L’infection par HIV-1 représente un des problèmes de santé publique majeurs de notre société actuelle. Le traitement HAART (Highly Active AntiRetroviral Therapy) inhibe le cycle réplicatif viral mais ne permet pas l’éradication du HIV-1. La principale cause de cet échec thérapeutique est la persistance de réservoirs cellulaires infectés de manière latente par HIV-1, qui, lors de l’arrêt du traitement HAART, sont à l’origine d’un rebond de la charge plasmatique virale. Le défi actuel est donc de découvrir de nouvelles méthodes d’élimination des cellules réservoirs. Une des stratégies envisagées est de forcer l’expression virale dans les cellules infectées de manière latente afin d’entraîner leur destruction suite à leur détection par le système immunitaire ou suite aux effets cytopathiques viraux. Parallèlement, le traitement HAART serait maintenu afin de limiter la propagation des virions néo-synthétisés. Plusieurs éléments sont impliqués dans la répression transcriptionnelle associée à la latence post-intégrationnelle du virus HIV-1 : la nature du site d’intégration ; l’absence de facteurs cellulaires inductibles tels que NF-κB ; la structure chromatinienne du provirus et les modifications post-traductionnelles des histones ; l’absence de niveaux suffisants de la protéine trans-activatrice Tat. De plus, notre laboratoire a précédemment mis en évidence un lien entre deux de ces éléments, en démontrant, dans une lignée modèle de latence post-intégrationnelle, que la cytokine pro-inflammatoire TNFα, un activateur de la voie de signalisation NF-κB, permet une réactivation synergique de l’expression virale combinée à l’inhibiteur d’histone-désacétylases (HDACI) TSA. Cependant, l’utilisation thérapeutique du TNFα et de la TSA est inenvisageable en raison de leurs toxicités. Au cours de notre thèse, nous avons montré que la prostratine, un ester de phorbol non-tumorigène qui active la cascade NF-κB, combinée à des HDACIs déjà utilisés en thérapie humaine, réactive en synergie l’expression virale dans des cellules modèles de latence post-intégrationnelle (U1, J-Lat 8.4 et 15.4). Nous avons également constaté que des cellules dont l’expression virale n’est pas réactivée par un traitement individuel (prostratine ou HDACIs) peuvent être réactivées par la combinaison prostratine+HDACI. Au niveau moléculaire, nous avons montré que le VPA intensifie la cascade NF-κB induite par la prostratine, et permet, combiné à cette dernière, un remodelage plus efficace du nucléosome répresseur nuc-1 et une activation synergique de la transcription. Nous avons testé les combinaisons prostratine+HDACIs sur des cultures ex vivo de PBMCs (Peripheral Blood Mononuclear Cells) provenant de patients HIV-1+ avirémiques et traités par la HAART. Les combinaisons prostratine+HDACIs réactivent l’expression virale de 25/42 cultures de PBMCs testées avec une réactivation synergique dans 17/25 cas. De plus, la combinaison prostratine+SAHA réactive l’expression virale de 7/9 cultures testées de lymphocytes T CD4+ HLA DR-. Cette étude suggère que des traitements combinant deux types différents d’activateurs de l’expression du HIV-1 pourraient être utilisés comme adjuvant de la thérapie HAART afin d’accélérer la purge des réservoirs cellulaires infectés de manière latente.

