L'incidence des Lymphomes non-Hodgkiniens a connu un essor fulgurant ces dernières années en dépit d'indiscutables progrès thérapeutiques. Cette progression reste encore inexpliquée et l'identification de facteurs de risque et mécanismes sous-jacents constituent un enjeu majeur de santé publique. Ma thèse s'inscrit dans cette démarche et a visé à mieux comprendre 1) l'étiologie et 2) le développement de ces hémopathies. Les translocations chromosomiques impliquant des loci immuns sont à la fois initiatrices et signatures des hémopathies et peuvent résulter d'un défaut de la recombinaison VDJ à l'exemple de la t(14;18) et t(11;14) dans les lymphomes folliculaire (LF) ou du manteau et t(10;14) dans les leucémies T. Cependant les facteurs à l'origine des cassures oncogéniques restent méconnus et leur exploration a constitué le 1er objectif de ma thèse. Le 2nd axe de ma thèse a porté sur l'étiologie du processus de transformation d'une cellule prétumorale avec comme modèle le LF. La t(14 ;18) est nécessaire mais insuffisante à la pathogenèse du FL et la preuve en est que des cellules t(14;18)+ sont décrites à taux variables (~10-6) dans le sang d'individus sains(IS). Ces cellules "LF-Like" portent un ensemble d'anomalies génomiques typiques du LF pouvant bien représenter des précurseurs du LF à différents stades d'évolution. Leur persistance et évolution clonale chez l'IS suggèrent l'existence de niches prétumorales, possiblement dans les organes lymphoïdes (rate/ganglions/moelle osseuse). Je me suis donc intéressée à l'identification de ces niches prétumorales et à la capacité des "LF-like" à disséminer et acquérir des hits secondaires clé de leur évolution vers le LF / Non Hodgkin Lymphomas have shown an increasing incidence in western countries over the last decades. As etiologic factors still remain elusive, it is clearly of critical importance to better define risk factors and early steps of lymphomagenesis and progression. Chromosomal translocations juxtaposing oncogenes to immune locus thereby deregulating oncogenic expression are hallmarks of lymphoid neoplasms; examples are t(14;18) and t(11;14) in Follicular (FL) and Mantle Cell lymphomas and t(10;14) in T Leukemias. Though it is assumed that the break at the immune locus is due to physiological VDJ recombination, the origin of the break at the oncogene remains unknown. In line with this, my 1st aim was to identify factors involved in the initiation of breaks at the oncogenic locus. My 2nd aim concerned the mechanisms governing evolution of a pre-malignant cell clone into the multiple steps of lymphomagenesis with FL, a B-cell neoplasm as model. T(14;18) translocation is a critical early event in the natural history of FL. However it is now clear that t(14;18) alone is not sufficient and that acquisition of synergistic oncogenic hits are required for malignant transformation. Indeed, it has been reported that t(14;18) cells are present at variable rates in blood of healthy individuals (HI) with yet uncertain significance. We recently demonstrated that in HI t(14;18) cells constitute an expanding population of atypical B-cells displaying geno/phenotypic features of FL suggesting that those cells could be bona-fide FL precursors prone to constitute potent premalignant niches. In the 2nd part of my PhD, I questioned the ability of these so-called "FL-Like" cells to seed pretumoral niches in lymphoid organs (spleen/lymph nodes/bone marrow) and to disseminate and acquire secondary transforming hits as their FL counterparts.

Depuis 2011, des mutations hétérozygotes germinales du gène GATA2 ont été identifiées chez des patients et familles, associées à des maladies hématologiques (myélodysplasie (MDS), leucémie aiguë myéloblastique (LAM)), immunologiques (déficit en cellules B, NK et monocytes (DMLC syndrome)) et vasculaires (syndrome d'Emberger, associant MDS et lymphœdème) 1-3. Le gène GATA2 code pour un facteur de transcription comportant 2 doigts de zinc, essentiel dans la régulation de la prolifération et de la différenciation des cellules progénitrices et des cellules souches hématopoïétiques (CSH). De nombreuses mutations différentes du gène GATA2 ont été identifiées (mutations ponctuelles non-sens ou faux sens, larges délétions, délétions focales d'un enhancer dans l'intron 4) sans claire corrélation entre le génotype et le phénotype. Nous avons d'abord retrouvé, par séquençage des phases codantes (exome) au sein d'une famille de 4 patients suivis à Toulouse, une mutation GATA2 R396Q. Dans un second temps, l'analyse d'une cohorte nationale a permis d'identifier des patients porteurs de mutations GATA2 présentant des phénotypes cliniques de type DMLC, LAM et/ou MDS 4. Actuellement, plus de 80 patients ont été identifiés au niveau national. Au niveau fonctionnel, nous avons initié l'analyse de 2 mutations ayant des conséquences clairement distinctes : la mutation R204X qui conduit à un codon stop dans le domaine précédant le premier doigt