EPR spectroscopy and isotopic substitution were used to gain increased knowledge about the proton-coupled electron transfer (PCET) mechanism for the reduction of the tyrosine D radical (YD*) in photosystem II. pL dependence (where pL is either pH or pD) of both the rate constant and kinetic isotope effect (KIE) was examined for YD* reduction. Second, the manner in which protons are transferred during the rate-limiting step for YD* reduction at alkaline pL was determined. Finally, high field electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy was used to study the effect of pH on the environment surrounding both the tyrosine D radical and the tyrosine Z radical (YZ*). At alkaline pL, it was determined that the proton and electron are both transferred in the rate-limiting step of YD* reduction. At acidic pL, the proton transfer occurs first followed by electron transfer. Proton inventory experiments indicate that there is more than one proton donation pathway available to YD* during PCET reduction at alkaline pL. Additionally, the proton inventory experiments indicate that at least one of those pathways is multiproton. High field EPR experiments indicate that both YD* and YZ* are hydrogen bonded to neutral species. The EPR gx component for YD* is invariant with respect to pH. Analysis of the EPR gx component for Yz* indicates that its environment becomes more electropositive as the pH is increased. This is most likely due to changes in the hydrogen bond strength

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:18:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TeseACPF.pdf: 1993727 bytes, checksum: 42770c78b76a4d455bc87403cef8c453 (MD5) Previous issue date: 2006-06-02 / The aim of this study was to verify the effects of histamine on the process of functional recovery after hemilabyrinthectomy in goldfish, Carassius auratus. To this end, the fish were submitted to unilateral vestibular lesion and treated with a histamine precursor (L-histidine) and antagonists of the receptors H1, H2 and H3 (respectively chlorpheniramine, zolantidine and thioperamide). The success of the surgery was evidenced by the ataxia they suffered during approximately thirty minutes of observation and the presence of these signs was used as criterion for the inclusion of the animal in the experiment. The subjects were treated during fifteen consecutive days with L-histidine (150 mg/kg), chlorpheniramine (24 mg/kg), zolantidine (18 mg/kg) and thioperamide (15 mg/kg). All substances were administrated in a volume of 1.5 ml/ kg of body weight and sterile saline (1.5 ml/kg) was used with the experimental control group. Another group, the sham lesion group, was submitted to the same surgical procedure, but in this case the vestibular lesion was not carried out. The subjects were submitted to seven tests, the first test being carried out on the first day after the lesion, and then five more at three day intervals. The seventh test was carried out three days after the conclusion of treatment. In each test, the subject was placed inside a translucent tube inside a black aquarium which was illuminated on the ipsilateral side for five minutes. The fish behavior was recorded with a video camera located in front of a small opening in the front wall of the aquarium. Body tilt was measured by comparing a line traced between the subject s eyes with a horizontal line traced on the television screen. The mean of the tilt in degrees obtained every thirty seconds was considered. The data were subjected to variance analysis (Two-way ANOVA), followed by the Student Newman Keuls multiple comparisons test. / O objetivo deste estudo foi verificar os efeitos da histamina sobre o processo de recuperação funcional, após hemilabirintectomia em peixes da espécie Carassius auratus. Para tanto, foram utilizados a L-histidina, um precursor histaminérgico e antagonistas dos receptores H1, H2 e H3, sendo a clorfeniramina, antagonista H1, a zolantidina antagonista H2 e a tioperamida, antagonista do receptor histaminérgico H3. Os peixes foram anestesiados e submetidos à lesão vestibular unilateral. O sucesso da cirurgia foi evidenciado pela ataxia, caracterizada pelo rolamento do corpo e nado incoordenado durante aproximadamente trinta minutos, e a presença desses sinais foi utilizada como critério de inclusão do animal no experimento. Os sujeitos foram tratados durante quinze dias consecutivos com L-histidina (150 mg/kg), clorfeniramina (24 mg/kg), zolantidina (18 mg/kg) e tioperamida (15 mg/kg). Todas as substâncias foram administradas em um volume de 1.5 ml/kg, e a salina estéril (1.5 ml/kg) foi utilizada como controle experimental. Um outro grupo foi submetido ao procedimento cirúrgico, mas a lesão vestibular não foi realizada (Lesão Fictícia). Os sujeitos foram submetidos a sete testes. O primeiro teste foi realizado no primeiro dia após a lesão, e os demais, a cada três dias, totalizando seis testes. O sétimo teste foi realizado três dias após o término do tratamento. Cada teste consistiu em posicionar o sujeito dentro de um cilindro, no interior de um aquário revestido com uma película preta e iluminar esse aquário no lado ipsilateral à lesão durante cinco minutos. O comportamento animal foi registrado através de uma câmera de vídeo posicionada em frente a uma pequena abertura presente na parede anterior do aquário. O ângulo de inclinação corporal foi formado por uma linha correspondente ao posicionamento dos olhos e uma linha horizontal e medido com um transferidor na tela do televisor. A média desses ângulos obtidos a cada trinta segundos foi considerada. Os dados foram analisados através da Análise de Variância (ANOVA) de duas vias, seguida do teste de comparações múltiplas de Student Newman Keuls.

