O bagaço de cana de açúcar é uma fonte de energia renovável e matéria prima promissora na produção de biocombustível, pois representa cerca de 30% de glicose contida na planta com potencial de ser hidrolisado e convertido em etanol. Os principais constituintes do bagaço de cana são a celulose, formada por cadeia linear de glicose, a hemicelulose, um polímero amorfo constituído de xilose, arabinose, galactose e manose e a lignina, um polímero complexo formado por unidades de fenilpropanos que atuam como revestimento impermeabilizante nas fibras, difícil de ser removido por sua característica recalcitrante. O objetivo do presente trabalho foi avaliar a eficiência da irradiação com feixe de elétrons como pré-tratamento do bagaço de cana para hidrólise enzimática da celulose. O pré-tratamento do bagaço de cana é uma das etapas mais importante para torná-lo economicamente viável e competitivo na produção de energia. Como pré-tratamento o processamento por feixe de elétrons pode fragilizar a estrutura da hemicelulose e lignina, pela ação de radicais altamente reativos que quebram as ligações químicas, reduzindo o grau de polimerização das fibras. Foram avaliados os efeitos da radiação na estrutura e composição do bagaço, assim como a combinação do processamento por feixe de elétrons com o pré-tratamento de esplosão à vapor. Para hidrólise enzimática utilizou-se enzimas comerciais fornecidas pela Novozymes. O processamento por feixe de elétrons levou a alterações na estrutura e composição do bagaço de cana aumentando a solubilidade pela degradação de celulose alfa e hemicelulose e aumentando também o rendimento da hidrólise enzimática. No caso do bagaço explodido, não houve alteração no rendimento da hidrólise enzimática, mas o processamento por feixe de elétrons promoveu uma redução de 67% no furfural, que é formado no processo de explosão a vapor. / The sugar cane bagasse is a renewable energy source and a raw material promise in the biofuel production, once represents about 30% of glucose contained in the plant with the potential to be hydrolyzed and then converted to ethanol. The bagasse is composed of cellulose, straight chain of glucose, of hemicellulose, an amorphous polymer consisting of xylose, arabinose, galactose, and mannose, and of lignin, a complex polymer consisting of fenilpropans units that acts as waterproof coating on the fibers, which is hard to remove due its recalcitrant nature. The aim of this work was to study the electron beam processing as a pretreatment of sugarcane bagasse to enzymatic hydrolysis of cellulose. The pretreatment of sugarcane bagasse is one of the most importante steps to make this material economically viable and competitive on the energy production. As a pretreatment the electron beam processing can weak the hemicellulose and lignin structures by the action highly reactive radicals that breaks the links, reducing the degree of polymerization fibers. It was evaluated the chemical and structural modifications on fibers caused by the irradiation, the enzymatic hydrolysis of electron beam as the only pretreatment and combined to steam explosion. For enzymatic hydrolysis it was used the commercial enzymes from Novozymes. The radiation processing promotes changes in structure and composition of sugarcane bagasse, increasing the solubility, that is related to hemicellulose and cellulose cleavage, and also increasing the enzymatic conversion yield. In the case of exploded bagasse there is no changes in the enzymatic hydrolysis yield, however the electron beam processing promoted a 67% reduction of furfural, that is formed in the steam explosion process.

Orientador: Edison Bittencourt / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química / Made available in DSpace on 2019-01-18T11:50:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Camargo_Marcelode_M.pdf: 25344897 bytes, checksum: 8146c1fb634f94d4bb4152d5bcc07e66 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: Este estudo trata-se de um novo método de obtenção de fibras de nanocelulose a partir de algodão "Never Dried Cotton" NDC, (algodão nunca seco). O algodão classificado como NDC, apesar de possuir a mesma cristalinidade do algodão normal e muito mais poroso e, portanto, muito mais suscetível a eventuais tratamentos químicos. Esta maior porosidade deve-se ao fato de que o NDC, no seu estado natural, ainda não passou pelo processo de colapso do lumen devido a evaporação da seiva presente no seu interior. Com este colapso da estrutura, as inúmeras pontes de hidrogênio formadas entre as hidroxilas da celulose estabelecem-se em um arranjo molecular diferente do NDC, e neste novo arranjo os poros fecham-se irreversivelmente, num processo que na área de celulose chama-se "hornification", que diminui a acessibilidade da celulose. Neste trabalho aplicamos uma hidrolise enzimática seguida da sonicação com ultrasom de 400 e 1000 W de potencia, submetendo as amostras a 20, 30, 40, e 50 minutos de tratamento com ultrasom. As analises de microscopia eletrônica revelaram fibras com comprimento médio de aproximadamente 30 Fm e de ate 232 nm de diâmetro para a sonicação com ultrassom de 1000 W durante 50 minutos no algodão Never Dried. Na viscose com a mesma potencia e tempo de tratamento foram obtidas nano fibras de ate 197 nm. Para o ultrassom de 400 W obtivemos fibras com 800 nm de diâmetro apos 50 minutos de tratamento. Contudo somente com a microscopia de Transmissão eletrônica e que pudemos identificar a presença de nano fibras com ate 40 nm de diâmetro já com apenas 20 minutos de tratamento e utilizando o ultrassom de menor potencia de 400 W. As analises de medição de tamanho de partícula por laser demonstraram que as amostras obtidas com ultrassom de 1000 W são mais homogêneas em relação as suas dimensões. / Abstract: This study is about a new method of obtainning Cellulose nano fibers from cotton "Never Dried Cotton" NDC. The cotton classified as NDC, despite has the same cristalinity of the normal cotton it is much more porous and, therefore, much more susceptible to eventual chemical treatments. This higher porosity is because the NDC, in natural state, is not in process of collapse of the lumen due to evaporation of the sap in the interior of fiber. With the collapse of the structure makes the innumerable hydrogen links formed between cellulose hydroxyls to agroup themselves molecular arrangement different from NDC, and in this new arrangement the pores close on a irreversible way, in a process that in the cellulose field is called of "hornification", wich reduces the accessibility of the cellulose. In this work we apply an enzymatic hydrolysis followed the sonication with 400 and 1000 W power ultrasound, submitting the samples the 20, 30, 40, and 50 minutes of treatment with ultrasound. The analyses of electronic microscopy disclosed fibers with average length of approximately 30 Pm and up to 232 nm of diameter for the sonication with 1000 W ultrasound during 50 minutes in the Never Dried Cotton. Nano fibers of up to 197 nm were obtained from viscose, with the same power and time of treatment. Utilizing ultrasound of 400 W fibers with 800 nm of diameters were obtained after 50 minutes of treatment. However only with Transmission electronic Microscopy it was possible to identify the presence of nano fibers with up to 50 nm of diameter with only 20 minutes of treatment and using an ultrasound of 400 W power. The analyses of measurement of particle size with laser had disclosed that the samples gotten with ultrasound of 1000 W are more homogeneous compared to its dimensions. / Mestrado / Ciencia e Tecnologia de Materiais / Mestre em Engenharia Química