de zinc et la mutation ponctuelle R396Q, faux sens, située à la fin du deuxième doigt de zinc. Les modèles de différenciation in vitro en milieu semi-solide à partir de progéniteurs hématopoïétiques transduits par un vecteur rétroviral ont montré que les cellules transduites avec le mutant R396Q restent bloquées à un stade précoce de différenciation granulo-monocytaire, confirmé par l'analyse cytologique (aspect de myéloblastes). Le mutant R204X ne montre aucun effet différentiel en comparaison des cellules transduites par GATA2 sauvage. Le mutant R396Q, à la différence du mutant R204X, peut induire une transformation leucémique des cellules in vitro lors de réensemencements sériels des progéniteurs transduits. Ces cellules peuvent être cultivées indéfiniment en milieu liquide sans cytokines, initiant une lignée leucémique. La localisation cellulaire de ces 2 protéines mutantes est distincte, nucléaire pour le mutant R396Q (identique à la protéine normale) et cytoplasmique pour le mutant R204X par perte probable du signal de localisation nucléaire. L'analyse transcriptomique a retrouvé un ensemble de gènes différentiellement exprimés entre le mutant R396Q et le gène sauvage. Différents modèles animaux sont développés. Deux modèles murins, un de reconstitution hématopoïétique après transduction et un modèle knock-in inductible, sont en cours. La première expérience de reconstitution hématopoïétique n'a pas permis de mettre en évidence de phénotype leucémique après 6 mois de suivi, par probable rétention intramédullaire et différenciation terminale des cellules transduites. Nous avons également initié une collaboration permettant d'analyser l'effet des mutations de GATA2 ou équivalents ontogéniques (serpent, pannier) dans la drosophile. Les protéines GATA sont ainsi très conservées au cours de l'évolution et dans la drosophile, les protéines de la famille GATA ont un rôle essentiel dans la différenciation du système hématopoïétique de cet animal. / Since 2011, heterozygous germline GATA2 mutations have been identified in patients and families associated with hematological (myelodysplasia (MDS), acute myelogenous leukemia (AML)), immunological (B cells, NK cells and monocytes deficiency (DMLC syndrome)) and vascular diseases (Emberger syndrome, combining MDS and lymphedema) 1-3. The GATA2 gene encodes a transcription factor containing two zinc fingers critical for the regulation of the proliferation and differentiation of progenitor and hematopoietic stem cells (HSCs). Many different GATA2 mutations were identified (nonsense or missense point mutations, large deletions, focal deletions of an enhancer in intron 4) without clear correlation between genotype and phenotype. We first identified a R396Q mutation of GATA2 by sequencing the coding frames (exome) of cells in a family of 4 patients followed in Toulouse. Then the analysis of a national cohort identified additional patients carrying GATA2 mutations with various clinical phenotypes such as DMLC, AML and/or MDS 4. Currently, over 80 patients have been identified at the national level. Functionally, we initiated the analysis of 2 specific mutations with very distinct consequences: R204X a mutation leading to a stop codon before the first zinc finger and the R396Q a missense mutation located at the end of the second zinc finger. In vitro differentiation in semi-solid medium of hematopoietic progenitors transduced with a retroviral vector have shown that the cells transduced with the mutant R396Q remain blocked at an early stage of granulo-monocytic differentiation confirmed by cytological analysis (myeloblasts). The R204X mutant shows no differential effect compared to cells transduced with wild type GATA2. The R396Q mutant, unlike the R204X, can induce leukemic transformation of cells in vitro after serial re-seeding of transduced progenitors. These cells may be grown in liquid media without cytokines indefinitely, initiating a leukemia cell line. The cellular localization of these two mutant proteins is distinct, nuclear for the R396Q mutant (identical to the wild type protein) and cytoplasmic for the R204X mutant by probable loss of the nuclear localization signal. Transcriptomic analyses have shown differential gene expression between R396Q mutant and the normal gene. Various animal models are developed. Two mice models, one of hematopoietic reconstitution after retroviral transduction and one inducible knock-in model, are ongoing. The first hematopoietic reconstitution experiment failed to demonstrate leukemic phenotype after 6 months of follow-up, likely by intramedullary retention and terminal differentiation of transduced cells. We have also initiated collaboration to analyze the effect of mutations of GATA2 or equivalent ontogenetic genes (serpent, pannier) in Drosophila. GATA proteins are very well conserved during evolution and in Drosophila, the GATA family proteins have a critical role in the differentiation of the hematopoietic system.