Although curable in the majority of cases, Diffuse Large B-cell Lymphoma (DLBCL), the most prevalent Non-Hodgkin Lymphoma (NHL) throughout the world, is still fatal for 30-40% patients. This patient population could benefit from the addition of new drugs to the current DLBCL chemotherapy regimen. Histone deacetylase inhibitors (HDIs) are a promising group of drugs for the treatment of hematological malignancies. In the current study we tested the HDI PXD101 in a panel of the two most common DLBCL subtypes, GCB (germinal center) and ABC (activated B-cell like), ABC being the least curable subtype. Cell viability assays showed that PXD101 induces antiproliferative effects at submicromolar concentrations in DLBCL cell lines regardless of DLBCL subtype. Flow cytometry demonstrated that upon PXD101 treatment two GCB cell lines (DB and OCILY19) undergo G2M cell cycle arrest followed by apoptosis, while two GCB (SUDHL4 and SUDHL8) and one ABC (U2932) cell line undergo G1 arrest with little apoptosis. Further experiments demonstrated that upon PXD101 removal G1-arresting cells recover their normal proliferative state, while in G2M-arresting cells only 8h exposure to PXD101 is sufficient to induce considerable apoptosis. We classified as PXD101-resistant cell lines that re-enter the cell cycle after drug removal, and PXD101-sensitive cell lines that commit to apoptosis after short periods of drug exposure. Kinase assays established that upon PXD101 treatment G1 phase cyclin dependent kinase 2 (CDK2)-cyclin E complex activity significantly decreases in resistant but not in sensitive cells lines. Furthermore, pull-down assays revealed that CDK inhibitors (CDKIs) p21 and/or p27 in resistant, but not sensitive cell lines persistently bind the CDK2-cyclin E complex throughout PXD101 treatment, thereby explaining why resistant lines stop at the G1 phase. CDKIs induction by PXD101 was p53-independent. This is the first time that an in vitro model of sensitivity and resistance to HDIs in DLBCL is established. We have also performed preliminary genomic and proteomic analysis in DLBCL cell lines treated with PXD101. We anticipate that further analysis of the genomic response and the functional impact of protein acetylation induced by HDIs will offer additional insight into mechanisms of sensitivity and resistance to HDIs in DLBCL.

Les mécanismes épigénétiques, tels que la méthylation et les modifications d'histones, sont impliqués dans le contrôle à grande échelle de l'expression du génôme et contribuent à la mise en place des profils d'expression des gènes spécifiques de tissus et de types cellulaires. Dans les cellules en cours ou en fin de différenciation, ces mécanismes sont aussi impliqués dans la mise en place et le maintien de la repression d'un grand nombre de gènes. La transformation oncogénique est presque toujours associée à des anomalies de la signalisation épigénétique cellulaire, dont certaines, comme les méthylations aberrantes de gènes suppresseurs de tumeur, sont considérées comme des événements oncogènes. Un aspect beaucoup moins étudié de ces dérégulations épigénétiques est l'activation aberrante de gènes tissu-spécifiques dans des cellules pré-cancéreuses et transformées. De nombreuses études rapportent l'activation « hors contexte » de gènes spécifiques du testicule dans plusieurs cancers somatiques. Ces gènes sont décrits sous le nom de gènes « cancer testis » ou C/T. Il a été suggéré que ces expressions illégitimes pourraient être de bons indicateurs des cancers, et fournir de nouvelles cibles pour une immunothérapie anticancéreuse. Au cours de cette thèse, nous avons développé une approche basée sur ce concept d'activation ectopique de gènes pour identifier les gènes exprimés de manière aberrante dans les lymphoblastes des patients atteints de leucémies lymphoblastiques aigues (LAL). Nous avons ensuite évalué leur intérêt pour une utilisation comme marqueurs pronostics et de prédiction de la réponse au traitement. Nous avons ainsi identifié une signature de huit gènes spécifiques de la lignée germinale / cellules souches embryonnaires, exprimés de manière aberrante dans les LAL pédiatriques et adultes : 4 gènes prédictifs de mauvais pronostic et 4 gènes associés à une issue favorable. Nous avons par la suite montré qu'une combinaison de l'expression de ces 8 gènes peut identifier les formes agressives de LAL chez les enfants ainsi que chez les adultes. Une étude prospective clinique a mis en évidence que notre système de détection des 8 gènes, basé sur un test RT- qPCR, pourrait aider à prédire la réponse précoce à un traitement (induction) dans un groupe de 31 patients adultes nouvellement recrutés, atteints de LAL. Enfin, en exploitant notre