A exploração indiscriminada dos combustíveis fósseis vem alertando para o colapso próximo do suprimento de energia. Fontes alternativas vêm sendo exploradas com o propósito de apresentarem-se como combustíveis com o mesmo potencial, além de estarem inseridas em um contexto de desenvolvimento sustentável. O Brasil, por consolidar sua posição com forte mercado agroindustrial e dispor de uma grande variedade de unidades agrícolas possui como subprodutos uma alta quantidade de resíduos, como o sabugo de milho. Assim, buscam-se viabilizar metodologias que tornem a exploração desta fonte economicamente vantajosa para a obtenção de etanol de segunda geração (2G). Novas metodologias vêm propondo o emprego de tensoativos como aditivos tanto no prétratamento quanto na hidrólise enzimática de materiais lignocelulósicos. Neste contexto, o presente trabalho objetivou estudar a hidrólise enzimática do sabugo de milho pré-tratado por ácido diluído na presença de diferentes concentrações do tensoativo Tween 80 em associação com a dosagem do complexo enzimático Cellic CTec2 para a obtenção de um hidrolisado rico em glicose para obtenção de etanol pela levedura Scheffersomyces stipitis CBS 6054 através do processo SHF (Separate Hydrolysis and Fermentation). Os ensaios foram conduzidos de acordo com planejamento experimental 23 com face centrada e 3 repetições no ponto central. As variáveis estudadas foram: concentração de surfactante no pré-tratamento e na hidrólise enzimática e dosagem do complexo enzimático. Os resultados mostraram que o uso do surfactante no pré-tratamento com ácido sulfúrico diluído surtiu maior efeito na remoção de lignina e hemicelulose quando empregado na concentração de 10% (m/m). Nesta condição foi possível observar um aumento (21,1%) na perda de celulose em relação ao pré-tratamento sem a presença de surfactante. A maior diminuição na cristalinidade (81,23%) foi com o uso de 10% do tensoativo. A análise da superfície de resposta permitiu determinar as condições ótimas do processo SHF para obtenção de máximo rendimento em glicose (entre 80 e 90 %) que foi quando a concentração de surfactante no pré-tratamento aumentou de 0 a 10 % (m/m) mantendo-se constante em seu nível superior a concentração de surfactante na hidrolise enzimática (10 % m/m) com redução na dosagem de enzima (25,50 FPU/gmaterial lignocelulósico seco). Nestas condições experimentais obteve-se favorecimento no rendimento em glicose (80,54%) e concentração em glicose (61,98 g/L) no meio reacional concomitantemente com o favorecimento no rendimento em xilose (70,66%). Esta levedura fermentou concomitantemente os açúcares (glicose, xilose e celobiose) a etanol com elevados fator de conversão (0,37 g/g) e produtividade volumétrica (1,02 getanol/L.h). A velocidade especifica máxima de consumo destes açúcares foi favorecida na seguinte ordem: glicose, celobiose e xilose. Após esta fermentação foi obtido um material com uma superfície mais porosa e fragmentada. Este fato evidenciou que o complexo enzimático agiu eficientemente quebrando a celulose cristalina obtendo um material amorfo. Espera-se que este trabalho tenha contribuído para o desenvolvimento de uma tecnologia alternativa para a produção de etanol por via biotecnológica a partir da fração lignocelulósica do sabugo de milho, a fim de mitigar os impactos ambientais intrínsecos ao processo. / The indiscriminate exploitation of fossil fuels has been warning of the near collapse of the energy supply. Alternative sources have been explored with the purpose of presenting themselves as fuels with the same potential, besides being inserted in a context of sustainable development. Brazil, by consolidating its position with a strong agroindustrial market and having a wide variety of agricultural units, has as a by-product a high amount of waste, such as corn cob. Thus, we seek to make feasible methodologies that make the exploitation of this source economically advantageous to obtain second generation etanol (2G). New methodologies have proposed the use of surfactants as additives in both pretreatment and enzymatic hydrolysis of lignocellulosic materials. In this context, the present work aimed to study the enzymatic hydrolysis of diluted-acid pretreated corn cob in the presence of different concentrations of the Tween 80 surfactant in combination with the dosage of the Cellic CTec2 enzymatic complex to obtain a glucose rich hydrolysate to produce ethanol by the yeast Scheffersomyces stipitis CBS 6054 in SHF (Separate Hydrolysis and Fermentation) process. The experiments were conducted according to experimental design 23 with centered face and 3 repetitions at the central point. The variables studied were: concentration of surfactant in the pretreatment and in the enzymatic hydrolysis and dosage of the enzymatic complex. The results showed that the use of surfactant in the pretreatment with diluted sulfuric acid had a greater effect on the removal of lignin and hemicellulose when used at the concentration of 10% (w/w). In this condition, the cellulose content was decreased by 21.1% as compared with the amount presents in the diluted-acid corn cob pretreatment without surfactant. The greatest decrease in crystallinity (81.23%) was with the use of 10% of the surfactant. The response surface analysis allowed to determine the optimum conditions of the SHF process to obtain maximum glucose yield (between 80 and 90%), when the pre-treatment surfactante concentration increased from 0 to 10% (w/w) with a reduction in the enzyme dosage (25,50 FPU/g dry lignocellulosic material) at a higher level than the surfactant concentration in the enzymatic hydrolysis. In these experimental conditions, glucose yield (80.54%) and glucose concentration (61.98 g/L) in the reaction medium were favored concomitantly with xylose yield (70.66%). This yeast concomitantly fermented the sugars (glucose, xylose and cellobiose) to ethanol with high conversion factor (0.37 g/g) and volumetric productivity (1.02 getanol/L.h). The maximum specific velocity of consumption of these sugars was favored in the following order: glucose, cellobiose and xylose. After this fermentation was obtained a material with a more porous and fragmented surface. This fact evidenced that the enzymatic complex acted efficiently breaking down the crystalline cellulose obtaining an amorphous material. It is hoped that this work had contributed to the development of an alternative technology to produce ethanol by Biotechnological route from the corn cob lignocellulosic fraction in order to mitigate the environmental impacts intrinsic to the process.