El remodelat vascular es un procés crític que present en el desenvolupament de patologies cardiovasculars com l’aterosclerosi i l’aneurisma d’aorta abdominal (AAA). La Lisil Oxidasa (LOX) i la Fibulina-5 (FBLN5) són dues proteïnes de matriu extracel•lular essencials en la formació i manteniment de les fibres elàstiques. Ambdues participen en processos fisiopatològics caracteritzats per l’alteració de l’equilibri síntesi/destrucció de la matriu extracel•lular i han estat involucrades en el remodelat vascular. Estudis en models experimentals han proporcionat indicis sobre la possible vinculació d’aquestes proteïnes en el desenvolupament d’aterosclerosi i d’AAA, si bé existeixen molts aspectes de la biologia d’aquestes proteïnes que haurien de ser analitzats en profunditat. Un aspecte crític en el remodelat vascular associat a la progressió de la lesió ateroscleròtica és l’aparició de regions d’hipòxia. L’estrès hipòxic és característic d’alguns processos fisiològics, però també de patologies com el càncer, els trastorns isquèmics, la inflamació crònica i l’aterosclerosi. Les cèl•lules endotelials són els sensors primaris d’aquest estrés hipòxic, i la seva adaptació a la hipòxia es produeix a través d’una complexa resposta finament regulada que afecta múltiples aspectes de la seva biologia, com la supervivència cel•lular, el control del to i la permeabilitat vascular, l’angiogènesi i el remodelat de la matriu extracel•lular. No obstant, no s’ha establert si la hipòxia pot regular la expressió de la LOX i la FBLN5 en cèl•lules endotelials ni la repercussió fisiològica que podria tenir. Les investigacions desenvolupades pel nostre grup indiquen que la LOX és un enzim clau en el manteniment de la integritat de l’endoteli i de la funció endotelial. La capacitat d’aquest enzim de controlar l’expressió gènica, en base a la seva activitat al nucli, així com l’activitat de factors de creixement fonamentals en l’homeòstasi vascular com el bFGF i el PDGF, suggereix que aquest enzim controla funcions cel•lulars que poden ser determinants en el desenvolupament de malalties cardiovasculars. En base a aquests antecedents, ens hem plantejat com a hipòtesis de treball que la LOX i la FBLN5 són proteïnes clau en l’homeòstasi vascular, que participen en la resposta adaptativa de les cèl•lules vasculars a la hipòxia, i que contribueixen al desenvolupament de patologies vasculars com l’aterosclerosi i l’aneurisma d’aorta abdominal. Els nostres resultats han demostrat que en artèries coronàries humanes, la LOX s’expressa principalment a l’endoteli i a l’adventícia, i que és la isoforma més expressada en cèl•lules vasculars, juntament amb la LOXL2. En cèl•lules endotelials, l’expressió de LOX i FBLN5 s’incrementa en resposta a hipòxia a través de mecanismes transcripcionals, si bé amb clares diferències entre ambdues proteïnes. Així, el factor HIF-1 juga un paper secundari en la regulació de la LOX per hipòxia en cèl•lules endotelials, una resposta en la que estan involucrades proteïnes de la família Smad i l’estrès oxidatiu. Per contra, HIF-1 és el principal responsable de la inducció de la FBLN5 en cèl•lules endotelials, en les quals hem demostrat que aquesta proteïna contribueix a la resposta adaptativa a l’estrès hipòxic. Finalment, hem observat que la sobre-expressió de LOX en cèl•lules endotelials mitjançant un sistema lentiviral indueix canvis en l’expressió gènica que afecten la senyalització i la comunicació cèl•lula-cèl•lula, d’entre els quals en destaca la inhibició de l’α2-macroglobulina. / Vascular remodeling is a critical process in the development of cardiovascular diseases such as atherosclerosis and abdominal aorta aneurysm (AAA). Lysyl oxidase (LOX) and Fibulin-5 (FBLN5) are two extracellular matrix proteins essential for the elastic fiber development and maintenance, and they both have an active role in physiological processes in which vascular remodeling is involved. By using different animal models, these proteins have been suggested to be involved with atherosclerosis and AAA. A critical aspect of the vascular remodeling in the atherosclerotic lesion is the apparition of hypoxic areas. Endothelial cells are primary sensors to the hypoxic stress, responding to it in a complex but subtly regulated way that affects multiple aspects of its biology. Nevertheless, it has not been established if the hypoxic stimulus can modulate LOX and FBLN5 expression, nor its possible physiological repercussions. Research made in our group shows the importance of LOX in the endothelial activity and vascular function. LOX can control the genetic expression as well as the activity of growth factors essential for the vascular homeostasis, suggesting that this enzyme may control cellular functions essential for the development of cardiovascular diseases. Based on these results, we have considered as working hypothesis that LOX and FBLN5 are key proteins in the vascular homeostasis, that they take part of the vascular response to hypoxia, and that they contribute to the development of vascular diseases like atherosclerosis and the AAA. Our results show that hypoxia transcriptionally induces LOX and FBLN5 in endothelial cells. While HIF-1 plays a secondary role in the regulation of LOX, being also involved in this modulation Smad proteins and oxidative stress, it is the main factor responsible for the FBLN5 induction. We also demonstrate that the modulation of FBLN5 in endothelial cells contributes to their adaptive response to hypoxia. Moreover, we have observed that overexpressing LOX in endothelial cells downregulates α2-macroglobulin expression.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O oxigênio é importante não só por sua participação no metabolismo energético, mas também por sua conversão em derivados parcialmente reduzidos, as espécies reativas de oxigênio (ERO). ERO participam de funções importantes em diversas vias do metabolismo, entretanto, em concentrações desequilibradamente elevadas deflagram a peroxidação lipídica, processo deletério que forma aldeídos tóxicos, como o 4-hidroxi-2-nonenal (4-HNE). A manutenção de concentrações não deletérias das ERO é realizada por moléculas componentes do sistema antioxidante. Peixes podem ser expostos a grandes variações das concentrações de oxigênio, o que provoca ciclos oxidantes. A maioria dos estudos usa fígado e rim para avaliar estresse oxidante por meio de ensaios das atividades antioxidantes, o que requer o sacrifício dos animais. Contudo, o sangue sofre efeitos das ERO e avaliações no sangue podem permitir o estudo de antioxidantes no mesmo animal, sem a