[pt] Método de identificação e quantificação de peptídeos, através da otimização de estratégias para a marcação de peptídeos com metais e subsequente separação por nano-HPLC-UV, MALDI MS. Primeiramente, peptídeos foram marcados com 3 diferentes metais lantanídeos usando um reagente funcional NHS-DOTA. Os resultados demonstraram que a reação de derivatização usando o reagente quelante DOTA foi eficiente para peptídeos simples e misturas dos mesmos, verificada através do MALDI MS a partir da relação m/z. Em paralelo, análises ambientais foram realizadas pela otimização de um procedimento de extração de metalotioneína em bílis de peixe, uma vez que esta matriz tem sido reportada como um biomarcador ambiental de contaminação por metal. Diferentes procedimentos e agentes de redução foram aplicadas para a extração de metalotioneína em bílis e fígado de peixe (Oreochromis niloticus. Análises espectrofotométricas foram realizadas a fim de quantificar os extratos de MT, e gel SDS-PAGE foi usado para avaliação qualitativa dos diferentes procedimentos usados. Cada procedimento foi avaliado estatisticamente. Metodologia de superfície de resposta foi aplicada para amostras de bílis, a fim de avaliar a resposta desta matriz. Em um contexto ambiental, concentrações de MT biliar foi mais baixa que MT do fígado, no entanto, a primeira mostrou-se mais adequada para um monitoramento ambiental. / [en] This work developed a new method for the identification and quantification of peptides, by optimizing some of the available strategies suitable for labeling peptides with lanthanide metals with subsequent separation by nano-HPLC with UV detection, matrix-assisted laser desorption ionization-mass spectrometry (MALDI MS). First, peptides were labeled with the three different lanthanide metals using a functional DOTA-based reagent. The results demonstrate that the derivatization reaction using the chelating reagent DOTA-NHS-ester was effective for single peptides and peptide mixtures, verified from the m/z relation obtained by MALDI MS. In parallel, environmental analyses were conducted, by performing the standardization of metalloprotein purification in fish bile, since this matrix has been reported as a biomarker for environmental metal contamination. Different procedures and reducing agents were applied to purify MT isolated from fish (Oreochromis niloticus) bile and liver. Spectrophotometrical analyses were used to quantify the resulting MT samples, and SDS-PAGE gels were used to qualitatively assess the different procedure results. A response surface methodology was applied for bile samples. In an environmental context, biliary MT was lower than liver MT, and, bile MT seems to be more adequate in environmental monitoring scopes. / [fr] Ce travail a développé une nouvelle méthode pour l identification et la quantification des peptides, par l optimisation de certaines stratégies disponibles appropriées pour le marquage des peptides avec des métaux lanthanide, une séparation par nano-HPLC et détection UV, et suivi par MALDI MS. Tout d abord, les peptides ont été marqués avec les trois métaux lanthanides différents et un réactif fonctionnel - DOTA. Les résultats montrent que la réaction de transformation en dérivé à l aide du réactif chélateur DOTA-NHS-ester a été efficace pour des peptides individuels et des mélanges de peptides, vérifiées à partir de la relation m/z obtenue par MALDI MS. En parallèle, nous avons effectué l optimisation pour la purification de métalloprotéine dans la bile de poisson, qui est signalée entant que biomarqueurs de contamination métallique de l environnement. Des procédures différentes et les agents réduisant ont été apliqués pour purifier les MT isolées de la bile et du foie des poissons (Oreochromis niloticus). Des analyses spectrophotométriques ont été utilisées pour quantifier les échantillons de MT, et le gel SDS-PAGE a été utilisé pour évaluer qualitativement les différents résultats de la procédure. Chaque procédure a en suíte été évaluée statistiquement, une méhtode des surfaces de réponse a été appliquée. Les MT de la bile semblent être plus adéquate pour la surveillance de l environnement en ce qui concerne l exposition récente à des xénobiotiques qui peuvent influer sur l expression protéomique et metalloproteomique de cette matrice biologique.