méthode de classification, nous avons découvert des traits biologiques communs entre les formes agressives de LAL chez les enfants et chez les adultes. Nos données montrent que les formes les plus agressives de LAL présentent les caractéristiques de cellules souches hématopoïétiques au repos. Cette information pourrait être utilisée pour adapter les approches thérapeutiques. Enfin, en plus de l'amélioration de la détection et du suivi des patients LAL, ce travail a un fort potentiel dans la définition de nouvelles stratégies thérapeutiques ainsi que d'ors et déjà dans les choix thérapeutiques les plus appropriés pour les patients porteurs des formes les plus agressives. / Epigenetic mechanisms such as methylation and histone modifications are involved in large-scale control of the expression of the genome and contribute to the development of specific gene expression profiles of tissues and cell types. In cells, during and after differentiation, these mechanisms are also involved in the establishment and maintenance of the repression of many genes. Oncogenic transformation is almost always associated with abnormalities of cellular epigenetic signalling, some of which, such as aberrant methylation of tumour suppressor genes, are considered as oncogenic events. One much less studied aspect epigenetic deregulations, is the aberrant activation of tissue-specific genes in pre-cancerous and transformed cells. Many studies have reported the “out of context” activation of specific testicular genes in several somatic cancers. These genes are described as the "cancer / testis" genes or C/T. It has been suggested that these illegitimate expressions could be good indicators of cancer and provide new targets for cancer immunotherapy. In this thesis, based on the concept of ectopic activation of genes, we have identified genes aberrantly expressed in lymphoblasts of patients with acute lymphoblastic leukemia (ALL). We have then assessed their potential for a use as markers for prognosis and prediction of treatment response. We have identified a signature of eight genes specific of germline/embryonic stem cells, aberrantly expressed in adult and paediatric ALL. The ectopic activation of four genes was predictive of poor prognosis and the expression of four other genes was associated with a favourable outcome. We have subsequently shown that the combination of the expression of these eight genes can identify aggressive forms of ALL in children and adults. A prospective clinical study showed that a test based on the detection of these 8 genes, by RT- qPCR could help predicting an early response to treatment (induction) in a group of 31 newly recruited ALL adult patients. Finally, using our classification method, we discovered common biological traits between aggressive forms of ALL in children and adults. Our data show that the most aggressive forms of ALL have characteristics of dormant hematopoietic stem cells. This information could be used to refine therapeutic approaches. Finally, in addition to improving the detection and monitoring of ALL patients, this work has great potentials in the definition of new therapeutic strategies as well as in the choice of the most appropriate therapeutic approaches for patients with aggressive forms of ALL.

Le réchauffement climatique a des effets importants et coûteux sur le climat et la production agricole. Étant sessiles, les plantes ont développé des mécanismes complexes pour percevoir les variations de température et y répondre, ainsi que pour afficher des changements spécifiques dans leur morphologie ou leur développement. Cependant, on sait peu de choses sur le mécanisme de reprogrammation de l'expression génique de la chromatine lors de la réponse de la plante à une température ambiante élevée. Les enzymes de modification de la chromatine nécessitent des produits de métabolisme intermédiaire en tant que substrats ou cofacteurs. Par exemple, les histone acétyltransférases utilisent l’acétyl-CoA en tant que donneur pour l’acétylation de la lysine et les histones déméthylases nécessitent l’a-cétoglutarate (α-KG) en tant que cofacteur. Chez les plantes, l'acétyl-CoA cytosolique est produite par l'ATP-citrate lyase (ACL) et l'α-KG est produite par les isocitrate déshydrogénases (ICDH) par différentes voies métaboliques. Cependant, il reste à déterminer si les fluctuations métaboliques affectent l'activité des enzymes de modification de l'histone et régulent l'expression des gènes lorsque la température ambiante est élevée. Dans ma thèse, j'ai contribué à analyser le rôle des histone désacétylases HDA9, HDA15 et HDA19 d'Arabidopsis dans la réponse thermique des plantes et j'ai étudié l'effet des niveaux d'acétyl-CoA sur l'état