Des mutations acquises du gène TET2 ont été décrites dans les hémopathies malignes humaines. La fréquence de ces anomalies dans les hémopathies myéloïdes est de 10 à 20%, atteignant 50% dans les échantillons de leucémies myélo-monocytaires chroniques (LMMC). Les mutations observées sont inactivatrices, ce qui suggère que TET2 est un gène de type suppresseur de tumeur et que les mutations retrouvées conduisent à une perte de fonction de la protéine. Ce gène code pour une enzyme capable de modifier les cytosines méthylées. Il participerait ainsi au contrôle de la méthylation de l'ADN et donc à la régulation épigénétique de l’expression génique. Afin de mieux comprendre son rôle au cours de l’hématopoïèse, deux modèles murins d'inactivation du gène Tet2 ont été développés. Des expériences de greffe de cellules médullaires dans des souris syngéniques montrent que les cellules déficientes pour ce gène présentent un avantage compétitif par rapport aux cellules sauvages. L’analyse des souris invalidées pour ce gène montre une amplification des populations hématopoïétiques immatures, ainsi que des anomalies de la différenciation des lignages myéloïdes et également des lignages lymphoïdes. Une fraction des souris invalidées pour Tet2 âgées de plus de six mois développe des hémopathies malignes ressemblant à la LMMC humaine. Des anomalies équivalentes sont retrouvées dans les souris hémizygotes pour Tet2 et dans des souris portant un allèle hypomorphe du gène. L’ensemble de ces résultats montre qu’une dérégulation de l'activité de Tet2 conduit à des anomalies précoces de l'hématopoïèse, mais n'entraine pas directement la transformation des cellules progénitrices immatures. La latence du développement de ces tumeurs suggère la nécessité d'une coopération avec d'autres évènements oncogéniques, comme des anomalies d’autres acteurs épigénétiques / Acquired loss-of-function mutations of TET2 gene are frequently observed in patients with myeloid malignancies, including acute myeloblastic leukemia, myeloproliferative neoplasm, myelodysplastic syndrome, and chronic myelomonocytic leukemia (CMML). The Ten-Eleven-Translocation (TET) family proteins are 2-oxoglutarate/Fe(II)-dependent dioxygenases that catalyze the conversion of 5-methyl-cytosine into 5-hydroxymethyl-cytosine, which is proposed to constitute a first step toward cytosine demethylation. To study the function of Tet2 in murine hematopoiesis, we developed two mouse models in which the catalytic domain of the protein is disrupted. In both models, Tet2 deficiency leads to the progressive expansion of the immature hematopoietic compartment that includes stem cell and multipotent progenitors. In addition, both Tet2-deficient animals display abnormalities of erythroid, megakaryocytic, myelo-monocytic and lymphoid lineages, recapitulated in competitive transplantation assays. With age, Tet2-deficient mice develop bona fide myeloid tumors. All these properties were shown to be cell-autonomous by bone marrow cells transplantation and in vitro assays. Together these data suggest that TET2 activity is essential for normal homeostasis of the hematopoietic system. Its inactivation results in the development of hematologic disorders resembling human CMML myeloid disorders. TET2 deficiency endows the cells with a competitive advantage over wild type cells, induces hematopoietic differentiation abnormalities but is not responsible for full cellular transformation. The latency observed for CMML development in mouse models of Tet2 deficiency suggests a requirement for cooperating mutations, such other epigenetic regulator alterations.

Les mécanismes épigénétiques, tels que la méthylation et les modifications d'histones, sont impliqués dans le contrôle à grande échelle de l'expression du génôme et contribuent à la mise en place des profils d'expression des gènes spécifiques de tissus et de types cellulaires. Dans les cellules en cours ou en fin de différenciation, ces mécanismes sont aussi impliqués dans la mise en place et le maintien de la repression d'un grand nombre de gènes. La transformation oncogénique est presque toujours associée à des anomalies de la signalisation épigénétique cellulaire, dont certaines, comme les méthylations aberrantes de gènes suppresseurs de tumeur, sont considérées comme des événements oncogènes. Un aspect beaucoup moins étudié de ces dérégulations épigénétiques est l'activation aberrante de gènes tissu-spécifiques dans des cellules pré-cancéreuses et transformées. De nombreuses études rapportent l'activation « hors contexte » de gènes spécifiques du testicule dans plusieurs cancers somatiques. Ces gènes sont décrits sous le nom de gènes « cancer testis » ou C/T. Il a été suggéré que ces expressions illégitimes pourraient être de bons indicateurs des cancers, et fournir de nouvelles cibles pour une immunothérapie anticancéreuse. Au cours de cette thèse, nous avons développé une approche basée sur ce concept d'activation ectopique de gènes pour identifier les gènes exprimés de manière aberrante dans les lymphoblastes des patients atteints de leucémies lymphoblastiques aigues (LAL). Nous avons ensuite évalué leur intérêt pour une utilisation comme marqueurs pronostics et de prédiction de la réponse au traitement. Nous avons ainsi identifié une signature de huit gènes spécifiques de la lignée germinale / cellules souches embryonnaires, exprimés de manière aberrante dans les LAL pédiatriques et adultes : 4 gènes prédictifs de mauvais pronostic et 4 gènes associés à une issue favorable. Nous avons par la suite montré qu'une combinaison de l'expression de ces 8 gènes peut identifier les formes agressives de LAL chez les enfants ainsi que chez les adultes. Une étude prospective clinique a mis en évidence que notre système de détection des 8 gènes, basé sur un test RT- qPCR, pourrait aider à prédire la réponse précoce à un traitement (induction) dans un groupe de 31 patients adultes nouvellement recrutés, atteints de LAL. Enfin, en exploitant notre méthode de classification, nous avons découvert des traits biologiques communs entre les formes agressives de LAL chez les enfants et chez les adultes. Nos données montrent que les formes les plus agressives de LAL présentent les caractéristiques de cellules souches hématopoïétiques au repos. Cette information pourrait être utilisée pour adapter les approches thérapeutiques. Enfin, en plus de l'amélioration de la détection et du suivi des patients LAL, ce travail a un fort potentiel dans la définition de nouvelles stratégies