A exposição prolongada a estressores socio-ambientais induz alterações duradouras nos níveis afetivo, cognitivo e fisiológico característicos de transtornos de ansiedade e depressão. No paradigma de estresse crônico variado (ECV) é possível modelar essas alterações com base na exposição aleatória, intermitente e incerta dos roedores a vários estressores. Porém, alguns indivíduos também demostram uma capacidade notável de adaptação ativa e persistem diante de eventos imprevisíveis e incontroláveis. Sabe-se também que o sistema neural histaminérgico (SNH) é um indicador sensível do estresse e regula as reações defensivas relacionadas. Contudo, pouco se sabe sobre o papel da histamina no modelo de ECV. Considerando ainda que o perfil comportamental dos camundongos estressados pelo ECV seja contraditório, o presente estudo investigou se (1) duas linhagens de camundongos seriam susceptíveis a respostas relacionadas ao estresse; (2) a neurotransmissão histaminérgica estaria envolvida na ansiedade induzida pelo estresse; (3) o tratamento crônico com L-histidina (LH) combinado ou não ao ECV modificaria a expressão de Fos em áreas cerebrais límbicas. Para testar o impacto do protocolo ECV sobre respostas do tipo depressivas, os comportamentos de camundongos Suíços não estressados (NST) e estressados (ST) foram analisados na tarefa de esquiva ativa de duas vias e no teste de suspensão da cauda. Não foi detectado aumento significativo da imobilidade passiva, mas o grupo ST apresentou hiperreatividade na tarefa de esquiva. Como etapa seguinte, os efeitos do ECV no comportamento ansioso dos animais NST e ST foi verificado no labirinto em cruz elevado (LCE). Notavelmente, camundongos C57Bl/6 estressados desenvolveram respostas ansiogênicas, enquanto a linhagem de Suíço exibiu um perfil comportamental heterogêneo no LCE. Estes resultados indicam que o regime de ECV induz um efeito ansiogênico de modo consistente em animais C57Bl/6 adultos, enquanto os camundongos Suíço são resilientes ao protocolo. Além disso, a ansiedade induzida pelo ECV não foi revertida ou potencializada pela administração crônica de LH, enquanto que a estimulação farmacológica prolongada do SNH poderia representar um potencial estresse isoladamente. Adicionalmente, uma hipo-ativação das áreas corticais pré-limbicas e infralímbicas foi relacionada à condição de estresse crônico, sem efeitos resultantes do tratamento farmacológico. A expressão de Fos+ induzida pela exposição ao LCE foi detectada nos subnúcleos lateral, basolateral e central, porém não houve ativação diferencial destes subnúcleos amígdaloides influenciados pelo ECV e/ou tratamento. Assim, os resultados apresentadas corroboram evidências de que respostas ao estresse são genética e experiência-dependentes, resultando em resiliência ou má adaptação de indivíduos e linhagens. Além disso, o ECV foi capaz de causar uma resposta ansiogênica acompanhada de hipo-ativação de subáreas específicas do córtex pré-frontal medial, região cerebral importante na regulação dos comportamentos defensivos e nas respostas psicofisiológicas do estresse. Finalmente, o tratamento crônico com LH não alterou os parâmetros comportamentais e neuroanatômico-funcionais influenciados pelo estresse. / Chronic exposure to socio-environmental stressors leads to a myriad of long-term alterations in affective, cognitive and physiological levels, which typifies prevalent neuropsychiatric disorders. Importantly, chronic variable stress (CVS) is an experimental model for anxiety- and depressive-like disorders based on the random, intermittent, and uncertain exposure to various stressors. Some individuals also show a remarkable ability to adapt and actively cope and persist in the face of such unpredictable and uncontrollable events. Histamine is a sensitive indicator of stressful experiences and modulates the activation of neuroendocrine stress response to influence defensive reactions. However, little is known about the role of histamine on CVS model. While the behavioral profile of CUS-stressed mice is also contradictory, we investigated whether (1) two widely used mouse strains were susceptible to stress-related responses; (2) histaminergic neurotransmission is involved on