necessidade de sacrifício. Em consequência, foram nossos objetivos estabelecer uma técnica de cateterismo branquial em peixes, a padronização dos ensaios e a avaliação em sangue de componentes do sistema antioxidante de duas espécies de teleósteos em diferentes tensões de oxigênio. Pacus e tilápias foram avaliados em 6,0 mg de O2.L-1 e em hipoxia a 0,5 mg de O2.L-1 por 42 horas . Para os ensaios de hiperoxia os animais foram avaliados em 6,0 mg de O2.L-1, depois de 6 horas em 9,5 mg de O2.L-1 e depois de 30 horas de recuperação a 6,0 mg de O2.L-1. A utilização de materiais para o cateterismo de humanos permitiu a implantação de um acesso branquial. Infelizmente, houve formação de trombo após 24 horas. Mesmo assim, a observação de fluxo sanguíneo no interior da cânula e a sobrevida dos animais testados, confirmam a viabilidade da técnica. Verificamos em sangue uma maior atividade da enzima glutationa S-transferase (GST) sobre o 4-HNE em relação ao 1-cloro-2-dinitrobenzeno (CDNB). Isto reflete a importância de avaliações de atividade de enzimas, como a GST, sobre substratos endógenos. As respostas enzimáticas de tilápias mostraram-se mais sensíveis que as dos pacus quando comparadas em diferentes tensões de oxigênio. / Oxygen is important not only for their role in energy metabolism, but also for its conversion into partially reduced derivatives, the reactive oxygen species (ROS). ROS participate in important roles in several metabolic pathways, however, at concentrations lopsidedly high they trigger lipid peroxidation process to form deleterious toxic aldehydes such as 4-hydroxy-2-nonenal (4-HNE). Maintenance of non deleterious concentrations of ROS molecules is performed by components of the antioxidant system. Fish may be exposed to large variations in the concentrations of oxygen, which causes oxidative cycles. Most studies use liver and kidney to assess oxidative stress through antioxidant activities assay, which requires the sacrifice of animals. However, the blood undergoes effects of ROS and evaluations in blood may allow the study of antioxidants in the same animal, without the need of sacrifice. Consequently, our objectives were to establish a catheterization technique in fish gill, standardization of testing and evaluation of components of blood antioxidant system of two species of teleost in various oxygen tensions. Pacus and tilapias were evaluated at 6.0 mg O2.L-1 hypoxia and 0.5 mg O2.L-1 for 42 hours. For assays of hyperoxia animals were evaluated at 6.0 mg O2.L-1, after 6 hours at 9.5 mg O2.L-1 and after 30 hours recovery at 6.0 mg O2.L-1. The use of materials of human catheterization allowed the implantation of a gill access. Unfortunately, there was thrombus formation after 24 hours. Nevertheless, the observation of blood flow within the cannula and survival of the animals tested, confirm the viability of the technique. We found blood in a higher activity of glutathione S-transferase (GST) on the 4-HNE compared to 1-chloro-2-dinitrobenzene (CDNB). This reflects the importance of assessing the activity of enzymes, such as GST with endogenous substrates. The enzymatic responses of tilapia were more sensitive than those of pacus when compared to different oxygen tensions.

Submitted by Gabriela Lopes (gmachadolopesufpel@gmail.com) on 2016-09-28T12:43:45Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) DISSERTAÇÃO CD 2.pdf: 3402780 bytes, checksum: 6767c83b34c1fb208e8cd7bc97b095d1 (MD5) / Approved for entry into archive by Aline Batista (alinehb.ufpel@gmail.com) on 2016-09-28T17:17:17Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) DISSERTAÇÃO CD 2.pdf: 3402780 bytes, checksum: 6767c83b34c1fb208e8cd7bc97b095d1 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-28T17:17:17Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) DISSERTAÇÃO CD 2.pdf: 3402780 bytes, checksum: 6767c83b34c1fb208e8cd7bc97b095d1 (MD5) Previous issue date: 2014-02-28 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / O crescimento populacional mundial tem contribuído para uma maior demanda de arroz, enquanto que alterações ambientais, causadas pelo homem, contribuem com o aumento da frequência de precipitações. Estas condições formam um ambiente de hipoxia, e restringem a produção do arroz. Frente a isso as plantas respondem com adaptações morfológicas e alterações em nível molecular. Portanto, este trabalho teve como objetivo avaliar os efeitos morfológicos e anatômicos em cultivares de arroz Oryza sativa L. submetidas a hipoxia e verificar o perfil de expressão dos genes de regulação complexa e simples de fatores de transcrição WRKY envolvidos na resposta ao estresse por hipoxia. Os resultados obtidos demonstraram que ocorre alterações morfológicas e anatômicas nas cultivares de arroz irrigado quando submetidas ao estresse por hipoxia, principalmente no sistema radicular. Ainda, o aerênquima é mais desenvolvido nas cultivares Epagri 108 e Nipponbare quando submetidas ao estresse por hipoxia. No estudo de expressão gênica através da técnica de qRT-PCR, foi possível observar que os genes WRKY responderam ao estresse por hipoxia, mas não foi possível, para este estresse, verificar uma diferença entre a resposta do perfil de expressão dos genes de regulação simples e complexa em plântulas de arroz sob estresse por hipoxia. / The growth of the world’s population has contributed for a greater demand of rice while environmental alterations caused by men contribute to an increase of rainfall. This conditions create a hypoxia environment and restrict the production of rice. Under these conditions, plants with morphological adaptations and alterations in molecular level. Thus, this work had as its objective to evaluate the morphological and anatomical effects in rice cultivars Oryza sativa L. submitted to hypoxia and to verify the expression profile of genes of complex and simple regulation of WRKY transcription factors involved in the response of stress by hypoxia. The results obtained demonstrated that morphological and anatomical alterations occur in cultivars of irrigated rice when submitted to stress by hypoxia, manly in their root system. Furthermore, the aerenchyma is more developed in the cultivars Epagri 108 and Nipponbare when submitted to stress by hypoxia. In the study of genic expression through the qRT-PCR technique, it was possible to observe that the WRKY genes responded to stress by hypoxia but it not possible, for this stress, to verify a difference between the response of the expression profile of genes of simple and complex regulation in seedlings of rice under stress by hypoxia.