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:31:03Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-09-01Bitstream added on 2014-06-13T19:19:57Z : No. of bitstreams: 1 rocha_ts_dr_sjrp.pdf: 2028689 bytes, checksum: fc26ec97a8f0c09ef335056fc152bcbe (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Para auxiliar o entendimento da estrutura semicristalina de grânulos de amido, o ‘annealing’ e as hidrólises ácida e enzimática de amidos granulares podem ser empregados. Este trabalho teve o objetivo de utilizar estes tratamentos para obter maiores informações sobre a estrutura granular de amidos de diferentes fontes botânicas, além de compreender o mecanismo de reorganização da estrutura granular provocada pelo ‘annealing. Amidos de milho normal, milho ceroso, mandioca, mandioquinha-salsa e batata foram isolados e caracterizados quanto a sua composição química, distribuição dos comprimentos de cadeias ramificadas da amilopectina, difração de raios-X, propriedades de pasta e propriedades térmicas. Suspensões de amidos nativos (5% p/v) foram submetidas ao ‘annealing’ à temperatura de 2 a 3 ºC menores que as temperaturas de início de gelatinização de cada amido, por 24 horas. Após ‘annealing’, os amidos foram avaliados quanto às suas características morfológicas (microscopia óptica, SEM e microscopia a laser confocal), teores de amilose, distribuição dos comprimentos de cadeias ramificadas da amilopectina, difração de raios-X, massa molar da amilopectina, propriedades térmicas e suscetibilidade às hidrólises enzimática (alfa-amilase e amiloglucosidase) e ácida. Os amidos submetidos à hidrólise enzimática ou ácida (em diferentes tempos) foram também avaliados quanto ao teor de amilose, massa molar da amilopectina, SEM, distribuição dos comprimentos de cadeias ramificadas da amilopectina, difração de raios-X e propriedades térmicas. O amido de mandioquinha-salsa apresentou características estruturais diferentes das apresentadas pelos outros amidos. Como o amido de batata, este amido apresentou polimorfismo tipo B e altas proporções de cadeias laterais muito longas (DP > 37) da amilopectina, o que pode ter superestimado... / To help understanding the semi-crystalline structure of starch granules, the annealing, the enzymatic and acid hydrolysis can be performed. Objectives of this study were to use these treatments to obtain more information about the granular structure of starches from different botanical sources, and help comprehend the starch granular reorganization mechanism provoked by annealing. Normal corn, waxy corn, cassava, Peruvian carrot and potato starches were isolated and characterized regarding their chemical compositon, amylopectin branch-chain length distribution, X-ray diffraction, pasting properties and thermal properties. Starches suspensions (5% w/v) were subjected to annealing for 24h at 3 ºC below the onset gelatinization temperatures of each starch. After annealing, the starches were evaluated regarding their morphological characteristics (optical microscopy, SEM, laser confocal microscopy), amylose content, amylopectin branch-chain length distribution, X-ray diffraction, amylopectin molar mass, thermal properties and susceptibility to enzymatic hydrolysis (alpha-amylase and amiloglucosidase) and acid hydrolysis. The starches subjected to enzymatic and acid hydrolysis (at different times) were also evaluated regarding their amylose content, amylopectin molar mass, SEM, amylopectin branch-chain length distribution, X-ray diffraction and thermal properties. Peruvian carrot starch had structural characteristics different of that of the other starches. As potato starch, it displayed a B-type Xray diffraction pattern and high proportion of very long amylopectin branch-chains (DP 37), which may have overestimated the apparent amylose content of these starches. However, the Peruvian carrot starch also displayed a high amount of short amylopectin branch-chains (DP 6-12). Normal corn and waxy corn starches displayed an A-type pattern and cassava starch displayed a CA-type... (Complete abstract click electronic access below)

O bagaço de cana é um importante material lignocelulósico gerado no Brasil e pode ser uma fonte de açúcares monoméricos. No entanto, a conversão eficiente de seus polissacarídeos via hidrólise enzimática requer processos de pré-tratamento para diminuir sua recalcitrância. Fungos basidiomicetos são reconhecidos como os organismos mais efetivos na degradação dos componentes lignocelulósicos em madeira e podem, potencialmente, ser empregados na etapa de pré-tratamento. Para que o balanço de massas de glicose obtida através deste processo combinado de conversão seja positivo, é necessário que a degradação biológica de lignina seja máxima e que a celulose seja preservada na etapa de pré-tratamento. O objetivo deste trabalho foi a avaliação da utilização do fungo de decomposição parda Laetipotus gilbertsonii e dos fungos de decomposição branca Pleurotus ostreatus e Ceriporiopsis subvermispora no pré-tratamento de bagaço de cana para etapas subsequentes de hidrólise enzimática dos polissacarídeos. O pré-tratamento biológico foi realizado em frascos Erlenmeyers de 2L com 25 g de bagaço de cana suplementado com 0,5% de milhocina por períodos de 7 a 60 dias. Após o biotratamento também foi aplicada uma etapa tratamento químico com peróxido de hidrogênio (2%) por 48 h a 40 ºC seguido de uma extração alcalina com hidróxido de sódio (5%) a 120 ºC por 2 h. Essa etapa também foi aplicada sobre o bagaço original para avaliação da eficiência da combinação dos tratamentos (controle). Para análise da eficiência dos tratamentos, foram realizadas hidrólises enzimáticas dos substratos gerados e do bagaço original. A biodegradação de bagaço de cana por por L. gilbertsonii e P. ostreatus apresentou baixa perda de massa. O bagaço de cana biotratado por L. gilbertsoni se mostrou mais recalcitrante à ação das enzimas que bagaço original, enquanto que o bagaço biotratado por P. ostreatus apresentou uma conversão superior dos polissacarídeos residuais ao original acima de 30 dias de cultivo.O biotratamento de bagaço de cana por C. subversmipora apresentou a mais extensa perda de massa em relação aos outros fungos. Após 60 dias de cultivo, C. subvermispora degradou 17%, 49% e 48% da celulose, hemicelulose e lignina, respectivamente; enriquecendo a fração celulósica do material. A hidrólise deste substrato biotratado alcançou conversão de