stress-induced anxiety; (3) L-histidine (LH) chronic treatment combined to CVS changes Fos expression in limbic areas. To test the impact of the CVS protocol on depressive-like responses, the performance of non-stressed (NST) and stressed (ST) Swiss animals was analyzed in the two-way avoidance task and in the tail suspension test. No increased passive immobility was detected, but the ST group did display hyperreactivity in the avoidance task. Next, the effects of CVS on anxiety were examined in the elevated plus maze (EPM). Remarkably, stressed C57Bl/6 developed anxiogenic responses, while Swiss mice displayed a heterogeneous behavioral profile in the EPM. These results indicate that 2-week-long CVS regimen consistently induces anxiogenic-like response in adult C57Bl/6 mice, while Swiss animals seem to be resilient. Additionally, CVS-induced anxiety is not reversed or potentialized by the chronic administration of LH, but the histamine precursor appears to be a potential stressor per se. Importantly, a hypoactivation of the prelimbic and infralimbic cortical areas was related to the chronic stress condition, with no main effects of the pharmacological treatment. EPM induced Fos+ expression was detected in the lateral, basolateral and central subnuclei, without differential activation of these amygdaloid subnuclei provoked by CVS and/or histaminergic stimulation. The present evidences corroborate the concept that stress responses can be genetic- and experience-dependent, resulting in resilience or maladaptation of a particular strain. Also, stress-induced anxiety could be related to a hypoactivation of the medial prefrontal cortex, important brain region in regulating the defensive behaviors and HPA stress response.

Submitted by Luciana Sebin (lusebin@ufscar.br) on 2016-10-11T18:07:04Z No. of bitstreams: 1 DissCDSJ.pdf: 5508281 bytes, checksum: 494e75225dc01ef99c7d2a4685a0f5a7 (MD5) / Approved for entry into archive by Ronildo Prado (ronisp@ufscar.br) on 2016-10-17T18:15:48Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissCDSJ.pdf: 5508281 bytes, checksum: 494e75225dc01ef99c7d2a4685a0f5a7 (MD5) / Approved for entry into archive by Ronildo Prado (ronisp@ufscar.br) on 2016-10-17T18:15:57Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissCDSJ.pdf: 5508281 bytes, checksum: 494e75225dc01ef99c7d2a4685a0f5a7 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-17T18:23:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissCDSJ.pdf: 5508281 bytes, checksum: 494e75225dc01ef99c7d2a4685a0f5a7 (MD5) Previous issue date: 2016-02-24 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Phenylalanine ammonia lyase (PAL) catalyzes the non-oxidative deamination of L-Phe. It is an important enzyme in the production of enantio-pure mixtures of phenylalanine. Besides being important in plant secondary metabolism, PAL has also been used both for industrial applications as in the treatment of leukemia and phenylketonuria. The PAL have high similarity with histidine ammonia lyase (HAL) and it is believed that the PAL originated from HAL. Use of HAL termini sequences, previously obtained from the metagenome of Poraquê Lake (03°57' S, 63°10' W) to produce an engineered enzyme. The HAL assembled from them had its catalytic core exchanged by one which was designed from the previously described PAL sequences. Thus, We aim to shift the HAL activity making it active in the presence of phenylalanine through an easy protocol. Our phylogenetic analysis shows a clear division between plant and fungal PALs, and showed that recombination played a key role in the separation of these groups. In addition, We also observed that PAL catalytic core is conserved despite positive selection operating in protein termini. The recombinant enzyme, mPAL_c1, was produced in insoluble form and was refolded in vitro. mPAL_c1, when using L-Phe as substrate, has a TOPT. of 30°C (at pH 7.5 with 2mM MnCl2), KM of 55μM and Kcat/KM of 0.01633 mM-1s-1. The activity of mPAL_c1 showed about 30% of activity of commercial PAL from Rhodotorula toruloides at 2 mM L-Phe. Activation of mPAL_c1 was tested through substrate concentration rising from 2 mM to 5 mM of L-Phe, and its activity was almost 5 times higher. The