[ES] Las especies reactivas de oxígeno (ROS), el oxígeno molecular (O2) y el óxido nítrico (NO) son factores comunes en las respuestas a diferentes tipos de estrés en las plantas. En los últimos años, las condiciones ambientales adversas han aumentado debido al cambio climático y, entre ellas, las fuertes lluvias que provocan anegaciones o inundaciones en los campos suponen un grave problema para el desarrollo y el futuro de la agricultura. Estas inundaciones provocan que la planta se enfrente a condiciones de hipoxia severas y a la re-oxigenación que ocurre cuando se retira el agua. Es importante, por tanto, conocer los factores genéticos y moleculares que modulan las respuestas de las plantas a la hipoxia u otros tipos de estrés abiótico para hacer frente a estas situaciones. La familia de proteínas VQ de Arabidopsis thaliana incluye cinco miembros codificados por genes que se inducen en respuesta a la hipoxia, al NO y al estrés oxidativo. Dos de ellos, VQ1 y VQ10, codifican dos proteínas con una gran homología de secuencia y estructura, que no poseen actividad transcripcional. En este trabajo, se describe que VQ1 y VQ10 interaccionan entre sí y con ellas mismas, y con las otras tres proteínas VQ y cuatro factores de transcripción WRKY cuyos genes también se inducen en respuesta a hipoxia, NO y estrés oxidativo. Un rastreo de doble híbrido de levadura de una genoteca de Arabidopsis utilizando VQ1 como cebo permitió identificar alrededor de 300 proteínas interactoras de VQ1 y probablemente también de VQ10, sugiriendo que ambas proteínas tienen patrones similares de interacción proteína-proteína. VQ1 y VQ10 son proteínas citoplásmicas y nucleares, por lo que la identificación de casi 50 proteínas cloroplásticas que interaccionan con VQ1 en el cloroplasto sugiere que estas interacciones deben ocurrir en el citoplasma. En el rastreo se identificó la 1-desoxi-D-xilulosa-5-fosfato sintasa (DXS), una enzima clave para la biosíntesis de isoprenoides, la fotosíntesis y el crecimiento de las plantas. Al co-inmunoprecipitar DXS y VQ1 o VQ10 se observó que VQ1 y sobre todo VQ10 favorecieron la monomerización de DXS en un ambiente reductor. A partir de la identificación de un mutante hipermórfico vq10-H se ha procedido a caracterizar algunas de las funciones reguladoras ejercidas por VQ10. El análisis transcriptómico comparado de vq10-H y plantas silvestres Col-0 permitió identificar la regulación ejercida por VQ10 en el desarrollo de las raíces, en las respuestas a NO y estrés oxidativo, así como una potencial función reguladora del procesamiento alternativo de ARNs. La sobreexpresión de VQ10 provocó el aumento de la elongación de la raíz primaria, y de la división y elongación celular en la raíz. También provocó una mayor tolerancia al estrés oxidativo, una menor sensibilidad al NO, y una mayor eficiencia fotosintética en comparación con las plantas silvestres. En conjunto, el trabajo realizado en esta Tesis sugiere que algunas funciones reguladoras de VQ1 y VQ10 en el desarrollo y las respuestas a estrés de las plantas podría estar basado en mecanismos de regulación redox. / [CA] Les espècies reactives d'oxigen (ROS), l'oxigen molecular (O2) i l'òxid nítric (NO) són factors comuns en les respostes a diferents tipus d'estrés en les plantes. En els últims anys, les condicions ambientals adverses han augmentat a causa del canvi climàtic i, entre elles, les fortes pluges que provoquen inundacions als camps suposen un greu problema per al desenvolupament i el futur de l'agricultura. Aquestes inundacions provoquen que la planta s'enfronte a condicions d'hipòxia severes i a la re-oxigenació que ocorre quan es retira l'aigua. És important, per tant, conéixer els factors genètics i moleculars que modulen les respostes de les plantes a l'hipòxia o altres tipus d'estrés abiòtic per a fer front a aquestes situacions. La família de proteïnes VQ d'Arabidopsis thaliana inclou cinc membres codificats per gens que s'indueixen com a resposta a l'hipòxia, al NO i a l'estrés oxidatiu. Dos d'ells, VQ1 i VQ10, codifiquen dues proteïnes amb una gran homologia de seqüència i estructura, que no posseeixen activitat transcripcional. En aquest treball, es descriu que VQ1 i VQ10 interaccionen entre si i amb elles mateixes, i amb les altres tres proteïnes VQ i quatre factors de transcripció WRKY, els gens dels quals també s'indueixen com a resposta a hipòxia, NO i estrés oxidatiu. Un rastreig amb la técnica del doble híbrid en llevat d'una genoteca d'Arabidopsis utilitzant VQ1 com a esquer va permetre identificar al voltant de 300 proteïnes interactores de VQ1 i probablement també de VQ10, suggerint que ambdues proteïnes tenen patrons similars d'interacció proteïna-proteïna. VQ1 i VQ10 són proteïnes citoplasmàtiques i nuclears, de manera que la identificació de gairebé 50 proteïnes cloroplàstiques que interaccionen amb VQ1 en el cloroplast suggereix que aquestes interaccions han d'ocorrer al citoplasma. En el rastreig es va identificar la 1-desoxi-D-xilulosa-5-fosfat sintasa (DXS), un enzim clau per a la biosíntesi d'isoprenoides, la fotosíntesi i el creixement de les plantes. En co-immunoprecipitar DXS i VQ1 o VQ10 es va observar que VQ1 i sobretot VQ10 van afavorir la monomerització de DXS en un ambient reductor. A partir de la identificación d'un mutant hipermòrfic vq10-H s'ha procedit a caracteritzar algunes de les funcions