d'acétylation des histones chez Arabidopsis et le rôle de la fluctuation de l'α-KG dans le contrôle Activité de la déméthylase JmjC et croissance de la plante et expression génique à température chaude. Dans la première partie de l’étude, des analyses génétiques et moléculaires ont montré que HDA9, HDA15 et HDA19 s’adressent à différents ensembles de gènes et jouent des rôles distincts dans la réponse à la chaleur. D'autre part, nous avons constaté que lorsque le ACL était surexprimé chez les mutants gcn5, le niveau de H3K27ac était augmenté. De plus, la surexpression des ACL complétait partiellement les phénotypes gcn5. Les résultats ont démontré un lien intrinsèque entre les fluctuations de l'acétyl-CoA et les niveaux d'acétylation de l'histone H3K27 chez les plantes. Dans la deuxième partie de ma thèse, nous avons montré que la perte d’ICDH cytosolique entraînait une augmentation des niveaux de H3K4me3 et une augmentation des phénotypes mutants du gène de la déméthylase H3K4me3, JMJ14. Les analyses génétiques ont suggéré que JMJ14 et JMJ15 (une autre déméthylase H3K4me3) fonctionnaient de manière redondante pour réguler l’expression et la croissance de gènes sensibles à la chaleur des plantes et indiquaient que la mutation de cICDH affectait principalement la fonction de JMJ15. Une analyse pangénomique a révélé le rôle essentiel de JMJ14 dans l'établissement de programmes d'activation et de répression géniques de la thermomorphogenèse des plantes. JMJ14 et JMJ15 ont directement réprimé un ensemble de gènes susceptibles de jouer un rôle négatif dans le processus. Les résultats ont montré que la fluctuation des taux de métabolites régulait l'activité de l'histone déméthylase et la réponse des plantes à la chaleur. Pris ensemble, les résultats mettent en évidence l'interaction entre le métabolisme, l'épigénétique et l'adaptation des plantes au changement de l'environnement ambiant. / Global warming is having significant and costly effects on the climate and agricultural production. Being sessile, plants have evolved complex mechanisms to perceive and respond to temperature variation and display specific changes in their morphology or development. However, little is known on the chromatin mechanism of gene expression reprogramming during plant response to elevated ambient temperature. Chromatin modification enzymes require intermediary metabolism products as substrates or cofactors. For example, histone acetyltransferases use acetyl-CoA as a donor for lysine acetylation and histone demethylases require α-ketoglutarate (α-KG) as a cofactor. In plants, cytosolic acetyl-CoA is produced by ATP-citrate lyase (ACL) and α-KG is produced by isocitrate dehydrogenases (ICDH) in different metabolic pathways. However, it remains unclear whether metabolic fluctuation affects the activity of histone modification enzymes and regulates gene expression under elevated ambient temperature. In my thesis, I contributed to analyze the roles of Arabidopsis histone deacetylases HDA9, HDA15, and HDA19 in plant thermal response and I studied the effect of acetyl-CoA levels on histone acetylation status in Arabidopsis and the role of α-KG fluctuation in controlling JmjC demethylase activity and plant growth and gene expression under warm temperature. In the first part of the study, genetic and molecular analysis showed that HDA9, HDA15, and HDA19 target to different sets of genes and play distinct roles in responding to warm temperature. On the other hand, we found that when overexpressed ACL in gcn5 mutants, the H3K27ac level was increased. Additionally, ACL overexpression partially complemented the gcn5 phenotypes. The results demonstrated an intrinsic link between acetyl-CoA fluctuation and histone H3K27 acetylation levels in plants. In the second part of my thesis, we showed that loss of cytosolic ICDH resulted in increased H3K4me3 levels and enhanced mutant phenotypes of the H3K4me3 demethylase gene JMJ14. Genetic analysis suggested that JMJ14 and JMJ15 (another H3K4me3 demethylase) functioned redundantly to regulate plant thermal responsive gene expression and growth and indicated the cICDH mutation mainly affected JMJ15 function. Genome-wide analysis revealed an essential role of JMJ14 in establishing both gene activation and repression programs of plant thermomorphogenesis. JMJ14 and JMJ15 directly repressed a set of genes that are likely to play a negative role in the process. The results provided evidence that the fluctuation of metabolites levels regulates histone demethylase activity and plant response to warm temperature. Taken together, the results highlight the interplay between metabolism, epigenetics and plant adaptation to changing the ambient environment.

