Une réponse rapide et adaptée est nécessaire à la survie des cellules soumises à un stress. La réponse cellulaire au stress (HSR pour Heat-Shock response) médié par le facteur de transcription HSF1 est induite par les contextes environnementaux (chaleur, hypoxie, …) et les processus biologiques normaux et pathologiques (vieillissement, inflammation, …) associés à une accumulation de protéines endommagées (Morimoto, 1998). Ces protéines endommagées forment des agrégats toxiques aux conséquences létales pour les cellules.Conservé chez tous les eucaryotes, HSF1 orchestre les actions nécessaires à la survie et à la croissance des cellules malgré le stress. Ses cibles les mieux connues sont les gènes codants pour les Heat Shock Protein (HSP) qui font office de chaperon moléculaire. Une caractéristique de la HSR chez l’Homme est l’accumulation massive du facteur HSF1 en foyers nucléaires nommés Nuclear Stress Bodies (nSBs). Curieusement, ces foyers ciblent l’hétérochromatine péricentrique composée de séquences répétées en tandem de type Satellite III (SATIII), particulièrement au niveau du locus 9q12. HSF1 induit une forte transcription en ARN SATIII Sens (Jolly et al., 2004). Le rôle des nSBs est une des problématiques majeures de notre équipe cependant jusqu’à présent aucune fonction n’a été confirmée pour ces structures.Les nSBs, spécifiques aux cellules humaines, n’ont été décrits que dans des cellules en culture. Mon projet de thèse a consisté dans un premier temps à montrer la présence des nSBs in vivo chez l’Homme. Cette étude, réalisée sur du tissu testiculaire nous a également permis d’identifier une nouvelle cible SATIII majeure pour HSF1, la région Yq12. Dans les testicules, les nSBs sont associés à des processus méiotiques et post-méiotiques, suggérant un rôle dans le remodelage de l’hétérochromatine. Dans un deuxième temps, nous avons cherché à mieux comprendre le rôle des nSBs lors de la HSR. Nous avons pu montrer que l’étape de transcription des SATIII induit une déstabilisation de l’hétérochromatine péricentrique caractérisée par une dissociation des facteurs HP1 (Heterochromatin Protein 1) alpha et beta et une perte de la marque répressive H3K9me3. Au cours de la période de récupération qui accompagne la reformation de l’hétérochromatine, une transcription séquentielle d’ARN SATIII Sens puis Anti-sens précède la restructuration des loci 9q12. Nous avons également pu montrer que la transcription des SATIII est associée à un blocage de la mitose. Nous montrons que dans les cellules stressées, une altération de ce point de contrôle par un Knock down des ARN sat III par des approches LNA conduisent à une l’instabilité génomique des cellules tumorales avec apparition de cellules polynucléées. / A rapid and well-adapted response is required for cell survival upon stress. The cellular stress response (HSR) is mediated by the transcription factor Heat Shock Factor 1 (HSF1) (Morimoto, 1998). It is activated by environmental stress (heat, hypoxia, ...) and by a series of patho-physiological contexts (aging, inflammation, ...) involving protein damages.The best-characterized targets of HSF1 are genes encoding for Heat Shock Protein (HSP) acting as molecular chaperone. A specific feature of the HSR in human cells is the presence of HSF1 nuclear foci named Nuclear Stress Bodies (NSBs). Surprisingly, nSBs target pericentric heterochromatin consisting in tandem repeats of type III Satellite (SATIII) sequences, primarily at the 9q12 locus. HSF1 triggers a strong transcriptional activation of this locus (Jolly et al., 2004). The role of nSBS is a major issue since no function related to these structures has been reported so far.So far, nSBs have been only identified in cells in culture. My thesis project has been to further explore whether these structures also existed in normal tissues. Indeed, we have been able to identify the presence of nSBs in testis where they were found to be associated to meiotic and post-meiotic stages, suggesting a role related to heterochromatin remodeling. Moreover, we have identified the Yq12 locus as a new target of nSBs in these tissues. Secondly, we have brought new evidence that sat III sequences triggers a transient dissociation of HP1 (heterochromatin Protein 1) α and β as well as a loss of the repressive epigenetic H3K9me3 histone mark at pericentric heterochromatin. Interestingly we have also found that, following stress, a sequential accumulation of SATIII RNA in a Sense and Antisense orientation occurs, suggesting that this specific pattern of expression plays an important role in heterochromatin reformation. Finally, we have found that the accumulation of SATIII RNA is associated with a slowdown of mitosis. Indeed we have found that in stressed cells, accumulation of sat III impcats the progression of mitosis and that a knock down of sat III RNA using LNA approaches releases this blockade, leading to genomic instability of tumor cells and to the appearance of poly nucleated cells.