The application of ICP-MS to the fields of proteomics and genomics has arisen in part due to its ability to detect and quantify trace levels of S and P, which are major constituents in proteins and nucleic acids respectively. The development of collision/reaction cell technology and high resolution instruments has enabled these biologically important elements to be measured and quantified at the pg - ng ml-1 level. Despite these advances, the detection limits of P and S are still inferior compared to other elements. Oligonucleotides containing biotin functionality were labelled with Au nano-particles attached to a streptavidin protein to achieve site specific labelling, with 100% labelling efficiency. Each nano-particle contained ~86 Au atoms, resulting in an 882 fold signal enhancement for 24 base length oligonucleotides. However, this enhancement factor was only observed when one oligonucleotide bound to one nano-particle in a 1:1 ratio. Much lower Au labelling efficiencies and signal enhancements were observed when thiolated oligonucleotides were labelled with maleimide functionalised gold nano-particles. This was attributed to the extensive and difficult sample preparation steps that were required prior to labelling. The detection and quantification of adducts formed between DNA and the Pt anti-cancer drugs cisplatin and oxaliplatin were also investigated with ICP-MS. Acid digestion of the carbon based DNA matrix enabled Pt adducts to be quantified at low dose rates of 1 Pt atom per 1 500 000 nucleotides in ~12 μg DNA. Such sensitive mass spectrometric determinations could be employed in clinical tests to detect and quantify low level adducts formed in patients in-vivo. To complement ICP-MS analysis, electrospray ionisation linear ion trap mass spectrometry was employed to study the interaction of oxaliplatin with the four DNA nucleobases. Multiple stage mass spectrometry enabled detailed Pt-nucleobase adduct fragmentation pathways to be established. The method of DNA detection using P in conjunction with the collision cell, or cool plasma to form PO+ was also demonstrated and the limitations of the method, namely, polyatomic interferences and severe matrix effects were highlighted.

Submitted by Ana Hilda Fonseca (anahilda@ufba.br) on 2016-02-25T13:31:28Z No. of bitstreams: 1 Tese Uenderson Araujo Barbosa -final.pdf: 2006362 bytes, checksum: 7f8502d02bb06b7f75032fb7a79d79bc (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Hilda Fonseca (anahilda@ufba.br) on 2016-05-10T17:54:24Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese Uenderson Araujo Barbosa -final.pdf: 2006362 bytes, checksum: 7f8502d02bb06b7f75032fb7a79d79bc (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-10T17:54:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese Uenderson Araujo Barbosa -final.pdf: 2006362 bytes, checksum: 7f8502d02bb06b7f75032fb7a79d79bc (MD5) / CAPES e CNPq / Neste trabalho foram propostas estratégias analíticas visando à avaliação toxicológica de metais e metaloides em medicamentos utilizados no tratamento da anemia ferropriva, empregando técnicas cromatográficas e não cromatográficas. Na primeira parte desta tese determinou-se chumbo nos medicamentos aplicando espectrometria de absorção atômica com atomização eletrotérmica (ETAAS). O preparo da amostra foi realizado fazendo uso de digestão ácida em bloco digestor com sistema de refluxo “dedo frio” usando 3 mL de HNO3 (69% v/v) e 1 mL de H2O2 (30% v/v). Foram otimizadas as temperaturas de pirólise e atomização usando uma mistura de paládio e magnésio como modificador químico convencional, obtendo-se 1100ºC e 2000ºC para pirólise e atomização, respectivamente. Com uma massa característica de 21,3 pg e 0,25 e 0,82 µg L-1, para os limites de detecção (LD) e de quantificação (LQ), respectivamente. A precisão, expressa pelo desvio padrão relativo de 5.92% para uma amostra com concentração de chumbo igual a 2,98 µg g-1. A exatidão foi estimada