results still suggest a histidine ammonia lyase remnant activity. The low catalytic rates are justified due to protein aggregation and misfolding, detected by size exclusion chromatography and by circular dichroism. In summary, our protocol has proved to be useful in protein design. / A fenilalanina amônia liase (PAL) catalisa a desaminação não oxidativa de L-Phe. Ela é uma enzima importante na produção de misturas enântio-puras de fenilalanina. Além de ser importante no metabolismo secundário vegetal, a PAL também tem sido utilizada tanto para aplicações industriais quanto no tratamento de leucemia e fenilcetonúria. As PAL apresentam alta similaridade com as histidina amônia liases (HAL) e acredita-se que as PAL se originaram das HAL. Utilizamos sequências das extremidades de uma HAL, previamente obtidas do metagenoma do Lago Poraquê (03°57' S e 63°10' W) para produção de uma enzima engenheirada. A HAL montada a partir delas teve seu núcleo catalítico trocado por um que foi desenhado a partir de sequências de PAL previamente descritas. Desta forma visamos deslocar as atividades da HAL tornando-a ativa em presença de fenilalanina por meio de um protocolo simplificado. As nossas análises filogenéticas revelam uma divisão clara entre PALs vegetais e fúngicas, e mostram que a recombinação teve um papel fundamental na separação destes grupos. Além disto, também observamos que o núcleo catalítico da enzima é conservado, com relação às extremidades. A enzima recombinante, mPAL_c1, foi produzida sob forma insolúvel e reenovelada in vitro. A mPAL_c1 tendo como substrato a L-Phe, possui uma Topt. de 30°C num pH de 7,5 com 2mM de MnCl2 e um KM de 55μM, VMáx de 15mU e Kcat/KM de 0,01633 mM-1s-1. A atividade da mPAL_c1 se mostrou cerca de 30% da atividade da PAL comercial de Rhodotorula toruloides a 2 mM de L-Phe. A ativação pelo substrato foi de quase 5 vezes quando a concentração de L-Phe foi elevada de 2mM até 5mM. Os resultados sugerem um resquício de atividade de histidina amônia-liase. As baixas taxas catalíticas se justificam devido à agregação e misfolding proteicos, detectados pela cromatografia de exclusão molecular e pelo dicroísmo circular. Por fim, o protocolo estabelecido neste estudo se mostrou útil para a engenharia de proteínas.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:51:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1830082 bytes, checksum: ec907521bfa48f79975e5fe22c20d972 (MD5) Previous issue date: 2009-10-01 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / The filamentous fungus Colletotrichum lindemuthianum (Sacc & Magnus) Briosi & Cav., causal agent of anthracnose, is an important pathogen of common bean (Phaseolus vulgaris L.). This fungus is an excellent model organism for understanding the infection process of pathogenic fungi. A C. lindemuthianum non-pathogenic mutant (LVSa1) with partial deficiency in the production of melanin was obtained through plasmid insertional mutagenesis. The aim of this study was to isolate and characterize the interrupted gene in theLVSa1 mutant and demonstrate its importance in the plant infection process. The mutated gene was isolated from a C. lindemuthianum genomic bank and named slnCl1. The sequence analysis revealed that slnCl1 encodes a histidine kinase. The sequence presents an ORF of 3555 base pairs, interrupted by three putative introns, containing 51, 87 and 89 bp. The multiple alignment of the deduced sequence of the protein, including sequences of all histidine kinases classes available in the databases, grouped SlnCl1 in class VI; possessing highly conserved regions characteristic of histidine kinase, and related to its function. A mutant with partial deficiency for the production of melanin was obtained through site-directed insertional mutagenesis using a gene fragment. This mutant showed a significant reduction in the ability to infect bean leaves, demonstrating that SlnCl1 is important to the pathogenicity process of this fungus. As many histidines kinases already described in fungi, SlnCl1 is involved in osmoregulation and adaptation to different osmotic concentrations in C. lindemuthianum. Furthermore, through this sensor protein, the fungus can distinguish the osmotic