La carence en vitamine B12 est fréquente chez les sujets âgés et produit un vieillissement cérébral par des mécanismes malconnus. La vitamine B12 joue un rôle majeur dans les régulations épigénomiques dépendantes de la S-adénosyl méthionine (SAM). Nous avons établi un modèle de cellules neuronales dopaminergiques NIE115 carencé en vitamine B12 par l'expression stable d'une protéine chimère : la transcobalamine-oléosine (TO) réduisant la disponibilité cellulaire en B12, la SAM et la prolifération cellulaire. La protéine chimère oléosine-transcobalamine (OT) ne lie pas la B12 et constitue un contrôle. Les cellules TO ont une diminution B12-dépendante de la déacétylase SIRT1 (sirtuin1) et un stress du réticulum endoplasmique (RE) avec une augmentation des transducteurs transmembranaires, une diminution des protéines chaperonnes et une augmentation des marqueurs pro-apoptotiques. La diminution de l'expression de SIRT1 déclenche le stress du RE en réponse au stress nutritionnel. Cette diminution produit une augmentation de HSF1 acétylé diminuant l'expression des protéines chaperons. L'ajout de B12, des activateurs de SIRT1 et HSF1, la surexpression de SIRT1 et HSF1 réduisent le stress du RE. Dans les cellules contrôles, le traitement par la thapsigargin, l'inhibition de SIRT1 et HSF1 induisent également un stress du RE réversible en présence de B12. Le traitement des cellules OT par Adox (inhibiteur des méthyltransférases) induit les mêmes effets que la carence. En conclusion, la carence en B12 induit un stress du RE via la diminution de SIRT1 et l'augmentation de HSF1 acétylé, l'ajout de B12 induit des effets neuro-protecteurs sur les cellules soumises à un stress du RE. Ces résultats suggèrent d'évaluer les effets des agonistes de SIRT1 sur les complications cérébrales de la carence / Vitamin B12 deficiency is common in elderly population and produces neurodegenerative disorders by elusive mechanisms. B12 is a key determinant for the S-adenosyl methionine-dependent epigenomic regulations. We have established a B12-deficient cell model via the stable expression of transcobalamin-oleosin chimera (TO), which impairs cellular availability of vitamin B12, reduces SAM level and cell proliferation. Since the expression of oleosin transcobalamin chimera (OT) does not modify the phenotype of the transfected cells, these cells serve as control cells. TO cells present a B12-dependant decrease of deacetylase SIRT1 (sirtuin1) and an endoplasmic reticulum stress (ER stress) reflected by the increased expression of ER stress tranducers, decreased chaperon proteins and increased pro-apoptotic markers. We propose that the decreased expression of SIRT1 triggers cell response to nutritional stress through ER stress. This decrease results in a greater acetylation of heat-shock factor protein 1 (HSF1) and thus reducing the expression of heat shock proteins (HSP). Adding B12, SIRT1, or HSF1 activators as well as overexpressing SIRT1 or HSF1 reduce ER stress. In OT cells, thapsigargin treatment or impairing SIRT1 and HSF1 leads to B12-reversible ER stress. Treating OT cells with AdoX, an inhibitor of methyltransferase activities, produces effects similar to those observed in cells with decreased B12 availability.In summary, the impaired cellular availability of vitamin B12 induces ER stress by increasing HSF1 acetylation through a decreased SIRT1 expression and adding vitamin B12 produces neuro-protective effects in cells subjected to prior ER stress. These results suggest evaluating the effects of SIRT1 agonists on cerebral complications due to a B12 deficiency