reguladores exercides per VQ10. L'anàlisi transcriptòmic comparat de vq10-H i plantes silvestres Col-0 va permetre identificar la regulació exercida per VQ10 en el desenvolupament de les arrels, en les respostes a NO i estrès oxidatiu, així com una potencial funció reguladora del processament alternatiu d'ARNs. La sobreexpressió de VQ10 va provocar l'augment de l'elongació de l'arrel primària, i de la divisió i elongació cel·lular a l'arrel. També va provocar una major tolerància a l'estrès oxidatiu, una menor sensibilitat al NO, i una major eficiencia fotosintètica en comparació amb les plantes silvestres. En conjunt, el treball realitzat en aquesta Tesi suggereix que algunes funcions reguladores de VQ1 i VQ10 en el desenvolupament i les respostes a estrés de les plantes podria estar basat en mecanismes de regulació redox. / [EN] Reactive oxygen species (ROS), molecular oxygen (O2), and nitric oxide (NO) are common factors in diverse plant stress responses. In the past few years, adverse environmental conditions have increased due to climate change, including heavy rains leading to waterlogging or flooding in fields, posing a serious problem for agriculture's development and future. Floods impose severe hypoxia conditions to plants to be later re-oxygenated when water recedes. Therefore, it is essential to understand the genetic and molecular factors that modulate plant responses to hypoxia and other abiotic stresses to address these situations. The VQ-motif containing protein family in Arabidopsis thaliana includes five members encoded by genes induced in response to hypoxia, NO, and oxidative stress. Two of them, VQ1 and VQ10, encode two proteins with significant sequence and structural homology, lacking transcriptional activity. In this study, it is described that VQ1 and VQ10 interact with each other and themselves, as well as with the other three VQ proteins and four WRKY transcription factors whose genes are also induced in response to hypoxia, NO, and oxidative stress. A yeast two-hybrid screening of an Arabidopsis library using VQ1 as bait allowed us identifying almost 300 VQ1-interacting proteins, that likely also interact with VQ10, suggesting that their homology can be extended to protein-protein interaction patterns. VQ1 and VQ10 are cytoplasmic and nuclear proteins, so the identification of nearly 50 chloroplast proteins interacting with VQ1 in the chloroplast suggests that these interactions may be occurring in the cytoplasm. 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase (DXS), a key enzyme in isoprenoid biosynthesis, photosynthesis, and plant growth, was identified in the screening. Co-immunoprecipitation of DXS with VQ1 or VQ10 showed that VQ1 and, particularly, VQ10 promoted the monomerization of DXS under reducing conditions. Based on the identification of a hypermorphic vq10-H mutant, some of the regulatory functions exerted by VQ10 have been characterized. Comparative transcriptomic analysis of the hypermorphic vq10-H mutant and Col-0 wild type plants allowed us identifying the regulation exerted by VQ10 in root development, in responses to NO and oxidative stress, as well as in the alternative splicing of RNAs. Overexpression of VQ10 led to increased primary root elongation, and increased root cell division and elongation. It also triggered an enhanced oxidative stress tolerance, reduced sensitivity to NO, and enhanced photosynthetic efficiency compared to wild type plants. Altogether, the work carried out in this thesis suggest that some of the regulatory functions exerted by VQ1 and VQ10 on development and stress responses in plants, could be based on redox mechanisms. / Gayubas Balaguer, B. (2023). Función de las proteínas VQ1 y VQ10 codificadas por genes inducibles por hipoxia, óxido nítrico, y estrés oxidativo en la regulación del desarrollo y las respuestas a estrés en Arabidopsis thaliana [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/202571

Objetivo: Avaliar a relação das alterações de fluxo na artéria cerebral média (ACM) com a ocorrência de acidemia no nascimento, em gestações com insuficiência placentária. Métodos: estudo transversal prospectivo com 91 gestações com diagnóstico de insuficiência placentária pelo Doppler de artéria umbilical (AU) alterado (índice de pulsatilidade [IP] > p95). Os critérios de inclusão foram: gestações únicas com idade gestacional (IG) superior a 26 semanas completas, membranas ovulares íntegras, ausência de anomalias cromossômicas ou congênitas. Os parâmetros da dopplervelocimetria analisados foram: IP da AU, IP da ACM, pico de velocidade sistólica (PVS) da ACM, relação cerebroplacentária (RCP) e índice de pulsatilidade para veias (IPV) do ducto venoso (DV). Foi analisada a última avaliação fetal realizada imediatamente antes do parto ou anterior à corticoterapia. Todos os parâmetros foram analisados por meio do escore zeta ou múltiplos da mediana (MoM), baseados nas médias, desvio-padrão e valores de referência para cada IG. Imediatamente após o parto, uma amostra de sangue da artéria umbilical foi obtida para a medida do pH, e os casos classificados de acordo com a presença (pH < 7,20) ou ausência de acidemia no nascimento. Resultados: Quarenta e sete (51,6%) recémnascidos apresentaram acidemia no nascimento. Os fetos que evoluíram com acidemia apresentaram valor de escore zeta do IP da AU significativamente