celulose de 54%, contra somente 23% no material original. Mesmo com o consumo de parte da fração celulósica pelo fungo C. subvermispora, a aplicação do biotratamento gerou mais glicose disponível do que o bagaço de cana in natura. / Sugarcane bagasse is one of the most important lignocellulosic raw material in Brazil and may be a source of fermentative sugars. However, for an efficient conversion of these polysaccharides by enzymatic hydrolysis, a pretreatment is required to overcome the material recalcitrance. Basidiomycetes are recognized as the most effective organisms to degrade lignocellulosic materials and may, potentially, be used for the pretreatment step. For a positive balance of glucose in this process, maximal degradation of lignin should be attained with minimal degradation of the cellulosic fraction. The aim of this work is the evaluation of the brown-rot fungi Laetiporus gilbertsonii and the white-rot fungi Pleurotus ostreatus and Ceriporiopsis subvermispora in the pretreatment of the sugarcane bagasse for subsequent enzymatic hydrolysis of the remaining polysaccharides. The biological pretreatment was carried in Erlenmeyers 2L flasks with 25 g of sugarcane bagasse, supplemented by 0.5% of corn steep liquor for 7 to 60 days. After the biological pretreatment, a chemical processing with hydrogen peroxide (2 %) for 48 h at 40 º C followed by alkaline extraction with sodium hydroxide (5 %) at 120 ºC for 2 h was also performed. This chemical step was also applied in the raw bagasse to evaluate the efficiency of the combined treatment. Enzymatic hydrolysis of the solids was performed to analyze the efficiency of the treatments on the pretreated and original bagasse. The biodegradation of sugarcane bagasse by L. gilbertsonii and P. ostreatus showed low mass loss values. The bagasse treated by L. gilbertsonii was even more recalcitrant to enzymes than the raw material, meanwhile the material treated by P. ostreatus showed a higher conversion of residual polysaccharide than raw material after 30 days of biotreatment. The biological treatment of bagasse with C. subvermispora showed the higher mass loss values among studied fungi. After 60 days of grown, C. subvermispora degraded 17 %, 49 % and 48 % of cellulose, hemicellulose and lignin, respectively, enriching the cellulosic fraction of the material. The hydrolysis of this treated substrate reached a cellulose conversion of 54 % against only 23 % found in the raw bagasse. Even considering the cellulosic fraction consumption by C. subvermispora, the fungal pretreatment provided more available glucose at the end of the process as compared to the raw bagasse.

Para diminuir o consumo dos combustíveis fósseis, que são os principais agentes intensificadores do efeito estufa, muitas pesquisas estão sendo realizadas para aumentar a produção de etanol, com ênfase no etanol produzido a partir de materiais lignocelulósicos. Dentre as etapas necessárias para esse processo, uma delas é a hidrólise enzimática da celulose a monômeros solúveis. No entanto, a parede celular das plantas é recalcitrante e de difícil acesso às enzimas. Diante disto, neste trabalho propôs-se tratar bagaços de cana-de-açúcar com diferentes concentrações de solução sulfito em meio alcalino, para solubilizar lignina e hemicelulose e favorecer o acesso das enzimas ao substrato. As amostras, obtidas de cultivares de cana-de-açúcar com teores reduzidos de lignina e de uma variedade comercial, foram submetidas ao processo quimio-mecânico por 2 horas, a 121oC, com soluções de hidróxido de sódio (2,5%, 3,75% e 5% m/m) e sulfito de sódio (5%, 7,5% e 10% m/m), combinadas na proporção de 1:2, respectivamente. Análises físico-químicas dos materiais pré-tratados, como quantificação dos grupos sulfônicos e capacidade de retenção de água (WRV), também foram realizadas. Conforme se empregou maior concentração de reagentes no pré-tratamento, mais eficientes foram as remoções de lignina e hemicelulose, favorecendo maiores conversões enzimáticas. A remoção de lignina, embora contribua para o acesso das enzimas ao substrato, não foi o único fator necessário para se alcançar os maiores rendimentos de açúcares. Nesse caso, o efeito da sulfonação foi essencial para melhores conversões. Os resultados de WRV não apresentaram correlação com os níveis de hidrólise, pois é provável que as fibras pré-tratadas tenham atingido seu ponto de saturação. O maior rendimento de hidrólise da celulose foi de 92% para o cultivar 58 (após 96 horas de reação), que associou o efeito da deslignificação (53,5%) com alta incorporação de sulfito (600 mmol/Kg de lignina). Todos os bagaços com menor conteúdo inicial de lignina apresentaram maiores velocidades iniciais de hidrólise, quando comparados com a variedade comercial. Dessas amostras, destacou-se o cultivar 146, que necessitou apenas de 8 horas de reação para estabelecer o patamar de conversão de celulose de 75%. Todos os cultivares foram mais eficientes que a variedade comercial, demandando menor concentração de reagentes químicos para atingir 50% de conversão de celulose, em 24 horas. Foi avaliada a diminuição de quatro vezes na carga de SO32- no pré-tratamento do cultivar 58, em que se empregou 2,5% de sulfito e 5% de NaOH, em tempos de cozimento correspondentes a 30, 60 e 120 minutos. Nesse sentido, observou-se que a maior proporção de íons OH- no meio reacional não resultou em rendimentos satisfatórios de hidrólise, devido à maior perda de hemicelulose e menor remoção de lignina, quando comparado ao mesmo processo utilizando 10% de sulfito. Para o maior tempo de pré-tratamento foi possível obter maiores rendimentos de hidrólise, pois a incorporação de sulfito e remoção de componentes aumentou com o tempo. Portanto, o efeito da sulfonação, em 2 horas de pré-tratamento, foi mais importante que a deslignificação total das amostras na conversão dos polissacarídeos do bagaço em açúcares fermentescíveis. / In order to reduce the consumption of fossil fuels, which are the main cause of the greenhouse effect, many studies are being undertaken to increase ethanol production through the use of lignocellulosic material. One of the steps in this process is enzymatic hydrolysis of the cellulose into monomers. However, the plant cell walls are recalcitrant and inaccessible to the enzymes. Thus, this study aims to treat sugar cane bagasse with different sulfite alkaline concentrations in order to dissolve lignin and hemicellulose and enable the enzymes access to the substrate. The samples, obtained from sugar cane hybrids with reduced lignin content along with a commercial variety, were submitted to a chemical-mechanical process for 2 hours at 121°C, with sodium hydroxide solutions (2.5%, 3.75% and 5% m/m) and sodium sulfite (5%, 7.5% and 10% m/m), combined in a 1:2 ratio, respectively. Furthermore, physical and chemical analyses, such as water retention value and sulfonic group