thérapeutiques ainsi que d'ors et déjà dans les choix thérapeutiques les plus appropriés pour les patients porteurs des formes les plus agressives. / Epigenetic mechanisms such as methylation and histone modifications are involved in large-scale control of the expression of the genome and contribute to the development of specific gene expression profiles of tissues and cell types. In cells, during and after differentiation, these mechanisms are also involved in the establishment and maintenance of the repression of many genes. Oncogenic transformation is almost always associated with abnormalities of cellular epigenetic signalling, some of which, such as aberrant methylation of tumour suppressor genes, are considered as oncogenic events. One much less studied aspect epigenetic deregulations, is the aberrant activation of tissue-specific genes in pre-cancerous and transformed cells. Many studies have reported the “out of context” activation of specific testicular genes in several somatic cancers. These genes are described as the "cancer / testis" genes or C/T. It has been suggested that these illegitimate expressions could be good indicators of cancer and provide new targets for cancer immunotherapy. In this thesis, based on the concept of ectopic activation of genes, we have identified genes aberrantly expressed in lymphoblasts of patients with acute lymphoblastic leukemia (ALL). We have then assessed their potential for a use as markers for prognosis and prediction of treatment response. We have identified a signature of eight genes specific of germline/embryonic stem cells, aberrantly expressed in adult and paediatric ALL. The ectopic activation of four genes was predictive of poor prognosis and the expression of four other genes was associated with a favourable outcome. We have subsequently shown that the combination of the expression of these eight genes can identify aggressive forms of ALL in children and adults. A prospective clinical study showed that a test based on the detection of these 8 genes, by RT- qPCR could help predicting an early response to treatment (induction) in a group of 31 newly recruited ALL adult patients. Finally, using our classification method, we discovered common biological traits between aggressive forms of ALL in children and adults. Our data show that the most aggressive forms of ALL have characteristics of dormant hematopoietic stem cells. This information could be used to refine therapeutic approaches. Finally, in addition to improving the detection and monitoring of ALL patients, this work has great potentials in the definition of new therapeutic strategies as well as in the choice of the most appropriate therapeutic approaches for patients with aggressive forms of ALL.

Les protéines de la famille TET catalysent l'oxydation des 5-méthylcytosines (5mC) en 5-hydroxyméthylcytosines (5hmC) et jouent ainsi un rôle dans la régulation épigénétique de la transcription et dans le processus de déméthylation de l'ADN. Les interactions entre la méthylation de l'ADN et les autres marques épigénétiques sont encore mal connues.Des mutations inactivatrices du gène TET2 ont été décrites dans les hémopathies myéloïdes et lymphoïdes et l'inactivation conditionnelle (cKO) de ce gène évaluée chez la souris a permis d'identifier de multiples anomalies de l'hématopoïèse, ainsi que le développement tardif d'hémopathies myéloïdes. Cette latence importante suggère la nécessité d'évènements oncogéniques coopératifs pour la transformation hématopoïétique. Chez l'Homme, les mutations de TET2 sont observées en association avec de nombreuses autres mutations, et en particulier avec des mutations du gène DNMT3A impliqué dans la méthylation de novo des cytosines de l'ADN, et avec des mutations du gène EZH2 responsable de methylation de la lysine 27 de l'histone H3. Nous avons testé fonctionnellement ces associations en utilisant des modèles murins.L'utilisation d'un modèle de transplantation de moelle osseuse nous a permis d'identifier une coopération de l'inactivation de Tet2 et du mutant DNMT3AR882H dans la transformation des lignées myéloïdes et lymphoïde T, correspondant aux hémopathies humaines porteuses de ces mutations. Dans la transformation lymphoïde, nos données indiquent que la dérégulation de la méthylation entraine une surexpression du gène NOTCH1 et de l'activité de la voie de signalisation correspondante.L'analyse de souris invalidées de manière conditionnelle pour Tet2 et Ezh2 a montré que les souris correspondantes meurent d'aplasie médullaire, dont l'origine est imputée à la disparition de cellules souches hématopoïétiques capables de reconstituer l'hématopoïèse à long terme (LT-HSC). Ezh2 et Tet2 ont donc des rôles primordiaux dans le maintien de l'autorenouvellement des cellules souches hématopoïétiques, dont les mécanismes moléculaires, génétiques et épigénétiques restent à définir. / TET family proteins catalyzing the conversion of 5-methylcytosines (5mC) into 5-hydroxymethylcytosines (5hmC) are crucial for epigenetic regulation of transcription and for DNA demethylation. Interactions between DNA methylation and other epigenetic marks are not fully understood.TET2 inactivating mutations have been identified in both myeloid and lymphoid malignancies. The conditional inactivation (cKO) of this gene in mice highlights pleiotropic hematopoietic abnormalities as well as myeloid transformation at late stages. This latency suggest cooperativity between Tet2 and other oncogenic events during transformation. Human TET2 mutations are frequently found associated with other mutations, and more particularly with mutations in DNMT3A, involved in de novo methylation of cytosines and with mutations in EZH2, responsible for lysine 27 of histone H3 methylation. We decided to functionally assess these mutation associations in mice.Bone marrow transplantation of Tet2 inactivated and DNMT3AR882H mutated cells allowed us to identify myeloid and T-cell transformations, corresponding to human hematological disorders harboring these mutations. Our results on T-cell transformations clearly demonstrate that the deregulation of methylation leads to NOTCH1 overexpression and activation of the corresponding signaling pathway.Analyses of Tet2 and Ezh2 inactivated mice show that these Ezh2 Tet2 mice succumb to bone marrow exhaustion, attributed to long term hematopoietic stem cells (LT-HSC) disappearance. Ezh2 and Tet2 show major roles in LT-HSC maintenance whose molecular, genetic and epigenetic mechanism remains to be investigated.