L'histone déacétylase HDAC6 est une enzyme multifonctionnelle possédant deux domaines déacétylases en tandem et un domaine fixant l'ubiquitine. Localisée exclusivement dans le cytoplasme, cette protéine peut déacétyler les microtubules acétylés et participer à la prise en charge des protéines ubiquitinées lors de la formation d'agrésomes. Elle possède également une activité sur d'autres substrats comme les histones ou HSP90, et elle contribue à divers processus cellulaires. Le travail présenté dans cette thèse décrit un rôle supplémentaire de cette déacétylase dans la réponse après un stress. Il vise à comprendre comment HDAC6 participe dans les mécanismes d'activation des gènes HSPs, et dans les processus de récupération cellulaire à la suite d'un choc thermique. La découverte d'un nouveau domaine nommé SE14 chez la protéine HDAC6 humaine, présente un dispositif supplémentaire de régulation nucléocytoplasmique pour cette protéine. Ce domaine permet la rétention dans le cytoplasme de cette protéine en renforçant le mécanisme d'export nucléaire. A coté de ce contrôle, le fonctionnement des deux domaines déacétylases est analysé. Des expériences in vitro et in vivo confirment l'importance de l'arrangement spatial des deux domaines dans la réaction de déacétylation. Finalement, ce travail montre que la protéine HDAC6 intervient lors de la différenciation ostéoclastique. Par son activité catalytique sur les microtubules acétylés et grâce à son interaction avec l'effecteur mDIA2, cette déacétylase est impliquée dans la maturation des ostéoclastes.

La majorité des études sur la dynamique des facteurs de transcription en cellules vivantes s'accordent sur une dynamique rapide. Il existe cependant quelques exceptions, comme la dynamique du facteur de transcription HSF " Heat Shock Factor ", sur les chromosomes polyténiques de drosophile. Notre projet a consisté à étudier la dynamique d'HSF1 dans des cellules humaines. L'exposition des cellules à un stress tel qu'un choc thermique induit une réponse ubiquitaire et transitoire, dont la fonction est de protéger les cellules contre les effets délétères du stress. Au cours d'un choc thermique, plusieurs phénomènes se produisent : i) un arrêt global de la transcription excepté pour certains gènes tels que ceux codant pour les protéines de choc thermique (HSPs), dont l'expression est sous le contrôle du facteur de transcription HSF1. ii) une activation d'HSF1 qui se relocalise de façon rapide et transitoire sur les corps nucléaires de stress (nSBs), où il induit la transcription des séquences satellite III. Les nSBs forment un site d'activité naturellement amplifié et visible en microscopie. Nous avons utilisé deux techniques complémentaires pour étudier la dynamique d'HSF1 en cellules vivantes : le recouvrement de fluorescence après photoblanchiment (FRAP) et la spectroscopie à corrélation de fluorescence multi-confocale (mFCS), qui permet l'analyse FCS en plusieurs points simultanément. En cellules HeLa, la protéine HSF1-eGFP présente une dynamique rapide qui est significativement ralentie suite à un choc thermique. En mFCS, nous avons obtenu des constantes de diffusion de 14 µm²/s avant choc thermique et de 10 µm²/s après choc thermique. En FRAP, le temps de demi-recouvrement est de 0,2 s avant choc thermique, 2,6 s après choc thermique dans le nucléoplasme et 65 s sur les corps nucléaires de stress. Le ralentissement de la dynamique d'HSF1 s'explique par deux phénomènes : i) la formation de complexes de haut poids moléculaire, ii) une augmentation des interactions avec la chromatine. Pour mieux caractériser le changement de dynamique d'HSF1 après choc thermique, plusieurs mutants ont été analysés. Le domaine de trimérisation est indispensable pour le changement de dynamique après choc thermique, alors que le domaine de liaison à l'ADN et le domaine de transactivation n'ont que peu d'effet sur le changement de dynamique. Il ne peut donc pas être expliqué uniquement par les interactions directes à la chromatine du domaine de liaison à l'ADN, ni même par les liaisons indirectes du domaine de transactivation via d'autres protéines. La protéine HSF1 pourrait interagir de façon aspécifique avec la chromatine lors de la recherche de site de liaison, ou d'autres protéines via d'autres domaines pourraient entrainer des interactions indirectes avec la chromatine.