measurement, were carried out. The greater reactants concentration in the pretreatment, the more efficient the lignin and hemicelullose removal was, therefore enabling greater enzymatic conversions. Although lignin removal augments enzyme access to the substrate, this was not the only factor necessary to reach better conversion rates. In this case, the effect of sulfonation was essential for better conversions. The water retention value did not present correlation with the hydrolysis levels, suggesting that the pre-treated fibers had already reached their saturation point. The greatest cellulose hydrolysis yield was 92% for hybrid 58 (after 96 hours of reaction), which is associated with the effect of delignification (53.5%) with high sulfite incorporation (600 mmol/Kg of lignin). All of the bagasse varieties with less initial lignin content presented greater initial hydrolysis velocities when compared to the commercial variety. Of these samples, the hybrid 146 stood out, since only 8 hours was needed to reach the cellulosic conversion plateau of 75%. All of the hybrids were more efficient than the commercial variety, as they required less chemical reactants to reach 50% cellulosic conversions in 24 hours. The charge of SO32- was reduced 75% for the pretreatment using 2.5% sulfite and 5% NaOH with hybrid 58 for reaction times of 30, 60 and 120 minutes. It was observed that a greater proportion of OH- ions did not lead to satisfactory hydrolysis yields due to the greater loss in hemicellulose and the great lignin removal when compared to the same treatment utilizing 10% sulfite. The greater hydrolysis yield was obtained through the longest period of pretreatment, because in this condition the sulfite incorporation and removal of components increased. Thus, the effect of sulfonation, in 2 hours of pretreatment was more important in the conversion of the bagasse polysacharides in fermentable sugars than the total delignification of the samples.

Atualmente, o aquecimento global, a deterioração ambiental, a eminente escassez das limitadas reservas de combustíveis fósseis e a forte demanda e dependência da matriz energética mundial face a esses combustíveis constituem sérias ameaças à sustentabilidade do desenvolvimento mundial, o que se têm revertido a favor de um crescente interesse por fontes alternativas de energia renováveis, dentre os quais a biomassa lignocelulósica se destaca como uma das mais promissoras. Neste contexto, a produção de etanol a partir do bagaço de cana-de-açúcar pela via enzimática e bioquímica se apresenta como uma das mais oportunas alternativas para a produção integrada e sustentável de biocombustível visando otimização de recursos, redução de resíduos e minimização de impactos ambientais nefastos. Todavia, o desenvolvimento de um pré-tratamento eficaz, a par da produção de enzimas hidrolíticas, constitui a chave para a viabilização da produção de etanol a partir de lignocelulósicos. Assim sendo, o propósito deste trabalho foi determinar os efeitos produzidos pelo pré-tratamento hidrotérmico catalisado com sulfito sobre a composição química do bagaço de cana e correlacionar esses valores com a eficiência da sacarificação enzimática e fermentabilidade do hidrolisado obtido desse bagaço. Após caracterização química inicial, o bagaço in natura foi pré-tratado com sulfito neutro e alcalino e verificou-se que a celulose foi recuperada quase que integralmente nas frações sólidas da reação. Por seu turno, as xilanas obtiveram solubilizações máximas de 72,0% e 35,4% enquanto a deslignificação máxima foi de 43,5% e 76,7%, para as reações catalisadas com sulfito neutro e sulfito alcalino respectivamente. Verificou-se maior efetividade do sulfito alcalino no enriquecimento de carboidratos no bagaço pré-tratado bem como uma maior deslignificação, pelo que, foi escolhido para as etapas seguintes do projeto. A partir de um planejamento fatorial 33, foram obtidos substratos pré-tratados que levaram aos máximos de sacarificação enzimática de 79,91% e 70,69% para celulose e xilanas, respectivamente, utilizando 10 UPF de celulases e 10 UCB de ?-glucosidase. Pela análise do rendimento global de glucanas foi definida a condição ótima para o prétratamento empregando 10% (m/m) de sulfito alcalino a 150ºC, por 30 min, o que foi corroborada pela análise estatística. Hidrolisados enzimáticos de bagaços pré-tratados em condições otimizadas foram fermentados a etanol com eficiência de, praticamente, 100% pela Saccharomyces cerevisiae PE-2 e 80,41% pela Scheffersomyces (Pichia) stipitis CBS 5773. Para as duas leveduras, os parâmetros fermentativos do hidrolisado foram em tudo semelhantes aos verificados para os meios semissintéticos contendo glicose e xilose puras. Conclui-se assim, que o pré-tratamento adotado neste trabalho apresentou grande potencialidade em gerar substratos com alta digestibilidade enzimática e hidrolisados tão fermentáveis quanto meios semissintéticos. / Currently, global warming, environmental degradation, imminent shortage of limited fossil fuel reserves and an intense demand and dependence of global energy on these fuels constitute serious threats to the sustainability of world development, which have led to a growing interest in alternative sources of renewable energy, among which lignocellulosic biomass stands out as one of the most promising. In this context, the production of ethanol from sugarcane bagasse by enzymatic and biochemical routes appears as the most promising alternative for integrated and sustainable production of biofuel aiming resource optimization, waste reduction and mitigation of adverse environmental impacts. However, the development of an effective pretreatment, as well as the production of hydrolytic enzymes, is the key to enabling the production of ethanol from lignocellulosics. Therefore, the purpose of this study was to determine the effects of hydrothermal pretreatment catalyzed by sulfite on the chemical composition of sugarcane bagasse and establish a correlation of these values with the efficiency of enzymatic saccharification and fermentability of these bagasse hydrolyzate. After the initial chemical characterization, the bagasse was pretreated with neutral and alkaline sulfite and was found that cellulose was almost fully recovered in the solid fraction of the reaction. In turn, xylan obtained its maximum solubilization of 72.0% and 35.4% while the maximum delignification was 43.5% and 76.7%, for the reactions catalyzed by neutral and alkaline sulfite, respectively. The alkaline sulfite was found more effective for carbohydrates enrichment in the pretreated bagasse and led to a greater delignification, therefore, it was chosen for the following stages of the project. From a 33 full factorial experiments were obtained pretreated substrates which led to maximum enzymatic saccharification of 79.91% and 70.69% for cellulose and xylans, respectively, using 10 FPU cellulases and 10 CBU ?- glucosidase. By analysis of the glucans overall yield the optimal condition for the pretreatment has been defined as 10% (w/w) alkaline sulfide at 150°C for 30 min, which was confirmed by statistical analysis. Enzymatic hydrolysates of bagasse pretreated in optimized conditions were fermented into ethanol with efficiency of virtually 100% by Saccharomyces cerevisiae PE-2 and 80.41% by Scheffersomyces (Pichia) stipitis CBS 5773. For both yeasts, the hydrolyzate fermentation parameters were at all similar to those seen for the semisynthetic media containing pure glucose and xylose. Therefore, we concluded that the pre-treatment used in this work showed great potential to generate substrates with high enzymatic digestibility and hydrolysates as fermentable as semisynthetic media.