Les enzymes de la famille Ten-Eleven-Translocation (TET) sont des oxygénases dépendantes du 2-oxoglutarate et du Fe (II) capables d’hydroxyler les cytosines méthylées. La conversion en 5-hydroxyméthylcytosines constituerait une étape vers la déméthylation et les protéines TET seraient donc impliquées dans le contrôle épigénétique de la transcription. Des mutations inactivatrices acquises du gène TET2 ont été décrites dans environ 20% des hémopathies myéloïdes humaines. L'analyse de deux modèles murins d’invalidation de Tet2 montre que Tet2 contrôle l'hydroxyméthylation et l’homéostasie du compartiment hématopoïétique. Son inactivation entraine des anomalies pléiotropiques des stades précoces et tardifs de l’hématopoïèse et le développement d'hémopathies myéloïdes. L'étude du statut de TET2 chez une grande série de patients porteurs d'hémopathies lymphoïdes matures retrouve des mutations de ce gène chez 12% des cas de lymphomes T. Celles-ci sont significativement associées aux mutations du gène DNMT3A et sont plus fréquemment observées au sein de deux sous-types, le lymphome T angio-immunoblastique et le lymphome T périphérique non spécifié. L’analyse de populations triées montre la préexistence des mutations de TET2 ou de DNMT3A dans les progéniteurs hématopoïétiques chez certains patients.En conclusion, les mutations de TET2 peuvent survenir dans des progéniteurs précoces, leur conférer un avantage sélectif par rapport aux progéniteurs sauvages et conduire au développement d’une hématopoïèse clonale. Des anomalies génétiques additionnelles semblent nécessaires à la transformation tumorale aussi bien myéloïde que lymphoïde. Ces deux types d’hémopathies pourraient donc se développer à partir d’une même atteinte du compartiment des cellules souches hématopoïétiques. / The Ten-Eleven-Translocation (TET) enzymes belong to a family of oxygenases that are dependent on 2-oxoglutarate and Fe (II) and are able to oxidize methylcytosines. This may represent a step toward DNA demethylation and as such these proteins are involved in the epigenetic control of transcription. Acquired TET2 loss-of-function mutations have been reported in about 20% of human myeloid malignancies.Analysis of two Tet2-deficiency mouse models shows that Tet2 controls hydroxymethylation and homeostasis in the hematopoietic compartment. Tet2 deficiency results in pleiotropic abnormalities of both early and late steps of hematopoiesis and leads to the development of myeloid disorders. The sequencing of TET2 in a large series of patients with mature lymphoproliferations identifies TET2 mutations in 12% of T-cell lymphoma. They are significantly associated with DNMT3A mutations and are more frequently observed in two subtypes, the angioimmunoblastic T-cell lymphoma and the peripheral T-cell lymphoma, not other specified. Analysis of flow-sorted populations shows the presence of TET2 and DNMT3A alterations in hematopoietic progenitors in some patients. In summary, TET2 mutations may affect early progenitors, confer a selective advantage compared with controls progenitors and result in a clonal hematopoiesis. Some additional genetic events are likely required to the myeloid or lymphoid transformation. Both diseases could therefore arise from a common alteration of the hematopoietic stem cell compartment.