stress caused by high concentrations of sugars and salts. The mutant was sensitive to fungicides that target a MAPK signaling pathway, probably regulated by slnCl1. The results suggest that C. lindemuthianum must have other histidines kinases involved in the osmoregulation process. The study of the signaling cascade regulated by slnCl1 may represent a major advance in understanding the pathogenicity and developing new methods to combat this disease. / O fungo filamentoso Colletotrichum lindemuthianum (Sacc & Magnus) Briosi & Cav., agente causal da antracnose, é um importante patógeno do feijoeiro comum (Phaseolus vulgaris L.). Esse fungo é um excelente modelo de estudo para o entendimento do processo de infecção de fungos fitopatogênicos. Por meio de mutagênese por inserção de plasmídeo foi obtido um mutante (LVSa1) não patogênico de C. lindemuthianum com deficiência parcial na produção de melanina. O objetivo desse trabalho foi isolar e caracterizar o gene interrompido no mutante LVSa1 e comprovar a sua importância no processo de infecção da planta. O gene mutado foi isolado de um banco genômico de C. lindemuthianum e denominado slnCl1. A análise da sequência revelou que slnCl1 codifica uma histidina quinase. A sequência apresenta uma ORF de 3555 pares de bases, interrompida por três íntrons putativos, contendo 51, 87 e 89 pb. O alinhamento múltiplo da sequência deduzida da proteína, com sequências de todas as classes de histidinas quinases disponíveis nos bancos de dados agrupou SlnCl1 na classe VI, possuindo regiões extremamente conservadas características de histidina quinases e relacionadas a sua função. Por meio de mutagênese insercional sítio dirigida utilizando um fragmento do gene, foi obtido um mutante que apresentou deficiência parcial na produção de melanina. Esse mutante apresentou uma redução significativa na capacidade de infectar folhas de feijoeiro, demonstrando que SlnCl1 é importante no processo de patogenicidade desse fungo. Como muitas histidinas quinases já descritas em fungos, SlnCl1 apresenta envolvimento no processo de osmorregulação e adaptação a diferentes concentrações osmóticas em C. lindemuthianum. Além disso, por meio dessa proteína sensora, o fungo pode distinguir o estresse osmótico causado por altas concentrações de açúcares e de sais. O mutante mostrou-se sensível a fungicidas que tem como alvo uma via de sinalização MAPK, provavelmente regulada por slnCl1. Os resultados obtidos sugerem que C. lindemuthianum deve possuir outras histidinas quinases envolvidas no processo de osmorregulação. O estudo da cascata de sinalização regulada por slnCl1 pode representar um grande avanço no entendimento do processo de patogenicidade e na elaboração de novos métodos de combate a doença.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Neste trabalho cristais de L-histidinato de nÃquel (II) monohidratado (Ni(C6H8N3O2)2.H2O) foram obtidos por meio da evaporaÃÃo lenta do solvente de uma soluÃÃo saturada de 1 mol de NiCl2.6H2O, 2 mols de L-histidina mais NaOH. ApÃs a obtenÃÃo da amostra a confirmaÃÃo da estrutura deu-se por refinamento do Reitveld. A classificaÃÃo dos modos vibracionais à temperatura e pressÃo ambiente foi realizada por comparaÃÃo com outros materiais e atravÃs de cÃlculos de teoria da densidade do funcional DFT. A distribuiÃÃo da energia potencial (PED) tambÃm foi calculada. Experimentos de espectroscopia Raman variando a temperatura desde a temperatura ambiente atà 150 0C, foram realizadas no cristal de L-histidinato de nÃquel (II) monohidratado no intervalo espectral entre 50 e 3500 cm-1. Para temperaturas superiores a 125 0C o desaparecimento e surgimento de modos na regiÃo dos modos da rede bem como na regiÃo dos modos internos indicam uma transiÃÃo de fase estrutural no L-histidinato de nÃquel (II) monohidratado devido à saÃda de Ãgua. A transiÃÃo à irreversÃvel pois o espectro obtido apÃs a amostra retornar a temperatura ambiente à bem diferente daquele obtido no inÃcio do experimento. Experimentos de DSC corroboram com o experimento de espectroscopia Raman pois indicam a saÃda da molÃcula de Ãgua do cristal de L-histidinato de nÃquel (II) monohidratado no valor de temperatura de 140 0C, e ainda perda de massa de