maior (mediana 2,1 vs 1,7; p=0,014), assim como maior proporção de casos com diástole zero ou reversa (51,0% vs 31,8%; p=0,006). Quanto à ACM, o escore zeta mostrou-se significativamente menor nos casos com pH < 7,20 (mediana -2,7 vs -2,1; p=0,042), porém, em relação ao PVS não foi possível estabelecer diferença significativa entre os grupos (p=0,051). A acidemia no nascimento se associou a menores valores de RCP (mediana 0,5 vs 0,7; p=0,006), porém não ao seu escore zeta (p=0,055). Em relação ao território venoso, maiores valores do escore zeta do IPV do DV associaram-se à acidemia (mediana 2,4 vs 0,6; p=0,015). Na análise de correlação entre os valores de pH no nascimento e os resultados da avaliação da dopplervelocimetria fetal, foi constatada correlação significativa entre o valor do pH no nascimento e o escore zeta do IP da AU (rho=-0,31; p=0,003), IP da ACM (rho=0,26; p=0,012), da RCP (rho 0,25; p=0,015) e IPV do DV (rho=-0,32; p=0,002), e PVS da ACM MoM (rho=-0,21; p=0,042). A regressão logística identificou o escore zeta do IP da AU e escore zeta IP da ACM como variáveis independentes para a predição de acidemia no nascimento, classificando corretamente 67,03% dos casos. Conclusão: em casos de insuficiência placentária, o IP da AU e da ACM são preditores independentes associados com a acidemia no nascimento. Este estudo reforça que o grau de insuficiência placentária e a capacidade de adaptação fetal estão diretamente relacionados com a acidemia no nascimento / Objectives: To evaluate the relationship between middle cerebral artery (MCA) parameters and acidemia at birth, in pregnancies complicated by placental insufficiency. Methods: The study was performed as a prospective cross-sectional analysis of Doppler measurements in 91 patients with the diagnosis of placental dysfunction by abnormal umbilical artery (UA) Doppler (pulsatility index [PI] > p95). Inclusion criteria were: singleton pregnancy, intact membranes, abscence of fetal congenital or chromosomal abnormalities. The Doppler parameters analyzed were: UA PI, MCA PI, MCA peak systolic velocity (PSV), cerebroplacental ratio (CPR) and pulsatilility index for veins (PIV) of ductus venosus (DV). It was analyzed the last assessment obtained right before birth or the antenatal steroids. Umbical artey blood samples were collected at birth, and acidemia was defined as pH below 7.20. Results: Forty seven (51.6%) newborns had acidemia at birth. Those who developed acidemia showed a UA PI z-score significantly higher (median 2.1 vs 1.7, p = 0.014), as well as a higher proportion of cases with absent or reverse end diastolic flow (51.0% vs 31.8%, p = 0.006). Regarding the MAC, the PI z-score was significantly lower in cases with pH < 7.20 (median -2.7 vs. -2.1, p = 0.042), but concerning PSV z-score, no significant relation between the groups could be established (p = 0.051).The acidemia at birth was associated with lower values of CPR (median 0.5 vs 0.7, p = 0.006), but not with its z-score (p = 0.055). In relation to the venous territory, greater values of DV PIV z-score were associated with acidemia (median 2.4 vs 0.6, p = 0.015).The correlation analysis between the pH values at birth and the Doppler measurements, a significant correlation was observed between the pH at birth and UA PI z-score (rho = -0.31, p = 0.003 ), MCA PI z-score (rho = 0.26, p = 0.012), CPR z-score (rho 0.25, p = 0.015), PIV DV zscore (rho = -0.32, p = 0.002), and PSV MCA MoM (rho = -0.21, p = 0.042). Logistic regression identified the UA PI z-score and the MCA PI z-score as independent predictors for acidemia at birth, correctly classifying 67.03% of cases. Conclusion: In pregnancies with placental insufficiency, the UA PI and the MCA PI are independent predictors associated with acidemia at birth. This study reinforces that the degree of placental insufficiency and the fetal adaptation capacity are directly related to acidemia at birth

Objetivo: Avaliar a relação das alterações de fluxo na artéria cerebral média (ACM) com a ocorrência de acidemia no nascimento, em gestações com insuficiência placentária. Métodos: estudo transversal prospectivo com 91 gestações com diagnóstico de insuficiência placentária pelo Doppler de artéria umbilical (AU) alterado (índice de pulsatilidade [IP] > p95). Os critérios de inclusão foram: gestações únicas com idade gestacional (IG) superior a 26 semanas completas, membranas ovulares íntegras, ausência de anomalias cromossômicas ou congênitas. Os parâmetros da dopplervelocimetria analisados foram: IP da AU, IP da ACM, pico de velocidade sistólica (PVS) da ACM, relação cerebroplacentária (RCP) e índice de pulsatilidade para veias (IPV) do ducto venoso (DV). Foi analisada a última avaliação fetal realizada imediatamente antes do parto ou anterior à corticoterapia. Todos os parâmetros foram analisados por meio do escore zeta ou múltiplos da mediana (MoM), baseados nas médias, desvio-padrão e valores de referência para cada IG. Imediatamente após o parto, uma amostra de sangue da artéria umbilical foi obtida para a medida do pH, e os casos classificados de acordo com a presença (pH < 7,20) ou ausência de acidemia no nascimento. Resultados: Quarenta e sete (51,6%) recémnascidos apresentaram acidemia no nascimento. Os fetos que evoluíram com acidemia apresentaram valor de escore zeta do IP da AU significativamente maior (mediana 2,1 vs 1,7; p=0,014), assim como maior proporção de casos com diástole zero ou reversa (51,0% vs 31,8%; p=0,006). Quanto à ACM, o escore zeta mostrou-se significativamente menor nos casos com pH < 7,20 (mediana -2,7 vs -2,1; p=0,042), porém, em relação ao PVS não foi possível estabelecer diferença significativa entre os grupos (p=0,051). A acidemia no nascimento se associou a menores valores de RCP (mediana 0,5 vs 0,7; p=0,006), porém não ao seu escore zeta (p=0,055). Em relação ao território venoso, maiores valores do escore zeta do IPV do DV associaram-se à acidemia (mediana 2,4 vs 0,6; p=0,015). Na análise de correlação entre os valores de pH no nascimento e os resultados da avaliação da dopplervelocimetria fetal, foi constatada correlação significativa entre o valor do pH no nascimento e o escore zeta do IP da AU (rho=-0,31; p=0,003), IP da ACM (rho=0,26; p=0,012), da RCP (rho 0,25; p=0,015) e IPV do DV (rho=-0,32; p=0,002), e PVS da ACM MoM (rho=-0,21; p=0,042). A regressão logística identificou o escore zeta do IP da AU e escore zeta IP da ACM como variáveis independentes para a predição de acidemia no nascimento, classificando corretamente 67,03% dos casos. Conclusão: em casos de insuficiência placentária, o IP da AU e da ACM são preditores independentes associados com a acidemia no nascimento. Este estudo reforça que o grau de insuficiência placentária e a capacidade de adaptação fetal estão diretamente relacionados com a acidemia no nascimento / Objectives: To evaluate the relationship between middle cerebral artery (MCA) parameters and acidemia at birth, in pregnancies complicated by placental insufficiency. Methods: The study was performed as a prospective cross-sectional analysis of Doppler measurements in 91 patients with the diagnosis of placental dysfunction by abnormal umbilical artery (UA) Doppler (pulsatility index [PI] > p95). Inclusion criteria were: singleton pregnancy, intact membranes, abscence of fetal congenital or chromosomal abnormalities. The Doppler parameters analyzed were: UA PI, MCA PI, MCA peak systolic velocity (PSV), cerebroplacental ratio (CPR) and pulsatilility index for veins (PIV) of ductus venosus (DV). It was analyzed the last assessment obtained right before birth or the antenatal steroids. Umbical artey blood samples were collected at birth, and acidemia was defined as pH below 7.20. Results: Forty seven (51.6%) newborns had acidemia at birth. Those who developed acidemia showed a UA PI z-score significantly higher (median 2.1 vs 1.7, p = 0.014), as well as a higher proportion of cases with absent or reverse end diastolic flow (51.0% vs 31.8%, p = 0.006). Regarding the MAC, the PI z-score was significantly lower in cases with pH < 7.20 (median -2.7 vs. -2.1, p = 0.042), but concerning PSV z-score, no significant relation between the groups could be established (p = 0.051).The acidemia at birth was associated with lower values of CPR (median 0.5 vs 0.7, p = 0.006), but not with its z-score (p = 0.055). In relation to the venous territory, greater values of DV PIV z-score were associated with acidemia (median 2.4 vs 0.6, p = 0.015).The correlation analysis between the pH values at birth and the Doppler measurements, a significant correlation was observed between the pH at birth and UA PI z-score (rho = -0.31, p = 0.003 ), MCA PI z-score (rho = 0.26, p = 0.012), CPR z-score (rho 0.25, p = 0.015), PIV DV zscore (rho = -0.32, p = 0.002), and PSV MCA MoM (rho = -0.21, p = 0.042). Logistic regression identified the UA PI z-score and the MCA PI z-score as independent predictors for acidemia at birth, correctly classifying 67.03% of cases. Conclusion: In pregnancies with placental insufficiency, the UA PI and the MCA PI are independent predictors associated with acidemia at birth. This study reinforces that the degree of placental insufficiency and the fetal adaptation capacity are directly related to acidemia at birth

[ES] Las células mesenquimales estromales (MSC) poseen una serie de cualidades inmunológicas, pro-angiogénicas y regenerativas que las convierten en un excelente candidato para el tratamiento de diversas patologías. A pesar de las pruebas contundentes obtenidas en modelos preclínicos que demuestran la actividad terapéutica de las MSC, los ensayos clínicos no han podido mostrar hasta ahora un beneficio consistente, probablemente debido a deficiencias metodológicas y a la falta de estandarización, así como a la variabilidad genética intrínseca a los estudios en humanos. Debido a ello, ha sido necesario profundizar en los mecanismos responsables del beneficio terapéutico y rediseñar las estrategias clínicas. En los últimos años, se ha observado que la reparación tisular mediada por las MSC se produce de forma paracrina, y se ha constatado que las vesículas extracelulares (EVs) secretadas por las MSC (EVMSC) son capaces de recapitular las propiedades inmunosupresoras de las células parentales. Además, las estrategias terapéuticas basadas en vesículas tienen grandes ventajas en términos de bioseguridad y producción en condiciones de grado clínico, reduciendo significativamente el coste de dichas terapias. Sin embargo, la dosis efectiva en grandes mamíferos, incluidos los humanos, es bastante elevada y la producción industrial de EVs se ve dificultada en parte, por la senescencia proliferativa que afecta a las MSC durante la expansión celular