Les enzymes de la famille Ten-Eleven-Translocation (TET) sont des oxygénases dépendantes du 2-oxoglutarate et du Fe (II) capables d'hydroxyler les cytosines méthylées. La conversion en 5-hydroxyméthylcytosines constituerait une étape vers la déméthylation et les protéines TET seraient donc impliquées dans le contrôle épigénétique de la transcription. Des mutations inactivatrices acquises du gène TET2 ont été décrites dans environ 20% des hémopathies myéloïdes humaines. L'analyse de deux modèles murins d'invalidation de Tet2 montre que Tet2 contrôle l'hydroxyméthylation et l'homéostasie du compartiment hématopoïétique. Son inactivation entraine des anomalies pléiotropiques des stades précoces et tardifs de l'hématopoïèse et le développement d'hémopathies myéloïdes. L'étude du statut de TET2 chez une grande série de patients porteurs d'hémopathies lymphoïdes matures retrouve des mutations de ce gène chez 12% des cas de lymphomes T. Celles-ci sont significativement associées aux mutations du gène DNMT3A et sont plus fréquemment observées au sein de deux sous-types, le lymphome T angio-immunoblastique et le lymphome T périphérique non spécifié. L'analyse de populations triées montre la préexistence des mutations de TET2 ou de DNMT3A dans les progéniteurs hématopoïétiques chez certains patients.En conclusion, les mutations de TET2 peuvent survenir dans des progéniteurs précoces, leur conférer un avantage sélectif par rapport aux progéniteurs sauvages et conduire au développement d'une hématopoïèse clonale. Des anomalies génétiques additionnelles semblent nécessaires à la transformation tumorale aussi bien myéloïde que lymphoïde. Ces deux types d'hémopathies pourraient donc se développer à partir d'une même atteinte du compartiment des cellules souches hématopoïétiques.

Des mutations acquises du gène TET2 ont été décrites dans les hémopathies malignes humaines. La fréquence de ces anomalies dans les hémopathies myéloïdes est de 10 à 20%, atteignant 50% dans les échantillons de leucémies myélo-monocytaires chroniques (LMMC). Les mutations observées sont inactivatrices, ce qui suggère que TET2 est un gène de type suppresseur de tumeur et que les mutations retrouvées conduisent à une perte de fonction de la protéine. Ce gène code pour une enzyme capable de modifier les cytosines méthylées. Il participerait ainsi au contrôle de la méthylation de l'ADN et donc à la régulation épigénétique de l'expression génique. Afin de mieux comprendre son rôle au cours de l'hématopoïèse, deux modèles murins d'inactivation du gène Tet2 ont été développés. Des expériences de greffe de cellules médullaires dans des souris syngéniques montrent que les cellules déficientes pour ce gène présentent un avantage compétitif par rapport aux cellules sauvages. L'analyse des souris invalidées pour ce gène montre une amplification des populations hématopoïétiques immatures, ainsi que des anomalies de la différenciation des lignages myéloïdes et également des lignages lymphoïdes. Une fraction des souris invalidées pour Tet2 âgées de plus de six mois développe des hémopathies malignes ressemblant à la LMMC humaine. Des anomalies équivalentes sont retrouvées dans les souris hémizygotes pour Tet2 et dans des souris portant un allèle hypomorphe du gène. L'ensemble de ces résultats montre qu'une dérégulation de l'activité de Tet2 conduit à des anomalies précoces de l'hématopoïèse, mais n'entraine pas directement la transformation des cellules progénitrices immatures. La latence du développement de ces tumeurs suggère la nécessité d'une coopération avec d'autres évènements oncogéniques, comme des anomalies d'autres acteurs épigénétiques

Résumé : Cette thèse porte sur le rôle de deux expositions environnementales encore peu étudiées et pouvant influer sur l’incidence des hémopathies malignes (HME) de l’enfant : les rayons ultraviolets (UV) et les pesticides liés aux activités agricoles.Les leucémies (LA) et lymphomes de l’enfant sont les deux types principaux de HME et représentent respectivement environ 470 et 200 nouveaux cas par an en France. Leur prise en charge thérapeutique et leur survie ont fait d’immenses progrès, cependant la connaissance de leurs facteurs de risque est encore très partielle.Les études sur les effets des UV dans les cancers de l’enfant sont peu développées. Plusieurs méta-analyses récentes concluent à une augmentation du risque de LA chez l’enfant lors d’une exposition professionnelle ou domestique de la mère aux pesticides pendant la grossesse. L’exposition aux pesticides d’origine agricole a été moins étudiée, et les résultats sont hétérogènes.La première partie, écologique, de ce travail s’intéresse à l’exposition résidentielle aux UV. Une étude a été réalisée à partir des observations du Registre National des Hémopathies malignes de l’Enfant (RNHE) faites sur une longue période, entre 1990-2009 et sur l’ensemble de la France métropolitaine (9 082 cas de LA et 3 563 cas de lymphomes). Les données de l’exposition aux UV résidentiels étaient issues de la base EUROSUN. Une moyenne quotidienne d’exposition aux UV résidentiels sur l’ensemble de la période 1988-2007 à l’échelle communale a été considérée. Une augmentation significative de l’incidence des leucémies aiguës lymphoblastiques à précurseurs B (LAL-Pré B) chez les moins de 5 ans a été observée avec l’exposition aux UV résidentiels au moment du diagnostic. L’association n’était pas modifiée après une stratification par périodes ; par tranches d’unités urbaines ; par grandes régions, et par un indice de défaveur français. Une deuxième étude, individuelle, sur les UV ne trouvait pas de modification de l’association