por comparação entre os resultados obtidos por ETAAS e espectrometria de massas com plasma indutivamente acoplado (ICP-MS). As concentrações de chumbo nas amostras variaram entre 0,096 e 7,068 µg g-1. Na segunda parte deste trabalho, foi efetuada a determinação de mercúrio através de amostragem em suspensão e espectrometria de absorção atômica com alta resolução e fonte contínua com geração de vapor frio (HR-CS CVAAS). As condições ótimas de preparo das suspensões (1,5 mol L-1 de HCl, 1,25% (m/v) de tioureia e 15 minutos de sonicação) foram otimizadas por planejamento fatorial completo. Os limites de detecção e quantificação foram 0,63 ng g-1 e 2,11 ng g-1, respectivamente. O desvio padrão relativo para avaliação da precisão foi calculado usando duas amostras com concentrações 4,82 e 9,61 ng g-1 com resultados 10,89 e 6,84%, respectivamente. Foi estimada a possível perda de mercúrio durante o procedimento proposto e a exatidão, mediante testes de adição e recuperação, variando entre 85,0 e 106,0%. As concentrações de mercúrio ficaram entre 3,17 e 34,86 ng g-1. A terceira parte deste trabalho descreve a determinação de macro e microelementos e o estudo in vitro da bioacessibilidade de ferro em medicamentos usados no tratamento da anemia ferropriva. Foi escolhida a espectrometria de emissão ótica com plasma indutivamente acoplado (ICP OES) como técnica analítica de medida. Foi efetuada digestão ácida para tratamento das amostras e o método foi validado, demonstrando boa sensibilidade, com limites de quantificação (mg L-1) 0,52 para Ca, 0,14 para K, 0,03 para Mg, 0,07 para Mn, 0,40 para Na, 0,36 para P e 0,24 para Zn. A precisão do método foi reconhecida mediante experimentos repetitivos intradia e interdia com resultados abaixo de 20%. Durante estudo da exatidão, testes de adição e recuperação foram executados em diferentes concentrações com resultados entre 81,85 e 114,97%. A robustez do plasma foi calculada mediante uma razão entre as linhas iônica e atômica de magnésio, Mg(II)/Mg(I) e os resultados, mediante análise componentes principais (PCA) e análise por agrupamentos hierárquicos (HCA). O estudo de bioacessibilidade in vitro de Fe demonstrou que alguns medicamentos são melhores bioacessíveis, sendo portanto, mais recomendados para o tratamento da anemia, comprovando dados da literatura farmacológica. Na quarta parte deste trabalho descreve-se o estudo da determinação e especiação simultânea de arsênio e cromo por 11 cromatografia líquida de alta eficiência acoplada à ICP-MS (HPLC-ICP-MS). A determinação total de arsênio e cromo foi realizada usando uma digestão ácida em forno de micro-ondas, uma mistura de 4 mL HNO3 (69% v/v) e 1 mL de H2O2 (30% v/v) e análise por ICP-MS. Para o estudo de especiação foi elaborado um estudo com três possíveis procedimentos para extração das espécies, sendo selecionado um procedimento com água a 80ºC por 30 minutos em energia de micro-ondas. Usando uma fase móvel contendo 1,0 mM de hidróxido de tetrabutilamônio (TBAH), 0,7 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) e 5% de metanol (v/v) em pH 7,2 foi possível separar as espécies presentes com tempo de retenção de 5 minutos com separação de As(III), As(V), Cr(III) e Cr(VI), com limites de detecção de 0,002, 0,003, 0,140 e 0,042 µg g-1, respectivamente. A exatidão do método foi avaliada conforme testes de adição e recuperação, entre 80,64 e 109,36%. O método foi aplicado em amostras do Brasil e Espanha, com concentrações entre 0,1-1,3 e 0,18-62,27 µg g-1 para As e Cr, respectivamente. / In this thesis work analytical strategies have been proposed for toxicological assessment of metals and metalloids in medicines used to treat iron deficiency anemia, using chromatographic and non-chromatographic techniques. In the first part of this thesis, lead was determined in drugs using electrothermal atomic absorption spectrometry (ETAAS). Sample preparation was performed using acid digestion in digester block with