L’utilisation de modèles animaux a permis la découverte de mécanismes importants du développement en général, et du développement tumoral en particulier afin d’établir et mettre au point de nouveaux traitements. Le poisson zèbre (Danio rerio), est de plus en plus utilisé dans le cadre de ces recherches du fait de ses nombreux avantages comme par exemple la transparence de ses larves ou une forte homologie avec l’homme. Plusieurs approches ont été développées chez ce poisson comme l’invalidation transitoire d’un gène afin d’identifier le rôle d’une protéine dans le développement, ou alors la transplantation de cellules tumorales de mammifères et étudier les réponses aux traitements anti-tumoraux.C’est dans l’un de ces deux contextes que nous avons étudié le rôle du monoxyde d’azote dans le développement tumoral. Pour cela nous avons utilisé une sonde fluorescente et avons pu détecter in vivo une production de monoxyde d’azote associée aux cellules tumorales xénogreffées, dont l’utilisation d’un capteur du NO, le cPTIO s’est traduit par une perte de cellules tumorales et une baisse de l’expression d’un facteur angiogénique le VEGF, démontrant une utilisation potentielle dans du cPTIO comme molécule anti-tumorale.L’autre volet d’étude a été l’identification du rôle de HSF1 dans le développement et la différenciation des globules rouges chez le poisson zèbre comme modèle expérimental, dans des conditions de non stress thermique. Pour cela, nous avons inactivé transitoirement le gène hsf1 grâce aux morpholinos, et avons constaté des défauts dans le développement, mais aussi une altération de la différenciation des érythrocytes. / The use of animal models has led to the discovery of important mechanisms of biology development in general, and tumor development in particular, to establish and develop new treatments. The Zebrafish (Danio rerio) is increasingly used nowadays as part of this research because of its many advantages such as the transparency of the larvae, and the high homology with human. Several approaches have been developed in this fish, as the gene-knockdown in order to identify the role of a protein in the development, or the tumor transplantation of mammalian cells to study anti-tumor treatments response.It is in one of these two contexts that we studied the role of nitric oxide in tumor development in zebrafish. We used a fluorescent probe and were able to detect in vivo the production of nitric oxide associated with xenograft tumor cells. The use of an NO scanvenger, the cPTIO resulted in a loss of tumor cells and a decrease in the expression of an angiogenic factor VEGF, showing a potential in the use of cPTIO as antitumor molecule.We used also the transitory invalidation of hsf1 gene, in order to explore a potential new role in the development and red blood cells differentiation in zebrafish as an experimental model, in non heat-shocked conditions. We found that HSF1 was important for the differentiation of erythrocytes, and its inactivation also reflected defects in development.