Ãgua na mesma temperatura (140 0C), relatada pela curva de TG. Nos experimentos de espectroscopia Raman a baixas temperaturas a amostra de L-histidinato de nÃquel (II) monohidratado foi resfriada desde a temperatura ambiente atà 18 K no intervalo espectral de 40 a 3500 cm-1. Observou-se o surgimento de alguns modos internos, porÃm, como nÃo evidenciou-se mudanÃas nos modos externos supomos que o material deva sofrer apenas uma mudanÃa conformacional. Os experimentos de espectroscopia Raman a altas pressÃes foram realizados no intervalo de pressÃo entre 0,1 e 9,5 GPa, em um intervalo espectral de 50 a 3500 cm-1. Com o aumento da pressÃo percebe-se o desaparecimento de modos indicando uma transiÃÃo de fase estrutural entre 0,4 e 0,8 GPa. Aumentando-se ainda mais a pressÃo observa-se o surgimento de trÃs modos em torno da frequÃncia de 50 cm-1 no intervalo de pressÃo entre 2,6 e 3,2 GPa. Estas mudanÃas indicam uma segunda transiÃÃo de fase estrutural da amostra de L-histidinato de nÃquel (II) monohidratado. O espectro obtido apÃs a descompressÃo à idÃntico aquele do inÃcio do experimento indicando reversibilidade da transiÃÃo. / In this work bis(L-histidinato)nikel(II) Monohydrate crystals were obtained by slow evaporation method using 1 mol of NiCl2.6H2O, 2 mols of L-histidine and NaOH. Reitveld refinement of X-ray data confirmed the structure. Raman modes obtained at ambient conditions of pressure and temperature were assigned by comparison with results on similar materials and by density functional theory DFT calculations. PED (potential energy distribution) is also present. Raman spectroscopy measurements were performed from room temperature up to 150 oC in the 50- 3500 cm-1 spectral range. For temperatures higher than 125 oC the modes related with the water stretching disappeared as well as the lattice modes disappeared indicating a phase transition undergone by the crystal. DSC experiments support this assumption. By decreasing temperature up to 18 K in the 40-3500 cm-1 spectral range it was observed modifications only in internal modes, so we believe that some conformational change has been occurred in the molecules of bis(L-histidinate)nikel(II) Monohydrate. High pressure experiments were performed from ambient pressure up to 9,5 GPa in the 50-3500 cm-1 spectral range. Disappearance of modes between 0,4 and 0,8 GPa was interpreted as evidences of a structural phase transition undergone by the crystal. A second set of modifications in the spectra indicates other phase transition experienced by the crystal between 2,6 and 3,2 GPa. The spectrum obtained the realizing pressure points out to the irreverbility of the phase transitions.

A atividade biológica de aldeídos α,Β-insaturados tem sido associada a diversos processos incluindo regulação gênica, envelhecimento Alzheimer e disfunções mitocondriais. Neste trabalho investigamos a formação de adutos do trans,trans-2,4-decadienal (DDE), um aldeído produzido endogenamente e presente como contaminante em alimentos e água, em lisina, histidina e citocromo c. Avaliamos também alterações na função de mitocôndrias de fígado de rato expostas ao aldeído. As análises por espectrometria de massas, LC-ESI/MS, indicaram a formação de diversos tipos de adutos de DDE nos aminoácidos lisina e histidina, entre eles bases de Schiff e enaminas. Os resultados obtidos por espectrometria de massas, MALDI-Tof, indicaram a formação de adutos de DDE formados via base de Schiff de maneira concentração do aldeído, tempo e pH dependentes. As análises da proteína digerida por ESI-Q-ToF, indicaram que os adutos foram formados nos resíduos H-33, K-39, 72 e 100, localizados em regiões ricas em resíduos básicos, cuja interação com membranas e citocromo e oxidase tem sido postulada. Observamos também o deslocamento da banda Soret (λ = 409 nm) e o desaparecimento da banda em λ = 695 nm, relativa a coordenação do sexto ligante do grupo heme (M-80). Este fenômeno está associado a abertura da cavidade do grupo heme e o deslocamento do ligante, indicando alterações nas estruturas secundária e terciária da proteína. Os experimentos realizados com mitocôndrias isoladas indicaram que DDE promove danos à membrana interna mitocondrial, demonstrando i