masiva. En este trabajo hemos intentado solventar los principales escollos de la terapia con EVs incrementando su potencial inmunosupresor y reduciendo por tanto la dosis efectiva. Este incremento se ha conseguido gracias a la sobreexpresión del factor inducible por hipoxia 1-alpha y al desarrollo de un medio de acondicionamiento en cultivo basado en citoquinas. Además, la inmortalización de las células secretoras mediante la transducción del gen de la telomerasa humana ha permitido tanto la estandarización del producto como su producción a gran escala. La eficacia de estas EVs ha sido testada en diferentes poblaciones celulares in vitro: linfocitos T, monocitos, células Natural Killer, macrófagos, células endoteliales y fibroblastos; y en dos modelos de ratón: hipersensibilidad retardada y colitis aguda inducida por TNBS. En conclusión, hemos desarrollado una fuente de EVs de larga duración que secreta grandes cantidades de vesículas con mayor capacidad inmunosupresora y antiinflamatoria, facilitando un producto terapéutico más estándar y fácil de producir para el tratamiento de enfermedades inflamatorias inmunomediadas. / [CA] Les cèl·lules mesenquimals estromals (MSC) posseeixen una sèrie de qualitats immunològiques, pro-angiogèniques i regeneratives que les converteixen en un excel·lent candidat per al tractament de diverses patologies. Tot i les proves contundents obtingudes en models preclínics que demostren l'activitat terapèutica de les MSC, els assaigs clínics no han pogut mostrar fins ara un benefici consistent, probablement degut a deficiències metodològiques i a la manca d'estandardització, així com a la variabilitat genètica intrínseca als estudis en humans. A causa d'això, ha calgut aprofundir en els mecanismes responsables del benefici terapèutic i redissenyar les estratègies clíniques. En els últims anys, s'ha observat que la reparació tissular intervinguda per les MSC es produeix de forma paracrina, i s'ha constatat que les vesícules extracel·lulars (EVs) secretades per les MSC (EVMSC) són capaços de recapitular les propietats immunosupressores de les cèl·lules parentals. A més, les estratègies terapèutiques basades en vesícules tenen grans avantatges en termes de bioseguretat i producció en condicions de grau clínic, reduint significativament el cost d'aquestes teràpies. No obstant això, la dosi efectiva en grans mamífers, inclosos els humans, és bastant elevada i la producció industrial de les EVs es veu dificultada en part, per la senescència proliferativa que afecta les MSC durant l'expansió cel·lular massiva. En aquest treball hem intentat solucionar els principals esculls de la teràpia amb EVs incrementant el seu potencial immunosupressor i reduint per tant la dosi efectiva. Aquest increment s'ha aconseguit gràcies a la sobreexpressió del factor induïble per hipòxia 1-alpha i a el desenvolupament d'un mitjà de condicionament en cultiu basat en citoquines. A més, la immortalització de les cèl·lules secretores mitjançant la transducció del gen de la telomerasa humana ha permès tant l'estandardització del producte com la seva producció a gran escala. L'eficàcia d'aquestes EVs ha estat testada en diferents poblacions cel·lulars in vitro: limfòcits T, monòcits, cèl·lules Natural Killer, macròfags, cèl·lules endotelials i fibroblasts; i en dos models de ratolí: hipersensibilitat retardada i colitis aguda induïda per TNBS. En conclusió, hem desenvolupat una font de EVs de llarga durada que secreta grans quantitats de vesícules amb major capacitat immunosupressora i antiinflamatòria, facilitant un producte terapèutic més estàndard i fàcil de produir per al tractament de malalties inflamatòries inmunomediades. / [EN] Mesenchymal stromal cells (MSC) possess several immunological, pro-angiogenic and regenerative qualities that make them an excellent candidate for the treatment of various pathologies. Despite compelling evidence from preclinical models demonstrating the therapeutic activity of MSCs, clinical trials have so far failed to show consistent benefit, probably due to methodological shortcomings and lack of standardisation, as well as the genetic variability intrinsic to human studies. As a result, it has been necessary to further investigate the mechanisms responsible for therapeutic benefit and to redesign clinical strategies. In recent years, it has been observed that MSC-mediated tissue repair occurs in a paracrine pathway, and it has been confirmed that extracellular vesicles (EVs) secreted by MSC (EVMSC) are able to recapitulate the immunosuppressive properties of the parental cells. Moreover, vesicle-based therapeutic strategies have great advantages in terms of biosafety and production under clinical-grade conditions, significantly reducing the cost of such therapies. However, the effective dose in large mammals, including humans, is quite high and the industrial production of EVs is hampered in part by the proliferative senescence that affects MSC during massive cell expansion. In this work, we have attempted to overcome the main challenges of EVs therapy by increasing their immunosuppressive potential and thus reducing the effective dose. This increase has been achieved by overexpression of hypoxia-inducible factor 1-alpha and the development of a cytokine-based culture conditioning medium. In addition, immortalization of secretory cells by transduction with