Os materiais lignocelulósicos possuem características que limitam a sacarificação enzimática da celulose. Entre essas características pode-se classificar a porosidade como uma das mais importantes, sendo usualmente mensurada pela técnica de exclusão de solutos. A secagem do material também pode aumentar sua recalcitrância por meio do fenômeno de hornificação. Neste contexto, o presente trabalho teve como objetivo avaliar a influência do teor de lignina e da secagem na porosidade e na sacarificação enzimática do bagaço de cana-de-açúcar. A partir de uma amostra in natura quatro amostras com teores de lignina decrescentes foram geradas, utilizando o método de deslignificação por clorito-ácido. Uma fração destas amostras foi seca ao ar em temperatura ambiente e o restante teve seu teor de umidade mantido. A análise das modificações estruturais promovidas pelo tratamento citado foi feita utilizando microscopia eletrônica de varredura (MEV). A porometria das amostras, determinada via técnica de exclusão de solutos, foi realizada utilizando 1 g de massa seca de amostra e 20 g de soluções de sondas moleculares com concentração de 1,5% (m/m); após 24 h sob agitação manual ocasional a 25 °C a determinação da distribuição do volume e área superficial de poros foi realizada com base na redução da concentração inicial da solução. O valor de retenção de água das amostras foi calculado via centrifugação. As amostras foram submetidas à sacarificação com cargas enzimática e de surfactante de 10 FPU e 0,025 g de Tween 20 por grama de bagaço, respectivamente. A reação ocorreu a 45 °C sob agitação de 150 rpm e a conversão de celulose foi medida após 2, 8, 24 e 72 h. As amostras deslignificadas por 1, 2, 3 e 4 horas apresentaram 14,2; 9,2; 8,0 e 5,9% de lignina, respectivamente, enquanto que a amostra in natura foi composta por 20,7%. Por meio das análises feitas por MEV, pôde-se observar que a remoção de lignina acarretou em uma descompactação estrutural dos feixes vasculares. As amostras com maiores teores de lignina apresentaram menores volumes e áreas superficiais de poros e piores conversões enzimáticas de celulose. Para a amostra in natura o volume total de poros foi de 0,89 mL/g de bagaço enquanto que para as amostras deslignificadas por 1, 2, 3 e 4 horas este volume foi de 1,19, 1,77, 1,92 e 2,21 mL/g de bagaço, respectivamente. A secagem reduziu o volume total de poros das amostras deslignificadas por 2, 3 e 4 horas para 1,47, 1,55 e 1,98 mL/g de bagaço respectivamente. Os valores de retenção de água foram similares aos valores de volume total de poros obtidos via técnica de exclusão de solutos. Enquanto cerca de apenas 20% da celulose da amostra in natura foi convertida após 72 h de sacarificação, a amostra com o menor teor de lignina apresentou conversão próxima a 100%. A secagem das amostras deslignificadas não alterou as taxas nem os rendimentos de sacarificação. Pode-se concluir então que o teor de lignina desempenha um papel importante na limitação da sacarificação enzimática da celulose, e que sua remoção implica num aumento do volume de poros do material. / Lignocellulosic materials present characteristics that limit the enzymatic saccharification of cellulose. Among these features, the porosity, usually measured by the solute exclusion technique, can be classified as one of the most important. Drying of the material can also increase its recalcitrance by the hornification phenomenon. In this context, this study aimed to evaluate the influences of lignin content and drying in the porosity and enzymatic saccharification of the sugar cane bagasse. From an in natura sample, other four samples with decreasing lignin contents were generated using the method of delignification by acid chlorite. A fraction of these samples was air dried at room temperature and the remainder one was kept wet. The analysis of the structural changes promoted by the aforementioned treatment was performed using scanning electron microscopy (SEM). The samples porometry, carried out using the solute exclusion technique, was performed using 1 g of sample (dry weight) and 20 g of solutions of molecular probes with concentration of 1.5% (w/w); after 24 h under occasional manual agitation at 25 °C, determination of the volume and surface area distribution of pores was carried out based on the reduction of the initial concentration of the solution. The water retention value of the samples was calculated by centrifugation. The samples were subjected to enzymatic saccharification with enzyme and surfactant loads of 10 FPU and 0.025 g of Tween 20 per gram of bagasse, respectively. The reaction was carried at 45 °C under agitation of 150 rpm and the cellulose conversion was measured after 2, 8, 24 and 72 h. Sample delignified by 1, 2, 3 and 4 hours showed 14.2, 9.2, 8.0 and 5.9% of lignin content, respectively, while the in natura sample was composed of 20.7%. Through SEM analysis, it was observed that the lignin removal resulted in a material with the vascular bundles structurally less compact and ordered. The samples with higher contents of lignin had lower volumes and surface areas of pores and worse enzymatic cellulose conversions. For the in natura sample the total pore volume was 0.89 mL/g of bagasse while for the samples delignified by 1, 2, 3 and 4 hours this volume was 1.19, 1.77, 1.92 and 2.21 mL/g of bagasse, respectively. Drying reduced the total pore volume of samples delignified by 2, 3 and 4 hours to 1.47, 1.55 and 1.98 mL/g of bagasse, respectively. The water retention values were similar to the total pore volume obtained by the solute exclusion technique. While only about 20% of the cellulose in the in natura sample was converted after 72 h of saccharification, the sample with the lowest lignin content showed a conversion close to 100%. Drying of the delignified samples did not change rates and yields of saccharification. It can be concluded then that the lignin content plays an important role on limiting the enzymatic saccharification of cellulose, and that its removal implies in increase in the pore volume of the material.