In order to survive, cells must be able to cope with a variety of environmental stressors. The heat shock response (HSR) is a pro-survival mechanism employed by cells in response to protein denaturing stress, such as heat. Since its discovery in 1960, the heat shock response has been found to be regulated by the transcription factor heat shock factor 1 (HSF1). During periods of increased stress, HSF1 undergoes a multi-step process of activation that involves homotrimerization, DNA-binding, and post-translational regulatory modifications, all of which ultimately function to control the transcription of chaperone genes. These chaperone genes encode molecular chaperone proteins which function to promote survival during stress by restoring protein homeostasis to the cell. Although HSF1 is classically studied for its role in regulating the HSR, HSF1 also has roles in regulating metabolism, development, and longevity. Studies in the nematode Caenorhabditis elegans demonstrate the HSF1 homolog, HSF-1, as a global regulator of gene expression that has both stress-dependent and -independent functions. Modulating HSF1 activity therefore has implications beyond stress-induced processes, and has been suggested as a promising therapeutic target for diseases of aging and protein dysfunction. We were interested in determining regulators of the HSR using C. elegans as a model to test for effects on proteostasis and longevity. In these studies, we observed the effects of compound treatment (Chapters 1 and 2), genetic manipulation (Chapters 3 and 4), and environmental stimuli (Chapters 5 and 6), on the HSR in C. elegans. In Chapters 1 and 2, we describe our findings that treatment with the DNA synthesis inhibitor Fluorodeoxyuridine, and treatment with coffee and caffeine, enhance the heat shock response and improve proteostasis in aging worms in an HSF-1-dependent manner. In Chapters 3 and 4, we uncovered that negative regulation of the HSR by the cell cycle and apoptosis regulator CCAR2 is conserved in C. elegans, and is mediated by the CCAR2 ortholog, LST-3. We also uncovered that negative regulation of the HSR by LST-3 requires the SIRT1 homolog Sir-2.1, and knockdown of LST-3 via lst-3 RNAi works through Sir-2.1 to enhance stress-resistance, fitness, proteostasis and longevity. In Chapters 5 and 6, we describe the global impact of HSF-1 in regulating transcriptional processes during a heat stress. The profiling of global HSF-1 mRNA and miRNA targets has allowed us to uncover a heat-dependent and -independent role for HSF-1 in regulating gene expression to impact stress-resistance, proteostasis, and longevity. Altogether, these studies demonstrate the impact of compound treatment, genetic manipulation, and environmental stimuli on the heat shock response, while also uncovering global stress-dependent and -independent roles for HSF-1. This work therefore provides insight into various methods of activating the HSR by modulating HSF-1 activity, and uncovering global HSF-1 target genes, which may be useful for designing therapeutic treatment strategies for diseases of protein dysfunction.

Un certain nombre d’études épidémiologiques font état d’une augmentation de l’infertilité masculine durant ces cinquante dernières années, en particulier dans les pays industrialisés, mais aussi d’une augmentation des malformations de l’appareil reproducteur masculin telles que la cryptorchidie (absence de migration des testicules dans les bourses) ou l’hypospadias (malformation du pénis), et des cancers testiculaires. Des données expérimentales suggèrent que ces anomalies du tractus génital mâle sont liées. Ces symptômes forment le syndrome de dysgénésie testiculaire. Les causes d’apparition ce syndrome semblent être d’origine environnementale. En effet, les évolutions relativement rapides de ce syndrome suggèrent des facteurs dynamiques, en lien avec le mode de vie ou l’environnement. Une des hypothèses est que, l’exposition durant la vie fœtale ou néonatale à des composés présents dans l’environnement capables d’interférer avec le système hormonal (perturbateurs endocriniens environnementaux, PEEs), serait responsable de l’augmentation de l’incidence de ces pathologies. Au banc des principaux accusés, les molécules qui possèdent des activités de type estrogénique ou antiandrogénique. A ce jour, les mécanismes d’action à l’origine du syndrome de dysgénésie testiculaire sont encore mal connus. Certaines études suggèrent des mécanismes de type épigenétique dans les effets à long terme des PEEs. L’objectif de notre travail était d’identifier et caractériser les mécanismes d’action de type épigenétique impliqué dans l’infertilité mâle. Pour cela, nous avons utilisé un modèle expérimental (rats nouveau-nés) reposant sur une exposition développementale à un estrogène (estradiol benzoate). Ce modèle induit chez le rat adulte un phénotype d’hypospermatogenèse liée à une à apoptose chronique des cellules germinales testiculaires. Nous montrons que ce phénotype est lié à l’altération de deux voies, impliquant en amont des effecteurs épigénétiques. La première voie implique la famille des miR-29s. Ainsi, nous