en prenant en compte le rôle de facteurs individuels soupçonnés d’être associés aux LAL et en regardant l’exposition à la naissance. Les données individuelles de ces facteurs provenaient de deux études cas-témoins en population générale, l’enquête ESCALE (2003-2004) et l’enquête ESTELLE (2010-2011).La dernière partie de la thèse se penche sur l’exposition résidentielle aux pesticides liés aux activités agricoles. Cette étude s’appuie sur les données du RNHE, recueillant 10 994 cas de LA et 4 301 cas de lymphomes sur la période 1990-2013. L’intensité de l’activité agricole dans le canton de résidence au moment du diagnostic a été choisie comme proxy de l’exposition aux pesticides. Cette intensité a été à partir des données cantonales du Recensement général Agricole de 2000. Dans cette première approche aucune association n’a été mise en évidence entre les HME et la part de Surface Agricole Utile (SAU) totale. Les analyses par grands types de cultures montrent, dans cette première approche, une association positive et significative entre l’intensité de cultures en oléagineux et l’incidence des LAL Pré-B et des lymphomes de Burkitt. Des analyses de sensibilité montraient des résultats hétérogènes par période d’étude. / Abstract: This thesis deals with the role of two environmental exposures not much studied and that could have an impact on the incidence of childhood hematological malignancies (CHM): ultraviolet radiation (UV) and agricultural pesticides.The two major diagnostic groups are acute leukemia (AL) and lymphomas and represent respectively around 470 and 200 new cases per year in France. Despite the progress made in improving therapeutic caring and survival, the etiology of these cancers remains largely unknown.There are very few studies on the association between UV and these cancers. Meta-analyses found a coherent association between childhood AL and parental professional or domestic pesticides exposure during pregnancy. However the association with residential exposure to agricultural pesticides has been less studied and results are heterogeneous.The first, ecological, part of the thesis addressed the associations between residential UV exposure at diagnosis and the incidence of types and subtypes of CHM in France. The 9,082 cases of acute leukemia (AL) and 3,563 cases of lymphoma diagnosed before the age of 15 years from 1990 to 2009 were provided by the French National Registry of Childhood Hematological Malignancies. UV data from 1988 to 2007 were extracted from the EUROSUN database. The annual daily average UV exposure of the children estimated at the municipalities of residence was considered. There was a significant increase in precursor B-cell acute lymphoblastic leukemia (PBC-ALL) in children aged less than 5 years with residential exposure to UV. The results remained stable in analyses stratifying by deprivation index or degree of urbanization of the municipalities.A second, individual, study found no change in the association between UV and PBC-ALL after taking into account the influence of suspected individual risk factors for ALL, and evaluated this association at birth. Individual data were collected by interviews in the ESCALE (2003-2004) and ESTELLE (2010-2011) nationwide case-control studies.The last part of this work focused on the residential exposure to agricultural pesticides. The 10,994 cases of AL and the 4,301 cases of lymphomas diagnosed among children less than 15 years old were obtained from the French National Registry of Childhood Hematological Malignancies over the period 1990-2013. Intensity of agricultural activities by Canton was used as a proxy of residential agricultural pesticides exposure. This proxy was estimated from the 2000 French agricultural census data. At this first step of the analysis, no associations were found between total agricultural area and incidence of CHM. Analyses by types of crops showed, at this first step, a significant association between oilseeds and PBC-ALL and Burkitt lymphoma. Sensitivity analyses evidenced heterogeneous results by time period.

La protéine p53 (« Gardien du génome ») doit être altérée pour que le cancer puisse se développer. Les nombreuses thérapies anti-cancéreuses disponibles sont très efficaces mais la réponse clinique est souvent transitoire et les cancers disséminés rechutent ou progressent du fait de l'évolution de sous-populations cancéreuses résistantes au traitement, impliquant souvent TP53 qui est le gène le plus muté dans les formes agressives de nombreux cancers. Nous l’avons étudié dans la leucémie lymphoïde chronique (LLC) et les syndromes myélodysplasiques avec délétion 5q (SMD del(5q)). Grâce à l’étude rétrospective longitudinale de 40 patients atteints de SMD del(5q), nous avons généré des données de NGS ciblé et montré que le statut mutationnel de TP53 au diagnostic ne permettait pas de prédire la progression tumorale, contrairement à ce qui avait été publié précédemment (Jädersten et al., JCO 2011). Nous avons montré que c’était l’évolution clonale du gène TP53 qui était l’élément clé de la progression des SMD del(5q). Nous avons observé de nombreuses émergences de clones mutés entre le stade diagnostique et un stade ultérieur de la maladie, toujours après initiation du traitement par lénalidomide.Le lénalidomide a été approuvé comme nouveau traitement spécifique et très efficace contre l’anémie liée aux SMD del(5q), permettant à la plupart des patients d’être indépendants des transfusions sanguines. Le lénalidomide permet souvent d’éradiquer le clone tumoral porteur de l’anomalie génétique del(5q) isolée, induisant une rémission