L'acétylation/désacétylation des histones joue un rôle important dans la régulation de divers processus du développement des plantes et de leur réponse au stress. Par contre, la régulation de l’activité des histone-desacétylases (HDAC) par des signaux cellulaires et la relation fonctionnelle entre les différentes HDAC au cours de la réponse au stress oxydatif et d'une élévation de la température ambiante restent encore mal connus. Mon travail de thèse a comporté : 1) l’analyse de la modification post-traductionnelle de la protéine HDA19, régulée par redox et celle des conséquences sur la régulation de l’expression de gènes et la réponse à l’acide salicylique (SA) ; 2) l'étude fonctionelle de HDA9, HDA15 et HDA19 dans la réponse à une élévation de la température ambiante. Dans la première partie, nous montrons que le changement redox induit par SA régule l’accumulation nucléaire de la protéine HDA19 via une S-nitrosylation réversible. Le traitement à SA, ou au donneur physiologique d’oxyde nitrique, S-nitrosoglutathione, augmente les marques d'acétylation des histones d'HDA19 dans des plantules d’Arabidopsis. Des lignées mutantes d’hda19 présentent un état plus oxydé avec une augmentation de l’expression de gènes associés au ROS/RNS, ainsi qu'une accumulation de nicotinamide adénine dinucléotide et de glutathionne. Ces résultats suggèrent que SA induit la S-nitrosylation d’HDA19, réduit son accumulation nucléaire et par conséquent augmente l’acétylation des histones. Dans la seconde partie, nous montrons que HDA9, HDA19 et HDA15 sont toutes impliquées dans la réponse de la plante à l’élévation de la température ambiante. Des mutants hda15 montrent une réponse constitutive à des températures élevées dans des conditions normales, alors que les mutants hda19 et hda9 ont des phénotypes insensibles à la température élevée. L’analyse de l’expression de gènes par RT-PCR et RNA-seq révèle que la mutation d’HDA15 provoque une augmentation de transcrits des gènes impliqués dans le métabolisme primaire et cellulaire lorsque les plantules sont transférées de 20°C à 27°C pendant 4 heures. Par contre, la mutation d’HDA19 conduit à l’induction de gènes impliqués dans des réponses au stress, alors que les gènes induits par la mutation d’HDA9 après le transfert à 27°C ne semblent pas concerner des catégories fonctionnelle spécifiques. Il semble donc que la réponse des plantes à l’élévation de la température soit régulées par HDA9 et HDA19 par différentes voies. Ces résultats suggèrent que de différents membres d’HDAC ont des rôles distincts ou opposés dans la réponse à l’élévation de la température, en affectant l’expression de gènes de différentes catégories. Les travaux de ma thèse apportent un éclairage nouveau sur la fonction des HDAC, en enrichissant la compréhension de la régulation de l’expression génique chez la plante. / Histone acetylation/deacetylation play important roles in a diverse range of developmental processes and stress-responsive pathways in plants. However, little is known regarding the regulation of HDACs themselves by environmental signals, which may alter their function in the regulation of gene expression. Also HDACs functions in plant sensing of environmental conditions such as redox stresses and warm ambient temperature need to be precized. My thesis work focuses on: (1) The analysis of redoxregulated posttranslational modifications and theirconsequences on HDA19 function in gene regulation and in salicylic acid (SA)-mediated stress response; (2) The study of the function of HDA9, HDA15, and HDA19 in plant responses to warm temperature and thermal-related genes expression. In the first part, we show that SA-induced redox changes negatively regulate HDA19 nuclear accumulation through a reversible S-nitrosylation. Treatment with SA, as well as with the physiological nitric oxide donor Snitrosoglutathione, increases the abundance of several histone acetylation marks of HDA19 in Arabidopsis seedlings. hda19 mutant lines display a more oxidative status with increased ROS/RNS-related genes expression, as well as nicotinamide adenine dinucleotide and glutathione levels. These results suggest that SA affects histone acetylation by decreasing the nuclear accumulation of HDA19, resulting in histone hyperacetylation. The second part of the study showed that HDA9, HDA15, and HDA19 are involved in modulating plant adaptation to higher ambient temperatures in Arabidopsis. Mutation of HDA15 displayed a constitutive warm temperatureresponsive phenotype under normal temperature, whereas HDA9 and HDA19 mutants were shown insensitive to warming-temperature. Genes expression and RNA sequencing analysis revealed that HDA15 mutation led to the up-regulation of many genes involved in primary and cellular metabolic process when the seedlings were transferred from 20 °C to 27 °C for 4 h. On the other hand, hda19 mutation resulted in up-regulation of genes mainly involved in stressresponses at both normal (20 °C) and warmer (27 °C) temperatures. However, up-regulated genes in hda9-1 mutants did not appear enriched for any particular gene functional category when shifted from 20 °C to 27 °C. Likely, HDA9 and HDA19 positively regulate thermosensory elongation through distinct mechanisms. Our study suggested that the dynamics of histone acetylation regulated by HDA9, HDA15, and HDA19 plays an important role for plant adaptation to warm temperature, which involves distinct regulatory pathways of gene expression. Taken together, my thesis work brought in a few new elements to the current understanding of HDACs functions in the regulation of gene expression in plants.