O cultivo da cana-de-açúcar é uma das atividades agrícolas mais importantes no Brasil, produzindo após a moagem o caldo, utilizado para a produção de açúcar e etanol, e o bagaço, resíduo lignocelulósico. O bagaço é recalcitrante à hidrólise enzimática, em parte pela baixa porosidade, resultante do recobrimento das fibrilas de celulose com lignina e hemicelulose. Neste estudo, o bagaço foi pré-tratado com sulfito alcalino nas concentrações de 2,5% de NaOH e 5% de Na2SO3 versus 5% de NaOH e 10% de Na2SO3 para produzir substratos para hidrólise enzimática. Ambos pré-tratamentos produziram substratos com teor de hemicelulose, grupos ácidos, grau de retenção de água e área superficial semelhantes. O conteúdo de lignina foi bem diferente nos bagaços pré-tratados com 5% de sulfito (21% de lignina) e 10% de sulfito (13% de lignina). A hidrólise da celulose e hemicelulose do bagaço com alto teor de lignina, utilizando a carga enzimática de 40 FPU/g e 80 U/g de ?-glicosidase foram próximas a 50% em 48 horas e, mesmo no bagaço com pouca lignina a conversão dos polissacarídeos não foi completa (90%). Considerando a importância do tipo de enzimas para a conversão dos polissacarídeos dos bagaços pré-tratados, realizou-se um planejamento experimental 24 com 6 pontos centrais ampliado em estrela, para avaliar uma mistura de enzimas partindo de 5 FPU/g do extrato comercial de Trichoderma reesei (celluclast) combinado com enzimas purificadas comerciais: xilanase de Neocallimastix patriciarum (família 10), xilanase de Thermotoga maritima (família 11), ?-xilosidase de Selelomonas ruminantium e ?-glicosidase de Aspergillus niger. A aplicação da mistura de enzimas otimizada no bagaço pré-tratado com alta carga de sulfito aumentou a conversão de celulose e hemicelulose em 6,6% e 15% respectivamente, comparado com a mistura de referência (5FPU de celluclast e 10UI de Novozyme 188 por grama de bagaço). A suplementação da celluclast com ?-xilosidase e ?- glicosidase foi estatisticamente significativa em 24 horas de hidrólise a um nível de 95% de confiança e a interação da xilanase 10 e 11 foi significativa com um nível de confiança de 90%. Quando foram realizados os mesmos ensaios do planejamento com o substrato com alto teor de lignina, as hidrólises da celulose e hemicelulose com a mistura de enzimas foram inferiores à obtida com a referência. A suplementação com xilanases e ?-xilosidase aumentou a conversão enzimática da hemicelulose apenas do substrato com pouca lignina, entretanto nos hidrolisados de ambos os substratos foi detectada a presença de xilooligossacarídeos, indicando a necessidade de adição de mais ?-xilosidase à mistura enzimática. As velocidades iniciais de hidrólise da celulose e hemicelulose foram pouco alteradas quando a lignina do bagaço reduziu de 21% para 13%, porém a conversão em 48 h de reação foi o dobro. Este estudo mostrou que o acesso das enzimas à hemicelulose foi limitado pelo alto teor de lignina do substrato, e que o benefício do uso de xilanases para a conversão de celulose foi obtido no substrato pré-tratado com alta carga de sulfito. / The cultivation of sugarcane is one of the most important agricultural activities in Brazil. The juice obtained from the crushed stalks of sugarcane is used to produce sugar and ethanol and the dry, fibrous residue remaining is the bagasse. Bagasse is recalcitrant to enzymatic hydrolysis, in part by low porosity due to the partial filling of space between the cellulose microfibrils by lignin and hemicelluloses. In this study, bagasses were pretreated with alkaline sulfite at concentrations of 2.5% NaOH and 5% Na2SO3 NaOH versus 5% and 10% Na2SO3 to produce substrates for enzymatic hydrolysis. Both substrates presented similar hemicellulose content, acid groups, water retention and specific surface area. Lignin content differed between pretreated bagasse with 5% sulfite (21%) and 10% sulfite (13%). The hydrolysis of cellulose and hemicellulose of bagasse with high lignin content, using 40 FPU/g and 80 U/g of ?-glucosidase was aproximately 50% in 48 hours and even on bagasse with low lignin content, the polysaccharides conversion was not complete (90%). Considering the importance of the type of enzymes for the conversion of polysaccharides of pretreated bagasses, a 24 full factorial experimental design with six central points was performed to evaluate a mixture of enzymes. A load of 5 FPU/g of Trichoderma reesei extract (celluclast) was combined with purified commercial enzymes: Neocallimastix patriciarum xylanase (family 10), Thermotoga maritima xylanase (family 11), Selelomonas ruminantium ?-xylosidase and ?-glucosidase from Aspergillus niger. The optimized mixture improved the conversion of cellulose and hemicellulose of the substrate with low lignin content in 6.6% and 15% respectively, when compared to the reference mixture (5FPU of celluclast and 10 IU of novozyme 188 per gram of bagasse). Supplementation with ?-xylosidase and ?-glucosidase was statistically significant at 24 hours of reaction and also the interaction of xylanases 10 and 11. When the same assays were performed with the substrate with low lignin, hydrolysis of the cellulose and hemicellulose with a mixture of purified enzymes was inferior to that obtained by the reference. Supplementation with xylanase and ?-xylosidase improved the enzymatic conversion only for substrate with low lignin content, however in supernatants of both substrates was detected the presence of xylo-oligosaccharides, suggesting the need for further addition of ?-xylosidase to the enzyme mixture. Initial rate of cellulose and hemicellulose hydrolysis changed very little when the lignin in the bagasse was reduced from 21% to 13%, but the conversion at 48 h conversion time was twice higher. This study showed that access of enzymes to the hemicellulose was limited by the high lignin content of the substrate, and that the benefit of using xylanases for the conversion of cellulose was obtained on the substrate pretreated with high sulfite load.