pelo aumento no consumo de O2 em mitocôndrias em estado 4. Em decorrência destas lesões observamos também o intenso inchamento mitocondrial, indicado por experimentos de espalhamento de luz e microscopia eletrônica de transmissão. O inchamento não foi bloqueado por ciclosporina A, um inibidor do poro de transição mitocondrial. DDE também induziu a perda do potencial de membrana da organela, demonstrado pelo monitoramento do indicador fluorescente safranina O e aumento da peroxidação lipídica atestado pela quantificação de malondialdeido (MDA). Estes resultados indicam que DDE promove alterações estruturais no citocromo e podendo levar ao comprometimento da atividade da proteína, além de promover alterações em parâmetros mitocondriais, indicando um possível envolvimento na disfunção mitocondrial promovida por estresse oxidativo. / Lipid hydroperoxide-derived α,β-unsaturated aldehydes are involved in several cellular processes such as gene expression, aging, Alzheimer disease and mitochondrial dysfunction. In this work we have investigated adduct formation in lysine, histidine and cytochrome c by trans,trans-2,4-decadienal (DDE), an endogenously lipoperoxidation product. DDE is also a widespread environment aldehyde found, for example, in food and as a contaminant in water. Alterations in rat liver mitochondrial parameters such as oxygen consumption, membrane potentials, swelling and lipoperoxidation were also investigated. LC-ESI/MS experiments indicated that DDE react with aminoacids lysine and histidine producing adducts. In addition, MALDI-TOF experiments indicated increases in the molecular weight of cytochrome c consistent with the formation of DDE adducts via the Schiff base mechanism. Our data shows that the protein modification was time, pH and DDE-concentration dependent, leading to the formation of at least six adducts after 2 h incubation at pH 7.4. ESI-Q-TOF MS analysis of tryptic digests indicated that H-33, K-39, K-72 and K-100 were modified by DDE. These adducts are present in clusters of basic amino acid residues, which are believed to participate in the interaction of cytochrome c with mitochondrial membrane and cytochrome c oxidase. A blue shift in the Soret band from 409 to 406 nm was also observed, indicating heme crevice opening and displacement of heme sixth ligand (Met-80) coordination in modified protein. DDE (180 µM) treatment increases the rate of mitochondrial oxygen consumption, suggesting a partial mitochondrial uncoupling. Moreover, extensive mitochondrial swelling upon treatment with DDE (900 nM-162 &#181M) was observed by light scattering and transmission electron microscopy experiments. These effects were not prevented by the mitochondrial permeability transition inhibitor cyclosporin A. A DDE concentration-dependent loss in the inner mitocondrial membrane potential, monitored by safranin O fluorescence and an increase in lipoperoxidation were also observed. All together, these results suggest that reactive aldehydes can induce inner mitochondrial membrane damage playing a role in mitochondrial dysfunction associated with oxidative stress.

In der heutigen Zeit sind ca. 4000 Verbindungen bekannt, denen die Fähigkeit nachgesagt wird, eine Kontaktallergie auslösen zu können. Die Entscheidung, ob ein Stoff hautsensibilisierende Eigenschaften besitzt, wird dabei meist auf der Grundlage von Beobachtungen am Menschen und/oder von tierexperimentellen Befunden getroffen. Bedingt durch den vermehrten Einsatz exotischer Pflanzen und neu entwickelter synthetischer Substanzen im Bereich der Kosmetikindustrie besteht der Bedarf an einer einfachen Methode zur Vorhersage des kontaktallergenen Potentials einer Verbindung. Als zentraler Schritt bei der Manifestierung einer Kontaktallergie wird die Bildung eines Hapten-Carrier-Komplexes aus dem niedermolekularen Kontaktallergen (Hapten) und Hautproteinen (Carrier) angesehen. Zur Abschätzung der Sensibilisierungsfähigkeit kann daher auch die Reaktivität der Substanz oder ihrer Metaboliten gegenüber Proteinen herangezogen werden. Im Rahmen dieser Arbeit werden neben dem bedeutenden Phytoekzematogen Tulipalin A die bisher wenig untersuchten kontaktallergenen Duftstoffe Geraniol, 