Les propriétés invasives des cellules cancéreuses sont liées à des modulations importantes de l’expression de gènes. Des protéases doivent être exprimées afin de permettre la dégradation de la matrice extracellulaire (MEC), l’activation protéolytique de protéines matricielles et la libération de facteurs de croissance, de cytokines, de récepteurs et de molécules d’adhérence. Parmi ces protéases, les métalloprotéinases matricielles (MMPs) jouent un rôle crucial dans la dégradation de la MEC et dans le remodelage tissulaire observéau cours de l’invasion tumorale. L’émergence de thérapeutiques anticancéreuses basées sur des stratégies épigénétiques nécessitent d’évaluer leurs effets sur les propriétés des cellules tumorales. Ce travail a pour objectif d’analyser les effets de modulateurs épigénétiques (un agent hypométhylant de l’ADN et des inhibiteurs d’histone désacétylases (inhibiteursd’HDACs ou HDIs)) sur l’expression des MMP-1, -2 et -9 dans la lignée cellulaire de fibrosarcome humain HT1080. Dans un premier temps, il apparaît que l’agenthypométhylant de l’ADN, la 5-aza-2’désoxycytidine (5-azadC), augmente l’expressiongénique et protéique des MMP-1, -2 et -9. Ces modifications de l’expression sont associées à (i) une déméthylation globale de l’ADN et (ii) des modifications de la supra-organisation chromatinienne correspondant globalement à une chromatine moins condensée. De plus, la5-azadC est capable d’accroître les propriétés invasives des cellules par l’intermédiaire,notamment, d’une augmentation de l’expression de la MMP-1 par un mécanisme transcriptionnel. Cette augmentation de la transcription implique le recrutement du facteurSp1 et un remodelage chromatinien au niveau du promoteur du gène de la MMP-1.Néanmoins, une déméthylation totale de ce promoteur n’est pas nécessaire à cette induction. De manière complémentaire, le traitement des cellules HT1080 par différents HDIs révèle le rôle potentiel d’HDACs dans la régulation de l’expression de la MMP-1. Un HDIà large spectre, la trichostatine A (TSA), est capable de moduler l’expression de la MMP-1 et la texture nucléaire, mais uniquement après déméthylation préalable de l’ADN par la 5-azadC. Par contre, l’HDI spécifique des HDACs de classe I, le MS-275, est capable d’induire, à lui seul, l’expression génique et protéique de la MMP-1. Cette expression génique requiert un remodelage de la chromatine et le recrutement de l’histone acétyltransférase p300 au niveau du promoteur du gène de la MMP-1. L’ensemble de ces résultats suggèrent que des mécanismes épigénétiques jouent un rôle crucial dans le contrôle de l’expression de laMMP-1 dans les cellules HT1080, influençant ainsi les propriétés invasives de ces cellules. / Invasive properties of cancer cells require critical changes in gene expression. Proteasesmust be expressed for the degradation of the extracellular matrix (ECM), the proteolyticactivation of matrix proteins and the release of bioactive molecules such as growth factors,cytokines, receptors and adhesion molecules. Among these proteases, the matrixmetalloproteinase (MMP) family members play a crucial role in the ECM breakdown andremodeling of tissues during tumor invasion. The introduction of epigenetic strategies in thetherapeutic arsenal against cancer led to the need to evaluate the effects of suchtherapeutic approaches on cell behavior. Here we focused our attention on the effects ofepigenetic modulators, a DNA hypomethylating agent and histone deacetylase inhibitors(HDAC inhibitors or HDI), on the expressions of MMP-1,-2, and -9 in the human HT1080fibrosarcoma cell line. First, we showed that the DNA hypomethylating drug 5-aza-2’deoxycytidine (5-azadC) increases MMP-1, -2, -9 expressions both at the mRNA andprotein levels. These changes in gene expression are associated with (i) a global DNAdemethylation and with (ii) modifications in chromatin supra-organization which globally correspond to a more decondensed chromatin. Moreover, 5-azadC is able to increase theinvasive properties capability of the HT1080 cells mainly via MMP-1 transcription-dependent expression. This enhancement of transcription occurs through (i) Sp1 recruitment, (ii)chromatin remodeling and (iii) in absence of full demethylation on the MMP-1 genepromoter. Using different HDIs reveals that HDACs could potentially play a role in MMP-1expression. The pan-HDI trichostatin A (TSA) act in synergy with 5-azadC and is able tomodulate MMP-1 expression and nuclear texture, but only after DNA demethylation. Incontrast, the HDAC class I inhibitor, MS-275, which display additive effect with 5-azadC, isable to induce, alone, MMP-1 gene expression through chromatin remodeling and p300recruitment to its promoter. These data suggest that epigenetic mechanisms play a crucialrole in MMP-1 expression control in HT1080 cells thus influencing the invasive potential ofthese cells.