observons une augmentation de l’expression des miR-29a, b, c qui provoque une diminution de deux de ses cibles: la protéine antiapoptotique MCL-1 et les enzymes de méthylation de l’ADN DNMTs. La chute des DNMTs entraine une hypométhylation globale (estimée à travers le gène Line-1) et spécifique du facteur de choc thermique HSF1. Ceci provoque une réexpression de ces facteurs entrainant l’apoptose des cellules germinales adultes. La deuxième voie implique le miR-18a. L’augmentation de son expression provoque une chute de l’expression de sa cible HSF2 qui régule la protéine de choc thermique HSP70/HSPA2. Le faible taux d’HSPA2 est une autre explication de l’apoptose des cellules germinales dans notre modèle. Nous montrons aussi que ce phénotype est irréversible lorsque l’exposition à lieu chez le nouveau-né alors qu’il est réversible quand l’exposition à lieu à l’âge adulte. Ces données suggèrent que l’exposition néonatale à l’estradiol benzoate induit une programmation développementale de l’hypospermatogenèse.Enfin, les anomalies tissulaires d’expression des miRNAs se retrouvent au niveau sanguin, suggérant leur utilisation potentielle comme biomarqueurs. Nous avons validé cet aspect chez l’homme en montrant que l’expression des miR29s et du miR-18a était plus élevée chez les patients oligo- ou azoospermiques que les chez patients normospermiques.En conclusion, nos résultats indiquent que l’hypospermatogenèse due à une apoptose chronique des cellules germinales observée chez l’animal adulte après exposition néonatale à l’EB met en jeu une modification d’expression de plusieurs effecteurs épigénétiques clés: miR-29s, miR-18a et DNMTs. De plus, les miR-29s et miR-18a pourraient être de nouveaux biomarqueurs circulants non invasifs de la stérilité masculine dans le contexte d’une oligo ou azoospermie chez l'homme. / Epidemiological studies have reported an increase in male infertility over the past fifty years, especially in industrialized countries, but also an increase in malformations of the male reproductive tract such as cryptorchidism (no migration of the testes into the scrotum) and hypospadias (malformation of the penis), and testicular cancers. Experimental data suggest that these abnormalities of the male genital tract are related. These symptoms form the testicular dysgenesis syndrome. The causes of the occurrence of this syndrome appear to be environmental in origin. Indeed, the relatively rapid evolution of this syndrome suggests dynamic factors related to lifestyle or environment. One hypothesis is that exposure during fetal or neonatal life to compounds present in the environment can interfere with the hormonal system (environmental endocrine disruptors), would be responsible for the increased incidence of these pathologies. Bench of the main accused, molecules that have estrogenic or anti-androgenic activity types. To date, the mechanisms of action behind the testicular dysgenesis syndrome are poorly understood. Some studies suggest that epigenetic mechanisms are at playThe objective of our work was to identify and characterize the epigenetic mechanisms of action involved in male infertility induced by neonatal exposure to xenoestrogen. For this, we used an experimental model based on a developmental exposure to estrogen (estradiol benzoate). This model induced in adult rats a hypospermatogenesis phenotype due to chronic apoptosis of germ cells.We show that this phenotype is related to an alteration of two pathways, involving upstream effectors epigenetic. The first pathway involves the family of miR- 29s. Thus, we observe an up-regulation of miR -29a, b, c, which causes a decrease in two of his targets: the anti-apoptotic protein MCL- 1 and the enzymes of DNA methylation DNMTs. Falling DNMTs leads to a global hypomethylation (estimated through the Line -1 gene) and to specific hypomethylation of the heat shock factor, HSF1. This causes a re-expression of factors that induce apoptosis in adult germ cells. The second pathway involves up-regulation of miR -18a that causes a down-regulation of its target HSF2 which regulates the heat shock protein HSP70/HSPA2. The down-regulation of HSPA2 is another explanation of germ cell apoptosis in our model. We also show that this phenotype is irreversible when the estrogen exposure takes place in the newborn whereas it is reversible when exposure takes place in adulthood, suggesting that neonatal exposure to estradiol benzoate induced a developmental programming of hypospermatogenesis.Finally, abnormal tissue expressions of miRNAs are found in the blood, suggesting their potential use as biomarkers. We validated this aspect in humans showing that the expression of miR29s and miR-18a was higher in patients with decrease or no sperm counts compared to normal sperm count. In conclusion, our results indicate that hypospermatogenesis due to chronic germ cell apoptosis observed in adult animals after neonatal exposure to EB involves a change in expression of several key epigenetic effectors: miR-29, miR-18a and DNMTs. In addition, miR-29 and miR-18a could be new non invasive circulating biomarkers of men infertility.

