogenes Tiermodell ....................................................................... 89 4.2.2 transgenes Tiermodell ..................................................................... 93 4.3 Therapeutischer anti-GvHD Oligonukleotid-basierter Ansatz (in vivo Applikation) .......................................................................................... 94 4.4 Biodistribution applizierter Oligonukleotide .......................................... 96 4.5 Untersuchung unspezifischer Toxizität nach in vivo Applikation .......... 98 Zusammenfassung der Arbeit ............................................................................. 101 Anhang ................................................................................................................. vii 5 Literaturverzeichnis .................................................................................. xxi 6 Tabellenverzeichnis ................................................................................. xxxiv 7 Abbildungsverzeichnis ............................................................................. xxxiv

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Homeostasis of human T cells is regulated by many factors that control proliferation, differentiation of effector cells and generation of memory. Our current knowledge of the mechanisms controlling human T cell homeostasis in vivo is based on experiments in small animal models. However many differences exist between immune systems of mice and humans, including cell composition, function, and gene expression. Humanized mouse models have shown great value in the study of human immunobiology. I have used novel humanized mouse models to examine the role of human MHC (HLA) and human IL2 in CD8 T cell and CD4 regulatory T cell (Treg) homeostasis. To study human CD8 T cells I engrafted CD8 T cells from healthy donor PBMC into NOD-scid IL2rgnull (NSG) mice that lacked expression of murine MHC and that expressed HLA-A2. My data demonstrate that CD8 T cell survival and effector function required the presence of HLA-A2, helper function from human CD4 T cells and exogenous human IL2. To study human Treg homeostasis I used NSG mice engrafted with human fetal thymus and hematopoietic stem cells (BLT model). NSG-BLT mice support the growth of human thymic tissue and enable the efficient development of HLA-restricted Treg and conventional T cells. Using an AAV vector to express human IL2, I demonstrated that functional human Treg but not conventional T cells increased in number in NSG-BLT mice and that this coincided with increases in activated human NK cells. Overall my research has revealed that HLA and human IL2 have an essential role in human T cell survival and function in vivo.