Histone deacetylases (HDACs) are key mediators of gene expression and, thus, major regulators of cell function. As such, HDACs play a role in orchestrating tumor biology, and the use of small inhibitors targeting theses proteins is attractive for the field of cancer therapy. Indeed, several HDAC inhibitors have received FDA-approval for the treatment of malignancies, while a myriad of these compounds continue to be evaluated in clinical trials. Besides their direct impact on tumor growth, HDAC inhibitors have been shown to increase immunogenicity of cancer cells, facilitating generation of a productive immune response against tumors. Immunotherapeutic approaches take advantage of the intrinsic ability of the immune system to manifest an anti-tumor response. Mechanisms of immune escape are often developed by cancer cells, neutralizing activity of the immune system. For example, upregulation of the PD1 ligands PDL1 and PDL2 by tumor cells negatively regulates the anti-tumor functions of PD1-expressing infiltrating T-cells. Importantly, strategies targeting this inhibitory axis have shown outstanding clinical benefit for the treatment of solid and hematological malignancies. The mechanisms by which HDAC inhibitors modulate tumor and immune cells biology were explored herein. Initially, treatment of melanoma cells with pan- and class I-selective HDAC inhibitors resulted in upregulation of PDL1 and PDL2 molecules. These effects were observed in mouse and human cell lines, as well as in tumor cells resected from metastatic melanoma patients. This upregulation was robust and sustained, lasting at least 96 hours in vitro, and validated in vivo using a B16F10 syngeneic mouse model. Enhanced expression of PDL1 mediated by HDAC inhibitors was found to result from enhanced histone acetylation at the PDL1 gene promoter region. Combination therapy of HDAC inhibition and PD1 blockade was explored in the tumor setting, leading to synergistic effects in terms of reducing melanoma progression and increasing survival of B16F10 melanoma-bearing mice. These data provide a clinical rationale for combination therapy of epigenetic modifiers (e.g. HDAC inhibitors) and PD1 blockade as means to augment cancer immunotherapy, improving patient outcomes. As a second pillar of this research, the impacts of HDAC-selective inhibition were explored on immune cell biology, since the broad nature of pan-HDAC inhibitors was shown to be detrimental to T-cells in vitro and in vivo. Based on screening assay results, novel implications of treating melanoma patient T-cells ex vivo with the HDAC6-selective inhibitor ACY1215 were investigated. Treatment with this compound was unique among pan- and isotype-selective HDAC inhibitors in modulating T-cell cytokine production and showing minimal impact of T-cell viability. ACY1215 tempered Th2 cytokine production (i.e. IL-4, IL-6 and IL-10), and maintained Th1 effector cytokines (e.g. IFNγ and IL-2). Furthermore, ACY1215 increased expression of surface markers, including CD69 activation marker and ICOS co-stimulatory molecule. In addition, ACY1215 treatment enhanced accumulation of central memory T-cells during ex vivo expansion of tumor infiltrating T-cells harvested from resected tumors of metastatic melanoma patients. Importantly, ACY1215-mediated inhibition improved tumor-killing capacity of T-cells. These results highlight an unexplored ability of selective HDAC inhibitor ACY1215 to augment T-cell expansion during protocols of adoptive cell therapy. While the discoveries presented here warrant further investigation of cellular and molecular mechanisms associated with ACY1215-treated T-cells, the clinic implications are clear and rapidly translatable.