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:26:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese Wagner Rodrigues de Carvalho.pdf: 2607795 bytes, checksum: 19e8481b5eb319af71b9e1f22666f1d9 (MD5) Previous issue date: 2008-06-30 / Xylanases have been used in the biobleaching of paper pulps, in bioconversion of plant biomass, for food and feed industries, among others. For successful selection of xylanases suitable for specific industrial applications it is important to characterize enzymes isolated from different sources. The thermophilic fungus Humicola grisea var. thermoidea is described as a good producer of extracellular endoxylanases and the Hxyn2 gene from this fungus was isolated and expressed in yeast Pichia pastoris. The aim of this project was focused on the production, purification and biochemical characterization of the recombinant HXYN2 (HXYN2r) enzyme and application on enzymatic hydrolysis of lignocellulosics substrates. The culture conditions of P. pastoris in flasks, using the 12.3 transformant and BMMY-U medium, were optimized and the best xylanolytic activity was 478.2 U/mL after 96 h, with a protein concentration of 100 mg/L, using 2.34% (w/v) of nitrogen sources (yeast extract plus urea 1.34:1.0% - w/v), 1% (v/v) of methanol, and OD600 of 10. The HXYN2r enzyme was purified by gel filtration chromatography with a yield of 6.4% and showed optimum pH and temperature values of 6.5 and 60ºC, respectively, maintaining 100% of initial activity after 4 h of incubation at pH 5.5, 6.5 and 7.5. The half-life time was 18 min at 60ºC and the enzyme was 100% stable after 3 h of incubation at 50ºC. Km and Vmax values were 7.9 mg/mL e 235.4 μmol/(mL.min), respectively. The HXYN2r enzyme were used on the enzymatic hydrolysis of sugarcane bagasse (SCB), corn cob (CC) and foliar sample of sugarcane (FSC) alone or with the enzymes of xylanolytic and cellulolytic system produced by H. grisea fungus. For enzymatic hydrolysis experiments, the substrates were milled and pretreated with 0.25% (w/v) of H2SO4 by 30 min. On the enzymatic hydrolysis the best conversion yield of hemicellulosic fractions were obtained using PpHXYN2r supplemented with EHg: 42.8% to CC, 9.6% to SCB and, a mean of 20% to foliar samples. / As endoxilanases têm sido utilizadas no biobranqueamento da polpa de papel, na bioconversão da biomassa de plantas, nas indústrias alimentícias e de ração animal, entre outras. Para a seleção de endoxilanases que possam ser empregadas em processos industriais específicos é importante caracterizar enzimas isoladas de diferentes fontes. O fungo termofílico Humicola grisea var. thermoidea é um bom produtor de endoxilanases extracelulares e o gene que codifica uma das endoxilanases (HXYN2) deste fungo foi isolado e expresso na levedura Pichia pastoris. O presente trabalho se concentrou na produção, purificação e caracterização bioquímica da endoxilanase recombinante HXYN2 e na sua aplicação na hidrólise enzimática de substratos lignocelulósicos. As condições de cultivo da levedura P. pastoris em frascos, utilizando o transformante 12.3 e o meio BMMY-U foram otimizadas e obteve-se uma atividade xilanolítica de 478,2 U/mL após 96 h de cultivo, com uma concentração de 100 mg/L de proteínas, utilizando 2,34% (p/v) de fontes de nitrogênio (extrato de levedura e urea 1,34:1,0% - p/v), 1% (v/v) de metanol e DO600 de 10. A enzima HXYN2r foi purificada por cromatografia de filtração em gel com um rendimento de 6,4% e apresentou pH e temperatura ótimos de 6,5 e 60ºC, respectivamente, mantendo 100% da atividade inicial após 4 h de incubação nos pH s 5,5, 6,5 e 7,5. O tempo de meia-vida foi de 18 min a 60ºC e a enzima manteve 100% da atividade após 3 h de incubação a 50ºC. Os valores de Km e Vmáx foram 7,9 mg/mL e 235,4 μmol/(mL.min), respectivamente. A enzima HXYN2r foi aplicada na hidrólise enzimática de sabugo de milho (SM), bagaço de cana-de-açúcar (BCA) e palha de cana-de-açúcar (PCA) sozinha ou em conjunto com as enzimas do sistema xilanolítico e celulolítico produzidas pelo fungo H. grisea. Para os experimentos de hidrólise enzimática os substratos testados foram moídos e submetidos a uma etapa de pré-tratamento com 0,25% (p/v) de H2SO4 por 30 min. Nos ensaios de hidrólise enzimática as melhores taxas de conversão da fração hemicelulósica dos substratos foram obtidas utilizando-se a PpHXYN2r suplementado com o EHg: 42,8% para o SM; 9,6% para o BCA e, em média 20% para as amostras foliares.