7-Hydroxycitronellal, Benzaldehyd, Salicylaldehyd, Vanillin, Zimtaldehyd, a-Amyl-zimtaldehyd und Benzylcinnamat hinsichtlich ihrer Reaktivität gegenüber peptidgebundenen Aminosäuren untersucht. Verwendet werden für diese Modellversuche Hippuryl-Derivate und Acetyl-Derivate der Aminosäuren Lysin, Histidin, Arginin bzw. Cystein sowie zusätzlich Glutathion. Die dabei gewählten Bedingungen sollen eine Adaption an physiologische Gegebenheiten erlauben. Ziel ist es, zu klären, ob die mit diesen Modellversuchen zu gewinnenden Ergebnisse mit dem bekannten kontaktallergenen Potential der eingesetzten Haptene korrelieren und somit geeignet sind, die Sensibilisierungsfähigkeit einer Substanz vorherzusagen. Über Konjugationsprodukte von Kontaktallergenen mit Peptiden oder Proteinen ist in der Literatur sehr wenig bekannt. Daher ist es ein weiteres Ziel dieser Arbeit, individuelle Produkte der Reaktionen der kontaktallergenen Substanzen mit den nukleophilen Aminosäureseitenketten zu isolieren und zu charakterisieren, um so definierte Hapten-Carrier-Konjugate, die unter physiologisch relevanten Bedingungen entstehen können, zu beschreiben. Aufbauend auf den gefundenen Strukturen sollte es auch möglich sein, Hinweise auf eventuelle Reaktionsmechanismen zu erhalten.

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Amine transaminases (ATA) catalyse the transfer of an amino group from one molecule and replaces a ketone or aldehyde with the amino group, the amino group on the amino-donor is replaced with a ketone or aldehyde. This enzyme, ATA from Chromobacterium violaceum, has previously been used to catalyse the reaction involving amphetamine, therefore, it might be possible to use this enzyme to convert amphetamine and the product absorbs in the UV spectrum and can therefore be measured spectrophotometrically. The aim of the project was to explore the possibility of using ATA in a portable biosensor for the detection of amphetamine. A literature study of commercially available portable biosensors was performed, activity of the free enzyme was tested against two substrates, methylbenzylamine (MBA) and amphetamine. Research on immobilization techniques, materials, and surface functionalization was done to chose suitable methods for immobilizing ATA. Two immobilization methods were suggested and one of the methods, ionic immobilization through His-tag towards Ni2+ on the surface, was tested for enzyme activity toward MBA. The enzyme activity of the free enzyme in solution towards MBA was comparable to previously reported enzyme activity, however, no enzyme activity towards amphetamine was observed. No activity was observed for the immobilized enzyme, but it might be due to the experimental design, more experiments need to be performed to draw conclusions. / Amintransaminaser (ATA) katalyserar överförandet av en amingrupp från en molekyl och ersätter en keton eller aldehyd med den amingruppen, amingruppen på amin-donatorn ersätts med en keton eller aldehyd. Det här enzymet, ATA från Chromobacterium violaceum (CvATA), har tidigare använts för att katalysera en reaktion som involverar amfetamin, därför skulle detta enzym kunna användas på amfetamin. Produkten av reaktionen absorberar i UV spektrumet och kan mätas med en spektrofotometer. Målet med projektet var att utforska möjligheten av att använda CvATA i en biosensor för att detektera amfetamin. En litteraturstudie på kommersiellt tillgängliga bärbara biosensorer genomfördes, aktiviteten av det fria enzymet testades mot två substrat, metylbenzylamin (MBA) och amfetamin. Information samlades om immobiliseringstekniker, material, och ytfunktionalisering gjordes för att välja ut lämpliga metoder för immobilisering av CvATA. Två immobiliseringsmetoder föreslogs och en av metoderna, immobilisering via enzymets His6-tagg och Ni2+ joner på ytan, testades för enzymaktivitet mot MBA. Enzymaktiviteten av det fria enzymet i lösning mot MBA var i samma storleksordning som tidigare rapporterad enzymaktivitet, men ingen enzymaktivitet mot amfetamin kunde observeras. Ingen aktivitet kunde observeras för det immobiliserade enzymet, men det kan vara på grund av designen på experimentet, fler experiment behöver göras för att kunna dra några fler slutsatser.