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Yes / Seasonal animals undergo changes in physiology and behavior between summer and winter conditions. These changes are in part driven by a switch in a series of hypothalamic genes under transcriptional control by hormones and, of recent interest, inflammatory factors. Crucial to the control of transcription are histone deacetylases (HDACs), generally acting to repress transcription by local histone modification. Seasonal changes in hypothalamic HDAC transcripts were investigated in photoperiod-sensitive F344 rats by altering the day-length (photoperiod). HDAC4, 6 and 9 were found to change in expression. The potential influence of HDACs on two hypothalamic signaling pathways that regulate transcription, inflammatory and nuclear receptor signaling, was investigated. For inflammatory signaling the focus was on NF-κB because of the novel finding made that its expression is seasonally regulated in the rat hypothalamus. For nuclear receptor signaling it was discovered that expression of retinoic acid receptor beta was regulated seasonally. HDAC modulation of NF-κB-induced pathways was examined in a hypothalamic neuronal cell line and primary hypothalamic tanycytes. HDAC4/5/6 inhibition altered the control of gene expression (Fos, Prkca, Prkcd and Ptp1b) by inducers of NF-κB that activate inflammation. These inhibitors also modified the action of nuclear receptor ligands thyroid hormone and retinoic acid. Thus seasonal changes in HDAC4 and 6 have the potential to epigenetically modify multiple gene regulatory pathways in the hypothalamus that could act to limit inflammatory pathways in the hypothalamus during long-day summer-like conditions. / Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC)

Strategies aimed at expanding functional beta cell mass remain a prime goal of diabetes research. Both the insulin signaling pathway, as well as the G1/S transition of the cell cycle are critically important for the maintenance of beta cell mass. We previously demonstrated in a mouse model of diabetes, insulin receptor substrate 2 (Irs2) deficient mice, that beta cell failure was attributed to reduced islet expression of Cyclin D2, and that overexpressing Cyclin D2 rescued proliferation in Irs2 deficient beta cells in vitro. Since Cyclin D2 partners with CDK4 to drive cell cycle progression, we hypothesized that an activated form of CDK4, Cdk4-R24C (resistant to inhibition by the INK4A cell cycle inhibitor p16), would rescue the in vivo proliferation defect in Irs2 deficient mice. Interestingly, Irs2 knockout mice with the active Cdk4 R24C allele, displayed rescued blood glucose, and normalized glucose tolerance, without affecting peripheral insulin resistance. I found that both and beta cell mass and proliferation were rescued in vivo, contributing to the rescue of glucose tolerance. Interestingly, the dedifferentiated phenotype of Irs2 knockout islets (ALDH1A3+ cells, nuclear FOXO1 and suppressed PDX1) was completely restored with the active Cdk4 allele, suggesting that CDK4 may play a role in promoting beta cell differentiation. Utilizing various in vitro models where FOXO1 represses Pdx1, overexpression of CDK4/CyclinD2 was consistently able to rescue the FOXO1-mediated repression of Pdx1, without significant impacts on FOXO1 subcellular localization. These results suggested that FOXO1 regulation in the beta cell is more complex than previously described, and also suggested that CDK4/Cyclin D2 may be instead modulating the acetylation status of FOXO1, impacting its transcriptional activity. To this end, inhibiting histone acetylate transferases (HATs) partially rescued FOXO1-mediated Pdx1 suppression, while inhibiting histone deacetylase enzymes (HDACs) showed the reverse effect of trending towards blocking the Cyclin D2/CDK4-mediated rescue of Pdx1. Finally, I found that CDK4/Cyclin D2 increases phosphorylation of sirtuin 1 (SIRT1), an HDAC that modulates the acetylation status, and transcriptional activity of FOXO1, and that CDK4/Cyclin D2 promotes FOXO1 degradation. In sum, we conclude that activated CDK4 rescues beta cell failure due to IRS2 deficiency through multiple mechanisms related to not only cell cycle regulation but also to beta cell differentiation status, primarily through modulation of FOXO1 transcriptional activity.