reflux system "cold finger" using 3 mL of HNO3 (69% v / v) and 1 mL of H2O2 (30% v / v). Pyrolysis and atomization temperatures were optimized using a mixture of palladium and magnesium as conventional chemical modifier, yielding 1100°C and 2000°C for pyrolysis and atomization, respectively. With a characteristic mass of 21.3 pg and 0.25 and 0.82 µg g-1, for limit of detection (LOD) and limit of quantification (LOQ), respectively. The accuracy, expressed as relative standard deviation was 5.92% for a sample with lead concentration of 2.98 µg g-1. The accuracy was evaluated by comparing the results obtained by ETAAS and inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS). Lead concentrations found in samples ranged between 0.096 and 7.068 µg g-1. In the second part of this work, the determination of mercury using slurry sampling and high resolution continuous source cold vapor atomic absorption spectroscopy (HR-CS CVAAS) was performed. The optimum conditions for preparation of slurries (1.5 mol L-1 HCl, 1.25% (w / v) thiourea and 15 minutes sonication) were optimized using a two level full factorial design. The limits of detection and quantification were 0.63 ng g-1 and 2.11 ng g-1, respectively. The relative standard deviation for accuracy evaluation was calculated using two samples with concentrations 4.82 and 9.61 ng g-1 from which was obtained as results 10.89 and 6.84%, respectively. The possible loss of mercury was evaluated for the proposed procedure and the accuracy was studied by addition/recovery test, with recoveries ranging from 85.0 to 106.0%. Mercury concentrations ranged between 3.17 and 34.86 ng g-1. The third part of this work describes the determination of macro and micro elements and the in vitro study of iron bioaccessibility in medicines used to treat iron deficiency anemia. It was used inductively coupled plasma optical emission spectrometry (ICP OES) measured as an analytical technique. Acid digestion treatment was conducted to the samples and the method was fully validated by demonstrating good sensitivity with quantification limits (mg L-1) 0.52 for Ca, 0.14 for K, 0.03 for Mg, 0.07 for Mn, 0.40 for Na, 0.36 for P and 0.24 for Zn. The precision of the method was evaluated by intraday and interday repetitive experiments with results below 20%. During accuracy evaluation, addition/recovery tests were performed at different concentrations with results between 81.85 and 114.97%. The robustness of plasma was evaluated by a ratio between magnesium atomic and ionic lines, Mg(II)/Mg(I). The results were evaluated by multivariate analysis tools, principal component analysis (PCA) and hierarchical cluster analysis (HCA). The study of in vitro bioaccessibility of Fe showed that some drugs are better bioaccessible, being therefore more recommended for anemia treatment, confirming data of pharmacological literature. The fourth part of this work describes the simultaneous determination of arsenic and chromium speciation using high-performance liquid chromatography coupled to ICP-MS (HPLC-ICP- MS). The total arsenic and chromium determination was carried out using an acid digestion in microwave oven, using a mixture of 4 mL HNO3 (69% v / v) 9 and 1 mL of H2O2 (30% v / v) and analyzed by ICP-MS. For speciation, a study was performed with three possible procedures for extraction of species, being employed a procedure with water at 80 °C for 30 minutes in microwave energy. Using a mobile phase containing 1.0 mM tetrabutylammonium hydroxide (TBAH), 0.7 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) and 5% methanol (v / v) under pH 7.2 was possible the separation of the species present with retention time of 5 minutes with separation of As(III) As(V), Cr(III) and Cr(VI), with a LOD of 0.002, 0.003, 0.140 and 0.042 µg g-1, respectively. The accuracy was assessed using addition/recovery tests, ranging between 80.64 and 109.36%. The method was applied in samples from Brazil and Spain.