Le noyau d'une cellule est hétérogène par sa structure et son activité et beaucoup de ses composants interagissent de façon dynamique. Lors de l'étude de processus cellulaires comme la réponse au stress thermique, des expériences classiques de spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS), qui sont habituellement limitées à un seul volume d'observation, n'apportent que des résultats partiels à cause des informations spatiales manquantes. Ce mémoire de thèse présente une nouvelle technique de FCS multi-confocale (mFCS) qui permet des mesures FCS simultanées à différents endroits d'une cellule. La technique est basée sur l'emploi d'un modulateur spatial de lumière pour la création de plusieurs volumes d'observations distincts et d'une caméra ``electron-multiplying'' CCD (EMCCD) pour la détection en parallèle. La résolution spatiale ainsi que la sensibilité du système mFCS sont proches de celles d'un système FCS classique et en utilisant un mode d'acquisition particulier une résolution temporelle de $14mu s$ a pu être atteinte. La technique mFCS est appliquée à l'étude de la réponse cellulaire au stress thermique en observant le facteur de transcription heat shock factor 1 (HSF1), qui est un régulateur clé de la réponse au stress thermique. Des mesures mFCS dans des cellules vivantes révèlent des changements dans la dynamique de HSF1 pendant le choc thermique. Ces changements concernent l'affinité ainsi que l'homogénéité spatiale des interactions avec l'ADN. En outre, nous avons également évalué les performances d'une caméra CMOS-SPAD et testé le dispositif en tant que capteur alternatif pour la mFCS en cellules vivantes. / The cell nucleus is heterogeneous in its structure and activity and many of its components are in dynamic interactions with each other. When investigating the cellular response to an external signal, such as heat shock, standard fluorescence correlation spectroscopy (FCS) experiments, which are limited to one observation volume, do only give partial results because of the missing spatial information. This work introduces a novel multi-confocal FCS (mFCS) technique that allows simultaneous FCS measurements in different locations within a cell. It is based on the use of a spatial light modulator (SLM) to create several distinct observation volumes at a time and an electron-multiplying charge coupled device (EMCCD) camera to perform parallel detection. The spatial resolution as well as the sensibility of the mFCS system are close to that of a classical FCS setup and using a special readout mode, a temporal resolution of $14mu s$ is reached. The mFCS technique is applied to study the cellular response to thermal stress by monitoring the transcription factor heat shock factor 1 (HSF1), which is a key regulator of the heat shock response. mFCS experiments in living cells reveal changes in the dynamics of HSF1 upon heat shock. These changes concern the affinity as well as the spatial homogeneity of its interactions with DNA. Additionally, the performance of a CMOS-SPAD camera, consisting of an array of single photon avalanche diodes, is evaluated and the device is tested as an alternative detector for mFCS in living cells.