clinique. Malheureusement, cette rémission est courte avec une durée médiane de 2 ans, puis, dans environ 1 cas sur 2, survient une transformation en leucémie aiguë secondaire de pronostic péjoratif.Nous avons étudié un possible lien entre le traitement par lénalidomide et l’évolution clonale de TP53 par annotation clinico-bio-thérapeutiques des résultats de séquençage de TP53 chez les 24 patients dont les échantillons séquentiels avaient été analysés. Dans notre étude, les patients avec progression tumorale (dont 10 évolutions clonales de TP53 et 1 évolution clonale de RUNX1) avaient reçu une dose cumulée de lénalidomide supérieure à celle reçue par les patients dont la tumeur était restée stable (p = 0.036). Nous avons observé chez plusieurs patients que l’éradication de la tumeur n’était pas utile à l’amélioration de la qualité de vie des patients. La non-éradication semblait même permettre un maintien de l’équilibre clonal et une compétition entre les différents sous-clones de la tumeur, résistants ou non au lénalidomide.Nous discutons de l’évolution de l'écologie de la tumeur au cours du traitement, i.e., l’évolution de ses interactions avec son micro-environnement qui se modifie après chaque nouvelle dose de traitement. Un modèle évolutif dit théorie de la thérapie adaptative, développée récemment remet en question les protocoles conventionnels de thérapie anti-cancéreuse qui préconisent souvent d'administrer la dose maximale tolérée par le patient (Gatenby, 2009). Elle suggère que la dose minimale efficace présenterait l’avantage de ne pas éradiquer les cellules cancéreuses sensibles au traitement pour qu'elles restent en compétition avec les cellules cancéreuses résistantes et limiter la progression ou la rechute. Nous suggérons de prendre en compte également la diminution des effets indésirables pour le patient, améliorant ainsi sa qualité de vie, et enfin la diminution des dépenses de santé pour la collectivité. A ce jour, peu d’études cliniques évaluent l’intérêt de l’adoption de tels protocoles de thérapie adaptative.Néanmoins, des modèles in vivo (xénogreffes) et in silico (modèles statistiques) ont permis d’analyser la dynamique évolutive des populations tumorales en fonction du traitement reçu. Ces modèles prédisent que la survie de l’hôte peut être maximisée par la mise en place d’une thérapie adaptative. / P53 protein is named «guardian of the genome » because it must be altered to let cancer grow.TP53 is the most mutated gene in agressive cancers.Numerous systemic therapies are successful for treatment of disseminated cancers. However, clinical response is often transient, and cancer undergo relapse or progression due to emergence of resistant populations. These latter often harbour TP53 mutations. We studied TP53 in chronic lymphoid leukemia (CLL) and lower-risk myelodysplastic syndroms with del(5q), MDS del(5q). We conducted a retrospective longitudinal study in 40 patients suffering from MDS del(5q). We obtained targeted NGS data showing that TP53 mutational status at diagnosis could not predict tumor progression, by contrast with previously published data (Jädersten et al., JCO 2011). We show that TP53 clonal evolution is the key feature of tumor progression in MDS del(5q). We observed numerous mutated sub-clones emerging between diagnosis and follow-up. In our study, this emergence always followed onset of lenalidomide treatment. Lenalidomide was recently approved as a new therapy specifically improving anemia in patients with MDS del(5q). It allows most patients to become red-blood-cells-transfusion independent. Lenalidomide often eradicates the major tumor clone harbouring the isolated genetic abnormality deletion (5q) and allows clinical remission. Unfortunately, this remission is short (median, 2 years) and is followed, in 1 case out of 2, by a secondary acute leukemic transformation with a very poor prognosis.We studied the issue of a possible link between lenalidomide therapy and TP53 clonal evolution by annotating TP53 sequencing results with acute biological, clinical and therapeutic features in the 24 patients with sequential samples analyzed. In our study, patients with tumor progression (10 TP53 clonal evolution and 1 RUNX1 clonal evolution) were given a higher cumulative dose of lenalidomide compared to patients with stable disease (p = 0.036). Similarly to « adaptive therapy theory »(Gatenby 2009), we observed that eradication of the tumor wasn’t useful for improvement of quality of life. Absence of eradication might even allow to maintain a clonal equilibrium and a clonal competition between the distinct tumor sub-clones, resistant to lenalidomide or not, and therefore maintain stable disease.This theory of adaptive therapy questions the classical protocols of treatments against cancer, in which the maximal tolerated dose is preferred to the minimal effective dose. The latter might however slow down cancer progression or cancer relapse, with decreased side effects in patients, and decreased health costs.To date, few clinical trials (if any) questions such protocols of adaptive therapy. However, in vivo experiments (xenografts) and in silico statistical models allowed to study evolutionary dynamics of tumor sub-populations with and without therapy.The models predict that host survival can be maximized if “treatment-for-cure strategy” is replaced by “treatment-for-stability.” Specifically, the models predict that an optimal treatment strategy will modulate therapy to maintain a stable population of chemosensitive cells that can, in turn, suppress the growth of resistant populations under normal tumor conditions, Dr Gatenby said.