Submitted by Luciana Sebin (lusebin@ufscar.br) on 2016-10-07T17:54:22Z No. of bitstreams: 1 TeseAFO.pdf: 3549447 bytes, checksum: 4e7cee7e550c3a9888b1a0994be5e4d1 (MD5) / Approved for entry into archive by Ronildo Prado (ronisp@ufscar.br) on 2016-10-10T20:05:35Z (GMT) No. of bitstreams: 1 TeseAFO.pdf: 3549447 bytes, checksum: 4e7cee7e550c3a9888b1a0994be5e4d1 (MD5) / Approved for entry into archive by Ronildo Prado (ronisp@ufscar.br) on 2016-10-10T20:08:58Z (GMT) No. of bitstreams: 1 TeseAFO.pdf: 3549447 bytes, checksum: 4e7cee7e550c3a9888b1a0994be5e4d1 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-10T20:31:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TeseAFO.pdf: 3549447 bytes, checksum: 4e7cee7e550c3a9888b1a0994be5e4d1 (MD5) Previous issue date: 2016-01-28 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Selenium is essential in animal nutrition; it ensures proper functioning of musculoskeletal, reproductive, and immune system. The intake requirement range for Se is narrow and low levels of Se are required. In order to supply the demand, the animal feed supplementation has grown, considering the knowing of Se deficiency in soils from different countries. This supplementation is made with the use of organoselenium, because of its low toxicity and high bioavailability to the animal. This study targets organoselenium speciation (of Se-methionine and its product of oxidation, Se-O-methionine, and Se-cystine) in animal feed samples and beef using HPLC coupled to ICP-MS/MS. Inorganic species, selenate (Se(VI)) and selenite (Se(IV)), which could be toxic even at low levels, were also determined. The instrumental parameters were optimized and the use of hydrogen as reaction gas to remove the m/z= 80 (Se most abundant isotope) interferences was evaluated, and it demonstrated analytical capacity by using Se standard solutions in presence of interfering elements and CRMs (bovine liver and fish liver) digests indicated a calculated accuracy of 89 and 97 %, respectively. The Se chemical speciation method was applied in samples provided from an experiment with 48 animals (divided into four groups) were fed with Se enriched feed for 82 days. The groups are: (1) cattle feed (control); (2) cattle feed + antioxidants (organoselenium + vitamin E); (3) cattle feed + canola oil and (4) cattle feed + antioxidants (canola oil + organoselenium + vitamin E). A sample preparation method development for complex matrices like animal feed and beef was optimized with an enzyme coquetail. A good separation was obtained and Se species could be easily identified. The method is robust and his been applied for different types of samples with recoveries > 65%. The results infer that a majority of Se in both feed and beef present as Se-methionine. The same method was used to evaluate commercialized feed of swine, poultry and bovine in order to evaluate if the concentrations and species are in agreement with labels. In general the samples attend to legislation according to the evaluated parameters. / O selênio é um elemento essencial na nutrição animal e está associado ao funcionamento saudável dos sistemas músculoesquelético, reprodutivo e imunológico. O valor de ingestão diária recomendado é estreito e baixas concentrações de Se são necessárias. A fim de suprir as necessidades na alimentação animal, a prática de suplementação tem crescido, pois a deficiência de Se em solos de diversos países é comum. Essa suplementação é feita com o emprego de Se orgânico pela sua baixa toxicidade e alta biodisponibilidade para o animal. O presente estudo teve como objetivo a especiação de Se orgânico (como a Se-metionina e seu produto de oxidação, Se-O-metionina, e a Se-cistina) em amostras de ração animal e carne bovina utlizando HPLC acoplado ao ICP-MS/MS. As espécies inorgânicas, selenato (Se(VI)) e selenito (Se(IV)), as quais podem ser tóxicas mesmo em concentrações baixas também foram determinadas no método. A otimização dos parâmetros