Avant le début de ma thèse, le laboratoire avait découvert et caractérisé HDAC6, une Histone Déacétylase atypique qui possède deux domaines déacétylases et peut interagir directement avec l'ubiquitine, grâce à son domaine ZnF-UBP. De plus, le laboratoire avait montré que HDAC6 interagit avec UFD3/PLAP, un régulateur du recyclage de l'ubiquitine, et p97/VCP, un orthologue murin de la chaperonne de levure Cdc48p. Cependant, aucune fonction biologique dans la voie d'ubiquitination des protéines n'était connue pour HDAC6. Nous avons tout d'abord observé que la surexpression de HDAC6 ralenti la dégradation des protéines poly-ubiquitinées, via son ZnF-UBP, son domaine de liaison à l'ubiquitine. Grâce à une série d'expériences, nous avons pu montrer que les complexes HDAC6-p97/VCP régulent directement la stabilité des protéines poly-ubiquitinées. L'accumulation intracellulaire de protéines poly-ubiquitinées peut être toxique pour les cellules si aucune réponse cellulaire n'est engagée. En réalité, une telle accumulation active le facteur de transcription Heat Shock Factor 1 (HSF1) afin de promouvoir la survie de la cellule. Grâce à ces considérations, nous avons découvert que HDAC6 contrôle la réponse cellulaire à l'accumulation de protéines poly-ubiquitinées et avons disséqué les mécanismes impliqués dans ce contrôle. Nous avons trouvé qu'en l'absence de stress, HDAC6 et HSF1 sont en complexes avec p97/VCP et HSP90. Cependant, lorsque la concentration intracellulaire en protéines poly-ubiquitinées augmente, comme lors d'une inhibition du protéasome, HDAC6 est re-larguée du complexe de manière ubiquitine et ZnF-UBP dépendante. Un tel re-largage permet ensuite à p97/VCP d'activer HSF1 et d'engager la cellule dans la réponse au stress.

Prokaryotic and eukaryotic organisms respond to various stresses with the production of heat shock proteins (HSPs). HSPs are molecular chaperones that bind to unfolded proteins and inhibit their aggregation as well as maintaining their solubility until they can be refolded to their original conformation. Stress-inducible hsp gene transcription is mediated by the heat shock element (HSE), which interacts with heat shock transcription factor (HSF). In this study, we examined the effect of KNK437 (N-formyl-3,4-methylenedioxy-benzylidene-g-butyrolactam), a benzylidene lactam compound, on heat shock, sodium arsenite, cadmium chloride and herbimycin A-induced hsp gene expression in Xenopus laevis A6 kidney epithelial cells. In studies limited to mammalian cultured cells, KNK437 has been shown to inhibit HSE-HSF1 binding activity and stress-induced hsp gene expression. In the present study, western and northern blot analysis revealed that exposure of A6 cells to heat shock, sodium arsenite, cadmium chloride and herbimycin A induced the accumulation of HSP30 protein and hsp30 mRNA, respectively. Western blot analysis also determined that exposure of A6 cells to heat shock, sodium arsenite, cadmium chloride and herbimycin A induced the accumulation of HSP70 protein. Pre-treatment of A6 cells with 100 µM KNK437 inhibited stress-induced hsp30 mRNA as well as HSP30 and HSP70 protein accumulation. Immunocytochemistry and confocal microscopy were used to confirm the results gained from western blot analysis as well as determine the localization of HSP30 accumulation in A6 cells. A 2 h heat shock at 33°C resulted in the accumulation of HSP30 in the mostly in the cytoplasm with a small amount in the nucleus. Heat shock at 35°C resulted in substantial HSP30 accumulation in the nucleus. This is in contrast with A6 cells treated for 14 h with 10 µM sodium arsenite, 100 µM cadmium chloride and 1 µg/mL herbimycin A, where HSP30 accumulation was found only in the cytoplasm and not in the nucleus. A 6 h pre-treatment with 100 µM KNK437 completely inhibited the accumulation of HSP30 in A6 cells heat shocked at 33 or 35°C as well as cells treated with 1 µg/mL herbimycin A. The same pre-treatment with KNK437 resulted in a 97-100% decrease in HSP30 accumulation in A6 cells treated with 10 µM sodium arsenite or 100 µM cadmium chloride. These results show that KNK437 is effective at inhibiting both heat shock and chemical induced hsp gene expression in amphibian cells.