the human telomerase gene has allowed both product standardisation and large-scale production. The efficacy of these EVs has been tested in different cell populations in vitro: T lymphocytes, monocytes, Natural Killer cells, macrophages, endothelial cells and fibroblasts; and in two mouse models: delayed-type hypersensitivity and TNBS-induced acute colitis. In conclusion, we have developed a long-lasting source of EVs that secretes large amounts of vesicles with enhanced immunosuppressive and anti-inflammatory capacity, providing a more standard and easier-to-produce therapeutic product for the treatment of immune-mediated inflammatory diseases. / Gómez Ferrer, M. (2022). Terapias innovadoras basadas en vesículas extracelulares derivadas de células madre mesenquimales modificadas genéticamente [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/182560 / TESIS

Homeostase do O2 é essencial para a sobrevivência e desenvolvimento fisiológico dos organismos. A falta de O2 nos tecidos é um fator subjacente comum na morbidade e mortalidade de situações clínicas como na Síndrome do Desconforto Respiratório Agudo (ARDS). Na retomada da homeostase as células mielóides exercem suas funções especializadas nas áreas de hipóxia. A adaptação destas células nesta condição depende dos produtos do gene HIF-1<font face=\"Symbol\">&#945, fator de transcrição que responde às mudanças de O2. Neste trabalho caracterizamos os mecanismos celulares e moleculares operantes no estado de hipóxia em resposta à reação inflamatória aguda no pulmão induzida pela I/R ateria mesentérica em duas linhagens de camundongos geneticamente selecionadas para máxima (AIRmax) ou mínima (AIRmin) Resposta Inflamatória Aguda (AIR). Observamos uma alta reação inflamatória aguda em resposta a I/R. Altos níveis de expressão dos genes envolvidos em situações de hipóxia Hif-1<font face=\"Symbol\">&#945, Vhl e das citocinas Il-1<font face=\"Symbol\">&#946 e Il-6 mostraram-se relacionados com a alta AIR nos camundongos AIRmax. / Oxygen homeostasis is essential for survival and physiologic development of organisms. Lack of O2 in tissues is a common underlying factor in morbidity and mortality for numerous serious medical conditions such as the Acute Respiratory Distress Syndrome (ARDS). For homeostasis recovery the myeloid cells exert their functions in specialized areas of hypoxia. The adaptation of myeloid cells in low O2 tissue depends on the HIF-1<font face=\"Symbol\">&#945 gene products. Hif-1<font face=\"Symbol\">&#945 is a transcription factor that responds to O2 levels change. In this study we characterize, in two lines of mice selected for maximal (AIRmax) or minimal (AIRmin) Acute Inflammatory response (AIR), the cellular and molecular mechanisms operating in the hypoxia state during an acute inflammatory reaction in the lung parenchyma produced by mesenteric artery Ischemia. We observed an acute inflammatory reaction with high levels of Hif-1<font face=\"Symbol\">&#945 and Vhl genes expression involved in hypoxia conditions and IL-1<font face=\"Symbol\">&#946 and IL-6 genes showed related to high AIR in AIRmax mice.

Homeostase do O2 é essencial para a sobrevivência e desenvolvimento fisiológico dos organismos. A falta de O2 nos tecidos é um fator subjacente comum na morbidade e mortalidade de situações clínicas como na Síndrome do Desconforto Respiratório Agudo (ARDS). Na retomada da homeostase as células mielóides exercem suas funções especializadas nas áreas de hipóxia. A adaptação destas células nesta condição depende dos produtos do gene HIF-1<font face=\"Symbol\">&#945, fator de transcrição que responde às mudanças de O2. Neste trabalho caracterizamos os mecanismos celulares e moleculares operantes no estado de hipóxia em resposta à reação inflamatória aguda no pulmão induzida pela I/R ateria mesentérica em duas linhagens de camundongos geneticamente selecionadas para máxima (AIRmax) ou mínima (AIRmin) Resposta Inflamatória Aguda (AIR). Observamos uma alta reação inflamatória aguda em resposta a I/R. Altos níveis de expressão dos genes envolvidos em situações de hipóxia Hif-1<font face=\"Symbol\">&#945, Vhl e das citocinas Il-1<font face=\"Symbol\">&#946 e Il-6 mostraram-se relacionados com a alta AIR nos camundongos AIRmax. / Oxygen homeostasis is essential for survival and physiologic development of organisms. Lack of O2 in tissues is a common underlying factor in morbidity and mortality for numerous serious medical conditions such as the Acute Respiratory Distress Syndrome (ARDS). For homeostasis recovery the myeloid cells exert their functions in specialized areas of hypoxia. The adaptation of myeloid cells in low O2 tissue depends on the HIF-1<font face=\"Symbol\">&#945 gene products. Hif-1<font face=\"Symbol\">&#945 is a transcription factor that responds to O2 levels change. In this study we characterize, in two lines of mice selected for maximal (AIRmax) or minimal (AIRmin) Acute Inflammatory response (AIR), the cellular and molecular mechanisms operating in the hypoxia state during an acute inflammatory reaction in the lung parenchyma produced by mesenteric artery Ischemia. We observed an acute inflammatory reaction with high levels of Hif-1<font face=\"Symbol\">&#945 and Vhl genes expression involved in hypoxia conditions and IL-1<font face=\"Symbol\">&#946 and IL-6 genes showed related to high AIR in AIRmax mice.