instrumentais e a avaliação do emprego de hidrogênio como gás de reação com os interferentes para determinação da m/z= 80 para monitoramento do isótopo mais abundante de Se foram realizadas, sendo a capacidade analítica demonstrada com o emprego de soluções padrão de Se na presença de possíveis interferentes e com o emprego de CRMs de fígado bovino e fígado de peixe, e a exatidão calculada foi de 89 e 97 %, respectivamente. A especiação química de Se foi aplicada a amostras provenientes de experimento com 48 animais (divididos em quatro grupos) alimentados com ração enriquecida de Se orgânico durante 82 dias. Os grupos foram: (1) ração animal (controle); (2) ração animal + antioxidantes (Se orgânico + vitamina E); (3) ração animal + óleo de canola e (4) ração animal + antioxidantes (óleo de canola + Se orgânico + vitamina E). O método de preparo de amostra para matrizes complexas, como ração animal e carne bovina foi otimizado com uma mistura de enzimas. Uma boa separação foi obtida e as espécies de Se foram facilmente identificadas. O método foi considerado robusto e tem sido aplicado para diferentes tipos de amostras com recuperações > 65%. Os resultados inferem que Se-metionina é a espécie majoritária nas amostras de rações animal e carne bovina. O método desenvolvido foi aplicado a extratos de ração animal comercializáveis de suínos, aves e bovinos, para verificação da veracidade quanto às espécies sugeridas nos rótulos das embalagens. De forma geral, as amostras atenderam a legislação perante aos quesitos avaliados. / CAPES: 001/2011 / CAPES: 99999.014317/2013-03

L'arsenic est un élément présent dans tous les compartiments de l'environnement, et les produits de la pêche représentent une source majeure d'exposition à l'arsenic par le biais de l'alimentation. Même s'il n'existe pas à ce jour de législation sur les teneurs en arsenic dans les aliments en France, les agences gouvernementales évaluent généralement les risques liés à la présence d'arsenic dans les produits de la pêche en se basant essentiellement sur la concentration totale de l'élément, sans tenir compte des différentes espèces présentes ni de leur bioaccessibilité. Par conséquent, le développement de méthodes d'analyse de spéciation revêt un intérêt particulier dans le cadre de l'évaluation des risques. La première partie de ce mémoire présente des informations générales sur les propriétés de l'arsenic, son occurrence dans les différents compartiments de l'environnement et sa toxicité, ainsi qu'une étude bibliographique des méthodes analytiques existantes pour étudier la spéciation de l'arsenic dans les matrices alimentaires, en particulier les produits de la pêche (extraction et séparation/détection). Les différentes approches pour l'évaluation de sa bioaccessibilité et de celle d'autres éléments traces métalliques d'intérêt sont également présentées. La deuxième partie de ces travaux porte sur la validation d'une méthode d'analyse de spéciation des principales espèces d'arsenic dans les produits la pêche (As(III), MA,DMA, As(V), AsB, TMAO, AsC) par couplage entre la chromatographie d'échange d'ions (IEC) et la spectrométrie de masse à plasma induit (ICP-MS) après extraction assistée par micro-ondes (MAE). L'évaluation des performances analytiques de la méthode, les contrôles qualités internes et externes mis en place et les différentes applications, en particulier les données d'occurrence des différentes espèces d'arsenic dans les produits de la pêche les plus consommés par la population française sont présentés et discutés. Dans la troisième partie, la bioaccessibilité maximale de l'arsenic et d'autres éléments d'intérêt est estimée à l'aide d'une méthode de lixiviation en ligne (impliquant la mesure en temps réel par ICP-MS de la fraction libérée par les différents fluides digestifs artificiels). La combinaison de ce procédé avec la méthode d'analyse de spéciation validée permet ainsi d'estimer la bioaccessibilité des différentes espèces d'arsenic.